專利名稱：新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種海藻糖基合成酶及其制備和用途，特別是涉及一種新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶，它能夠在酸性高溫環(huán)境下特異性利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。本發(fā)明還涉及能產(chǎn)生所述酶的微生物及該酶的制備，用所述酶得到的非還原性淀粉糖和海藻糖，及含所述非還原性淀粉糖和海藻糖的組合物的制備。
已知海藻糖或α，α-海藻糖是一種由葡萄糖單位組成的非還原性淀粉糖。如在Advances in Carbohydrate Chemistry.Academic Press，1993，18201-225和Applied and Environmental Microbiology.1990，563213-3215中描述的那樣，海藻糖廣泛存在于生物界，包括動(dòng)物、植物和微生物之中均存在此糖，但含量較低。海藻糖是一種非還原二糖，常態(tài)下為白色晶體，爽口甘甜且無后味，其甜度為砂糖的45％；因?yàn)樵撎蔷哂歇?dú)特的生物學(xué)功能，對(duì)多種生物大分子和細(xì)胞膜有顯著的保護(hù)作用，其用途和潛在作用十分廣泛，可作為生物制品及活菌制劑的保護(hù)劑和穩(wěn)定劑使用，也可在食品及化妝品中用做天然添加劑。因此迫切要求能夠工業(yè)化大規(guī)模制備海藻糖。
傳統(tǒng)的海藻糖制備方法包括如日本專利公開No.154,485/75中利用酵母提取物的方法及日本專利公開No.216,695/83中報(bào)道的用麥芽糖磷酸化酶和海藻糖磷酸化酶聯(lián)合轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖的方法。然而，由于前者用作為起始材料的酵母體中，海藻糖的含量通常低于15W/W％(除非特別說明，本說明書中的術(shù)語“W/W％”縮寫為“％”)，并且提取和純化步驟復(fù)雜，因此不適于工業(yè)化生產(chǎn)。后者有下列缺點(diǎn)(I)由于海藻糖是經(jīng)葡萄糖-1-磷酸形成的，不可能將作為底物的麥芽糖濃度調(diào)整到符合要求的高水平(II)磷酸酶的酶反應(yīng)系統(tǒng)是傳遞反應(yīng)，而實(shí)際生產(chǎn)中很難獲得穩(wěn)定的連續(xù)酶反應(yīng)系統(tǒng)，因此海藻糖產(chǎn)率比較低，使該方法也不能作為工業(yè)化生產(chǎn)方法。
同樣，我們知道，水解淀粉產(chǎn)生的還原性淀粉部分水解物如糊精和麥芽寡糖可用作增甜劑、功能保健添加劑及能量補(bǔ)充糖源廣泛使用，但由于其還原性而與其它物質(zhì)具有高度反應(yīng)性，如和氨基酸或蛋白質(zhì)等帶氨基的物質(zhì)共存時(shí)易發(fā)生褐變反應(yīng)，損害相應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量，因此也極大地影響了其使用范圍。
考慮以上這些因素，大家現(xiàn)在都努力尋找一種制備非還原性淀粉糖以及海藻糖的簡便高效新途徑。結(jié)果如日本專利申請(qǐng)No.349,216/93中公開的，人們發(fā)現(xiàn)從土壤中分離的根瘤菌(Rhizobium sp.)M-11(CCTCC M94031)和節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)Q36(CCTCC M94030)能產(chǎn)生一種海藻糖基合成酶，在常溫中性環(huán)境下利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖，大大降低了該淀粉部分水解物的還原性；同時(shí)該酶能與一種海藻糖基水解酶一起使用，水解淀粉直接生產(chǎn)海藻糖，上述海藻糖基水解酶能夠在常溫中性條件下水解以上方法產(chǎn)生的非還原性淀粉糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，生成海藻糖。但由于該方法中微生物培養(yǎng)周期長，產(chǎn)酶水平低，特別是該酶的熱穩(wěn)定性差，不耐酸，導(dǎo)致生產(chǎn)工藝復(fù)雜，糖轉(zhuǎn)化率低下，生產(chǎn)成本偏高等眾多不利結(jié)果，不能適應(yīng)現(xiàn)代淀粉糖化生產(chǎn)中高溫、高效、高質(zhì)的需求。因?yàn)樵趯?shí)際生產(chǎn)中，淀粉水解溫度低于55℃時(shí)，極容易染菌造成生產(chǎn)污染；此外反應(yīng)過程中溶液pH會(huì)不斷下降而導(dǎo)致不耐酸的酶類失活，但在中性條件下，淀粉又容易老化，形成不溶沉淀，影響生產(chǎn)；這些都是該方法中明顯的不足。為解決這個(gè)問題，迫切需要篩選一種新型海藻糖基合成酶，它既具備高效專一的合成海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的酶活力，也要有理想的熱穩(wěn)定性，在55℃以上的環(huán)境中不失活，并具備理想的pH穩(wěn)定性，特別在酸性條件下，也能具備穩(wěn)定的酶活力。
本發(fā)明的目的為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人廣泛篩選了能夠生產(chǎn)這種新酶的微生物，所述酶可以能夠在酸性高溫環(huán)境下特異性利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。結(jié)果，我發(fā)現(xiàn)了埃希氏菌屬的微生物菌株(E.coli)MTS-16能夠產(chǎn)生特異性利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的海藻糖基合成酶；我發(fā)現(xiàn)，在酸性高溫環(huán)境下該酶利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖；并在同樣條件下與同樣耐熱耐酸的海藻糖基水解酶共同使用時(shí)，以令人滿意的高產(chǎn)率催化還原性淀粉部分水解物，高效合成海藻糖；而且通過回收非還原性淀粉糖或海藻糖含量相對(duì)高的反應(yīng)混合物，很容易制備高純度的非還原性淀粉糖或海藻糖。我還發(fā)現(xiàn)，與來自埃希氏菌屬的微生物一樣，酵母菌的微生物也能夠產(chǎn)生相似的催化還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的海藻糖基合成酶，對(duì)此我也進(jìn)行了同樣的研究并完成了本發(fā)明。我同時(shí)也研制了含由上述制備方法制備的非還原性淀粉糖或海藻糖的組合物，如食品、化妝品和藥物，并完成了本發(fā)明。
本發(fā)明人已將這些微生物分別命名為“大腸桿菌MTS-16”和“酵母菌MTH-8”，并分別于2001，7，11和2000，12，27保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microbiological Culture CollectionCenter，即CGMCC)，并由該機(jī)構(gòu)分別以CGMCC No 0600和CGMCC No 0525的保藏號(hào)予以保藏。
除上述微生物外，埃希氏菌屬、酵母屬的其它菌株和其突變體；只要能產(chǎn)生本發(fā)明的新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶，就適用于本發(fā)明，所述的海藻糖基合成酶能夠在高溫酸性條件下特異性催化還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。
任何營養(yǎng)培養(yǎng)基只要上述微生物能生長于其上，且能產(chǎn)生本發(fā)明的海藻糖基合成酶，就可用于本發(fā)明例如可隨意使用合成的和天然營養(yǎng)培養(yǎng)基。任何含碳的物質(zhì)只要它被所述微生物利用，就可作為碳源用于本發(fā)明所述碳源的實(shí)例是糖類，如葡萄糖，果糖，乳糖，蔗糖，甘露醇，山梨醇，糖蜜，淀粉和淀粉部分水解物；有機(jī)酸類如檸檬酸和琥珀酸?？梢赃m當(dāng)選擇這些碳源在營養(yǎng)培養(yǎng)基中的濃度例如，在用葡萄糖時(shí)，從所述微生物生長和繁殖的角度看，優(yōu)選的濃度通常是10％或更低，最好是1％或更低。可用于本發(fā)明的氮源有無機(jī)氮化合物，如銨鹽和硝酸鹽；含有機(jī)氮的物質(zhì)，如脲，玉米漿，酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉膏?？捎糜诒景l(fā)明的無機(jī)鹽有鈣鹽，鎂鹽，鉀鹽，鈉鹽，磷酸鹽及鋅，鐵，銅，鉬和鈷的其它鹽。如果需要，可以添加氨基酸和維生素。
將在本發(fā)明中可用的微生物于需氧條件下，通常在4-50℃的范圍，優(yōu)選的25-45℃的范圍；及pH4-10；優(yōu)選的pH5-9條件下培養(yǎng)。將在本發(fā)明中適用的培養(yǎng)時(shí)間調(diào)整至比所述微生物生長開始所需的時(shí)間更長，優(yōu)選的是，8-100小時(shí)。沒有特別限制營養(yǎng)培養(yǎng)基中溶解氧(DO)的濃度，通常使用0.5-20ppm范圍的DO是令人滿意的。通過控制通氣率，攪拌營養(yǎng)培養(yǎng)基，通氣補(bǔ)充氧，及增加發(fā)酵容器的內(nèi)壓，可將DO濃度保持在該范圍內(nèi)。該微生物的培養(yǎng)方式可以是分批培養(yǎng)，也可以是連續(xù)培養(yǎng)。
