專利名稱：轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法
(一)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及采用基因工程技術(shù)，制備轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的方法。
(二)發(fā)明背景乙型肝炎病毒感染是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病，慢性乙型肝炎容易發(fā)展為肝硬化和肝癌。乙型肝炎感染率很高，據(jù)估計全世界約有3.5億人為乙型肝炎病毒慢性攜帶者。我國是乙型肝炎的高感染區(qū)，乙型肝炎病毒感染率為57.68％，乙型肝炎病毒慢性攜帶率為9.75％?？刂埔倚透窝讉魅镜闹饕侄问墙臃N疫苗。目前臨床上使用的疫苗主要由啤酒酵母表達(dá)的乙型肝炎表面抗原主蛋白顆粒組成，效果良好，對控制乙型肝炎傳播起到了巨大作用。但這種疫苗有一些不足之處。部分人群對疫苗存在不反應(yīng)或低反應(yīng)性，疫苗接種后可能產(chǎn)生逃逸突變。且疫苗價格高，難于在貧窮的發(fā)展中國家普遍推廣。因此開發(fā)效果好、使用方便而且價廉的疫苗，對于全球范圍內(nèi)控制乙型肝炎病毒傳播具有重要意義。
眾所周知，植物作為生產(chǎn)藥用蛋白的生物反應(yīng)器，為人類提供了一個更加安全和廉價的生產(chǎn)系統(tǒng)。與微生物發(fā)酵和轉(zhuǎn)基因動物等生產(chǎn)系統(tǒng)比較，它具有許多優(yōu)點1、一些微生物系統(tǒng)不能對真核生物蛋白進(jìn)行準(zhǔn)確的翻譯后加工和蛋白糖基化；大腸桿菌發(fā)酵過程常常產(chǎn)生一些不溶性聚合物，而將這些聚合物重新溶解并折疊成天然蛋白質(zhì)，難度極大；此外發(fā)酵常需要龐大的設(shè)備投資。2、動物細(xì)胞培育所需費用昂貴，用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)重組蛋白，可能會污染動物病毒，這對人類可能造成潛在威脅。植物病毒不會感染人類，故用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)重組蛋白更為安全。3、植物細(xì)胞培養(yǎng)不需要昂貴培養(yǎng)基和復(fù)雜的純化系統(tǒng)，也不需要嚴(yán)格無菌的生產(chǎn)條件和冷藏保存。
鹽藻(Dunaliella salina)，屬綠藻門團藻目多睫毛藻科。為單細(xì)胞真核生物，個體呈梨形或橢圓形，細(xì)胞體積50-1000μm3。具有2條長鞭毛，可自由游動。鹽藻細(xì)胞與其它一些單細(xì)胞真核藻類最大的不同點是它缺乏細(xì)胞壁，細(xì)胞外僅包被一薄層彈性漿膜。藻體內(nèi)有一杯狀葉綠體，內(nèi)含一個造粉核。藻體前端有一紅色眼點。其繁殖主要靠細(xì)胞縱裂的無性繁殖，有性生殖為同配接合。鹽藻是目前所知耐鹽性最強的單細(xì)胞真核生物，生長在海水或咸水湖等高鹽環(huán)境下。由于無細(xì)胞壁，可通過快速的細(xì)胞體積變化來適應(yīng)細(xì)胞外滲透壓的變化，因此對環(huán)境適應(yīng)性極強，可在低濃度(0.2％)和接近飽和的高濃度(35％)鹽水中生長。鹽藻具有很強的光合作用能力，能利用水和空氣中的二氧化碳在陽光照射下合成蛋白質(zhì)等多種有機物，因此鹽藻的養(yǎng)殖容易，成本低廉。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題而旨在研制一種轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法。將重組人HBsAg基因，通過目前國際上公認(rèn)較為成熟的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)(電激法，基因槍法等)導(dǎo)入鹽藻細(xì)胞中，使其表達(dá)，建立鹽藻生物反應(yīng)器，用來制備或生產(chǎn)人口服型乙型肝炎疫苗。
本發(fā)明的目的是通過以下方式來實現(xiàn)的本發(fā)明的轉(zhuǎn)HBsAg基因鹽藻的制備方法，是將編碼重組HBsAg蛋白的DNA序列和含有特定的篩選標(biāo)記基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將它們導(dǎo)入鹽藻，通過繼代選擇培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)HBsAg基因鹽藻藻株，供制備乙型肝炎口服疫苗使用。
