專利名稱：甜菜夜蛾核多角體病毒及其生物殺蟲劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exiguaMulti-nucleocapside Nucleopolyhedrovirus，SeMNPV)及其生物殺蟲劑，為從前未分離和鑒定過的昆蟲致病性病毒毒株，含有該毒株的生物殺蟲劑及其在害蟲防治中的用途。該病毒毒株已于2001年9月7日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其簡稱為CCTCC，保藏號為CCTCC No.V200107。
背景技術：
甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hbner)屬鱗翅目(Lepidoptera)，夜蛾科(Noctuidae)，雜夜蛾亞科(Amphypyninae)灰翅夜蛾屬(Spotera Guenee)，是一種世界性分布的農作物害蟲，在亞洲、美州、歐洲都有嚴重危害成災的記錄。
甜菜夜蛾是一種熱帶害蟲，但在低溫下也能繁殖，是一種廣溫性害蟲；它的食物適應能力很強，是一種雜食性害蟲，危害種類達170多種，從木本到草本、從農作物到藥材都可以危害。農作物中又以豆類、花生、蔬菜、玉米、棉花等的危害最為嚴重。
甜菜夜蛾的危害有如下特點來勢兇猛，蔓延迅速；蟲量大，危害嚴重；危害時間長，世代重疊嚴重；不同地域、不同作物危害差別大。
甜菜夜蛾在我國80年代以前尚屬偶發(fā)性害蟲，80年代以后甜菜夜蛾的危害地區(qū)逐漸擴大，尤以江淮、黃淮地區(qū)最為嚴重，成災頻率和程度也越來越高。以河南省為例，繼1997年甜菜夜蛾大爆發(fā)之后，1999年甜菜夜蛾再次猖獗，危害面積達200萬公頃，經濟損失巨大。
目前甜菜夜蛾的防治主要以有機磷、擬除蟲菊酯類化學農藥為主，這不但對環(huán)境和作物造成了嚴重的污染，而且防治效果并不理想。研究表明，甜菜夜蛾對有機磷、擬除蟲菊酯類化學農藥普遍存在較高的抗性。如危地馬拉的甜菜夜蛾品系對溴氰菊酯產生100倍的抗性，墨西哥的甜菜夜蛾品系對硫丹的抗性可達196150倍。再加上甜菜夜蛾具有很強的遷飛習性，這就大大增加了傳統(tǒng)方法防治甜菜夜蛾的難度。因此尋找更有效的防治方法已成為當務之急。桿狀病毒以其專一性強、不產生抗性、不污染環(huán)境和作物的特點越來越受到人們的青睞，用其進行甜菜夜蛾等害蟲的生物防治具有明顯的社會效益和經濟效益。
分離鑒定甜菜夜蛾病毒毒株是生產病毒殺蟲劑的前提。病毒一般應從自然界分離得到并對害蟲有較高的毒性。甜菜夜蛾核多角體病毒是一種昆蟲特異性DNA病毒，它屬于桿狀病毒科(Baculoviridae)。核多角體病毒是含有囊膜的病毒粒子被包裹于多角體蛋白質基質中，每個病毒粒子包含80～160kb的環(huán)狀雙鏈DNA基因組。按照每個囊膜中的病毒粒子數目，又可分為單粒包埋型核多角體病毒(Single-nucleocapside NPV，SNPV)和多粒包埋型核多角體病毒(Multi-nucleocapside NPV，MNPV)。
發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是在于提供一種甜菜夜蛾核多角體病毒。本發(fā)明還提供一種含有本發(fā)明病毒的甜菜夜蛾生物殺蟲劑。
為解決上述問題，本發(fā)明提供一種新分離的多粒包埋型甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua Multi-nucleocapsideNucleopolyhedrovirus，SeMNPV)毒株，它具有保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為V200107的樣品特征。
本發(fā)明的生物殺蟲劑包括有上述的甜菜夜蛾核多角體病毒構成。
本發(fā)明所提供的新的甜菜夜蛾核多角體病毒毒株可適于生產生物殺蟲劑，能有效防治蔬菜、水果、農作物上的甜菜夜蛾、苜蓿丫紋夜蛾(Autographa californica)等害蟲，并具有專一性強、不產生抗性和不污染環(huán)境和作物的特點。
圖1為本發(fā)明病毒的多角體切片顯微照片圖示。
具體實施例方式
以下進一步詳細說明本發(fā)明的病毒及其生物殺蟲劑。
分離與擴增本發(fā)明所述病毒于2000年從河南安陽某地發(fā)現的1只病毒致死的甜菜夜蛾幼蟲體內分離得到。將收集的蟲尸搗碎滴于飼料表面喂食甜菜夜蛾幼蟲來人工增殖該病毒。感染在27℃進行，重復上述過程擴增得到大量甜菜夜蛾病毒，儲藏與4℃冰箱中。
純化按上述方法在甜菜夜蛾幼蟲中增殖該病毒，幼蟲感染癥狀與典型的病毒感染癥狀一致體結腫脹發(fā)亮，體色變淡，表皮薄脆，一觸即破，流出乳白色濃液。
收集典型病毒感染病死蟲，搗碎，充分研磨，三層紗布過濾，差速離心(500rpm離心5分鐘，3000rpm離心30分鐘)兩次去除組織碎塊、細菌等雜質。沉淀用清水洗3次，丙酮洗滌一次去除脂類物質，0.5％SDS處理30分鐘，離心沉淀多角體，洗滌三次，沉淀用蒸餾水重懸，計數后冰箱保存?zhèn)溆谩?br>