在微生物培養(yǎng)完成后，回收本發(fā)明的酶。在細(xì)胞和無細(xì)胞上清液中，都發(fā)現(xiàn)具有活性的本發(fā)明酶，可將其分別回收并用作粗酶；也可將所得的培養(yǎng)物原封不動(dòng)地用作粗酶。在本發(fā)明中，可以使用傳統(tǒng)的液-固分離方法，以便從培養(yǎng)物中分離細(xì)胞。例如，可以將所得的培養(yǎng)物直接離心的方法，以及預(yù)涂布濾器將其過濾或通過使用板框?yàn)V器或空心纖維的膜過濾分離細(xì)胞的方法，可將因此得到的無細(xì)胞濾液原封不動(dòng)地用作酶溶液或在使用前將其濃縮，也可將獲得的細(xì)胞直接破碎提取酶液。本發(fā)明中可用的濃縮方法如，加熱法，使用硫酸銨的鹽析，使用丙酮和醇的有機(jī)沉淀法，使用如板框?yàn)V器和空心纖維膜的濃縮法。
可將無細(xì)胞濾液和其濃縮物用于傳統(tǒng)的固定方法。傳統(tǒng)方法的實(shí)例是使用離子交換劑的結(jié)合法，使用樹脂和膜的共價(jià)鍵合吸附法，以及高分子量物質(zhì)的包理法。可以將培養(yǎng)液中分離的細(xì)胞用作粗酶而不需任何其它處理或在使用前將其固定。例如，將細(xì)胞與藻酸鹽混合，在氯化鈣液中滴所得的混合物，將膠滴凝成顆粒，從而固定細(xì)胞?？梢杂镁蹃喴一鶃啺坊蛭於┕潭ㄋ玫念w粒。可以將由細(xì)胞提取的酶制品，作為粗酶溶液使用。通過從細(xì)胞中提取本發(fā)明的酶，包括用超聲波，使用玻璃珠和氧化鋁的機(jī)械破碎，法蘭西壓(Frenchpress)破碎等，使得到的提取物經(jīng)加熱預(yù)處理、離心或膜過濾，從而得到含本發(fā)明酶的粗酶澄清溶液。
可以原封不動(dòng)地使用由此得到的粗酶溶液或在使用前用傳統(tǒng)方法將其純化。例如可以通過粗酶液濃縮、透析，然后用“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換柱上層析；用“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析；和使用“Sephacryl S-200”(一種凝膠過濾樹脂)的凝膠過濾層析，從而制備電泳上呈一條帶的純酶制品。
由此得到的本發(fā)明海藻糖基合成酶有下列物理化學(xué)特性；1. 作用特異性催化還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖；2. 分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)上約75000到85000道爾頓；3. 等電點(diǎn)(PI)在用兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳上約6.2到7.2；4. 最佳溫度在pH5.5保存30分鐘時(shí)，60～80℃；5. 最佳pH在65℃保存30分鐘時(shí)，5.0～6.0；6. 熱穩(wěn)定性在pH5.5保存60分鐘時(shí)，可穩(wěn)定的溫度為約30～75℃；7. pH穩(wěn)定性在25℃保存60分鐘時(shí)，可穩(wěn)定的pH為4.0～11.0。
按下列步驟檢測(cè)本發(fā)明海藻基合成酶的活性將0.1ml酶溶液加到0.1ml2w/w％麥芽五糖的50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中，60℃反應(yīng)10分鐘后沸水浴10分鐘以滅活，反應(yīng)混合物用水稀釋20倍，然后取稀釋液400ul用Somogyi-Nelson方法確定還原能力。作為對(duì)照，在100℃將酶溶液預(yù)熱15分鐘以使酶失活，按與上述相似的方法檢測(cè)。本發(fā)明中將1單位的酶活性定義為在該條件下，每分鐘去除1μmol麥芽五糖還原能力所需的酶量。
任何物質(zhì)只要它是淀粉水解產(chǎn)生的還原性淀粉糖，就可作為本發(fā)明酶的底物；所述底物的實(shí)例是麥芽三糖，麥芽四糖，麥芽五糖，麥芽六糖和麥芽七糖等。除這些底物外，其它通過用淀粉酶或酸部分水解淀粉類物質(zhì)如淀粉、支鏈淀粉和直鏈淀粉而制備的還原性淀粉部分水解物也適用于本發(fā)明。
部分水解淀粉的所述淀粉酶的實(shí)例是在Handbook of Amyloses and RelatedEnzymes(由Pergamon Press；Tokyo，Japan(1988)出版)中公開的α-淀粉酶、麥芽五糖形成淀粉酶和麥芽六糖形成淀粉酶等?？梢詫⑦@些淀粉酶與脫支酶如支鏈淀粉酶和異淀粉酶結(jié)合使用。
對(duì)在本發(fā)明中用作底物的還原性淀粉部分水解物的濃度沒有特別的限制。根據(jù)本發(fā)明甚至可以在含0.1％或50％底物的溶液中進(jìn)行酶反應(yīng)，形成非還原性淀粉糖。在本發(fā)明中也可使用含過量底物的不可溶懸浮物。在本發(fā)明酶反應(yīng)中可用的反應(yīng)溫度可以是本發(fā)明酶不失活的溫度，即最高達(dá)約75℃，優(yōu)選的在55-75℃。在本發(fā)明酶反應(yīng)中可用的反應(yīng)pH是4.5-8.0，優(yōu)選在pH5-6。應(yīng)根據(jù)酶反應(yīng)條件來選擇本發(fā)明酶反應(yīng)所用的時(shí)間，通常，當(dāng)以0.1-100單位/g底物使用本發(fā)明的酶時(shí)，大約需0.1-100小時(shí)。
具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的制備在本發(fā)明制備方法中，可以用本發(fā)明的海藻糖基合成酶作用于還原性淀粉部分水解物，生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖；并用常規(guī)方法過濾并濃縮由此得到的反應(yīng)混合物以除去不可溶物質(zhì)，然后用活性炭將所得的溶液脫色，用H-和OH-形式的離子交換劑脫鹽，進(jìn)一步濃縮成漿狀產(chǎn)品后，可以隨意地將糖漿產(chǎn)品干燥成粉狀產(chǎn)品。如果需要，也可用一種或多種方法，如離子交換柱層析、活性炭或硅膠的柱層析分級(jí)分離進(jìn)行純化；用有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮分離法；用降解剩余還原性糖的堿處理法等；也可用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解相應(yīng)淀粉糖，或用環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化的多糖-轉(zhuǎn)移反應(yīng)以控制其甜度和還原力并降低其粘度；此外，可以隨意氫化多糖產(chǎn)品將其轉(zhuǎn)變成糖醇，從而進(jìn)一步降低其還原力；以上方法很容易將粉狀產(chǎn)品加工成所要求的高純度非還原性淀粉糖產(chǎn)品；該產(chǎn)品與處理前的還原性淀粉部分水解物相比，有同樣理想的甜味、粘度和溶解性，但更因具有明顯低的還原性，而不與氨基酸或蛋白質(zhì)類物質(zhì)共存時(shí)發(fā)生反應(yīng)，所以使用時(shí)有著更好的產(chǎn)品穩(wěn)定性。
因此可以將本發(fā)明生成的非還原性淀粉糖或含該非還原性淀粉糖的多糖組合物作為甜味劑、味道改善劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑用于各種組合物如食品、香煙、煙草、飼料、化妝品和藥物；而將本發(fā)明生成的非還原性淀粉糖或含該非還原性淀粉糖的多糖組合物摻人上述物質(zhì)的方法包括傳統(tǒng)方法，例如混合、捏合、溶解、融化、浸泡、滲透、噴淋、敷、涂上、噴、注射、結(jié)晶和固化。通常以0.1％或更高，優(yōu)選的1％或更高的量，將本發(fā)明生成的非還原性淀粉糖或含該非還原性淀粉糖的多糖組合物摻入上述的物質(zhì)和組合物中。
海藻糖的制備本發(fā)明制備海藻糖的酶機(jī)制如下首先用本發(fā)明的海藻糖基合成酶將具有相對(duì)高的葡萄糖聚合度的還原性淀粉部分水解物轉(zhuǎn)變成1摩爾具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖，然后，用海藻糖基水解酶將所得的非還原性淀粉糖水解成1摩爾海藻糖和1摩爾比原材料還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度低2的還原性淀粉部分水解物。對(duì)于新形成的還原性淀粉部分水解物，可以將其進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為有一個(gè)海藻糖作為末端單元的非還原性淀粉糖，然后再一次用海藻糖基水解酶轉(zhuǎn)變成1摩爾的海藻糖和淀粉部分水解物。因此，重復(fù)前述海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶的酶反應(yīng)，可以從1摩爾還原性淀粉部分水解物形成多摩爾的海藻糖分子及少量其他淀粉水解糖。(示意如

圖1)在本發(fā)明制備方法中，可以同時(shí)使用本發(fā)明的海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶以作用于還原性淀粉部分水解物，或按順序分別使用這兩種酶作用于非還原性淀粉部分水解物，制備海藻糖；為了進(jìn)一步提高海藻糖的產(chǎn)率，也可用使所得的反應(yīng)混合物進(jìn)一步經(jīng)淀粉脫支酶或葡糖淀粉酶的作用并用常規(guī)方法過濾、濃縮由此得到的反應(yīng)混合物以除去不可溶物質(zhì)，然后用活性炭將所得的溶液脫色，用H-和OH-形式的離子交換劑脫鹽，進(jìn)一步濃縮成漿狀產(chǎn)品后，可以隨意地將糖漿產(chǎn)品干燥成粉狀產(chǎn)品。
如果需要，用一種或多種方法，如離子交換柱層析、活性炭或硅膠的柱層析分級(jí)分離進(jìn)行純化；用有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮分離法；用降解剩余還原性糖的堿處理法等，很容易將粉狀產(chǎn)品加工成高純度的海藻糖產(chǎn)品。