該方法包括編碼重組HBsAg蛋白基因的CtxB-SS1融合基因的構(gòu)建和鹽藻表達(dá)載體構(gòu)建。重組乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白基因包括乙型肝炎病毒S基因、PreS1基因和PreS2基因的全部或部分序列及其組合。SS1基因是指S基因和PreS1基因部分序列的融合；CtxB-SS1融合基因是指霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)和SS1基因的融合。該CtxB-SS1融合基因的構(gòu)建是將CtxB-SS1融合基因序列插入到鹽藻Hsp70B5’啟動子和T-Nos終止子之間，構(gòu)成完整的表達(dá)盒，使CtxB-SS1融合基因在Hsp70B5’啟動子控制下轉(zhuǎn)錄。
高效轉(zhuǎn)化與穩(wěn)定表達(dá)的依據(jù)(1).鹽藻核基質(zhì)結(jié)合序列[Chromatin matrix(Scaffold)attachment region[(MAR or SAR)]指導(dǎo)下的同源交換重組。MAR是染色體中的中、高度重復(fù)序列，并且處于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)。將目的基因插入MAR序列之中，可以提高基因轉(zhuǎn)化的效率；MAR序列位于轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)，整合于該位點的目的基因可以穩(wěn)定、高效表達(dá)。(2).誘導(dǎo)型高效啟動子熱激蛋白啟動子為誘導(dǎo)型啟動子，可以提高目的基因的表達(dá)效率，可以經(jīng)濟、有效的獲得表達(dá)產(chǎn)物。(3).高效終止子胭脂堿合成酶基因終止子(T-Nos)。
表達(dá)載體構(gòu)建中含有兩個同向的核基質(zhì)結(jié)合序列(Matrix attachmentregion，MAR)MAR1和MAR2，而在MAR1和MAR2間插入Nit15’-Nit1-T-Nos表達(dá)盒，能表達(dá)鹽藻硝酸鹽還原酶，供篩選轉(zhuǎn)化藻用。
硝酸還原酶基因作為選擇標(biāo)記理由是，硝酸鹽是真核綠藻杜氏鹽藻培養(yǎng)中最常使用的氮源。Milk和Grant等人認(rèn)為NaNO3對于鹽藻是最好的氮源。因此，以硝酸還原酶基因作為轉(zhuǎn)基因硝酸鹽還原缺陷型鹽藻的基因選擇標(biāo)記是最理想的。在硝酸鹽作為唯一氮源的情況下，硝酸鹽既是其必需的營養(yǎng)元素，又是其選擇劑，具有雙重作用。同時以硝酸鹽作為唯一N源和選擇劑，還解決了以抗生素、除草劑作為選擇劑成本高及環(huán)境(土壤、水質(zhì)、作物等)污染等問題。
該鹽藻表達(dá)載體，同時加入了除草劑(PPT)抗性基因-Bar基因作為輔助或第二選擇標(biāo)記，保證工程鹽藻的純度和質(zhì)量。工程鹽藻在開放環(huán)境中生產(chǎn)，自然界中的雜藻污染，以及自然環(huán)境(土壤、水體等)亞硝酸鹽的污染，可能會使培養(yǎng)的工程鹽藻純度降低。為保證工程鹽藻的純度，在生產(chǎn)中可建立工程鹽藻“種子培養(yǎng)池”。培養(yǎng)工程鹽藻時，可加入硝酸鹽和PPT雙重選擇劑。這種“種子”培養(yǎng)池規(guī)模很小，可控制，培養(yǎng)液可反復(fù)處理使用。從而保證工程鹽藻的純度，又可避免污染環(huán)境。
此外，該載體加入藍(lán)、白斑選擇標(biāo)記LacZ基因及多克隆位點MCS，可使目的基因在載體中的克隆、選擇和鑒定更為容易、方便。該載體以NPT II(Kanr)作為在E.coli中的選擇標(biāo)記；pUC18中的ColE1復(fù)制子，使其作為高拷貝質(zhì)粒，便于基因操作和使用。
在本發(fā)明中，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的遺傳轉(zhuǎn)化生物學(xué)方法，將重組HBsAg外源目的基因?qū)臌}藻細(xì)胞并得到表達(dá)，以獲得轉(zhuǎn)基因鹽藻藻株。常用物理和化學(xué)方法包括聚乙二醇(PEG)處理法、電激法和基因槍法等。
