專利名稱：用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種功能性食品配料的制備方法，具體說(shuō)是一種基于固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶法，以蔗糖為原料，工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖(低聚果糖)的方法。
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背景技術(shù)：
蔗果低聚糖(fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)，又稱低聚果糖，是由1～3個(gè)果糖基通過(guò)β(2→1)糖苷鍵與蔗糖(用符號(hào)G-F表示)中的果糖基(用符號(hào)F表示)結(jié)合而生成的蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)等一類的碳水化合物。FOS由于其具有優(yōu)異的生理學(xué)功能如促進(jìn)腸內(nèi)雙歧桿菌的生長(zhǎng)、預(yù)防蛀牙等而普遍地被用作為保健食品配料使用。FOS存在于洋蔥、香蕉等許多天然植物中，但含量很低。商品化的FOS首先被H.Hidaka于1988年用酶法生產(chǎn)開發(fā)成功，他從研究黑曲霉的果糖基轉(zhuǎn)移酶開始，然后成功地應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)FOS糖漿。果糖基轉(zhuǎn)移酶(fructosyltransferase，F(xiàn)Tase)，酶分類號(hào)為[EC、2、4、1、9]，能催化蔗糖(G-F)生成蔗果低聚糖，其酶促反應(yīng)機(jī)理可用下式表示。 上式中G-F--蔗糖，G-葡萄糖，F(xiàn)Tase-果糖基轉(zhuǎn)移酶，GF2--蔗果三糖，GF3--蔗果四糖，GF4-蔗果五糖。
目前國(guó)內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)FOS的現(xiàn)有技術(shù)只有液體深層發(fā)酵法，即用液體深層發(fā)酵法培養(yǎng)黑曲霉，這種微生物能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶，從培養(yǎng)液分離收集黑曲霉菌絲體后，不經(jīng)任何處理，直接投入蔗糖溶液中，使其轉(zhuǎn)化為FOS。該法的缺點(diǎn)是產(chǎn)酶菌絲體只能利用一次，在FOS生產(chǎn)過(guò)程中，由于菌絲體及其培養(yǎng)基成分的存在并參與反應(yīng)，使產(chǎn)品色度及鹽份過(guò)高，需要活性碳脫色和離子交換塔脫鹽等后處理工序，使整個(gè)工藝繁雜，成本提高。至于菌體細(xì)胞的代謝物就只能作為雜質(zhì)留在FOS產(chǎn)品中，無(wú)法除去，影晌產(chǎn)品質(zhì)量。
中國(guó)專利96106345.9公開了一種低聚果糖的制備方法，它包括采用能產(chǎn)生果糖基轉(zhuǎn)移酶的菌種Aspergillus niger，將此微生物培養(yǎng)后，收集活性菌絲體，加入蔗糖溶液，于40℃-60℃接觸反應(yīng)20-40小時(shí)，然后經(jīng)活性碳脫色，用陰陽(yáng)離子交換樹脂脫鹽，再過(guò)濾、濃縮、消毒、包裝，得到產(chǎn)品。但該專利所采用的方法也屬于液體深層發(fā)酵法，它是將培養(yǎng)產(chǎn)物包括菌絲體和培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)鹽一起投入反應(yīng)罐中，產(chǎn)酶菌絲體也只能利用一次，得到的產(chǎn)品色度大，含鹽分高，需要加入活性碳脫色和經(jīng)過(guò)陰離子樹脂和陽(yáng)離子樹脂脫鹽，工藝過(guò)程復(fù)雜，生產(chǎn)成本也較高。
此外，雖有其他方法生產(chǎn)FOS的報(bào)導(dǎo)，如固定化細(xì)胞法，共固定化生產(chǎn)高含量的FOS研究等，但至今仍停留在實(shí)驗(yàn)室研究和試驗(yàn)階段，未能用于我國(guó)工業(yè)化生產(chǎn)。其中固定化細(xì)胞法，即用海藻酸鈣凝膠將產(chǎn)酶菌體包埋起來(lái)的方法，與本發(fā)明的方法不同，日本已產(chǎn)業(yè)化，該法不足之處是對(duì)生產(chǎn)環(huán)境和條件要求苛刻(例如空氣凈化)，而且細(xì)胞代謝物殘留在產(chǎn)品中的問(wèn)題仍未能解決。至于共固定化法，指的是將葡萄糖氧化酶或葡萄糖異構(gòu)酶與菌體細(xì)胞共固定化，條件更復(fù)雜，難以控制，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)此尚有爭(zhēng)議，而且至今未能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)室研究了固定化酶法合成蔗果低聚糖的方法，在《食品與發(fā)酵工業(yè)》1995年第四期提出了用殼聚糖為載體和以戊二醛為固定化試劑，使果糖基轉(zhuǎn)移酶固定化，可多次使用，得到的蔗果低聚糖為透明的亮黃色，清香，蔗糖轉(zhuǎn)化率達(dá)90％左右，開創(chuàng)了固定化酶法合成蔗果低聚糖的新路。但由于某種原因，當(dāng)時(shí)該方法還沒(méi)有應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。