如果需要，按照本發(fā)明，可以用淀粉酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶和/或海藻糖酶水解含海藻糖的產(chǎn)品，或用環(huán)狀糊精葡聚糖轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶催化的多糖-轉(zhuǎn)移反應(yīng)以控制其甜度和還原力并降低其粘度。此外，可以隨意氫化海藻糖產(chǎn)品將其轉(zhuǎn)變成糖醇，從而進(jìn)一步降低其還原力?？梢杂蒙鲜龅募兓椒ǎ珉x子交換柱層析從所得的產(chǎn)品中除去葡萄糖以制備海藻糖的組份。可以很容易將由此得到的組份純化并濃縮成糖漿產(chǎn)品，且根據(jù)需要可以進(jìn)一步將糖漿產(chǎn)品濃縮成過飽和濃液并結(jié)晶以得到含水或無水的結(jié)晶海藻糖。
為了制備含水的結(jié)晶海藻糖，將約65-90％的海藻糖溶液放在-結(jié)晶器中，于95℃或更低，優(yōu)選10-90℃的范圍內(nèi)，在存在0.1-20％晶種的情況下，邊攪拌邊逐漸冷卻以得到含有含水結(jié)晶海藻糖的糖膏?？梢栽诒景l(fā)明中使用傳統(tǒng)方法，如分離法、塊粉碎作用、流化床或成粒作用及噴霧干燥法以便從糖膏或晶狀多糖制備含水的結(jié)晶海藻糖。
在分離時(shí)，使糖膏經(jīng)籃式離心以便從母液中分離含水的結(jié)晶海藻糖，如果需要，用少量冷水噴洗含水結(jié)晶海藻糖以促進(jìn)高純度含水結(jié)晶海藻糖的制備。噴霧干燥時(shí)，通過從一個(gè)高壓泵嘴射具有60-85％濃度，約20-60％結(jié)晶度的糖膏，用含約60-100℃不融化所得晶體粉末的熱空氣干燥，邊攪拌所得粉末邊通熱空氣約1-20小時(shí)，很容易制備沒有或基本沒有吸濕性的結(jié)晶多糖。在塊粉碎作用時(shí)，使水分含量為約10-25％且結(jié)晶度為約10-60％的糖漿放幾小時(shí)或3天以便使全部內(nèi)含物結(jié)晶并固化成塊，粉碎或切割所得的塊，并將所得物干燥，從而很容易地制備沒有或基本沒有吸濕性的結(jié)晶多糖。盡管可以通過干燥含水的結(jié)晶海藻糖以脫水來制備無水結(jié)晶海藻糖，但一般方法是通過將水分含量低于10％的高海藻糖含量溶液置于結(jié)晶器中，在攪拌條件下，于50-160℃，優(yōu)選80-140℃的范圍，添加晶種的情況下處理溶液以得到無水結(jié)晶海藻糖的糖膏，在干燥和高溫下將其結(jié)晶，用傳統(tǒng)方法如塊粉碎法、流化床成粒法和噴霧干燥將所得的無水結(jié)晶海藻糖粉碎，從而制備無水結(jié)晶海藻糖。
在上面提到的本發(fā)明中可用的離子交換柱層析技術(shù)包括，在日本專利公開No.23,799/83和72,598/83中公開的使用強(qiáng)酸陽離子交換樹脂的方法。使用這些技術(shù)，可以很容易地除去在粗海藻糖及相應(yīng)非還原性淀粉糖產(chǎn)品中所含的伴生糖以得到高含量的產(chǎn)品。在這種情況下，可以隨意使用固定床、移動(dòng)床和半移動(dòng)方法。
由此得到的本發(fā)明海藻糖是穩(wěn)定的且基本上沒有還原能力，并可以與其它物質(zhì)，特別是氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)混合，而不必顧慮引起焦化變質(zhì)和產(chǎn)生令人討厭的氣味。海藻糖本身有令人滿意的品質(zhì)和甜度，且容易被體內(nèi)的海藻糖酶水解，因此口服時(shí)能被機(jī)體同化，吸收和利用。此外，海藻糖基本上不會(huì)被誘發(fā)齲齒的微生物發(fā)酵，因此這可使其用作防齲齒的甜味劑。
可以將本發(fā)明的海藻糖制成藥劑，如用于輸血和管飼法的營養(yǎng)藥劑，可以隨意地將其施用于活體并很容易被活體代謝和利用而不必?fù)?dān)心起毒性和副作用。因此，有利于將這些產(chǎn)品作為用于機(jī)體的能量補(bǔ)充劑。
海藻糖是穩(wěn)定的甜味劑，特別是與粘合劑如支鏈淀粉，羥乙基淀粉或聚乙烯吡咯烷酮結(jié)合使用時(shí)，晶體海藻糖可隨意被用作片劑的糖包衣劑。另外，海藻糖有許多特性，如控制滲透壓的能力、賦予填料的能力、賦予光澤的能力、保持濕度的能力、賦予粘度的能力、基本不發(fā)酵性、防止膠凝化淀粉退化的能力、以及防止其它多糖結(jié)晶的能力。
因此，可隨意地將本發(fā)明中海藻糖和含海藻糖的多糖組合物作為甜味劑、味道改善劑、質(zhì)量改善劑、穩(wěn)定劑和填充劑用于各種組合物如食品、香煙、煙草、飼料、化妝品和藥物。
可將本發(fā)明中海藻糖和含海藻糖的多糖組合物原封不動(dòng)地用作甜味調(diào)料。可根據(jù)需要與足量的一種或多種其它甜味劑，如粉化的糖漿、葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、異構(gòu)糖、蜂蜜、槭糖、赤蘚糖、山梨醇、甘露醇、乳糖醇、甜葉菊苷、阿里塔姆(Alitame)、甘草甜、天冬甜精(Asparmate)、糖精、甘氨酸和丙氨酸或填充劑如糊精、淀粉和乳糖一起使用。
可以原封不動(dòng)地使用海藻糖和含海藻糖的多糖組合物的粉末或結(jié)晶與其它賦形劑、填充劑、稀釋劑和粘合劑混合，并制成顆粒、球棒，扁片、錠劑和片劑。
本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物可以與有酸味、鹽味、苦味、澀味及美味的其它物質(zhì)很好地兼容，并有相對(duì)高的耐酸性和熱抗性。因此可很好地將其用于食品、作為甜味劑、味道改善劑和質(zhì)量改善劑。
可以將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用于調(diào)味劑中，如氨基酸、肽、醬油、粉末化的醬油、酒、蛋黃醬、調(diào)味品、醋、醬菜、方便調(diào)料、核酸調(diào)味品、混合調(diào)料、食糖和咖啡糖。
可以將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物隨意用于增加以下食品的甜味糕點(diǎn)、果胨、面醬、乳脂糖；甜食如甜點(diǎn)心，餅干，干酪，小甜餅，派，布丁，黃油，八寶粥，牛奶蛋糊，奶油酥，牛奶雞蛋格子甜餅，海綿蛋糕，油炸餅圈，巧克力，口香糖，焦糖和糖果；冷凍甜點(diǎn)如冰激凌和甜味果汁粉、糖漿；加工過的水果和蔬菜如果醬、蜜餞、番茄醬；腌菜和腌制食品如腌蘿卜、腌榨菜和腌黃瓜；肉產(chǎn)品如火腿和香腸；魚肉產(chǎn)品如魚火腿，魚腸，魚干；干菜如紫菜，脫水蔬菜；奶產(chǎn)品，如牛奶、豆奶；罐裝和瓶裝產(chǎn)品如肉，魚肉，水果和蔬菜罐頭；含醇飲料如米酒，黃酒，葡萄酒和白酒；軟飲料如咖啡，茶，可可，果汁，碳酸飲料，酸奶飲料和含乳酸菌的飼料；方便食品如即食布丁混合物，即食熱糕點(diǎn)混合物和即食湯混合物；和特殊食品，如嬰兒食品、藥療食品、太空食品，全營養(yǎng)素；本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物能改善上述食品的味道和質(zhì)量。
也可將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用于動(dòng)物如家畜、家禽、蜜蜂、蠶和魚的飼料和寵物食品，以改善其口味愛好。也可將海藻糖和含海藻糖的多糖組合物用作甜味劑、味道改善劑、質(zhì)量改善劑和穩(wěn)定劑添加進(jìn)如煙草、香煙、牙膏和牙膏粉、口紅、胭脂、唇膏、面霜、內(nèi)服藥、魚肝油、口服降溫劑、含漱劑、化妝品和藥物。
可將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物作為質(zhì)量改善劑和穩(wěn)定劑用于對(duì)其有效成分和活性喪失敏感的生物活性物質(zhì)，及含生物活性物質(zhì)的健康食品和藥物組合物。上述生物活性物質(zhì)的實(shí)例是淋巴細(xì)胞活素如α-，β-，和γ-干擾素，α-腫瘤壞死因子(INF-α)，β-腫瘤壞死因子(TNF-β)，巨噬細(xì)胞遷移抑制因子，集落刺激因子，轉(zhuǎn)移因子和白細(xì)胞介素2(IL-2)；激素如胰島素，生長激素，泌乳素，紅細(xì)胞生成素和卵泡刺激素；生物制品如BCG疫苗，日本腦炎疫苗，麻疹疫苗，活脊髓灰質(zhì)炎疫苗，天花疫苗，破傷風(fēng)類毒素，抗毒素和人免疫球蛋白，獸用注射疫苗；抗生素如青霉素，紅霉素，氯霉素，四環(huán)素，鏈霉素和硫酸卡那霉素；維生素如硫胺，核黃素，L-抗壞血酸，魚肝油，類胡蘿卜素，麥角甾醇和生育酚；酶如脂酶，彈性蛋白酶，脲激酶，蛋白酶，α-乙酰乳酸脫羧酶，β-淀粉酶，異淀粉酶和乳糖酶；提取物如人參提取物，龜鱉提取物，藻類提取物，蘆薈提取物、蜂膠提取物；可存活的微生物菌種，如病毒，乳酸菌和酵母；其它生物活性物質(zhì)如蜂王漿。通過使用本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物，可以很容易將上述生物活性物質(zhì)加工成具有令人滿意的穩(wěn)定性和質(zhì)量的健康食品和藥物組合物，而不必?fù)?dān)心其有效成分和活性的喪失或丟失。
按上文所述，將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物摻人上述物質(zhì)的方法包括傳統(tǒng)方法，例如混合、捏合、溶解、融化、浸泡、滲透、噴淋、敷、涂上、噴、注射、結(jié)晶和固化。通常以0.1％或更高，優(yōu)選的1％或更高的量，將本發(fā)明海藻糖和含海藻糖的多糖組合物摻入上述的物質(zhì)和組合物中。