本發(fā)明以轉(zhuǎn)基因鹽藻生產(chǎn)人口服型乙型肝炎疫苗，與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因可食性植物如馬鈴薯、萵苣等比較，具有以下優(yōu)點1、鹽藻為單細(xì)胞真核生物，無細(xì)胞壁，易于遺傳操作，基因工程下游產(chǎn)品工藝簡便。2、單細(xì)胞鹽藻生長快，無季節(jié)性限制。3、培養(yǎng)條件簡單，生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)化生產(chǎn)。4、鹽藻細(xì)胞本身無毒性，而且富含多種對人體有益的維生素、多不飽和脂肪酸等營養(yǎng)成分。
本發(fā)明主要包括四方面技術(shù)1、鹽藻培養(yǎng)技術(shù)。2、鹽藻表達(dá)載體構(gòu)建，3、將外源基因?qū)臌}藻的技術(shù)。4、轉(zhuǎn)基因鹽藻轉(zhuǎn)化子的篩選。


圖1重組HBsAg鹽藻表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-CtxB-SS1的構(gòu)建圖2鹽藻表達(dá)載體pCAMBIA-DS1664圖3重組HbsAg鹽藻表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-CtxB-SS具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合以下實施例做進(jìn)一步描述，但并不限制本發(fā)明。
實施例一、鹽藻培養(yǎng)技術(shù)1、液體培養(yǎng)藻種接種于Mclachlan培養(yǎng)液，培養(yǎng)條件如下溫度25±2℃，光照強度3000lux，每天光照培養(yǎng)14小時，黑暗培養(yǎng)10小時。
2、固體培養(yǎng)Mclachlan培養(yǎng)液中加入瓊脂濃度為0.5-0.8％，于超凈臺用消毒白金耳從液體培養(yǎng)液取藻種立即接種到固體培養(yǎng)基面上，置恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，恒溫箱中需配置熒光管照射，按液體培養(yǎng)條件要求進(jìn)行培養(yǎng)。
二、HBsAg鹽藻表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-CtxB-SS1的構(gòu)建1.重組乙肝表面抗原SS1融合基因的構(gòu)建質(zhì)粒pBS-SK-HBS上克隆有乙肝病毒S基因、Pre-S2基因和Pre-S1基因序列，設(shè)計四條引物引物15’-GCAGTCGACCCAATG GAGAGCAC-3’；Sal I引物25’-GCGGGTACCAGG AATGTATACCC-3’；Kpn I引物35’-CTGGGTACCCCA AATCCTCTGGG-3’；Kpn I引物45’-GCGGCATGCTTA GTTGGGGTTG-3’；Sph I分別以引物1和2擴增SHBsAg(1-226aa)，以引物3和4擴增PreS1 Ag(20-48aa)DNA片段，經(jīng)酶切、回收后連接到質(zhì)粒pUC18的Sal I/Sph I位點，構(gòu)建成編碼重組乙肝表面抗原SS1[包括SHBsAg(1-226aa)和PreS1 Ag(20-48aa)]的融合基因片段，質(zhì)粒命名為pUC18-SS1。
2.CtxB-SS1融合基因的構(gòu)建(1)根據(jù)文獻(xiàn)報道的霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)序列，設(shè)計兩條引物正向引物5’-GCGGGATCCATG ATTAAATTAAAATTTGG-3’BamH I反向引物5’-GCGGTCGACAGG ATTTGCCATACTAATTGC-3’Sal I以古典霍亂小川型疫苗菌CVC 0139基因組DNA為模板，PCR擴增CtxB基因序列約380bp，經(jīng)BamH I/Sal I酶切后克隆到質(zhì)粒pUC18上，構(gòu)建成質(zhì)粒pUC18-CtxB。
(2)以Sal I/Sph I雙酶切割質(zhì)粒pUC18-SS1，切下SS1融合基因片段約770bp，連接入質(zhì)粒pUC18-CtxB的Sal I/Sph I位點，構(gòu)成含CtxB基因和SS1基因片斷的融合基因質(zhì)粒pUC18-CtxB-SS1。
