專利名稱：一種基于基因芯片進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤藥物的篩選方法。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤是危害人類健康、導(dǎo)致死亡最為嚴(yán)重的疾病之一。在我國(guó)，每年約有90萬(wàn)腫瘤病人死亡，并且近年來死亡人數(shù)呈逐年遞增的趨勢(shì)。因此，世界各國(guó)都投入巨資研究開發(fā)抗腫瘤藥物。
盡管到目前為止已有數(shù)十種化療或輔助抗腫瘤藥物可以用于臨床治療，但大多數(shù)藥物只能使病情緩解，無法達(dá)到治愈的目的。尤其是大多數(shù)死亡率很高而又很常見的癌癥，如胃癌、食道癌、肺癌等仍缺乏有效的抗癌藥物。因此，迫切需要新的、具有明顯療效的抗癌藥物的研究和開發(fā)。
篩選模型和篩選技術(shù)是創(chuàng)新藥發(fā)展階段的主要環(huán)節(jié)。全世界每年新增可供篩選的合成化合物和從動(dòng)植物中提取的天然化合物數(shù)以萬(wàn)計(jì)，從中篩選藥物的主要障礙在于篩選通量、效率和成本。只有通過先進(jìn)的篩選模型與技術(shù)才能快速有效地發(fā)現(xiàn)具有特異性生物活性的后選藥物。其中主要包括分子、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞、離體器官及整體動(dòng)物等一系列篩選模型及篩選技術(shù)。目前臨床使用的大部分抗腫瘤藥物是通過體外細(xì)胞篩選系統(tǒng)、動(dòng)物體內(nèi)腫瘤模型或者近年發(fā)展起來的人腫瘤移植瘤篩選得到的。
隨著人類基因測(cè)序工作的大規(guī)模展開，使人類掌握了大量基因組信息，獲得人類疾病的相關(guān)基因。關(guān)鍵疾病基因的確定，為藥物作用提供了大量的新靶點(diǎn)。隨著分子腫瘤學(xué)、分子藥理學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，抗腫瘤藥物發(fā)揮作用的機(jī)理均通過影響腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)而進(jìn)一步引起細(xì)胞和瘤體表型的改變。藥物作用后細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)變化特征與細(xì)胞和瘤體表型改變呈現(xiàn)內(nèi)在規(guī)律，根據(jù)這種規(guī)律，可以在未觀察到細(xì)胞表型變化之前就推測(cè)藥物的作用機(jī)理。
藥物引發(fā)的基因表達(dá)變化非常復(fù)雜，呈現(xiàn)基因相互作用和調(diào)控后的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，根據(jù)個(gè)別基因的變化來推測(cè)藥物最終引起的表型變化往往有失偏頗。而通過觀察基因群的變化，雖復(fù)雜但能反映藥物作用的內(nèi)在規(guī)律。傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)均無法在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化，而基因表達(dá)譜芯片集成了成千上萬(wàn)種基因，因此使在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化成為可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法，在國(guó)內(nèi)外首次建立了基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選模型，使大規(guī)模、高通量篩選抗腫瘤藥物成為可能。
本發(fā)明的主要思路是1)將已知四大類細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物的藥物反應(yīng)基因和已知的腫瘤相關(guān)基因克隆，合并另外已有的待篩選基因作為待檢靶基因；2)選擇臨床使用的、作用機(jī)理較為明確的四大類細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中具有代表性的藥物作為工具藥物；3)選擇若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞株作為細(xì)胞模型；4)用上述工具藥分別作用各種細(xì)胞后，篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，然后用基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)藥物作用的早期反應(yīng)基因；5)應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類，得到藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因；6)依據(jù)藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因的變化規(guī)律驗(yàn)證2種化合物的抗瘤活性，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上加以確證。
本發(fā)明采用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞株是目前常用的腫瘤細(xì)胞株，它們可以是早幼細(xì)胞白血病HL-60、慢性髓細(xì)胞性白血病K-562、神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宮頸癌Hela等。