實(shí)施例1海藻糖基合成酶的制備含0.1w/v％蛋白胨，0.05w/v％酵母提取物，0.1w/v％葡萄糖和0.1w/v％氯化鈉的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，調(diào)pH到7.0，將約50ml等份的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基放在250ml搖瓶中，在15lbf/in2(1.034×105Pa)高壓蒸汽滅菌30分鐘，冷卻，加入5mg氨芐青霉素，用大腸桿菌MTS-16種子培養(yǎng)物接種，在轉(zhuǎn)速為220轉(zhuǎn)/分的搖床上30℃培養(yǎng)12小時(shí)，收集所得的培養(yǎng)物并用作種子培養(yǎng)物。
將約3升上述新鮮制備的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基放在5升的發(fā)酵罐中，滅菌，冷卻到28℃，加入0.3g氨芐青霉素，用5％的種子培養(yǎng)物接種，并在28-37℃，pH6.0-8.0，攪拌并通氣的條件下培養(yǎng)約4-6小時(shí)，當(dāng)培養(yǎng)液的OD600為0.3-1.0時(shí)，加入0.1-0.5ppm異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)繼續(xù)保溫培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物于4℃，5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離成菌體細(xì)胞和上清液。
實(shí)施例2酶的純化對(duì)由實(shí)施例1方法得到的菌體進(jìn)行處理，用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時(shí)后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液。然后用20mL“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)裝填的柱進(jìn)行柱層析；目標(biāo)蛋白海藻基合成酶被吸附于離子交換劑上，用新鮮制備的以不同鹽濃度的醋酸緩沖液將它從柱上洗脫下來。在鹽濃度為0.1M時(shí)，海藻糖基合成酶被從柱上洗脫下來，合并含海藻基合成酶酶活的組份并精制。
把合并的含有海藻糖基合成酶的組份在新鮮制備的用2M硫酸銨補(bǔ)充的同一醋酸緩沖液中透析。透析液于10000rpm下離心30分鐘除去不溶物，所得上清液用以10ml“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)裝填的柱進(jìn)行疏水柱層析。用從2M到0M范圍的線性梯度緩沖液將吸附于凝膠的酶從柱上洗脫下來，回收具有酶活性的組份。將所得組份精制并用“Sephacryl S-200”(一種凝膠過濾樹脂)裝填的柱進(jìn)行凝膠過濾層析，回收具有酶活性的組份。表1顯示了每個(gè)純化步驟中海藻糖基合成酶的總酶活力、比活及收率。
表1總酶活力 比活 收率(％)(U)(U/mg)粗酶液 12081.8熱處理 120810 100DEAE-Fast Flow離子柱層析 942 25 78Phenyl-Sepharose疏水柱層析 592 41 49Sephacryl S-200凝膠柱層析 278 72 23純化過的酶制品(凝膠過濾層析到的酶活性組份)，使用7.5％聚丙烯酰胺，在電泳上測(cè)定其純度。結(jié)果，觀察到酶制品呈單一蛋白譜帶，這表明它是具有較高純度的電泳單一制品。
實(shí)施例3海藻糖基合成酶的性質(zhì)使用含10％十二烷基磺酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠，將由實(shí)施例2方法得到的純酶制品進(jìn)行電泳，并通過將它與蛋白分子量標(biāo)記進(jìn)行比較，測(cè)得其分子量為約75,000-85,000道爾頓。
使用含2w/v％兩性電解質(zhì)“AMPHOLINE”，對(duì)實(shí)施例2方法得到的純酶制品進(jìn)行等電點(diǎn)電泳(isoeletrohopresis)。將所得凝膠切成片，然后測(cè)定它們的pH值，得到該酶的pI為約6.2-7.2。
根據(jù)對(duì)酶活性的分析來研究溫度和pH對(duì)該酶活性的影響。圖2(溫度的影響)和圖3(pH的影響)分別顯示了這些結(jié)果。
當(dāng)于pH5.5保存30分鐘時(shí)，該酶的適宜溫度為約60-80℃，在65℃保存30分鐘時(shí)，該酶的適宜pH為約5.0-6.0。
通過將在50mm醋酸緩沖液(pH5.5)中的酶在不同溫度下保存60分鐘，然后用冷水冷卻測(cè)試試管中的緩沖液并測(cè)定每份緩沖液中殘留的酶活性，從而來測(cè)定該酶的熱穩(wěn)定性。通過將在不同pH的來廣泛圍緩沖溶液在25℃保存1小時(shí)，調(diào)整這些緩沖液至pH5.5，然后分析每份緩沖液中殘留的酶活性來測(cè)定該酶的pH穩(wěn)定性。圖4和圖5分別顯示了該酶的熱和pH穩(wěn)定性結(jié)果。該酶在溫度高達(dá)約75℃和pH約4-11下是穩(wěn)定的。
分別向作為底物的含10％葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液中加入實(shí)施例2中獲得的2單位/g底物的海藻糖基合成酶，將所得混合物于75℃和pH5.5下進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)；把得到的每種反應(yīng)混合物脫鹽并經(jīng)高壓液相色譜(HPLC)(使用REZEX RNMCARBOHYDRATE柱)分析其組成。表2顯示該結(jié)果。
表2
表2中的結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的海藻糖基合成酶具有在高溫酸性條件下特異地作用于葡萄糖聚合度大于等于3的還原性淀粉水解糖，生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖；但該酶不能作用于葡萄糖和麥芽糖；此外，由表中可以看出，該酶對(duì)底物還原性淀粉糖有輕微的糖苷水解作用，能生成少量的葡萄糖。
實(shí)施例4從麥芽低聚糖制備具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原麥芽低聚糖向作為底物的10％麥芽低聚糖水溶液中加入實(shí)施例2中獲得的2單位/g底物的海藻糖基合成酶，將所得混合物于75℃和pH5.5下進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)；將以上反應(yīng)混合物100℃加熱，使殘留的酶失活，過濾、脫色、脫鹽并濃縮得到一種濃的糖溶液，然后用“XT-1016(Na型)”(一種聚和度為4％的堿金屬型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂)對(duì)該溶液進(jìn)行柱層析。在柱層析中，用內(nèi)徑為2.0cm，長為1m的3個(gè)套層的不銹鋼柱裝填離子交換劑，然后將這些柱順序級(jí)聯(lián)并加熱至柱內(nèi)溫達(dá)55℃，將5v/v％濃糖溶液(對(duì)樹脂量)上樣，當(dāng)溫度保持在55℃，且在SV(體積速度)為0.13下用55℃熱水洗脫，得到較高純度的非還原麥芽低聚糖，該糖末端具有海藻糖結(jié)構(gòu)單元。在得到的制品中，葡萄糖基海藻糖、麥芽糖糖基海藻糖、麥芽三糖基海藻糖、麥芽四糖基海藻糖和麥芽五糖基海藻糖的含量分別為18.6％、7.6％、46.3％、2.1％和4.2％。
與還原性麥芽低聚糖相比，這些非還原麥芽低聚糖有同樣理想的甜味、粘度和溶解性，但更因具有較低的還原性，而不與氨基酸或蛋白質(zhì)類物質(zhì)共存時(shí)發(fā)生反應(yīng)，所以使用時(shí)有著更好的產(chǎn)品穩(wěn)定性。
實(shí)施例5從不同還原性大小的淀粉部分水解物制備非還原性淀粉糖經(jīng)加熱使含5％蠟狀玉米淀粉的懸浮液明膠化，調(diào)至pH5.5，加熱到50℃，與一種異淀粉酶(isoamylase)樣品以4,000單位/g淀粉的量混合，并使該酶反應(yīng)持續(xù)20小時(shí)。該反應(yīng)混合物于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至60℃，然后用以750ml“Toropearl 50s凝膠”裝填的柱進(jìn)行凝膠過濾層析，得到葡萄糖聚合度不同且DE值(淀粉糖中還原糖含量占干物質(zhì)的百分率)為12～20之間的還原性淀粉部分水解物。
分別將上述得到的還原性淀粉部分水解物作為底物溶于10mM醋酸緩沖液(pH5.5)制成1％溶液，然后將該溶液與純化的海藻糖基合成酶(以實(shí)施例2中方法制備)以4單位/g底物的量混合，并于75℃進(jìn)行酶反應(yīng)24小時(shí)。待酶的反應(yīng)完全后，用DNS還原糖比色法測(cè)定還原性淀粉部分水解物前后DE值的變化，結(jié)果如表3
表3
