專利名稱：固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶制備，尤其是殼聚糖微球體固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶的制備。
蚯蚓是世界環(huán)保動物。蚯蚓以“地龍”入藥已有悠久的歷史并沿用至今。已知蚯蚓體內(nèi)主要有效成分是幾種重要酶(系)蚯蚓血纖蛋白溶酶、蚯蚓血纖蛋白溶酶原激酶、蚯蚓膠原蛋白酶，它們協(xié)同作用，能有效地溶解血栓。廣泛用來治療血栓病、心血管疾病。具有穩(wěn)定性好，在體內(nèi)半衰期長，不易導(dǎo)致出血，而且價格便宜等特點。目前市售溶栓膠囊、地龍膠囊、“9·12”膠囊等只是蚯蚓凍干粉，未經(jīng)提取制備，在體內(nèi)療效低，易遭受酶、抑制劑等分解、破環(huán)和抑制，也不易進入病灶組織，同時具有免疫原性，易引起過敏等不適反應(yīng)。因此，開發(fā)新藥物、新劑型勢在必行。
酶應(yīng)用于臨床，必須在體內(nèi)半衰期長(即穩(wěn)定性高)；易于進入細胞(組織)；無免疫原性。對酶分子進行化學(xué)修飾和固定化是目前國內(nèi)外常用的方法。殼聚糖又稱脫乙酰甲殼質(zhì)，學(xué)名為聚-2-氨基-2-脫氧-D-β-1，4-葡萄糖，能溶于稀酸溶液形成凝膠；殼聚糖為陽離子天然高聚物，分子內(nèi)含有大量游離的氨基和羥基，具有良好的吸附作用，而且親水、無毒、生物相溶性好、易為生物降解，是酶的良好載體，而被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、食品等領(lǐng)域。
本發(fā)明的目的對蚯蚓血纖蛋白溶酶通過固定化處理，使處理后的蚯蚓血纖蛋白溶酶具有高效、廣效無毒、無副作用、無免疫原性、半衰期長、易進入細胞的新藥源。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的殼聚糖微球體的制備殼聚糖微球體為載體，吸附蚯蚓血纖蛋白溶酶(EFE)，再用戊二醛交聯(lián)，得固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶。
稱取一定量殼聚糖并溶于體積分?jǐn)?shù)為2％的醋酸溶液，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的殼聚糖酸性凝膠。在容器中加入一定量的透平油，攪拌下緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的殼聚糖酸性凝膠，攪拌15min，使凝膠均勻分散，然后滴加25％的戊二醛溶液，攪拌10min后，用1mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至9～10，于60～70℃水浴中保溫2-5小時，靜置冷卻后，棄去上層油液，依次用石油醚、丙酮、無水乙醇抽洗，除去透平油。真空干燥后，過篩(80目)，再用蒸餾水抽洗，真空干燥，即為殼聚糖微球體。
酶的固定化稱取殼聚糖微球體，用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液平衡、浸泡、抽干。加入蚯蚓血纖蛋白溶酶，10℃以下吸附完全，并不斷攪動。然后滴加0.6％戊二醛，使終濃度為0.5％。用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液洗去多余戊二醛，吸干，得產(chǎn)品。殼聚糖微球與蚯蚓血纖蛋白溶酶的比例為50-70∶1。
影響固定化效果的幾個因素1.給酶量隨著給酶量的增加，載體吸附的酶量增多，固定化酶活力增高。當(dāng)給酶量達到3.413mg酶/g載體(175.1U/ml)時，固定載體結(jié)合酶量已趨于飽和，但活力回收率卻已下降。結(jié)合固定化酶活力和固定化酶回收率兩方面的因素，給酶量為1.524mg酶/g載體(123.1U/ml)時固定化效果最佳，固定化酶活力達58.8U/g載體，酶的活力回收達57.3％。
2.吸附時間隨著吸附時間的延長，固定化酶的活力與活力回收率逐漸增加。當(dāng)吸附時間為10h，兩者達到最大，分別為60.8U/g和59.3％。當(dāng)吸附達到一定程度后開始飽和，既使時間再延長，吸附量也不再增加，而且隨著時間的延長，酶逐漸失活，導(dǎo)致固定化酶的活力與活力回收率下降。