3、Hsp70B5’-CtxB-SS1-T-Nos表達(dá)盒的構(gòu)建質(zhì)粒pSP72-Hsp-Nos中克隆有鹽藻(D.Salina UTEX1664)熱休克蛋白Hsp70B5’啟動子和T-Nos終止子。用BamH I/Sph I雙酶切割質(zhì)粒pSP72-Hsp-Nos和pUC18-CtxB-SS1，將CtxB-SS1融合基因序列連接到Hsp70B5’啟動子和T-Nos終止子之間，構(gòu)成完整的表達(dá)盒，使CtxB-SS1融合基因在Hsp70B5’啟動子控制下轉(zhuǎn)錄。
4、鹽藻表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-CtxB-SS1的構(gòu)建鹽藻表達(dá)載體pCAMBIA-DS1664中含有兩個同向的核基質(zhì)結(jié)合系列(MAR1和MAR2，在MAR1與MAR2序列間順序連接有Nit5’-Nit1-T-Nos表達(dá)盒(可表達(dá)鹽藻硝酸鹽還原酶，用于轉(zhuǎn)化藻的篩選)、多克隆位點MCS(來源于pUC18)和Nit5’-BAR-T-Nos表達(dá)盒(可表達(dá)PPt抗性，用于轉(zhuǎn)化藻的輔助篩選)，將構(gòu)建完整的Hsp70B5’-CtxB-SS1-T-Nos表達(dá)盒用EcoR I/Xho I切下后，連入載體pCAMBIA-DS1664的EcoR I/Sal I位點，構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA-CTP-SS1，該質(zhì)?？捎蒑AR1和MAR2序列介導(dǎo)同源重組，使Nit1表達(dá)盒和CtxB-SS1表達(dá)盒及BAR表達(dá)盒整合于鹽藻染色體活躍轉(zhuǎn)錄區(qū)，經(jīng)PPt抗性篩選和硝酸鹽選擇培養(yǎng)篩選鑒定轉(zhuǎn)化藻，轉(zhuǎn)化藻可經(jīng)由溫度誘導(dǎo)高效表達(dá)CtxB和SS1的融合蛋白。
三、將外源目的基因?qū)臌}藻1、用電激法將外源目的基因?qū)臌}藻取培養(yǎng)第5天的鹽藻培養(yǎng)液，1000rpm離心15min，棄上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇液處理后加入電激緩沖液，調(diào)整鹽藻密度在108個/mm3。繼之加入終濃度為10μg/ml的含外源基因的質(zhì)粒及25μg/ml的鮭精DNA，混勻后，置冰上5-10min，吸取0.5ml置于轟擊小室中待用。電激儀(Backon 2000型)電激時電壓為9.5KV，每次電激時間為0.05μs，次數(shù)為210，循環(huán)次數(shù)100次，電激高度2mm，每次電激間隔時間為62.5sec。
2、用基因槍法將外源目的基因?qū)臌}藻取培養(yǎng)第5天的鹽藻培養(yǎng)液，1000rpm離心15min，棄上清，用鹽藻培養(yǎng)液將鹽藻密度調(diào)整在108個/mm3，再取0.5ml鹽藻培養(yǎng)液鋪于含抗生素的固體培養(yǎng)基中央，直徑為3cm的圓形有效轟擊范圍內(nèi)，置超凈臺下吹干待用。
在無菌條件下，用基因槍(Bio-Rad公司產(chǎn)的PDS-1000型)轟擊。具體步驟如下取50μl(60μg/ml)金粉懸浮液加入6μg含有外源基因的質(zhì)粒以及50μl 2.5M Cacl2和20μl 0.1M亞精胺，振蕩3min，12000rpm離心10sec，棄上清。用無水乙醇洗一次，振蕩，12000rpm離心，棄上清，共二次。最后將附有金粉的質(zhì)粒懸浮于60μl無水乙醇中。每次轟擊取6-8μl，每皿轟擊3次，轟擊后將培養(yǎng)皿放入鹽藻適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
3、用PEG法將外源目的基因?qū)臌}藻取0.5ml鹽藻培養(yǎng)液(細(xì)胞密度107-108個/ml)，在超凈臺內(nèi)接種于含抗生素的固體培養(yǎng)基上，直徑為3cm，吹干待用。
構(gòu)建攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒和鹽藻細(xì)胞原生質(zhì)體。爾后將新制備的原生質(zhì)體懸浮液與Ti質(zhì)粒DNA一起保溫培養(yǎng)，同時加入分子量4000-6000的PEG，在pH8-9下促進(jìn)原生質(zhì)體攝取DNA，從而使細(xì)胞轉(zhuǎn)化，為促進(jìn)轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)時加入運載DNA(小牛胸腺DNA)，培養(yǎng)后離心收集原生質(zhì)體，并重新懸浮到原生質(zhì)體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。