表3的結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的海藻糖基合成酶作用于DE值不同的淀粉部分水解物，在不改變其分子量的情況下能明顯將降低其DE值，說明海藻糖基合成酶有降低還原性淀粉部分水解物末端還原性的作用，生成含有非還原性淀粉糖的多糖組合物；該組合物具有爽口適中的甜味，較低的還原性及適宜的粘度和保濕性能，可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實(shí)施例6從葡萄糖聚合度為3或更高的麥芽寡糖制備海藻糖分別向作為底物的含10％麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖或麥芽七糖的水溶液中加入實(shí)施例2中獲得的2單位/g底物的海藻糖基合成酶和1單位/g底物的海藻糖基水解酶，將所得混合物于75℃和pH5.5下進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)；把得到的每種反應(yīng)混合物以“XT-1016(Na型)”裝填的柱進(jìn)行柱層析，之后回收含海藻糖的組份。將這些組份合并濃縮至約65％濃度，將該濃縮物于25℃放置2天使其結(jié)晶出水合結(jié)晶海藻糖，然后分離出這些結(jié)晶并真空下干燥得到純度為99％或更高的高純度海藻糖制品。用葡萄糖基海藻糖、麥芽糖基海藻糖為底物制備海藻糖的收率分別為9.5％、14.9％、16.0％、18.5％和17.7％。研究了高純度海藻糖制品和巾場(chǎng)上購得的海藻糖樣品(作標(biāo)準(zhǔn)品)的熔點(diǎn)、融化熱、比旋光、紅外吸收光譜、X-衍射圖譜及對(duì)海藻糖酶(Sigma產(chǎn)品)的水解作用的敏感度。結(jié)果，各種海藻糖制品顯示的熔點(diǎn)為97.6±0.5℃、融化熱為57.9±1.2KJ/mol和比旋光為+182±1.1°，與標(biāo)準(zhǔn)海藻樣品的數(shù)值十分吻合，此外這些海藻糖制品的紅外吸收光譜和X-衍射圖譜也與標(biāo)準(zhǔn)海藻樣品的十分吻合。與標(biāo)準(zhǔn)的海藻糖樣品相似，這些海藻糖制品很容易被海藻糖酶水解成為葡萄糖單體。
這些結(jié)果明確證實(shí)，由本發(fā)明的海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶作用于葡萄糖聚合度大于等于3的還原性淀粉糖，能形成海藻糖。
實(shí)施例7從還原性的淀粉部分水解物制備海藻糖經(jīng)加熱使含5％蠟狀玉米淀粉的懸浮液明膠化，調(diào)至pH5.5，加熱到50℃，與一種異淀粉酶(isoamylase)樣品以4,000單位/g淀粉的量混合，并使該酶反應(yīng)持續(xù)20小時(shí)。該反應(yīng)混合物于120℃高壓滅菌10分鐘，冷至60℃，然后用以750ml“Toropearl 50s凝膠”裝填的柱進(jìn)行凝膠過濾層析，得到葡萄糖聚合度為35～10的還原性淀粉部分水解物。
將上述得到的還原性淀粉部分水解物作為底物分別溶于10mM醋酸緩沖液(pH5.5)制成1％溶液，然后將該溶液與以實(shí)施例2中方法制備的4單位/g底物量的海藻糖基合成酶和一種純化的2單位/g底物量的海藻糖基水解酶混合，進(jìn)行酶反應(yīng)24小時(shí)。待酶反應(yīng)完全后，將得到的每種反應(yīng)混合物進(jìn)行脫鹽并經(jīng)HPLC分析其組成。表4顯示該結(jié)果。
表4
A本海藻糖基合成酶+海藻糖基水解酶B本海藻糖基介成酶+海藻糖基水解酶+葡萄淀粉酶如表4所示，在使用葡萄糖聚合度為3的麥芽三糖為底物的情況下，本海藻糖基合成酶反應(yīng)后的收率比較低，為4.3％，但在使用葡萄糖聚合度為10-35的淀粉部分水解物為底物的情況下，該海藻糖的收率比較高，即67.4-80.4％。并發(fā)現(xiàn)還原性淀粉部分水解物的葡萄糖聚合度越高，所得海藻糖的純度也越高。還發(fā)現(xiàn)通過使葡萄淀粉酶作用于由兩種酶水解還原性淀粉部分水解物制得的反應(yīng)混合物，將伴生的具有海藻糖末端且葡萄糖聚合度為3或大于3的非還原性淀粉糖水解成海藻糖和葡萄糖分子，能提高所得海藻糖的濃度。
實(shí)施例8美拉德反應(yīng)將1％甘氨酸、10％高純度海藻糖(純度為99.5％，通過實(shí)施例6的方法獲得)溶于50mM磷酸緩沖液中(pH7.0)，于100℃保存90分鐘，然后冷卻該溶液并測(cè)定它在480nm波長處的光吸收。以同樣處理的葡萄糖和麥芽糖作為對(duì)照，結(jié)果見表5。
表5
該結(jié)果表明本發(fā)明的海藻糖制品經(jīng)美拉德反應(yīng)誘導(dǎo)后僅表現(xiàn)為較淺的顏色，其顏色程度僅為葡萄糖和麥芽糖的約0.3-0.5％。說明該海藻糖基本上不參與美拉德反應(yīng)，本發(fā)明的海藻糖是一種當(dāng)它們與氨基酸混合時(shí)，對(duì)氨基酸的破壞威脅性較小的一種糖。
實(shí)施例9由酵母菌MTH-8生產(chǎn)的海藻糖基合成酶及其性質(zhì)酵母菌MTH-8也被發(fā)明者證實(shí)能產(chǎn)生本發(fā)明的嗜酸耐酸海藻糖基合成酶。按實(shí)施例1的方法，將該菌株在發(fā)酵罐中28-31℃，pH6.0-8.0，誘導(dǎo)培養(yǎng)12-150小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，將培養(yǎng)物于4℃，5000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，分離成菌體細(xì)胞和上清液。將上清液用UF-膜濃縮成粗酶液，或者將菌體使細(xì)胞破碎離心得到的上清液為粗酶液，然后將該粗酶液按順序用“DEAE-Fast Flow”(一種陰離子交換劑)的陰離子交換柱上層析；用“Phenyl-Sepharose”(一種疏水樹脂)的疏水柱層析和“Sephacryl S-200”(一種凝膠過濾樹脂)的凝膠過濾層析進(jìn)行層析得到純化的酶制品，然后研究它的性質(zhì)。酵母菌MTH-8的海藻糖基合成酶基本與大腸桿菌MTS-16相似。
下述實(shí)施例A描述了本發(fā)明海藻糖基合成酶的制備，用該酶制備的具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖、海藻糖及其相關(guān)糖組合物；實(shí)施例B描述了含一種或多種此類非還原性淀粉糖或海藻糖的組合物的制備。
實(shí)施例A-1按實(shí)施例1的方法，將大腸桿菌MTS-16的種子培養(yǎng)物接種到3L的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)6小時(shí)。發(fā)酵完后，將所得發(fā)酵液離心，分離成菌體細(xì)胞和上清液。用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時(shí)后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液，該溶液含8單位/ml的海藻糖基合成酶。
向作為底物的20％麥芽低聚糖水溶液中加入4單位/g底物的海藻糖基合成酶溶液，將所得混合物于75℃和pH5.5下進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)；將以上反應(yīng)混合物100℃加熱，使殘留的酶失活，過濾、脫色、脫鹽并濃縮得到一種濃的糖溶液，然后用“XT-1016(Na型)”對(duì)該溶液進(jìn)行柱層析。在柱層析中，用內(nèi)徑為2.0cm，長為1m的3個(gè)套層的不銹鋼柱裝填離子交換劑，然后將這些柱順序級(jí)聯(lián)并加熱至柱內(nèi)溫達(dá)55℃，將5v/v％濃糖溶液(對(duì)樹脂量)上樣，當(dāng)溫度保持在55℃，且在SV(體積速度)為0.13下用55℃熱水洗脫，得到較高純度的非還原麥芽低聚糖，該糖末端具有海藻糖結(jié)構(gòu)單元。在得到的制品中，葡萄糖基海藻糖、麥芽糖糖基海藻糖、麥芽三糖基海藻糖、麥芽四糖基海藻糖、麥芽五糖基海藻糖、麥芽六糖基海藻糖和少量其他的淀粉非還原性淀粉糖含量分別為14.6％、17.6％、22.3％、17.1％、12.2％、8.3％和7.9％.，它具有爽口適中的甜味，較低的還原性及適宜的粘度和保濕性能。由于這些性質(zhì)，它可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實(shí)施例A-2將酵母菌MTH-8的種子培養(yǎng)物接種到3L的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)24小時(shí)。發(fā)酵完后，用SF-膜濾去細(xì)胞得到約3L濾液，該濾液再用SF-膜濃縮至500mL酶溶液，在冰浴條件下用95％的乙醇進(jìn)行沉淀，離心分離出的蛋白沉淀用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新溶解并于70℃保溫半小時(shí)后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL 上清液為粗酶液，該溶液含8單位/ml的海藻糖基合成酶。
向作為底物的10％麥芽糊精水溶液中加入2單位/g底物的海藻糖基合成酶溶液，將所得混合物于75℃和pH5.5下進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)；將以上反應(yīng)混合物100℃加熱，使殘留的酶失活，過濾、脫色、脫鹽并濃縮得到一種濃的非還原性麥芽糊精溶液，并可根據(jù)需要，進(jìn)行真空干燥并粉碎得到它的固體粉末，該產(chǎn)品具有適度的甜味，非常低的還原性及適宜的粘度和保濕性能。由于這些性質(zhì)，它可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實(shí)施例A-3將大腸桿菌MTS-16的種子培養(yǎng)物接種到3L的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在5L發(fā)酵罐中培20小時(shí)。發(fā)酵完后，將所得發(fā)酵液離心，分離成菌體細(xì)胞和上清液。用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時(shí)后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液，該溶液含8單位/ml的海藻糖基合成酶。往15％的土豆淀粉懸浮液中加入碳酸鈣使其終濃度達(dá)0.1％，將所得溶液調(diào)至pH6.0，與0.2％的高溫α-淀粉酶樣品混合，接下來于95℃進(jìn)行酶反應(yīng)15分鐘，該反應(yīng)混合物在2kg/cm2壓力下高壓滅菌消毒30分鐘，冷卻至75℃，調(diào)pH至5.5，以1,000單位/g淀粉的普魯蘭酶與4單位/g上述海藻糖基合成酶溶液混合，接下來進(jìn)行48小時(shí)的酶反應(yīng)。如此得到的反應(yīng)混合物于100℃保持10分鐘，冷卻并過濾，所得濾液以常規(guī)方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化，之后再將得到的溶液濃縮得為72％糖漿，收率約為82％。