本發(fā)明采用四大類細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中已知具有代表性的、臨床有效的藥物，它們可以是甲氨喋呤、喜樹堿、鬼臼素、放線菌素D、紫杉醇、秋水仙堿和高三尖酯堿等。
用四唑氮鹽(MTT)比色法檢測(cè)抗腫瘤藥物對(duì)上述腫瘤細(xì)胞株的藥物細(xì)胞毒作用。處于快速增殖期的細(xì)胞(貼壁細(xì)胞用胰酶消化后)計(jì)數(shù)后接種于96孔酶標(biāo)板上(貼壁細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)24小時(shí))，加入藥物或無藥溶劑對(duì)照培養(yǎng)24小時(shí)后，加入MTT20ul的DMSO后避光，振蕩15分鐘后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定570nm波長(zhǎng)的OD值，五個(gè)復(fù)孔取平均值，按下式計(jì)算不同藥物作用下的腫瘤細(xì)胞的抑制率，采用曲線專家1.3將藥物濃度以抑制率畫圖并求出半抑制濃度值IC50。獲得敏感腫瘤細(xì)胞系藥物的IC50值(見圖1)。
抑制率(％)＝(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/對(duì)照組OD值×100用上述細(xì)胞藥物毒性實(shí)驗(yàn)獲得的藥物IC50濃度處理相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系，然后用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)藥物作用下基因表達(dá)水平變化。
腫瘤細(xì)胞用藥物相應(yīng)的IC50濃度或藥物溶劑對(duì)照處理0.5小時(shí)或1小時(shí)后，抽提細(xì)胞總RNA，再用OligotexmRNAMidi Kit純化mRNA。藥物及溶劑對(duì)照組mRNA分別用cDNA一鏈合成摻入熒光標(biāo)記dUTP(Cy 3-dUTP/Cy5-dUTP)的方法制備cDNA探針，混合后在密封倉(cāng)內(nèi)與表達(dá)譜芯片42℃雜交16小時(shí)。雜交結(jié)束后按BioDoor洗片技術(shù)進(jìn)行洗滌和晾干。再用ScanArray3000掃描芯片，用ImaGene軟件分析Cy3，Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值。每個(gè)芯片雜交重復(fù)三次。
三次芯片雜交所得的Cy3/Cy5比值取均值后，均值大于等于2或小于等0.5標(biāo)準(zhǔn)作為判定藥物作用下腫瘤細(xì)胞系基因表達(dá)差異標(biāo)準(zhǔn)，把所有差異表達(dá)的基因定為藥物反應(yīng)基因。用自編軟件聚類分析藥物反應(yīng)基因，篩選確定藥物篩選共用標(biāo)志基因(Common Marker Genes，CMG)以及特異性腫瘤基因(Specific Tumor Genes，STG)。
藥物篩選共同標(biāo)志基因分成3級(jí)I級(jí)CMG為對(duì)7個(gè)藥物的共同反應(yīng)基因；II級(jí)CMG為對(duì)6個(gè)藥物的共同反應(yīng)基因；III級(jí)CMG為對(duì)5個(gè)藥物的共同反應(yīng)基因。
特異性腫瘤基因(STG)為各個(gè)腫瘤細(xì)胞系所特有的藥物反應(yīng)基因。
在計(jì)算機(jī)輔助下運(yùn)用聚類分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所得藥物反應(yīng)基因進(jìn)行分析，得到一定數(shù)量的抗腫瘤藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因。將這些抗腫瘤藥物標(biāo)志基因和特異性腫瘤基因進(jìn)行基因芯片制作，制備成抗腫瘤藥物篩選芯片。
用鬼臼素分別處理藥物敏感細(xì)胞系，各個(gè)細(xì)胞株可以分別抽提mRNA，然后等量RNA混合后進(jìn)行芯片雜交。也可用鬼臼素分別處理了藥物敏感細(xì)胞系后合并所有細(xì)胞同時(shí)抽提mRNA，再進(jìn)行芯片雜交。
另外，本發(fā)明的發(fā)明人還利用表達(dá)譜芯片檢測(cè)了非IC50濃度的細(xì)胞毒抗腫瘤藥物處理藥物敏感細(xì)胞株的藥物反應(yīng)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，非IC50濃度的藥物出來不會(huì)影響芯片對(duì)藥物的顯性篩選結(jié)果。因此在實(shí)際篩選中，可以選擇較高的藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞刺激。
為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗腫瘤藥物基因芯片技術(shù)的可行性，本發(fā)明的發(fā)明人還采用雙盲法，利用腫瘤細(xì)胞株用抗腫瘤藥物篩選芯片篩選了兩個(gè)樣品，然后用細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效藥物的抗腫瘤作用瘤譜。
基因表達(dá)譜芯片集成了成千上萬(wàn)種基因，使在同一時(shí)間內(nèi)分析大量的基因表達(dá)變化成為可能，克服了傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)的缺陷。因此，本發(fā)明的利用基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法具有更高的篩選效率，并且可以在基因調(diào)控水平上部分闡明藥物的作用機(jī)理，為大規(guī)模、高通量篩選腫瘤藥物提供了技術(shù)手段，同時(shí)也為篩選其他類型的藥物提供了理論依據(jù)和技術(shù)思路。