該樣品保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號V200107。形態(tài)觀察多角體在光學顯微鏡下呈折光性較強的顆粒，能被伊紅染成粉紅色。電鏡下觀察多角體形態(tài)多樣，呈圓形、四邊形、五邊形等，其平均大小為1.45μm，病毒粒子為多粒包埋型，每個病毒囊膜中含一個至四個核衣殼。圖1顯示了本發(fā)明病毒的多角體切片顯微照片。切片制作過程為，將提純的多角體離心，5％戊二醛固定5小時，然后用1％鋨酸固定1～2小時，脫水，包埋，切片，染色后H-7000FA電鏡觀察。
生物測定生物測定是衡量病毒毒力高低的最重要的標準。取健康的二齡、三齡甜菜夜蛾進行生物測定，每個濃度60頭幼蟲，同時以清水喂食做對照。將甜菜夜蛾幼蟲飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲杯中，加入適量的人工飼料，并加100μl不同濃度的病毒感染液于人工飼料表面，使其充分吸收。幼蟲進食48小時后補加足量的人工飼料，27℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從第3天起逐日記錄。由結果可以看出該病毒具有較高的毒力，能有效殺滅甜菜夜蛾，適于進行甜菜夜蛾的防治。
表1甜菜夜蛾核多角體病毒對二齡、三齡甜菜夜蛾幼蟲的生物測定結果95％置信限(PIB/ml)蟲齡 回歸方程 LC50(PIB/ml) 相關系數下限 上限二齡 Y＝1.81x-3.726.60×1040.93 5.18×1048.93×104三齡 Y＝1.74X-4.442.62×1050.98 2.10×1053.28×105分子生物學鑒定取約109多角體加入1ml堿解液，37℃處理至溶液清亮，用0.5M的醋酸中和至PH7.0，加入終濃度為200μg/ml的蛋白酶K和1％的SDS，37℃處理5小時。再用酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提兩次，直至界面無可見蛋白質，透析48小時，然后加入限制性內切酶消化6小時，通過瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣品。
表2甜菜夜蛾核型多角體病毒限制性內切酶酶切電泳分析結果
殺蟲制劑該病毒通常以復配的方式制作成殺蟲劑用于害蟲防治。復配后劑型包括可濕性粉劑或油劑或水劑或病毒微膠囊懸浮液等。復配時通?？稍谥苿┲屑尤霛櫇駝?、分散劑以及保護病毒組份的紫外線吸收劑和抗氧化劑等。D.J Rhodes在D.G Jones編輯的1993年出版(Chapmant &Hall，London)的“Exploitation ofMicroorganisms(微生物開發(fā))”第411-439頁的“Formulation ofBiological Control Agents(生物防治劑制劑)”更全面地公開了作為生物殺蟲劑的核多角體病毒復配技術，可供參考。
權利要求
1.一種甜菜夜蛾核多角體病毒，其特征在于為一種新分離的多粒包埋型夜蛾核多角體病毒毒株(SeMNPV)，它具有保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為V200107的樣品特征。
2.一種甜菜夜蛾生物殺蟲劑，其特征在于所述的殺蟲劑包括有權利要求1所述的核多角體病毒構成。
3.按權利要求2所述的甜菜夜蛾生物殺蟲劑，其特征在于復配劑型包括可濕性粉劑或油劑或水劑或病毒微膠囊懸浮液。
4.按權利要求2或3所述的甜菜夜蛾生物殺蟲劑，其特征在于復配時制劑中加入有潤濕劑、分散劑以及保護病毒組份的紫外線吸收劑和抗氧化劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種甜菜夜蛾核多角體病毒(Spodoptera exigua Multi－nucleocapsideNucleopolyhedrovirus,SeMNPV)及其生物殺蟲劑,為從前未分離和鑒定過的昆蟲致病性病毒毒株,含有該毒株的生物殺蟲劑及其在害蟲防治中的用途。本發(fā)明所提供的新的甜菜夜蛾核多角體病毒毒株具有保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏號為V200107的樣品特征?？蛇m于生產生物殺蟲劑,能有效防治蔬菜、水果、農作物上的甜菜夜蛾、苜蓿丫紋夜蛾(Autographa califorica)等害蟲,并具有專一性強、不產生抗性和不污染環(huán)境和作物的特點。
文檔編號C12N7/01GK1346886SQ0112842
公開日2002年5月1日 申請日期2001年9月7日 優(yōu)先權日2001年9月7日
發(fā)明者張俊杰, 未榮杰, 張友清 申請人:武漢普洛森生物制劑有限公司