專(zhuān)利名稱(chēng)：核酸靶分子選擇及擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種核酸靶分子選擇及擴(kuò)增方法。
遺傳診斷或分子檢測(cè)的基本方法是測(cè)定核酸序列的堿基組成或變化。核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸的基本單位是核苷酸，它們通過(guò)磷酸二脂鍵連成鏈狀結(jié)構(gòu)，核苷酸的特征決定于其堿基，DNA中的四種堿基由A、C、G、T表示，RNA中的四種堿基為A、C、G、U。核酸中的堿基A與T(或U)配對(duì)(互補(bǔ))，G與C配對(duì)(互補(bǔ))，因?yàn)樗鼈冎g能形成穩(wěn)定的氫鍵結(jié)構(gòu)。有連續(xù)配對(duì)堿基的兩條核酸鏈能結(jié)合(雜交)成雙鏈結(jié)構(gòu)，雙鏈核酸結(jié)構(gòu)在高溫(90℃-100℃)下會(huì)分裂(變性)成單鏈核酸分子。核酸中的自然產(chǎn)堿基或核苷酸可被非自然產(chǎn)的類(lèi)堿基或非自然核苷酸取代。非自然核苷酸包括雙脫氧核苷酸(ddNTP)、雙環(huán)核苷酸(LNA)、生物素標(biāo)記脫氧核苷酸(Biotin-dNTP)、熒光素標(biāo)記的雙脫氧核苷酸(F-ddNTP)及不具核苷酸結(jié)構(gòu)特征的分子鏈，含有由非典型磷酸二酯鍵組成的核酸包括肽鍵核酸(PNA)和硫代磷脂鍵脫氧核糖核酸(S-DNA)。含有非自然類(lèi)堿基或類(lèi)核苷酸的核酸可具有熒光性、高穩(wěn)定性、抗酶降解性，并能終止聚合酶反應(yīng)等。對(duì)核酸包括脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)，需把核酸樣品中的靶分子篩選出來(lái)并加以擴(kuò)增(復(fù)制出多個(gè)同一分子)。靶分子是須檢測(cè)的核酸片段，其結(jié)構(gòu)特征可以代表所屬生物體的遺傳特征。靶分子可以是DNA、RNA或是在體外由RNA轉(zhuǎn)錄成的DNA。篩選擴(kuò)增得到高純度的大量的靶分子后，用分子生物學(xué)技術(shù)可以測(cè)定靶分子的結(jié)構(gòu)特征，從而得知生物體(病人)的遺傳特征。目前，對(duì)核酸中的靶分子進(jìn)行選擇和擴(kuò)增采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。對(duì)一個(gè)雙鏈DNA靶分子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)時(shí)，要有二個(gè)對(duì)靶分子具專(zhuān)一性的、方向相反的單鏈核酸小分子，即引物。引物是由化學(xué)方法合成的單鏈的DNA分子，能與靶分子在末端進(jìn)行分子雜交，其長(zhǎng)度為10-50堿基。一個(gè)引物與靶分子中的一條分子鏈在3′末端進(jìn)行雜交，并在聚合酶的作用下有選擇性地復(fù)制靶分子，反復(fù)此過(guò)程可得到大量的靶分子?，F(xiàn)已經(jīng)知道，造成一種遺傳病的基因位點(diǎn)變化可以是不止一個(gè)，也就是說(shuō)要檢測(cè)一種或多種遺傳病時(shí)，所需選擇和擴(kuò)增的靶分子種數(shù)可達(dá)數(shù)百以上。所述的基因位點(diǎn)是指核酸結(jié)構(gòu)中特定的堿基位置或具多態(tài)性的堿基位置?；蚴呛怂峁δ苄缘膭澐只蚓咭欢üδ艿暮怂崞危咭欢ǖ慕Y(jié)構(gòu)特征。進(jìn)行分子檢測(cè)時(shí)，如用常規(guī)的PCR方法，需要合成大量的引物，并用大量的反應(yīng)分別對(duì)靶分子進(jìn)行選擇和擴(kuò)增。這種做法所需要的人力物力、費(fèi)用都很大。如把多個(gè)引物組合在一個(gè)PCR反應(yīng)中，這些引物之間的相互作用會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，因而影響靶分子的篩選和擴(kuò)增。