專利名稱：乙型肝炎病毒耐藥檢測寡核苷酸基因芯片的制備和用途的制作方法
乙型肝炎病毒(HBV)是一種嚴重危害人類健康和生命的病毒性傳染病。目前雖有預(yù)防用的HBV疫苗，但全球近億HBV感染者的治療是醫(yī)學界面臨的一個難題(Zoulim F.et al.AntiviralRes.1999，441-30)。除了干擾素可選用外，最近發(fā)現(xiàn)治療HIV的核苷類藥物拉米呋啶(Lamivudine)對HBV具有很強的抑制作用，并很快開發(fā)為治療HBV慢性感染病人的藥物，投入臨床應(yīng)用。隨著拉米呋啶在臨床上的廣泛應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)易出現(xiàn)拉米呋啶抗性現(xiàn)象，給HBV治療帶來影響。最近研究發(fā)現(xiàn)，拉米呋啶作用于HBV的靶蛋白——HBV多聚酶基因的點突變與HBV的拉米呋啶抗性密切相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)了這些與HBV拉米呋啶抗性相關(guān)的點突變(Zoulim F，etal.J.Hepatology，1998，29151-168)。HBV拉米呋啶抗性的快速檢測對臨床藥物的合理應(yīng)用，選擇最佳治療方案以及降低病人治療費用等具有重要意義。
寡核苷酸基因芯片(Oligochip)是近年來發(fā)展成熟的一種高通量基因檢測技術(shù)(Hacia J.Naturegenetics(Supl)，1999，21(1)42-47)。寡核苷酸基因芯片的一個主要用途是基因突變的快速和高通量檢測，已成功應(yīng)用于HIVRT基因，結(jié)核桿菌利福平(Rifapin)抗性相關(guān)基因，腫瘤p53基因以及藥物代謝相關(guān)細胞色素酶p450基因等的突變分析，是一種發(fā)展前景好的基因突變大規(guī)模檢測新生物技術(shù)。
本發(fā)明的目的是，設(shè)計一種HBV耐藥檢測的寡核苷酸基因芯片，為建立合理高效的HBV治療方案，指導(dǎo)臨床合理用藥提供快速高效的檢測手段。
本發(fā)明的主要內(nèi)容是1、HBV耐藥檢測寡核苷酸芯片制備 根據(jù)HBV拉米呋啶抗藥性相關(guān)突變主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位點，設(shè)計了28條寡核苷酸探針(見表1)。探針對應(yīng)序列為HBV DNA聚合酶基因反義鏈，長度為15-18nt。設(shè)計探針時使其Tm值盡可能接近，但優(yōu)先考慮探針長度，即探針長度位于15-18nt，以17為主。探針合成時在其3’端接氨基和間隔臂(spacer)等特定修飾，一方面利于探針與載玻片表面的活性醛基發(fā)生反應(yīng)并固定到載體表面，同時增加固定于載體表面探針的自由度和與靶序列的可接近性(accessibility)。探針純化與定量后，用基因芯片點樣儀點到醛基修飾載玻片上，制成HBV耐藥寡核苷酸芯片。芯片上每個探針重復(fù)2次，以驗證檢測結(jié)果的重復(fù)性。芯片上探針微陣列(microarray)中第1，5列探針對應(yīng)HBV DNA野生型序列；其他探針對應(yīng)于各種可能的突變型DNA序列。微陣列中表1氨基酸編號探針序列(5’→3’)長度 Tm GC％ 分子量(堿基)1 TGAGCCAGGAGAAAC 1550.28 53.3 4697.082L526 TGAGCCATGAGAAAC 1547.86 46.7 4672.073(1 base) TGAGCCAAGAGAAAC 1547.09 46.7 4681.084 TGAGCCACGAGAAAC 1551.02 53.3 4657.065 CTGAGCCAGGAGAAAC1652.12 56.3 4986.276L526 CTGAGCTAGGAGAAA 1543.12 46.7 4712.097(3 base) CTGAGCGAGGAGAAA 1550.81 53.3 4737.108 CTGAGCAAGGAGAAA 1547.42 46.7 4721.109 CTGAAAGCCAAACAATG 1753.51 41.2 5258.4710 A546 CTGAAAACCAAACAATG 1750.33 35.3 5242.4711 (2 base) CTGAAACCCAAACAATG 1753.10 41.2 5218.4512CTGAAATCCAAACAATG 1750.18 35.3 5233.4613CATCATCCATATAACTGA 1846.53 33.3 5488.6314 M550 CATCATCCACATAACTG 1747.52 41.2 5160.4115 (1 base) CATCATCCAGATAACTG 1746.61 41.2 5200.4216CATCATCCAAATAACTG 1746.97 35.3 5184.4317ACATCATCCATATAACT 1741.33 29.4 5159.4218 M550 ACATCATCAATATAACT 1738.33 23.5 5183.4419 (3 base) ACATCATCTATATAACT 1734.35 23.5 5174.4320ACATCATCGATATAACT 1741.60 29.4 5199.4421CAATACCACATCATCCA 1751.44 41.2 5129.4022 V553 CAATACCAGATCATCCA 1750.20 41.2 5169.4223 (1 base) CAATACCATATCATCCA 1747.19 35.3 5144.4124CAATACCAAATCATCCA 1750.41 35.3 5153.4225CAATACCACATCATCCA 1751.14 41.2 5129.4026 V553 CAATACAACATCATCCA 1748.13 35.3 5153.4227 (3 base) CAATACTACATCATCCA 1744.02 35.3 5144.4128CAATACGACATCATCCA 1751.37 41.2 5169.42探針后標示的堿基對應(yīng)該探針出現(xiàn)熒光信號時所判讀的堿基。