該糖漿含有123％葡萄糖基海藻糖、5.6％麥芽糖糖基海藻糖、28.3％麥芽三糖基海藻糖、2.1％麥芽四糖基海藻糖和3.2％麥芽五糖基海藻糖和少量的淀粉還原性糖，它具有適宜的甜味，較低的還原性及適宜保濕性能。由于這些性質(zhì)，它可任意用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
實(shí)施例A-4通過實(shí)施例A-1的方法得到的糖溶液為原料溶液，用以“XT-1016(Na型)”填裝層析柱分離。該過程如下用內(nèi)徑5.4cm的4個(gè)套層的不銹鋼柱裝填樹脂，將該柱順序級(jí)聯(lián)使得到的總凝交床深度為20m。將該柱加熱到柱內(nèi)溫度55℃，并在該溫度保持下，以5V/V％的糖溶液(對(duì)樹脂)上柱，用55℃熱水洗脫分離該糖溶液，以除去伴生的還原性糖，例如麥芽糖和麥芽三糖，之后收集密集具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖餾分。將得到的該組份合并、純化、濃縮、真空干燥并粉碎得到高濃度具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖組份，收率為約52％。
該產(chǎn)物中具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的濃度為約97％，且該產(chǎn)物具爽口適中的甜味，因此它可任意地用于食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、穩(wěn)定劑、賦形劑和填充劑。
實(shí)施例A-5將大腸桿菌MTS-16的種子培養(yǎng)物接種到3L的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，并在5L發(fā)酵罐中培養(yǎng)15小時(shí)。發(fā)酵完后，將所得發(fā)酵液離心，分離成菌體細(xì)胞和上清液。用100ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，在冰浴條件下超聲波破碎，直到菌體懸浮液變清亮為止；所得懸浮液于70℃保溫半小時(shí)后，11,000rpm下離心20分鐘得到約100mL上清液為粗酶液，該溶液含8單位/ml的海藻糖基合成酶。
往15％的綠豆淀粉懸浮液中加入碳酸鈣使其終濃度達(dá)0.1％，將所得溶液調(diào)至pH6.0，與0.2％的高溫α-淀粉酶樣品混合，接下來于95℃進(jìn)行酶反應(yīng)15分鐘，該反應(yīng)混合物在2kg/cm2壓力下高壓滅菌消毒30分鐘，冷卻至75℃，調(diào)pH至5.5，以1,000單位/g淀粉的普魯蘭酶與4單位/g淀粉的海藻糖基水解酶及4單位/g上述海藻糖基合成酶溶液混合，接下來進(jìn)行48小時(shí)的酶反應(yīng)。如此得到的反應(yīng)混合物于100℃保持10分鐘，冷卻并過濾，所得濾液以常規(guī)方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽并純化，之后再將得到的溶液濃縮得為60％糖漿，收率約為92％。
該糖漿含有71.2％海藻糖、2.4％葡萄基海藻糖、3.3％麥芽糖基海藻糖、0.7％葡葡糖、9.1％麥芽糖、12.1％麥芽三糖和1.2％的麥芽四糖和高級(jí)寡糖，它具有爽口適中的甜味，較低的還原性及適宜的粘度和保濕性能。由于這些性質(zhì)，它可任意地用于食品、化妝品和藥品中，作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、稀釋劑、填充劑和賦形劑。
通過實(shí)施例A-5的方法得到的糖溶液為原料溶液，用以“XT-1016”(Na型，4％的聚合度，一種堿金屬型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂)填裝層析柱分離。該過程如下用內(nèi)徑5.4cm的4個(gè)套層的不銹鋼柱裝填樹脂，將該柱順序級(jí)聯(lián)使得到的總凝交床深度為20m。將該柱加熱到柱內(nèi)溫度55℃，并在該溫度保持下，以5V/V％的糖溶液(對(duì)樹脂)上柱，用55℃熱水洗脫分離該糖溶液，以除去伴生的糖，例如麥芽糖和麥芽三糖，之后收集富集海藻糖的餾分。將得到的該組份合并、純化、濃縮、真空干燥并粉碎得到高濃度海藻糖粉，收率為約58％。
該產(chǎn)物中海藻糖的濃度為約97％，且該產(chǎn)物具爽口適中的甜味，因此它可任意地用于食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、賦形劑和填充劑。
實(shí)施例A-6通過實(shí)施例A-5方法得到的高濃度海藻糖溶液，用活性炭脫色，離子交換劑脫鹽，并濃縮成70％溶液，然后將該溶液放入結(jié)晶中，混入約2％水合海藻糖結(jié)晶作為晶種，再緩慢冷卻得到一糖膏，其結(jié)晶率約為45％。該糖漿經(jīng)高壓干燥噴霧，獲得海藻糖結(jié)晶粉末，并將其注入老化塔中老化干燥10小時(shí)使之完全結(jié)晶，獲得粉末狀結(jié)晶海藻糖，收率為90％。
該產(chǎn)物基本上不吸濕，便于保存，可作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、賦形劑和填充劑任意地用于食品、化妝品和藥品。
實(shí)施例A-7與實(shí)施例A-6相似，將實(shí)例A-5方法獲得的高濃度海藻糖溶液，置于蒸發(fā)器中，真空蒸發(fā)得到濕度約為3.0％的糖漿。將該糖漿放在結(jié)晶皿中，加入約1％的水合結(jié)晶海藻糖，于120℃下攪拌結(jié)晶5分鐘，將產(chǎn)物置于老化塔中，于100℃老化6小時(shí)得到塊狀物。
將所得塊狀物用粉碎機(jī)粉碎，并經(jīng)流化床干燥即得到粉狀水合結(jié)晶海藻糖(其濕度約為0.4％)，收率約為88％。該產(chǎn)物可任意作為食品、化妝品、藥品的干燥劑、甜味劑或填充劑使用。
實(shí)施例A-8將酵母菌MTH-8的種子培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐中誘導(dǎo)培養(yǎng)150小時(shí)。所得3L培養(yǎng)液于10,000rpm下離心20分鐘除去細(xì)胞，用UF-膜濃縮得到的上清液，得200mL酶溶液，它含有25單位/ml的海藻糖基合成酶。
將1份重的土豆淀粉與6份重的水和0.01份重的高溫α-淀粉酶混合攪拌，調(diào)至pH6.2并加熱至85～90℃使淀粉明膠化和液化。所得液態(tài)淀粉于120℃高壓滅菌10min使剩余的酶失活，冷至75℃，調(diào)pH至5.5，以500單位/g淀粉的異淀粉酶樣品混合，另與10單位/g淀粉的海藻糖基水解酶及上述酶溶液混合，然后進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)。待反應(yīng)完全后，于100℃將該反應(yīng)混合物加熱20min使剩余酶失活，調(diào)至50℃和pH5.0，以10單位/g淀粉量與葡萄糖淀粉酶混合，之后進(jìn)行酶反應(yīng)40小時(shí)，并加熱使剩余的酶失活。如此得到的反應(yīng)混合物以常規(guī)方法用活性炭脫色，用離子交換劑脫鹽并濃縮成約60％溶液，該溶液含78.3％的海藻糖。與實(shí)施例A-2的方法相同，只是使用CG6000(Na+型堿金屬型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂)作為離子交換劑，將濃縮的溶液進(jìn)行離子交換柱層析，得到高濃度海藻糖組份，它含有約95％的海藻糖。將所得組份濃縮到75％的濃度，置于一平面塑料容器中結(jié)晶，于室溫放置并老化3天，使結(jié)塊，然后將該塊狀物用粉碎機(jī)粉碎，得到粉狀水合結(jié)晶海藻糖，收率為約70％。
該產(chǎn)品基本上沒有吸濕性且易于保存，能任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實(shí)施例A-9按實(shí)施例1的方法，將大腸桿菌MTS-16的種子培養(yǎng)物接種到營養(yǎng)培養(yǎng)基上，在發(fā)酵器中培養(yǎng)20小時(shí)，3L培養(yǎng)液經(jīng)板框過濾分離得到菌體，用200ml醋酸緩沖液(pH5.5)重新懸浮菌體，用細(xì)胞破碎儀處理，所得混合物于10,000rpm下離心20min除去殘留物，上清液為粗酶液。該溶液含12.5單位/ml的海藻糖基合成酶。
33％的木薯淀粉懸浮液與碳酸鈣混合使其終濃度為0.1％，并調(diào)其pH至6.0，與0.3％α-淀粉酶混合，然后在95℃進(jìn)行酶反應(yīng)20min。所得反應(yīng)混合物在2kg/cm2壓力下高壓滅菌30min，冷卻至75℃。再以200單位/g淀粉量與異淀粉酶樣品混合，以0.2ml/g淀粉量與10單位/g淀粉的海藻糖基水解酶及上述酶溶液混合，之后75℃進(jìn)行酶反應(yīng)48小時(shí)。如此得到的反應(yīng)混合物于100℃保持20min，冷卻并過濾，得到濾液，該濾液以常規(guī)方法用活性炭脫色，用H-和OH-型離子交換劑脫鹽，再濃縮成60％糖漿，收率為約90％。