技術(shù)內(nèi)容為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明人經(jīng)過(guò)幾年的實(shí)驗(yàn)室研究和工業(yè)化實(shí)驗(yàn)，找到了一種固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)方法，以及利用該酶制劑以蔗糖為原料進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖(糖漿或干粉)的方法，該方法技術(shù)先進(jìn)，工藝簡(jiǎn)單，操作便利，生產(chǎn)成本低。
本發(fā)明的內(nèi)容包括固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的制備以及利用該酶制劑進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖的兩部分，其工藝過(guò)程如下1、菌株培養(yǎng)和固定化酶的制備選擇具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法等將酶分離純化，再用固定化試劑將酶固定下來(lái)。
上面所述的具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株經(jīng)本發(fā)明人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和篩選，有以下幾種可達(dá)到要求，它們是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)和短梗帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis_)。
上面所述的合適的培養(yǎng)基包括以下幾種物質(zhì)1～10％蔗糖，1～5％酵母提取物，0.1～0.3％NaNO3，1～5％玉米粉，其培養(yǎng)方法是在25～36℃，通氣量200～600ml/min，攪拌速度50～200r/min條件下，經(jīng)過(guò)20～60h，獲得大量菌絲體。
上面得到的菌絲體必須先進(jìn)行破壁，收集這些菌體細(xì)胞的胞內(nèi)酶，才獲得較好的果糖基轉(zhuǎn)移酶，所述的菌體破壁可用已知的方法，如機(jī)械破壁法，凍融法，超聲波破碎法，溶菌酶法等獲得果糖基轉(zhuǎn)移酶的粗酶，再用離心法和超濾法等將酶分離純化和濃縮。
上面所述的用試劑將酶固定化的方法采用化學(xué)偶聯(lián)法，用來(lái)固定酶的載體是天然有機(jī)高聚物，如交聯(lián)瓊脂糖凝膠，一定交聯(lián)度的葡聚糖凝膠，殼聚糖凝膠等；所用交聯(lián)劑為戊二醛。利用偶聯(lián)反應(yīng)可使果糖基轉(zhuǎn)移酶和載體之間以化學(xué)健聯(lián)接起來(lái)，達(dá)到固定化的目的。所用戊二醛濃度在0.05～0.3％，過(guò)低或過(guò)高都影響固定化效果。
固定化過(guò)程中，酶和載體的比例范圍是每克載體需酶20～160u，當(dāng)酶的用量＜20u/g載體時(shí)，固定化酶的酶活太低，酶促作用很難發(fā)揮出來(lái)，但當(dāng)酶活＞160u/g載體時(shí)，酶的固定化效率太低，部分呈游離酶狀態(tài)，使用一次后就流失掉。
固定化的條件是pH4～9，溫度10～60℃，攪拌速度20～100r/min。
固定化操作果糖基轉(zhuǎn)移酶酶液經(jīng)純化，濃縮后，用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定其酶活力，按一定的酶/載體比例，加入載體凝膠，混合，加入一定濃度的戊二醛溶液，在上述條件下，交聯(lián)反應(yīng)4～12h，充分洗滌，離心甩干，再成型和整型，可得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶，于0～5℃保存。
2、以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶法生產(chǎn)蔗果低聚糖(fructooligosaccharide，F(xiàn)OS)固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶法生產(chǎn)FOS過(guò)程可以采用以下兩者之一分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法。
(1)、分批反應(yīng)法在反應(yīng)罐中，加入22～65％(w/w)的蔗糖溶液，按每kg蔗糖(干)加入1000～4000U固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶量，控制反應(yīng)液在pH4.8～7.8，溫度在32～55℃，攪拌速度在50～200r/min的條件下，反應(yīng)12～48h調(diào)節(jié)固定化酶的數(shù)量、反應(yīng)液溫度和時(shí)間，可以獲得合乎要求的FOS產(chǎn)品。反應(yīng)完成后，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，可以分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)。