附圖1 抗腫瘤藥物對(duì)8種腫瘤細(xì)胞系半數(shù)抑制濃度IC50附圖2 腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤藥物反應(yīng)基因的表達(dá)水平具體實(shí)施方式
實(shí)施例1 腫瘤藥物標(biāo)志基因和特異性基因的篩選將已知四大類細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物的藥物反應(yīng)基因和已知的腫瘤相關(guān)基因克隆，合并另外已有的12000余種基因作為待檢靶基因。
使用7個(gè)代表性藥物作為工具藥物，它們分別是甲氨喋呤、喜樹堿、鬼臼素、放線菌素D、紫杉醇、秋水仙堿和高三尖酯堿。
選擇8種常用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞株作為細(xì)胞模型，它們分別是早幼細(xì)胞白血病HL-60、慢性髓細(xì)胞性白血病K-562、神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH、肝癌QGY-7703、胃腺癌SGC7903、乳腺癌Bcap-37、卵巢癌H08910和宮頸癌Hela。
用四唑氮鹽(MTT)比色法檢測(cè)了7種臨床有效的抗腫瘤藥物對(duì)8株腫瘤細(xì)胞系的藥物細(xì)胞毒作用，得到敏感腫瘤細(xì)胞系藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)32個(gè)，結(jié)果見圖1。
用上述細(xì)胞藥物毒性實(shí)驗(yàn)獲得的藥物IC50濃度處理相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系，然后用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)藥物作用下基因表達(dá)水平變化，結(jié)果見圖2。
在計(jì)算機(jī)輔助下運(yùn)用聚類分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)所得藥物反應(yīng)基因進(jìn)行分析，得到569個(gè)抗腫瘤藥物標(biāo)志基因和50個(gè)特異性腫瘤基因。將這些569個(gè)抗腫瘤藥物標(biāo)志基因和50個(gè)特異性腫瘤基因進(jìn)行基因芯片制作，制備成抗腫瘤藥物篩選芯片。
其中，I類抗腫瘤標(biāo)志基因?yàn)?4個(gè)；II類抗腫瘤標(biāo)志基因?yàn)?60個(gè)；III類抗腫瘤標(biāo)志基因?yàn)?75個(gè)。神經(jīng)母細(xì)胞瘤特異性基因6條；人急性早幼粒白血病細(xì)胞特異性基因4條；慢性髓細(xì)胞性白血病特異性基因4條；肝細(xì)胞特異性基因4條；胃腺癌特異性基因9條；乳腺癌特異性基因4條；卵巢癌特異性基因9條和宮頸癌細(xì)胞特異性基因13條。
I級(jí)抗腫瘤標(biāo)志基因?yàn)樗幬锩舾屑?xì)胞株對(duì)7類藥物的共同反應(yīng)基因。在得到的34個(gè)I類抗腫瘤標(biāo)志基因中，33條基因在抗腫瘤藥物作用下表達(dá)下調(diào)，僅一條表達(dá)上調(diào)。
表達(dá)下調(diào)的為長(zhǎng)插入元件反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)坐因子(LINE RETROTRANSPOSABLE 1；LRE1)，是哺乳動(dòng)物基因組中高度保守序列，與基因組進(jìn)化、染色體異常密切相關(guān)，并且參加凋亡早期的DNA片段化形成。在本實(shí)驗(yàn)中其表達(dá)上調(diào)可能與化療造成的染色體不穩(wěn)定和凋亡有關(guān)。
其余的33條基因在抗腫瘤藥物作用下均表達(dá)下調(diào)，根據(jù)文獻(xiàn)分析其功能涉及能量代謝、蛋白質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和腫瘤相關(guān)等五個(gè)方面。實(shí)施例2 兩種混合法的比較本發(fā)明的發(fā)明人摸索了鬼臼素分別處理7株藥物敏感腫瘤細(xì)胞系，各個(gè)細(xì)胞系分別抽提mRNA，然后等量RNA混合后芯片雜交的方法，以及鬼臼素分別處理7株敏感細(xì)胞系后合并所有細(xì)胞同時(shí)抽提mRNA，再進(jìn)行芯片雜交的方法。
把這兩種方法與多種細(xì)胞系同步單獨(dú)處理方法相比較，其結(jié)果表明，用RNA混合或細(xì)胞混合后再提取RNA的方法仍能反映藥物作用后基因表達(dá)的特征變化規(guī)律。因此作為一種優(yōu)選方式，將細(xì)胞混合后再提取RNA的方法更為快捷、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)。實(shí)施例3 IC50的濃度處理的比較在建立抗腫瘤藥物基因芯片的技術(shù)路線中，本發(fā)明的發(fā)明人采用了IC50的藥物處理濃度。而如果應(yīng)用抗腫瘤藥物篩選芯片直接篩選未知藥物，我們將面對(duì)藥效以及半數(shù)抑制濃度未知的狀況。因此，我們用表達(dá)譜芯片檢測(cè)了非IC50濃度(450μl)的鬼臼素處理7株藥物敏感細(xì)胞株的藥物反應(yīng)基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，非IC50濃度的藥物處理不會(huì)影響芯片對(duì)藥物的顯性篩選結(jié)果。因此，在實(shí)際藥物篩選中可以選擇較高的藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞刺激，使本方法具有經(jīng)濟(jì)方便快捷的特點(diǎn)。實(shí)施例4 雙盲法抗腫瘤藥物的篩選采用雙盲法利用8種腫瘤細(xì)胞株用抗腫瘤藥物篩選芯片篩選了兩個(gè)樣品，然后用細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證有效藥物的抗腫瘤作用瘤譜。