3.吸附溫度溫度從0-20℃吸附時，固定化酶活力與活力回收率有逐步提高趨勢。吸附溫度在20℃時，固定化酶活力與活力回收率分別為62.83U/g和61.24％；20℃以后隨著溫度的上升，固定化酶活力與活力回收率逐步下降；在4-8℃時，固定化酶活力與活力回收率分別為61.36U/g和59.8％，比20℃時稍低，但吸附是一個放熱過程，當(dāng)超過一定溫度后，隨著溫度的升高，載體吸附的酶量下降，同時，溫度也影響吸附過程中酶分子的運動、酶活力和穩(wěn)定性的變化。溫度升高，酶分子的布朗運動加快，酶分子易從殼聚糖表面脫出；溫度過高，酶變性加劇。雖然吸附溫度在20℃時酶活力與活力回收率是最高的，但考慮上述之原因，在生產(chǎn)過程中選擇的最佳溫度為4-8℃。
3.戊二醛濃度當(dāng)戊二醛濃度為0.5％時，固定化酶活力與活力回收率達到最大，分別為60.12U/g和58.6％。這是由于戊二醛使吸附在載體表面的酶分子相互交聯(lián)，從而更牢固地將酶分子連接到載體上，不易脫落。但隨著戊二醛濃度進一步升高時，固定化酶活力與活力回收率都呈減少。這是因為戊二醛濃度過高，會使部分酶分子內(nèi)交聯(lián)，從而導(dǎo)致酶變性，活力下降。
4.戊二醛交聯(lián)時間隨著交聯(lián)時間的延長，固定化酶的活力與活力回收率逐漸上升。當(dāng)交聯(lián)時間為2h時，兩者達到最大，分別為59.3U/g和57.8％。之后隨著時間的延長，由于戊二醛自身締合，從而導(dǎo)致酶變性，活力下降。
5.戊二醛交聯(lián)溫度以0.5％戊二醛在不同溫度下交聯(lián)2h進行固定化。交聯(lián)溫度在4-8℃時，固定化酶的活力與活力回收率達到最大，分別為58.8U/g和56.8％。之后隨著交聯(lián)溫度升高，兩者開始下降，這是由于溫度升高，加快戊二醛的締合速度，從而影響固定化的效果。
固定化酶活力測定稱取0.1g酪蛋白，加入80ml 0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液小心加熱(60℃)溶解，再用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液定容至100ml，0.1g固定化酶，加入1ml 37℃預(yù)熱的酪蛋白溶液，37℃下，準(zhǔn)確保溫15min后，立即加入2ml 10％三氯乙酸溶液，靜置30min后，過濾，濾液于280nm波長測定光密度(A280nm)。原酶活力測定是用0.1ml酶液，其余過程同固定化酶的。以每10min增加0.01個A280nm單位的酶量為1個酶活力單位(U/g載體)。
固定化酶活力回收(％)＝固定化酶活力/原酶活力×100％蛋白質(zhì)含量測定按Bradford(1976)方法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶性質(zhì)固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶活力和活力回收分別為588U/g載體以上和57.2％以上。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶的Km(底物為酪蛋白)為0.21％，比原蚯蚓血纖蛋白溶酶降低2倍以上。說明它對底物的親和力比原蚯蚓血纖蛋白溶酶高2倍以上。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶的最適pH為8.6，比原蚯蚓血纖蛋白溶酶的pH8.2有所提高。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶在pH5.8～9.2范圍內(nèi)活力穩(wěn)定，這與原蚯蚓血纖蛋白溶酶較一致。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶在20-55℃間活力穩(wěn)定，這與原蚯蚓血纖蛋白溶酶一致。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶在室溫下存放2個月酶活力不變。