四、轉(zhuǎn)基因鹽藻轉(zhuǎn)化子的篩選取電激法或基因槍法轉(zhuǎn)化的鹽藻細(xì)胞團，用1ml培養(yǎng)液A(5mM NH4Cl、5mMNaNO2)洗下，3001ux弱光培養(yǎng)2-3天，轉(zhuǎn)入含3μg/ml PPt的培養(yǎng)液A中繼續(xù)培養(yǎng)5-7天，光照周期為12小時/天，光強為1600lux；之后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)液B(10mM NaNO3)中繼續(xù)光照培養(yǎng)7-10天。繼之涂布于培養(yǎng)液B平板上(1.0％瓊脂)光照培養(yǎng)10-15天至轉(zhuǎn)化藻落出現(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，其特征在于編碼重組HBsAg蛋白的DNA序列和含有特定的篩選標(biāo)記基因，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將它們導(dǎo)入鹽藻，通過繼代選擇培養(yǎng)，建立轉(zhuǎn)HBsAg基因鹽藻藻株，供制備乙型肝炎口服疫苗使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，其特征在于編碼重組HBsAg蛋白基因的CtxB-SS1融合基因的構(gòu)建和鹽藻表達(dá)載體pCAMBIA-CtxB-SS1的構(gòu)建。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，其特征在于重組乙型肝炎表面抗原(HBsAg)蛋白基因包括乙型肝炎病毒S基因、PreS1基因和PreS2基因的全部或部分序列及其組合。SS1基因是指S基因和PreS1基因部分序列的融合；CtxB-SS1融合基因是指霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)和SS1基因的融合。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，其特征在于將CtxB-SS1融合基因序列插入到鹽藻Hsp70B5’啟動子和T-Nos終止子之間，構(gòu)成完整的表達(dá)盒，使CtxB-SS1融合基因在鹽藻Hsp70B5’啟動子控制下轉(zhuǎn)錄。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，其特征在于表達(dá)載體中含有兩個同向的核基質(zhì)結(jié)合序列(Matrixattachment region，MAR)MAR1和MAR2，在MAR1和MAR2間插入能表達(dá)硝酸鹽還原酶的Nit15’-Nit1-T-Nos表達(dá)盒，供篩選轉(zhuǎn)化藻用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)基因鹽藻的制備方法，即將外源基因HBsAg重組到真核單細(xì)胞鹽藻細(xì)胞中，從而利用獲得的轉(zhuǎn)基因鹽藻，供制備乙型肝炎口服疫苗使用。本發(fā)明以含有HBsAg基因的具有真核表達(dá)元件的質(zhì)粒為轉(zhuǎn)化載體，通過常規(guī)方法對鹽藻細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，再進(jìn)行繼代選擇性培養(yǎng)，最終得到轉(zhuǎn)HBsAg基因鹽藻，本發(fā)明與現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因可食性植物如馬鈴薯、萵苣等比較，具有以下優(yōu)點鹽藻為單細(xì)胞真核生物，繁殖快，無季節(jié)性生長限制；培養(yǎng)條件簡單，成本低；鹽藻細(xì)胞無毒性，富含多種維生素、不飽和脂肪酸等對人體有益成分，適于工業(yè)化生產(chǎn)口服疫苗。
文檔編號C12N1/13GK1410525SQ0112848
公開日2003年4月16日 申請日期2001年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月21日
發(fā)明者薛樂勛, 潘衛(wèi)東, 姜國忠, 陳占寬, 嚴(yán)海燕, 王建民, 呂玉民, 張貴星, 謝華, 郭玉忠, 牛向麗, 侯桂琴, 李 杰, 王建人, 杜保華 申請人:薛樂勛