(2)、柱式反應(yīng)法將固定化酶裝入柱式反應(yīng)器中，以22～68％(w/w)的蔗糖溶液在pH4.8～7.8，溫度32～55℃下通過(guò)此反應(yīng)柱，調(diào)節(jié)固定化酶的活性和數(shù)量，蔗糖溶液的流量、溫度等，可以控制FOS成分達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)先進(jìn)，果糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)過(guò)固定化后，可以提高其利用率，采用分批反應(yīng)法時(shí)，可以反復(fù)使用70次以上。柱式反應(yīng)法，每公斤酶可以生產(chǎn)白利糖度(Brix)≥50的FOS糖漿1000kg以上，而且FOS產(chǎn)品不必經(jīng)過(guò)活性碳脫色，不需離子交換柱脫鹽，經(jīng)濃縮后可以獲得Brix≥75，固形物中總低聚糖≥50％的FOS糖漿，整個(gè)工藝簡(jiǎn)化，操作便利，生產(chǎn)成本明顯下降。


圖1為本發(fā)明菌株培養(yǎng)和固定化酶制備的工藝流程圖；圖2為本發(fā)明以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶法生產(chǎn)蔗果低聚糖的工藝流程圖。
圖1中，菌株接種斜面培養(yǎng)，再接種至搖瓶培養(yǎng)，繼而種子罐培養(yǎng)，接至工業(yè)發(fā)酵罐培養(yǎng)，過(guò)濾收集菌絲體，洗滌，破壁，收集游離酶液，純化濃縮后加入載體和固定化試劑，可獲得固定化酶。
圖2中，在分批反應(yīng)法條件下，于反應(yīng)罐中加入蔗糖和凈化水，按比例投入固定化酶，恒溫?cái)嚢璺磻?yīng)一定時(shí)間，放料，用粗濾網(wǎng)分離固定化酶，作下一批反應(yīng)用；濾液經(jīng)過(guò)濾和濃縮，滅菌包裝得FOS產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一1.固定化酶的制備選取米曲酶(Aspergillus oryzae)菌種接入含2％蔗糖，3％玉米粉，10％酵母提取物和0.2％NaNO3培養(yǎng)基的100升種子發(fā)酵罐中。于33℃發(fā)酵16h，得種子培養(yǎng)液。在3000升發(fā)酵罐中，加入培養(yǎng)基溶液，其中含7％蔗糖，2％酵母提取物，1.5％玉米粉和0.3％NaNO3，于120℃滅菌30min，加入種子培養(yǎng)液80升，在33℃，200r/min的條件下，培養(yǎng)30h，得含菌絲體的發(fā)酵液，經(jīng)離心機(jī)離心，分離收集菌絲體，洗滌，破壁，離心取酶液，超濾濃縮后得果糖基轉(zhuǎn)移酶酶液，經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按每400U酶液加入1.0克載體(干)的比例。在100升反應(yīng)罐中，加入300萬(wàn)U的酶液和7.5Kg的殼聚糖凝膠(干)，攪拌混勻加入戊二醛，使其終濃度為0.1％，在pH7.0，30℃下反應(yīng)10h，過(guò)濾取固態(tài)物，充分洗滌，離心甩干水分，成型，即得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑。
2.固定化酶法生產(chǎn)FOS在2M3的反應(yīng)罐中，加入50％(w/w)蔗糖溶液2000kg，加入固定化酶制劑200萬(wàn)(約50Kg)，在pH5.0～5.5，47～48℃，100r/min條件下，反應(yīng)12h，經(jīng)HPLC檢測(cè)，F(xiàn)OS產(chǎn)品合格后，放料，用60目篩網(wǎng)回收固定化酶，用板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾反應(yīng)液，經(jīng)真空濃縮機(jī)濃縮成Brix＝75的FOS糖漿。
實(shí)施例二1.固定化酶的制備黑曲霉(Aspergillus niger)菌種接入含5％蔗糖，3％玉米粉，1％酵母提取物和0.2％MgSO4培養(yǎng)基的100升種子罐中，32℃發(fā)酵14h，得種子培養(yǎng)液，在2000升發(fā)酵，加入含有8％蔗糖，2％玉米粉，2％酵母提取物和0.3％MgSO4的培養(yǎng)基溶液，120℃滅菌30min，加入種子培養(yǎng)液60升，在32℃，200min，通氣量1000L/min條件下，培養(yǎng)36h，得含菌絲體的發(fā)酵液，經(jīng)離心機(jī)離心分離，收集菌絲體，洗滌，破壁，離心取酶液，超濾濃縮后得果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶液，經(jīng)HPLC測(cè)定酶活力之后，按每500U酶液加入1.0克載體(干)的比例，在100升反應(yīng)罐，加入300萬(wàn)U的酶液和6Kg的交聯(lián)瓊脂糖凝膠(干)，攪拌混勻，加入戊二醛，使其終濃度為0.15％，在pH6.5，35℃下反應(yīng)15h，過(guò)濾取固態(tài)物，充分洗滌，離心甩干水分，成型，即得固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑。
2.固定化酶法生產(chǎn)FOS在1M3的反應(yīng)罐中，加入52％(w/w)蔗糖溶液1100Kg，加入固定化酶制劑80萬(wàn)u，(約20Kg)，在pH5.1～5.4，48～50℃，100r/min條件下，反應(yīng)20h，經(jīng)PHLC檢測(cè)FOS合格后，放料，用40網(wǎng)篩網(wǎng)回收固定化酶，用板框過(guò)濾機(jī)過(guò)濾反應(yīng)液，經(jīng)真空濃縮機(jī)濃縮成Brix＝75的FOS糖漿。
權(quán)利要求