該產(chǎn)物含有60.1％海藻糖、1.4％葡糖基海藻糖、1.5％麥芽糖基海藻糖、1.0％葡萄糖、6.5％麥芽糖、8.3％麥芽三糖、21.2％麥芽四糖和高級(jí)寡糖，它具有爽口適中的甜味，還具有較低還原性和適當(dāng)?shù)谋裥阅?。由于這些因素，它可任意地用于各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中作為甜味劑、矯味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定劑、賦形劑、填充劑和稀釋劑。
實(shí)施例A-10將通過實(shí)施例A-5方法得到的95％純度的海藻糖溶液，以常規(guī)方法脫色和脫鹽。將所得溶液濃縮成75％溶液，然后將該溶液轉(zhuǎn)移到一結(jié)晶皿中，混入2％的水合結(jié)晶海藻糖作為晶種，加熱至50℃，攪拌下逐漸冷至25℃，用籃式離心分離出結(jié)晶。噴入少量水洗滌所得到純度為99％的高純度水合結(jié)晶海藻糖，收率為約50％。
實(shí)施例B-1甜味劑往通過實(shí)施例A-5方法得到的1份重的粉狀非還原性淀粉糖中加入0.01份重的天冬甜精和0.01份重的甜葉菊苷，將得到的混合物送入制粒機(jī)，得到粒狀甜味劑。該產(chǎn)品有令人滿意的甜味，且甜度為蔗糖的2倍，熱量值為蔗糖的2/5。由于該產(chǎn)品的低熱量且具有令人滿意的穩(wěn)定性，不會(huì)分解混入的其它甜味劑，非常適宜作為向肥胖者和糖尿病患者提供的低熱量食品的低熱量甜味劑。當(dāng)誘導(dǎo)齲齒的細(xì)菌作用于該產(chǎn)物時(shí)，它基本上不形成酸和不溶性的葡聚糖，因此可用作甜味劑而防止齲齒的產(chǎn)生。
實(shí)施例B-2硬糖果將100份重的55％蔗糖溶液與30份重的非還原性淀粉糖(通過實(shí)施例A-7方法得到)加熱混合，真空濃縮至濕度低于2％。向該濃溶液中加1份重的檸檬酸和足量的檸檬酸芳香劑和著色劑混勻后，用常規(guī)方法制成所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種高質(zhì)量的硬糖果，它具有令人滿意的味道和咀嚼特性，并且不用擔(dān)心會(huì)產(chǎn)生蔗糖結(jié)晶。
實(shí)施例B-3口香糖將3份基姆膠加熱至熔化變軟，之后與4份重的蔗糖和3份重的非還原性淀粉糖(通過實(shí)施例A-3方法得到的)混合，再與足量芳香劑和著色劑混合。用常規(guī)方法將所得混合物用輥揉制成型并包裝得所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種具有令人滿意的結(jié)構(gòu)和味道的口香糖。
實(shí)施例B-4甜濃縮牛奶將通過實(shí)施例A-1方法得到的三份重的非還原性淀粉糖漿和1份重的蔗糖溶于100份新鮮牛奶中，所得溶液經(jīng)平板加熱器加熱滅菌并濃縮成70％的濃度，隨后將得到的濃縮物無菌裝罐成所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品具有牛奶甜味和令人滿意的味道，這使它可任意地用在嬰兒食品、新生兒食品、水果、咖啡、可可和茶中作調(diào)料。
實(shí)施例B-5乳酸飲料將170份重的脫脂牛奶、130份重的非還原性淀粉糖漿(通過實(shí)施例A-1的方法得到)和50份重的高含量乳蔗糖粉(如日本專利公開No.281,795/9中所公開)溶于1150份重的水中。所得溶液于65℃滅菌30min，冷卻至40℃并接種30份重的乳酸菌作為起始物，于37℃培養(yǎng)8小時(shí)后得到所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種味道令人滿意的芳香的乳酸飲料。因?yàn)樵摦a(chǎn)品中含有寡糖，可以保持乳酸菌的穩(wěn)定并促進(jìn)雙歧菌的生長。
實(shí)施例B-6粉末果汁將33份重經(jīng)噴霧干燥得到的粉狀橘汁和50份重的高純度非還原性淀粉糖粉(通過實(shí)施例A-2方法制得)、10份重的蔗糖、0.65份重的無水檸檬酸、0.1份重的蘋果酸、0.1份重的L-抗壞血酸、0.1份重的檸檬酸鈉、0.5份重的支鏈淀粉和足量粉狀芳香劑混合均勻。將所得混合物粉碎并送入制粒機(jī)制粒，同時(shí)以作為粘合劑的海藻糖糖漿(通過實(shí)施例A-1方法得到)噴霧并用40℃空氣通風(fēng)。將獲得的粒狀物進(jìn)行稱重并包裝得所需產(chǎn)品。
該種含30％橘汁的產(chǎn)品能在較長時(shí)間內(nèi)保持其高品質(zhì)而不會(huì)產(chǎn)生異味。
實(shí)施例B-7牛奶蛋糊凍將100份重的玉米淀粉、100份重的非還原性淀粉糖漿(通過實(shí)施例A-7方法得到)、80份重的乳糖、20份重的蔗糖和1份重的鹽混合均勻后，再逐漸加入280份重的雞蛋和100份重的沸牛奶，并繼續(xù)加熱攪拌，當(dāng)混合物中淀粉完全明膠化時(shí)停止加熱，得到半透明物，然后冷卻該混合物并往其中加入足量香草香精。將所得混合物稱重并注裝得所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品表面光滑并具光澤，并有牛奶味和甜味。
實(shí)施例B-8豆沙醬用10份重的大豆為原料，以常規(guī)方法與水混合并煮沸，在去除豆的澀味和精糙感及水溶性雜質(zhì)后，往所得物中加入14份重的蔗糖、5份重的非還原性淀粉糖漿(通過實(shí)施例A-7方法得到)和4份重的水，并將所得混合物煮沸，與少量沙拉油混合并小心捏合到使豆不成糊狀。這樣，就制得了約35kg所需產(chǎn)品。
不因煮沸而褪色的該產(chǎn)品具有令人滿意的味道和香味，這使它可用作豆沙醬面包、豆沙醬包子、湯圓、豆沙醬薄脆餅、米糕和冰激凌的原料。
實(shí)施例B-9面包將100份重的麥粉、2份重的酵母、5份重的糖、1份重的粉狀非還原性淀粉糖(通過實(shí)施例A-3方法得到)、0.1份重的食用酵母粉混合后按一般方法加水捏合，于26℃發(fā)酵2小時(shí)，老化30分鐘并烤制。
該產(chǎn)品是一種高品質(zhì)的面包，具有令人滿意的顏色、甜度和松軟性。
實(shí)施例B-10火腿往1000份重的切成片的火腿肉中加入15份重的鹽和3份重的硝酸鉀并均勻磨碎，將該火腿肉片堆起并放在冷藏室過液。然后，將該火腿肉片先于冷藏在鹽溶液中浸泡7天，該鹽溶液含500份重的水、100份重的鹽、3份重的硝酸鉀、40份重的非還原性淀粉糖的粉末(通過實(shí)施例A-6方法制備)及足量胡椒，再以常規(guī)方法用冷水洗，掛起薰制，烹煮，冷卻包裝得所需產(chǎn)品。
該產(chǎn)品是一種高質(zhì)量的火腿，具有令人滿意的顏色、味道和芳香。
實(shí)施例B-11豆奶粉將1份重的豆奶與兩份重的非還原性淀粉糖粉末(通過實(shí)施例A-6的方法制備)混合，所得混合物放入塑料器皿中，于50℃真空干燥并粉碎得到粉末豆奶粉。
該產(chǎn)品具有令人滿意的味道和芳香，可任意地用作糖果，例如預(yù)混物、冰糕和冰激凌的原料，也用作口服或飼料喂形工的嬰兒食品和治療用營養(yǎng)品的原料。
實(shí)施例B-12粉末蛋黃用新鮮雞蛋制得的蛋黃，用平板加熱器于60～64℃滅菌，將1份重的所得液體與4份重的粉狀非還原性淀粉糖(通過實(shí)施例A-4得到)混合。并轉(zhuǎn)入-容器中，放置過夜使結(jié)塊，將這樣得到的塊狀物用粉碎機(jī)粉碎得到粉末蛋黃。
該產(chǎn)品可任意地用作糖果，例如預(yù)混物、冰激凌和乳制品的原料，還有口服或飼喂形式的嬰兒食品和治療用營養(yǎng)的原料。該產(chǎn)品也可用作皮膚護(hù)理劑和生發(fā)劑。
實(shí)施例B-13化妝霜按常規(guī)方法加熱溶解2份重的聚乙二醇單硬脂酸酯、5份重的單硬脂酸甘油酯(自身乳化的)、2份重的高純度非還原性淀粉糖粉(通過實(shí)施例A-2方法得到)、1份重的α-糖基蘆丁、1份重的液態(tài)凡士林、10份重的三-2-乙基環(huán)己酸甘油酯和足量抗菌劑。將所得溶液與2份重的L-乳酸、5份重的1，3-丁二醇和66份重的純化水混合，并用均化器乳化所得混合物，再在攪拌下混入足量香精，得到化妝霜。
該產(chǎn)品有較高穩(wěn)定性，可任意地用作高質(zhì)量防曬霜、皮膚護(hù)理劑和皮膚增白劑。
實(shí)施例B-14粉末人參提取物將半份重的人參提取物與1.5份重的粉狀無水結(jié)晶海藻糖(通過實(shí)施例A-4方法得到)混合，所得混合物轉(zhuǎn)入平面容器中，使之放置2天將無水結(jié)晶海藻糖轉(zhuǎn)化為水合結(jié)晶海藻糖，結(jié)塊。用粉碎機(jī)粉碎所得塊狀物，分份得到粉末人參提取物。該產(chǎn)物和足量維生素B1和B2裝入制粒機(jī)制得含維生素的粉末人參提取物。這樣得到的該產(chǎn)品可任意地用作滋補(bǔ)劑、疲勞恢復(fù)劑和強(qiáng)身劑。該產(chǎn)品也可用作生發(fā)劑。
實(shí)施例B-15固體藥品將天然的人α-干擾素制品用常規(guī)方法上固定有抗人α-干擾素抗體的柱以吸附α-干擾素，并將作為穩(wěn)定劑的一種含牛血清的緩沖液上柱，然后除去過量蛋白。此后，用含5％濃度的海藻糖(通過實(shí)施例A-2方法得到)的生理鹽水將α-干擾素從柱上洗脫下來，此時(shí)生理鹽水的pH發(fā)生變化。將所得洗脫液進(jìn)行膜過濾，濾液通過加入20倍體積的無水結(jié)晶麥芽糖粉，產(chǎn)物脫水后粉碎，并將所得粉末通過制片機(jī)制片，得到每片含約150單位天然人α-干擾素的藥片，每片重約200mg。
該產(chǎn)品可作為舌下片給患者口服，劑量為每人1-10片/天，并任意地用于治療病毒性疾病、變態(tài)反應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、糖尿病和腫瘤。更具體地，該產(chǎn)品適于用作治療AIDS和肝炎的藥劑，患有這類疾病的患者數(shù)顯著增加?；煸谠撝械暮Ｔ搴望溠刻亲鳛樘烊蝗甩?干擾素的穩(wěn)定劑，其活性在室溫下也能較長時(shí)間、較好地保持。