另一種分子擴(kuò)增的方法是使雙鏈的DNA分子與啟動(dòng)子連接，然后用核糖核酸聚合酶把DNA轉(zhuǎn)錄成單鏈的核糖核酸(RNA)。用轉(zhuǎn)錄的方法可以把DNA分子平衡擴(kuò)增成大量的RNA分子，同時(shí)可對(duì)RNA進(jìn)行分子內(nèi)標(biāo)記，但轉(zhuǎn)錄方法的擴(kuò)增能力一般在數(shù)百倍左右，因此單用轉(zhuǎn)錄的方法也難以把極微量的核酸擴(kuò)增至可用的量。從生物體中提取的DNA分子一般為雙鏈的大分子結(jié)構(gòu)，由數(shù)千個(gè)以上的堿基單位組成。用物理方法如超聲波或生物化學(xué)方法如限制性?xún)?nèi)切酶，脫氧核糖核酸酶可使DNA降解為短小的分子片段，這一由大分子轉(zhuǎn)化為多個(gè)小分子的過(guò)程叫片段化。在適當(dāng)?shù)臈l件下連接酶可把多個(gè)DNA片段連接在一起達(dá)到末端延伸的目的，DNA分子片段也可在末端轉(zhuǎn)移酶的作用下使3′末端延伸，DNA聚合酶也可利用DNA鏈作為模板對(duì)與其雜交的分子鏈進(jìn)行3′末端的延伸，此外DNA外切酶還可以除去部分DNA分子序列，因此末端修飾包括末端切除和末端延伸。用聚合酶對(duì)專(zhuān)一引物進(jìn)行單堿基延伸是分析多態(tài)性的常用方法，經(jīng)末端修飾后可用數(shù)量較少的引物對(duì)多個(gè)靶分子進(jìn)行PCR擴(kuò)增，但這種擴(kuò)增缺少選擇性，現(xiàn)已知可用與靶分子互補(bǔ)的核酸分子即選擇分子進(jìn)行雜交，把雜交分子選出，然后進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可達(dá)到選擇的效果，但常用的選擇分子往往與靶分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)，這不利多態(tài)性靶分子的選擇，此外選擇分子本身也易被擴(kuò)增，可能造成假陽(yáng)性反應(yīng)。
本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)多個(gè)不同的核酸靶分子進(jìn)行選擇和擴(kuò)增的方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺點(diǎn)。
一種核酸靶分子選擇和擴(kuò)增的方法，包括使靶分子片段化并與選擇分子雜交，再對(duì)靶分子進(jìn)行末端修飾和擴(kuò)增，其特征是選擇分子具有非自然核苷酸單位，在選擇分子與靶分子形成的雜交序列中有部分單鏈結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)對(duì)大量的靶分子進(jìn)行選擇性修飾，然后用少量幾種通用引物對(duì)大量種類(lèi)的靶分子進(jìn)行擴(kuò)增，能簡(jiǎn)化分子檢測(cè)過(guò)程，節(jié)省人力物力，降低利用核酸進(jìn)行分子檢測(cè)的成本。用本方法對(duì)靶分子進(jìn)行擴(kuò)增后，靶分子的結(jié)構(gòu)特征可以通過(guò)雜交、序列測(cè)定、分子質(zhì)量、分子大小、電荷量、分子量比值等進(jìn)行測(cè)定，特別適用于生物芯片使用過(guò)程中的樣品制備。本方法可用于測(cè)定動(dòng)物、植物、微生物及病毒的基因型或其核酸量的多少。應(yīng)用本方法可以制造有商業(yè)價(jià)值的試劑盒或從事分子診斷服務(wù)。
下面通過(guò)實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。
