專利名稱：一種人白細(xì)胞介素－10基因序列及含該基因序列的大腸桿菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人白細(xì)胞介素-10基因序列及含該基因的具有能產(chǎn)生免疫抑制及抗炎活性物質(zhì)的大腸桿菌工程菌。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)是直接源于人類基因的表達(dá)產(chǎn)物，傳統(tǒng)的生物制藥技術(shù)是無法制備的。運(yùn)用人工合成基因、分子克隆、目的蛋白表達(dá)及純化等多種先進(jìn)的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，獲得有天然生物學(xué)活性和療效的重組人白介素-10(rhIL-10)是現(xiàn)代生物技術(shù)之一種。真核短肽基因的高效表達(dá)和分離純化是基因工程中的關(guān)鍵問題。針對不同多肽的結(jié)構(gòu)特點，需要采取不同的表達(dá)方式。對于分子量較小的多肽蛋白，若采用非融合方式表達(dá)，由于表達(dá)產(chǎn)物很難形成包涵體，因而極易被胞內(nèi)蛋白酶降解，且包涵體的變復(fù)性處理是一個極其復(fù)雜的過程，不同蛋白的復(fù)性條件各異，復(fù)性率往往很難提高，易造成重組蛋白的變性失活。采用分泌表達(dá)方式可部分克服這一問題，但表達(dá)量偏低，且表達(dá)量差異很大，實際應(yīng)用難度較大，特別是表達(dá)一些分子量較小、二硫鍵較多的蛋白時，非融合表達(dá)系統(tǒng)很難得到有生物學(xué)活性的蛋白。hIL-10是一個分子量僅有18KD的小分子糖蛋白，分子內(nèi)部有兩對二硫鍵，等電點為8.1。人白細(xì)胞介素-10(human Interleukin-10，hIL-10)是由Th2細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞、Th1、B等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生的具有多向性生物學(xué)活性的強(qiáng)免疫抑制因子，能改變機(jī)體的免疫應(yīng)答和MHC II類抗原的表達(dá)，介導(dǎo)Th1和Th2兩類細(xì)胞之間的相互調(diào)節(jié)，抑制IL-2、IL-6、IL-β、IFN-γ、TNF-α等炎癥介質(zhì)因子及其它促炎因子的分泌釋放，把體內(nèi)原有的、但未活化的針對自身反應(yīng)性T細(xì)胞的抑制機(jī)制重新激活，達(dá)到抑制免疫反應(yīng)的目的，是非常有效的抗炎介質(zhì)。研究還顯示人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)參與單核細(xì)胞介導(dǎo)的抗體依賴的細(xì)胞毒作用以及通過激活自然殺傷細(xì)胞(NK)來殺死腫瘤細(xì)胞(Mosmann T R，New YorkAcademic Press，1994224)。在臨床應(yīng)用方面，IL-10是抑制炎癥發(fā)生和減輕炎癥程度的良好藥物，非常有效地用于治療各種急性和慢性炎癥性疾病，如過敏反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病、移植排斥反應(yīng)、牛皮蘚及肝炎等(Lalani I et al，Annals of allergy，Asthma & Immunology，1997，79469)；用于防治敗血癥休克和中毒休克；治療分支桿菌感染；對肺組織損傷有保護(hù)作用；臨床上IL-10與IL-2合用來進(jìn)行繼承性治療癌癥。生物工程制藥是新藥研制的新趨勢，據(jù)統(tǒng)計，已獲準(zhǔn)上市的生物工程藥品已達(dá)數(shù)百種之多，產(chǎn)業(yè)年收益達(dá)二千多億。由于此類疾病患者數(shù)量巨大，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是最常見的系統(tǒng)性免疫疾病，呈世界性分布，在美國，RA的發(fā)病率為0.3-0.5％，在我國RA的發(fā)病率為0.4-0.7％，患者人數(shù)達(dá)500萬以上，目前還沒有治療這些疾病的特效藥，而且，人白細(xì)胞介素-10在生物技術(shù)領(lǐng)域尚未形成可以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的藥品，因而該藥的開發(fā)將帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