2、HBV DNA聚合酶基因突變體構(gòu)建克隆了833號HBV病人血清中HBV DNA聚合酶基因，測序證實為HBV DNA野生型(即未發(fā)生突變)。以該DNA為模板，用PCR法構(gòu)建了下列4種突變體(見表2)。
3、HBV耐藥檢測寡核苷酸芯片檢測HBV野生型和突變體DNA用HBV耐藥寡核苷酸芯片對HBV野生型DNA和人工構(gòu)建DNA突變體進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對于HBV833野生型質(zhì)粒，僅在芯片第1，5列探針出現(xiàn)熒光信號，而且重復(fù)性好。說明HBV耐藥核苷酸芯片能有效檢測出野生型DNA序列。當用HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測突變體HBV833 Mutantl時，根據(jù)雜交信號可發(fā)現(xiàn)HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測的結(jié)果與表2所示序列相一致。分析HBV耐表2氨基酸位點526546 550 553HBV 833 DNA seq CTGGCT ATG GTG/AA(widetype) L AM VHBVg33-Mutant 1 CTGGTT GTG ATGHBV833-Mutant 2 CTGGAT ATT GTTHBV833-Mutant 3 CTGGGT ATC GTCHBV833-Mutant 4 ATGGTT GTG ATG藥寡核苷酸芯片與HBV 833 Mutant3和Mutant4雜交結(jié)果，同樣發(fā)現(xiàn)HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測結(jié)果與相應(yīng)突變體DNA序列一致。表明HBV耐藥寡核苷酸芯片不僅可檢測出野生型序列，而且可有效地分辨出單堿基突變，可應(yīng)用于HBV耐藥基因突變檢測。
4、HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測HBV臨床樣本用HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測HBV陽性血清20份。不對稱PCR法對HBV DNA進行熒光標記，HBV DNA標記產(chǎn)物與HBV耐藥寡核苷酸芯片雜交，根據(jù)雜交信號判定DNA序列，并與DNA測序結(jié)果比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測結(jié)果與DNA測序結(jié)果相吻合。實驗發(fā)現(xiàn)，中國人HBV在526位出現(xiàn)高頻率的CTG→TTG突變。此外HBV耐藥寡核苷酸芯片檢測HBV樣本時，有的探針組(4個一組)不出現(xiàn)任何信號；經(jīng)與DNA測序結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，探針對應(yīng)的靶序列附近出現(xiàn)堿基突變，說明在設(shè)計探針時要考慮DNA熱點突變周圍核酸序列的保守程度。
總之，本發(fā)明中我們據(jù)HBV拉米呋啶耐藥基因熱點突變，設(shè)計了一種HBV耐藥寡核苷酸芯片。該芯片的特點是，能同時測定多個耐藥突變，而且隨著新的HBV耐藥突變位點不斷發(fā)現(xiàn)，可以把檢測HBV耐藥相關(guān)所有突變的探針放到一張芯片上，真正實現(xiàn)一種芯片能測定HBV各種可能耐藥突變的快速和高通量的策略。HBV耐藥寡核苷酸芯片的制備與初步應(yīng)用為HBV耐藥突變提供了一種新型檢測手段，對預(yù)測HBV藥物治療效果，指導(dǎo)臨床合理用藥等具有重要的應(yīng)用價值。結(jié)合


本發(fā)明的具體實施方法如下
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒耐藥檢測寡核苷酸基因芯片。其特征在于，根據(jù)乙型肝炎病毒拉米呋啶耐藥性相關(guān)突變主要位于乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因的L526，A546，M550和V553等氨基酸位點，設(shè)計檢測突變的寡核苷酸探針。寡核苷酸探針與HBV拉米呋啶耐藥相關(guān)基因突變位點互補，長度為15-18，3’端進行NH3-(PEG)4-修飾。基因芯片支持物為醛基化載玻片。該寡核苷酸基因芯片能有效檢測HBV耐藥基因突變。
2.權(quán)利要求1中的寡核苷酸基因芯片在HBV耐藥臨床檢測中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物工程類檢測產(chǎn)品及其用途。具體說是一種新型乙型肝炎病毒耐藥檢測寡核苷酸基因芯片。根據(jù)乙型肝炎病毒拉米呋啶耐藥性相關(guān)突變主要位于乙型肝炎病毒DNA聚合酶基因的L526，A546，M550和V553等氨基酸位點，設(shè)計寡核苷酸探針，長度為15－18，探針3’端進行NH3－(PEG)4－修飾。以醛基化載玻片為支持物制成寡核苷酸基因芯片。該基因芯片能有效分辨人工構(gòu)建突變體中的點突變，也能檢測HBV臨床標本中DNA突變，是一種用于HBV耐藥檢測的新型生物工程類檢測產(chǎn)品。
文檔編號C12Q1/68GK1393567SQ0112965
公開日2003年1月29日 申請日期2001年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月27日
發(fā)明者王升啟, 陳忠斌, 高瑋, 管偉 申請人:軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所