對(duì)一病人DNA樣品中與遺傳病相關(guān)的1000個(gè)多態(tài)性靶分子片段進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增前把DNA提純，用限制性?xún)?nèi)切酶把DNA切成平均200堿基對(duì)的DNA分子片段，使這些分子片段變性成單鏈分子，然后與1000個(gè)選擇分子雜交。選擇分子為60堿基長(zhǎng)，它們的5′末端有40核酸單位與相應(yīng)的靶分子配對(duì)，但其第20位為缺少堿基的非自然核苷酸單位，并與靶分子的多態(tài)位點(diǎn)相對(duì)應(yīng)，其3′端的第20個(gè)核苷酸單位為一共同序列，不與靶分子配對(duì)。在雜交分子形成以后，用具3′→5′外切酶活性的DNA聚合酶對(duì)靶分子及選擇分子的3′末端進(jìn)行修飾，其結(jié)果使靶分子的3′末端通過(guò)復(fù)制在選擇分子的5′末端而延伸出一個(gè)共同序列，在選擇分子的3′末端復(fù)制出靶分子的5′末端。此后用連接酶在靶分子5′末端延伸出另一共同序列。在以上過(guò)程中，單鏈的非靶分子及多余的選擇分子被外切酶活性除去，經(jīng)修飾后的雜交分子兩端具有共同的序列，可用PCR進(jìn)行擴(kuò)增，由于選擇分子有去堿基位點(diǎn)，因而能篩選出具多態(tài)性的靶分子但本身不被PCR擴(kuò)增，所以擴(kuò)增后的產(chǎn)物可用于遺傳診斷。診斷前先對(duì)擴(kuò)增的靶分子進(jìn)行標(biāo)記，然后對(duì)其進(jìn)行基因芯片雜交分析，最后根據(jù)分析的結(jié)果推斷病人的遺傳特征。
本方法所用的靶分子分析方法包括單堿基延伸法、基因芯片方法、質(zhì)譜方法、電泳方法、熒光法或放射性方法。
本方法所用的選擇分子所含的非自然核苷酸單位為肽鍵核苷酸單位、硫代磷脂核苷酸單位、去堿基核苷酸單位以及不能形成堿基配對(duì)的類(lèi)核苷酸單位。
根據(jù)本方法原理可制成試劑盒，該試劑盒包括所述的選擇分子、PCR擴(kuò)增所用的引物、所需的酶及緩沖劑。
本方法可用于動(dòng)植物和微生物的核酸鑒定、包括物種鑒定、多態(tài)性測(cè)定，核酸分子數(shù)量測(cè)定，遺傳特征測(cè)定。
本方法所用的擴(kuò)增方法包括聚合酶反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及這些反應(yīng)的組合。
本方法所用的修飾反應(yīng)包括連接酶反應(yīng)，末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，外切酶反應(yīng)，聚合酶反應(yīng)及這些反應(yīng)的組合。
權(quán)利要求
1.一種核酸靶分子選擇和擴(kuò)增的方法，包括使靶分子片段化并與選擇分子雜交，再對(duì)靶分子進(jìn)行末端修飾和擴(kuò)增，其特征是選擇分子具有非自然核苷酸單位，在選擇分子與靶分子形成的雜交序列中有部分單鏈結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是所述的選擇分子所含的非自然核苷酸單位為肽鍵核苷酸單位、硫代磷脂核苷酸單位、去堿基核苷酸單位以及不能形成堿基配對(duì)的類(lèi)核苷酸單位。
全文摘要
一種核酸靶分子選擇和擴(kuò)增的方法,包括使靶分子片段化并與選擇分子雜交,再對(duì)靶分子進(jìn)行末端修飾和擴(kuò)增,其特征是選擇分子具有非自然核苷酸單位,在選擇分子與靶分子形成的雜交序列中有部分單鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能同時(shí)對(duì)大量的靶分子進(jìn)行選擇性修飾,然后用少量幾種通用引子對(duì)大量種類(lèi)的靶分子進(jìn)行擴(kuò)增,能簡(jiǎn)化分子檢測(cè)過(guò)程,節(jié)省人力物力,降低利用核酸進(jìn)行分子檢測(cè)的成本。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1344803SQ0112751
公開(kāi)日2002年4月17日 申請(qǐng)日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者吳昌, 吳明 申請(qǐng)人:吳昌, 吳明