為了將人白細(xì)胞介素-10從人體基因表達(dá)改變?yōu)轶w外表達(dá)，從而實現(xiàn)其藥品化，本發(fā)明提供一種能高效表達(dá)于微生物的人白細(xì)胞介素-10基因序列，該基因序列做了如下密碼子的改造，根據(jù)Genbank發(fā)表的Human interleukin-10(hIL-10)基因序列(見

圖1)，在以下核苷酸位點51，72，78，81，91，94，136，139，142，144，159，193，210，234，249，252，285，294，304，306，310，312，315，318，330，339，342，378，393，423，450，465，471，474，477進(jìn)行密碼子的替換，替換成大腸桿菌偏愛的密碼子。遺傳密碼具有通用性，從最簡單的生物例如病毒，一直到人類，在蛋白質(zhì)的生物合成中都使用同一套遺傳密碼。而對遺傳密碼簡并性的研究發(fā)現(xiàn)，不同的生物在翻譯過程中對密碼子有“偏愛性”。針對大腸桿菌偏愛且使用頻率高的密碼子，在不改變基因所編碼的氨基酸序列的情況下，進(jìn)行人白細(xì)胞介素-10基因的上述堿基序列的改造(見圖2)，以達(dá)到在大腸桿菌中高效表達(dá)。
為了獲得人白細(xì)胞介素-10的基因克隆并進(jìn)行序列測定，在本發(fā)明的一種人白細(xì)胞介素一10基因序列的5’端加上AATTC以構(gòu)成EcoR I識別位點，3’端加上AGCTT以構(gòu)成Hind III識別位點，即可直接克隆至pUC18質(zhì)粒，用于hIL-10合成序列的測定，以及經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得大量hIL-10目的基因。
本發(fā)明的一種優(yōu)選人白細(xì)胞介素-10基因序列如下TCTCCGGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGTAACCTGCCT 60AACATGCTTCGTGATCTGCGTGATGCCTTCAGCCGTGTGAAGACTTTCTTTCAAATGAAGG120ATCAGCTGGACAACCTGCTGCTGAAGGAGTCCTTGCTCGAGGACTTTAAGGGTTACCTGG 180GTTGCCAAGCCCTGTCTGAGATGATCCAATTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCGCAAGCTG 240
AGAACCAGGATCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGCGAGAACCTTAAGACCC 300TCCGTCTGCGTCTGCGTCGCTGTCATCGTTTTCTTCCGTGCGAAAACAAGAGCAAGGCCGT 360GGAGCAGGTGAAGAACGCCTTTAATAAGCTGCAGGAGAAAGGCATCTACAAAGCCATGA420GCGAGTTTTGACATCTTCATCAACTACATCGAAGCCTACATGACTATGAAAATCCGTAAC 480TGA為了構(gòu)建pTRX-hIL-10表達(dá)克隆，本發(fā)明在上游引物中加入了KpnI識別序列GGT ACC，在下游引物中加入了Not I識別序列G CGG CCG C，以便PCR擴(kuò)增獲得的hIL-10目的基因能直接克隆于pTRX表達(dá)載體的相應(yīng)克隆位點。
為了切去融合蛋白中的伴體蛋白，在上游引物KpnI識別序列之后設(shè)計了腸激酶切割位點GAT GAC GAT GAC AAG，腸激酶能特異性地識別多肽鏈中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五個氨基酸殘基位點，切割點在Lys的羧基端，切割下來的外源蛋白在氨基端無額外的氨基酸，從而使其氨基酸序列與天然蛋白完全一致。