固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶在常溫下對血塊能完全溶解，這種溶解血塊能力較原蚯蚓血纖蛋白溶酶強。
本發(fā)明的優(yōu)點1.本發(fā)明采用的最基礎(chǔ)原料是蚯蚓，原料來源容易、價廉，并有利于帶動養(yǎng)殖蚯蚓業(yè)的發(fā)展，有利于我國扶貧工作的開展。
2.工藝簡易，生產(chǎn)設(shè)備投資少。
3.固定化酶比原酶的性質(zhì)有明顯的改善，對底物的親和力比原酶提高了2.05倍，其穩(wěn)定性也有所提高。
實例稱取0.5g殼聚糖并溶于體積分?jǐn)?shù)為2％的醋酸溶液，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的殼聚糖酸性凝膠。在燒杯中加入透平油，攪拌下緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的殼聚糖酸性凝膠，攪拌15min，使凝膠均勻分散，然后滴加25％的戊二醛溶液，攪拌10min后，用1mol/L的NaOH溶液將pH調(diào)至9～10，于60～70℃水浴中保溫3h，靜置冷卻后，棄去上層油液，依次用石油醚、丙酮、無水乙醇抽洗，真空干燥后，過篩(80目)，再用蒸餾水抽洗，真空干燥，即為殼聚糖微球體。
稱取0.5g殼聚糖微球體，用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液浸泡24h，加入1.27mg蛋白質(zhì)/ml的蚯蚓血纖蛋白溶酶6ml，置4-8℃下吸附10h，攪拌。然后在攪拌下滴加0.6％戊二醛(用pH8.0 0.1mol/L硼酸緩沖液配制)3ml，使戊二醛終濃度為0.5％。置4～8℃下交聯(lián)2h后，用pH7.8 0.1mol/L磷酸緩沖液洗去多余戊二醛。吸干，即制得殼聚糖微球固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶。
權(quán)利要求
1.固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶制備方法，其特征在于將1.27mg蛋白質(zhì)/ml的蚯蚓血纖蛋白溶酶加入于經(jīng)用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液平衡、浸泡的殼聚糖微球體中，在20℃以下吸附完全、攪拌，然后在攪拌下滴加0.6％戊二醛，使最終濃度為0.5％，用0.1mol/L pH7.8磷酸緩沖液洗去多余戊二醛，吸干，得產(chǎn)品，蚯蚓血纖蛋白溶酶與殼聚糖微球體的比例為50-70∶1(質(zhì)量比)。
2.根據(jù)權(quán)利要求書所說的固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶制備方法，其特征在于殼聚糖微球吸附蚯蚓血纖蛋白溶酶的最適宜溫度為4-8℃，最適宜的吸附時間為10小時。
全文摘要
本發(fā)明以殼聚糖微球為載體,吸附固定蚯蚓血纖蛋白溶酶。再用0.6%的戊二醛在4～8℃下交聯(lián)2h,所制得的固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶活力和活力回收率較高,分別588U/g載體和57.2%。固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶的活力比原蚯蚓血纖蛋白溶酶的性質(zhì)有明顯改善。固定化蚯蚓血纖蛋白溶酶對底物的親和力較原蚯蚓血纖蛋白溶酶提高了2.05倍,穩(wěn)定性也有提高。本發(fā)明具有原料來源易、價廉、投資少、工藝可行簡便。產(chǎn)品能在一定時間內(nèi)溶解血塊,為醫(yī)藥應(yīng)用提供了新藥物。
文檔編號C12N11/10GK1334342SQ01127750
公開日2002年2月6日 申請日期2001年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月20日
發(fā)明者高向陽, 徐鳳彩, 詹福建, 陳玉云 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)