化合物1(128mol/l)和化合物2(128mol/l)分別刺激8種腫瘤細(xì)胞系后，進(jìn)行基因芯片的雜交，結(jié)果表明，化合物2作用下，抗腫瘤藥物標(biāo)志基因和瘤譜基因表達(dá)變化，說明化合物2具有抗瘤活性，對(duì)SK-N-SH、Hela、SGC7901、HL-60和H08910有效。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，化合物2呈濃度依賴抑制上述細(xì)胞系生長(zhǎng)，對(duì)K562細(xì)胞生長(zhǎng)也有抑制作用，對(duì)Bcap37GY7703細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用則較弱。
化合物1作用下，藥物標(biāo)志基因和瘤譜基因表達(dá)無變化，表明該化合物無抗瘤活性。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明，化合物1對(duì)8種細(xì)胞生長(zhǎng)無抑制作用。
解盲結(jié)果揭示，化合物1為乙醇(藥物溶劑)，化合物2為鬼臼乙叉苷(鬼臼素類似物)。
權(quán)利要求
1.一種抗腫瘤藥物的篩選方法，其特征在于，它包括以下步驟1)使用若干細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物作為工具藥物，使用若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞系作為細(xì)胞模型，獲得腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性參數(shù)；2)用上述工具藥分別作用各種細(xì)胞后，篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，抽提mRNA，與表達(dá)譜芯片雜交，檢測(cè)藥物作用的早期反應(yīng)基因；3)應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類，得到藥物標(biāo)志基因和特異性瘤譜基因。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所使用的工具藥物是已知四大類細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中臨床使用的、作用機(jī)理較為明確的的藥物。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用四唑氮鹽比色法檢測(cè)工具藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞系的藥物細(xì)胞毒作用，得到敏感腫瘤細(xì)胞系藥物半數(shù)抑制濃度，刺激相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞系。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還可選擇高于半數(shù)抑制濃度的藥物濃度進(jìn)行細(xì)胞刺激。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多種細(xì)胞系同步藥物處理后分別抽提mRNA，然后等量混合后與表達(dá)譜芯片雜交。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可采用多種細(xì)胞系同步藥物處理后合并所有細(xì)胞，然后抽提mRNA，與表達(dá)譜芯片雜交。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，采用聚類分析方法對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可應(yīng)用雙盲法，在基因芯片和細(xì)胞水平上二級(jí)驗(yàn)證基于基因芯片的藥物篩選模型進(jìn)行抗腫瘤藥物篩選的準(zhǔn)確性。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于基因芯片的抗腫瘤藥物篩選方法，它包括步驟1)使用若干細(xì)胞毒抗腫瘤藥物中代表性藥物作為工具藥物，使用若干種常用的篩選抗腫瘤藥物的細(xì)胞系作為細(xì)胞模型，獲得腫瘤細(xì)胞的藥物敏感性參數(shù)；2)用上述工具藥分別作用各種細(xì)胞后，篩選出各工具藥物相應(yīng)的敏感細(xì)胞系，抽提mRNA，與表達(dá)譜芯片雜交，檢測(cè)藥物作用的早期反應(yīng)基因；3)應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析軟件對(duì)藥物反應(yīng)基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分類，得到藥物標(biāo)志基因和特異性瘤譜基因。該方法具有更高的抗腫瘤藥物篩選效率，并且可以在基因調(diào)控水平上部分闡明藥物的作用機(jī)理，為大規(guī)模、高通量篩選腫瘤藥物提供了技術(shù)手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1408883SQ0112694
公開日2003年4月9日 申請(qǐng)日期2001年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月30日
發(fā)明者毛裕民, 謝毅, 張俊平, 應(yīng)康, 郭學(xué)青, 陳哨輝, 陳穎 申請(qǐng)人:上海博德基因開發(fā)有限公司