為了使人白細(xì)胞介素-10基因能在大腸桿菌中表達(dá)，必須先將人白細(xì)胞介素-10基因序列插入到質(zhì)粒載體中，本發(fā)明提供一種載有上述基因序列的表達(dá)質(zhì)粒pTRX-hIL-10(見圖6)。其特征是pTRX原核融合表達(dá)載體中含有具有優(yōu)化翻譯起始序列(TIR)的T7強(qiáng)啟動子、TRX伴體蛋白(后接柔韌區(qū))、6個組氨酸純化位點、連接外源基因的多克隆位點的一段組合序列(見圖5)。pTRX是由本室構(gòu)建的高效原核融合表達(dá)載體，其強(qiáng)啟動子及優(yōu)化的翻譯起始序列(TIR)有利于重組蛋白在原核生物中的高效穩(wěn)定表達(dá)(Calvez H L et al，Gene，1996，17051)。融合伴體是來自大腸桿菌的硫氧還蛋白(TRX)，分子量約為12KD，其構(gòu)象嚴(yán)緊，熱穩(wěn)定性好。融合伴體既可以保護(hù)外源蛋白免受細(xì)菌蛋白酶的降解，又能協(xié)助外源蛋白的正確折疊(Smith et al，Gene1988，6731)，因此，表達(dá)的重組蛋白溶解性好，更接近于天然蛋白的構(gòu)象，對保證其生物學(xué)活性具有極為重要的作用，非常適合重組蛋白的大量生產(chǎn)和制備。本發(fā)明中hIL-10重組蛋白的表達(dá)量達(dá)40％，95％以上可溶，約占細(xì)菌總可溶蛋白的40％。融合伴體基因后設(shè)計了一個GSGSG(甘氨酸、絲氨酸)序列的柔韌區(qū)，其分子量小，空間位阻小，柔韌性好，減少了融合伴體和外源蛋白空間結(jié)構(gòu)上的相互干擾以及可能出現(xiàn)的一些剛性結(jié)構(gòu)，更有利于外源蛋白的正確折疊，保證了外源蛋白天然構(gòu)象形成和生物學(xué)活性。pTRX的連接區(qū)設(shè)計了由6個組氨酸組成的純化位點，組氨酸能提供配位電子與一些金屬離子如Ni2+螯合，6個連續(xù)的組氨酸可以使蛋白很好地吸附于含金屬Ni2+的層析填料上，因而可以利用金屬螯合層析來純化融合蛋白，從而大大簡化了重組蛋白的下游純化工作，純度達(dá)95％以上，且純化效率高，成本低，非常適合大規(guī)模制備?；蛐蛄羞B接于TRX伴體蛋白之后的柔韌區(qū)，使融合伴體和外源蛋白之間的連接區(qū)空間位阻小，更有利于腸激酶對伴體蛋白的有效切割而獲得目的蛋白單體。
為了獲得表達(dá)人白細(xì)胞介素-10重組蛋白的工程菌，本發(fā)明提供一種載有上述質(zhì)粒(pTRX-hIL-10)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。其特征在于將pTRX-hIL-10原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后進(jìn)行重組克隆的篩選，獲得大腸桿菌工程菌。由于PTRX上的T7 Promoter是T7噬菌體RNA聚合酶基因啟動子，所以利用T7啟動子的表達(dá)載體需要以缺陷型λ噬菌體DE3的溶源菌株，如BL21(DE3)作為宿主，其攜帶的T7 RNA聚合酶基因受Lac UV5啟動子和操縱基因控制，而插入的外源基因受T7 RNA聚合酶的強(qiáng)啟動子Ф10的控制，用IPTG誘導(dǎo)，可使外源基因表達(dá)增強(qiáng)105倍。上述轉(zhuǎn)化可以采用傳統(tǒng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化生物技術(shù)。
為了獲得人白細(xì)胞介素-10重組蛋白的高效表達(dá)，本發(fā)明提供一種上述含pTRX-hIL-10質(zhì)粒的大腸桿菌的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，其特征在于工程菌于35-39℃搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)菌液按1∶50-100放大培養(yǎng)至菌密度為OD600nm＝0.4-0.8時，加入IPTG和葡萄糖至終濃度分別為0.1-0.5mM和0.1-0.5％，于20-28℃，200-280rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)7h-12h，離心收獲菌體。35-39℃的培養(yǎng)溫度和200-280rpm的搖床速度范圍內(nèi)大腸桿菌能正常繁殖生長，1∶50-100倍的放大培養(yǎng)利于大腸桿菌快速達(dá)對數(shù)生長期。溫度優(yōu)化試驗表明，20-28℃為最佳誘導(dǎo)表達(dá)溫度，重組蛋白的表達(dá)量高，凝膠密度掃描分析為占總蛋白的40％，可溶性最好，95％以上可溶，且低溫有利于重組蛋白的穩(wěn)定存在。