實(shí)施例B-16糖包衣片重150mg的未加工的片，用溶液進(jìn)行包衣直至片的總重達(dá)230mg，該包衣用溶液組成為40份重的粉狀水合結(jié)晶海藻糖(通過實(shí)施例A-3方法得到)、2份重的香草香精(平均分子量為200,000)、30份重的水、25份重的滑石粉和3份重的二氧化鈦；將所得片劑再用一種溶液包衣，該溶液組成為65份新鮮制備的相同的水合結(jié)晶海藻糖、1份重的香草香精和34份重的水，并用液態(tài)石蠟上光，得到具有令人滿意光澤和外觀的糖包衣片。
該產(chǎn)品有較高的貯存耐受性并能在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)保持其高質(zhì)量。
實(shí)施例B-17全營養(yǎng)素制備由下列組份組成的組合物500份重的的粉狀水合海藻糖結(jié)晶(通過實(shí)施例A-6的方法制備)、270份重的粉末蛋黃、209份重的脫脂牛奶、4.4份重的氯化鈉、1.8份重的氯化鉀、4份重的硫酸鎂、0.01份重的硫胺素、0.1份重的抗壞血酸鈉、0.6份重的維生素E和0.04份重的尼克酰胺。將該該合物以25g每等份裝入防潮的小袋并熱封制得所需產(chǎn)品。
將1袋該產(chǎn)品溶于約150～300ml的水制成流食，通過飼喂經(jīng)口或非胃腸道施用到鼻腔、胃或腸道，以補(bǔ)充機(jī)體能源。
實(shí)施例B-18超級(jí)營養(yǎng)液將通過實(shí)施例A-8方法制備的高純度水合結(jié)晶海藻糖和由下組份組成的氨基酸組合物攪拌下溶于水中，得到濃度分別為5w/v％和30w/v％的溶液，以常規(guī)方法將該水溶液進(jìn)行膜過濾除去熱原，無菌條件下裝入塑料瓶中，封口得所需產(chǎn)品。
氨基酸組合物的組成組份 mg/100mlL-異亮氨酸 180L-亮氨酸 410L-賴氨酸單鹽酸鹽 620
L-甲硫氨酸 240L-苯丙氨酸 290L-蘇氨酸180L-色氨酸60L-纈氨酸 200L-精氨酸鹽酸鹽 270L-組氨酸單鹽酸鹽 130甘氨酸 340雖然該產(chǎn)品是一種含有海藻糖和氨基酸的復(fù)合超級(jí)營養(yǎng)液，但它具有令人滿意的穩(wěn)定性，存放時(shí)基本不會(huì)發(fā)生變化，該產(chǎn)品可任意地用于向機(jī)體補(bǔ)充能源和氨基酸。
由上可見，當(dāng)本發(fā)明的海藻糖基合成酶單獨(dú)或聯(lián)合海藻糖基水解酶，作用于還原性淀粉部分水解產(chǎn)物時(shí)，它能以較高收率生產(chǎn)非還原性淀粉糖或海藻糖，所述非還原性淀粉糖具有海藻糖末端結(jié)構(gòu)。這樣得到的非還原性淀粉糖或海藻糖可被簡便地分離和純化，所得的非還原性淀粉糖、海藻糖和含有它們的糖組合物具有令人滿意的穩(wěn)定性及較高的質(zhì)量和中度甜味。當(dāng)口服未加工的產(chǎn)品或經(jīng)胃腸道施用輸液劑時(shí)，該非還原性淀粉糖和海藻糖可方便地被機(jī)體消化、吸收和利用。非還原性淀粉糖、海藻糖本身和含有它們的糖組合物可任意地用作各種組合物，例如食品、化妝品和藥品中的甜味劑、增質(zhì)劑、穩(wěn)定性、賦形劑和填充劑。
因此，本發(fā)明提供限一種工業(yè)規(guī)模制備具有海藻糖末端結(jié)構(gòu)的非還原性淀粉糖、海藻糖和含有它們的糖組合物的新技術(shù)，該技術(shù)以價(jià)廉和資源豐富的淀粉制備的淀粉部分水解產(chǎn)物為原料，具有較低成本。所以，本發(fā)明給許多領(lǐng)域帶來不可預(yù)測(cè)的巨大影響，這些領(lǐng)域包括如淀粉、酶和生化科學(xué)等，其它工業(yè)領(lǐng)域有食品、化妝品、藥品工業(yè)，及林業(yè)、漁業(yè)、農(nóng)業(yè)、家畜和化學(xué)工業(yè)。因此，本發(fā)明對(duì)這些領(lǐng)域有著深遠(yuǎn)而巨大的影響。
考慮到在此的描述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但很清楚其中可以進(jìn)行各種修改和補(bǔ)充。因此本發(fā)明既包含了符合本發(fā)明實(shí)質(zhì)精神和范圍內(nèi)的附屬權(quán)利要求，也包括了與此相關(guān)的所有此類修改和補(bǔ)充產(chǎn)生的權(quán)力要求。
權(quán)利要求
1.一種新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶，所述酶能在pH5.5，75℃條件下不需海藻糖為底物，而利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖，并具有下列物理化學(xué)特性(1) 作用不需海藻糖為底物，而利用還原性淀粉部分水解物，特異性高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。其中的還原性淀粉部分水解物，來自淀粉的部分水解，由三個(gè)或三個(gè)以上葡萄糖殘基組成。(2) 分子量在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)上約75,000到85,000道爾頓；(3) 等電點(diǎn)(PI)在用兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)電泳上約6.2到7.2；(4) 最佳溫度在pH5.5保存30分鐘時(shí)，60～80℃；(5) 最佳pH在65℃保存30分鐘時(shí)，5.0～6.0；(6) 熱穩(wěn)定性在pH5.5保存60分鐘時(shí)，可穩(wěn)定的溫度為約30～75℃；(7) pH穩(wěn)定性在25℃保存60分鐘時(shí)，可穩(wěn)定的pH為4.0～11.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，它是一種來自微生物的酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的酶，其中所述微生物是埃希氏菌屬大腸桿菌(EscherichiaColi)MTS-16，保藏號(hào)為CGMCC No 0600或酵母菌(Saccharomyces sp)MTH-8保藏號(hào)為CGMCC No 0525。
4.一種制備權(quán)利要求1的酶的方法，所述方法含有在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)能生產(chǎn)所述酶的微生物以形成所述的酶，并回收所得的酶；所述微生物為選自埃希氏菌屬、酵母菌的微生物。
5.一種制備具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的方法，包括(a)使權(quán)利要求1的酶作用于還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。其中的還原性淀粉部分水解物，來自淀粉的部分水解，由三個(gè)或三個(gè)以上葡萄糖殘基組成。(b)純化所得的非還原性淀粉糖。其中包括使步驟(a)中所得的非還原性淀粉糖溶液經(jīng)裝有強(qiáng)酸陽離子交換樹脂的柱進(jìn)行柱層析以純化該非還原性淀粉糖的步驟。
6.一種制備含海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖的多糖組合物的方法，包括(a)使權(quán)利要求1的酶作用于還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。(b)回收所得的帶有或不帶有其它多糖的具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。(c)將帶有或不帶有其它多糖的具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖摻入物質(zhì)構(gòu)成組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述的組合物是食品或化妝品或藥物。
8.一種制備海藻糖的方法，包拈(a)使權(quán)利要求1的酶與一種海藻糖基水解酶一起作用于還原性淀粉部分水解物以形成海藻糖溶液。其中的海藻糖基水解酶能特異性水解根據(jù)權(quán)利要求5的方法產(chǎn)生的非還原性淀粉糖中海藻糖部分和其余糖基部分之間的鍵，形成海藻糖。其中該步驟中還包括使淀粉脫支酶作用于還原性淀粉部分水解物，使葡萄糖淀粉酶作用于所得海藻糖溶液的步驟。(b)純化所得的海藻糖。其中還包括將步驟(a)中所得的海藻糖溶液經(jīng)裝有強(qiáng)酸陽離子交換樹脂的柱進(jìn)行柱層析以純化海藻糖并制成含水或無水的結(jié)晶海藻糖的步驟。
9.一種制備含海藻糖的多糖組合物的方法，包括(a)使權(quán)利要求1中的酶與一種海藻糖基水解酶一起作用于還原性淀粉部分水解物以形成海藻糖。(b)回收所得的帶有或不帶有其它多糖的海藻糖。(c)將帶有或不帶有其它多糖的海藻糖糖摻入物質(zhì)構(gòu)成組合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述的組合物是食品或化妝品或藥物。
全文摘要
本文公開的是一種新型嗜酸耐熱海藻糖基合成酶及其制備和用途，該酶從埃希氏菌屬、酵母屬的微生物中獲得，能夠在高溫酸性條件下不需海藻糖為底物，而利用還原性淀粉部分水解物，高效合成具有海藻糖結(jié)構(gòu)作為末端單元的非還原性淀粉糖。該酶分子量約75000到85000道爾頓；等電點(diǎn)約為6.2到7.2。該酶很容易通過微生物發(fā)酵大量制備，并用于工業(yè)化制備非還原性淀粉糖和海藻糖。該非還原性淀粉糖和海藻糖可廣泛地用于食品、化妝品和藥品組合物中。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1398966SQ0112352
公開日2003年2月26日 申請(qǐng)日期2001年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月27日
發(fā)明者吳襟 申請(qǐng)人:吳襟