1.一種用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖(低聚果糖)的方法，包括果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備以及利用該酶制劑進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖的兩部分，所說(shuō)的果糖基轉(zhuǎn)移酶的制備采用固定化工藝，其特征在于(1)、選擇具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁，用離心法和超濾法將酶分離純化，再用固定化工藝將酶固定下來(lái)(2)、用分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于選擇具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株是米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、海棗曲霉(Aspergillus phoenicis)和短梗帚霉(Scopulariopsis brevicaulis_)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的合適的培養(yǎng)基包括以下幾種物質(zhì)1～10％蔗糖，1～5％酵母提取物，0.1～0.3％NaNO3，1～5％玉米粉，其培養(yǎng)方法是在25～36℃，通氣量200～600ml/min，攪拌速度50～200r/min條件下培養(yǎng)20～60小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的菌絲體破壁方法采用機(jī)械破壁法或者凍融法，超聲波破碎法，溶菌酶法。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的用工藝酶將酶固定下來(lái)的方法采用化學(xué)偶聯(lián)法，用來(lái)固定酶的載體是天然有機(jī)高聚物一交聯(lián)瓊脂糖凝膠或者一定交聯(lián)度的葡聚糖凝膠、殼聚糖凝膠；所用交聯(lián)劑為戊二醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1和5所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于所述的固定化的條件是pH4～9，溫度10～60℃，攪拌速度20～100r/min，酶和載體的比例范圍是每克載體需酶20～160u，交聯(lián)劑戊二醛濃度為0.05～0.3％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖所采用的分批反應(yīng)法是在反應(yīng)罐中，加入22～65％(w/w)的蔗糖溶液，按每kg蔗糖(干)加入1000～4000U固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶的酶量，控制反應(yīng)液在pH4.8～7.8，溫度在32～55℃，攪拌速度在50～200r/min的條件下反應(yīng)12～48h，反應(yīng)完成后，用篩網(wǎng)過(guò)濾反應(yīng)液，分離回收固定化酶，用于下一批原料的生產(chǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖的方法，其特征在于以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖所采用的柱式反應(yīng)法是將固定化酶裝入柱中，以22～68％(w/w)的蔗糖溶液在pH4.8～7.8，溫度32～55℃下通過(guò)此柱。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種以蔗糖為原料,工業(yè)化生產(chǎn)蔗果低聚糖(低聚果糖)方法,它包括固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶制劑的工業(yè)化生產(chǎn)以及利用該酶制劑進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)FOS兩部分:一、選擇具有能分泌果糖基轉(zhuǎn)移酶的優(yōu)良菌株,在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),然后將培養(yǎng)得到的大量菌絲體進(jìn)行破壁,用離心法和超濾法將酶分離純化,再用試劑將酶固定下來(lái);二、分批反應(yīng)法或柱式反應(yīng)法以固定化果糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)蔗果低聚糖;采用本發(fā)明方法得到的蔗果低聚糖產(chǎn)品不必經(jīng)過(guò)活性碳脫色,不需離子交換柱脫鹽,可以獲得Brix≥75,固形物中總低聚糖≥50%的FOS糖漿,生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)化,操作便利,成本明顯下降。
文檔編號(hào)C12N11/00GK1335402SQ0112834
公開日2002年2月13日 申請(qǐng)日期2001年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月12日
發(fā)明者魏遠(yuǎn)安, 謝慶武, 姚評(píng)佳, 董毅宏, 梁錦添 申請(qǐng)人:廣西大學(xué), 廣西南寧奧立高食品生化有限公司