種子菌放大培養(yǎng)至菌密度OD600nm＝0.4-0.8時細(xì)菌處于最佳生長狀態(tài)，此時重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量最高，菌密度太高，菌體老化，不利于外源蛋白的表達(dá)。IPTG濃度優(yōu)化試驗顯示，IPTG的誘導(dǎo)濃度為1.0mM-0.1mM時，重組蛋白均可達(dá)到高效表達(dá)，但I(xiàn)PTG價格昂貴，選擇0.1-0.5mM IPTG誘導(dǎo)濃度最合理，即保證了重組蛋白的高效率表達(dá)，又大大降低了生產(chǎn)成本。誘導(dǎo)時添加適量的葡萄糖作為碳源物質(zhì)，利于大腸桿菌表達(dá)外源蛋白。
為了制備純化的人白細(xì)胞介素-10重組蛋白，本發(fā)明提供一種上述條件誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌體所表達(dá)的重組蛋白的分離純化方法，關(guān)鍵步驟(1)hIL-10重組蛋白的hIL-10重組蛋白的Ni2+-Chelating Sepharose親和層析；(2)hIL-10重組蛋白的SP-Sephadex陽離子交換層析。親和層析具有特異性高、純化效率高、產(chǎn)物純度高等優(yōu)點，但價格貴、成本高。本發(fā)明所采用的金屬Ni2+螯合親和層析是利用表達(dá)的融合蛋白上6個組氨酸能提供配位電子與一些金屬離子如Ni2+螯合，6個連續(xù)的組氨酸序列可以使重組蛋白很好地吸附于含金屬Ni2+的層析填料上，因而可以利用金屬螯合層析來純化融合蛋白，從而大大簡化了重組蛋白的下游純化工作，純度達(dá)95％以上，且純化效率高，成本低，非常適合大規(guī)模制備。SP-Sephadex陽離子交換層析是蛋白分離純化技術(shù)中非常常用的方法。在50mM PB，100mM NaCl，pH＝6.0的緩沖液條件下，經(jīng)腸激酶切割后的融合伴體(TRX)和hIL-10蛋白單體所帶電荷不同，經(jīng)SP-Sephadex陽離子交換柱純化，穿流峰為TRX伴體蛋白，用50mM PB，500mM NaCl，pH＝7.0的緩沖液洗脫，即可獲得純化的hIL-10蛋白，純度達(dá)95％以上，得率約為10mg/升發(fā)酵液，操作簡單快速。
為了獲得具有高效生物學(xué)活性的人白細(xì)胞介素-10蛋白，本發(fā)明提供了一種有效的酶切條件。腸激酶是一種絲氨酸蛋白酶，它能特異性識別肽鏈中N-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C五個氨基酸殘基，特異性強(qiáng)，切割效率高，反應(yīng)條件溫和。本發(fā)明在2-10℃的溫度下腸激酶作用10-15小時，既保證了重組蛋白的活性，又利于腸激酶的完全切割。
圖2本發(fā)明的一種對人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)基因序列進(jìn)行密碼子替換的示意圖。
圖3本發(fā)明的一種人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)基因序列4本發(fā)明hIL-10 PCR電泳結(jié)果圖。
泳道M分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1hIL-10 PCR產(chǎn)物圖5本發(fā)明融合表達(dá)載體pTRX的物理圖譜。
圖6本發(fā)明pTRX-hIL-10重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。
圖7本發(fā)明pTRX-hIL-10重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳結(jié)果圖。
泳道M分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1pTRX/Kpn I+Not I；泳道2pTRX-hIL-10/Kpn I+Not I
圖8本發(fā)明hIL-10重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的電泳分析圖。
泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道1，3，5，7總細(xì)菌蛋白；泳道2，4，6，8總可溶性細(xì)菌蛋白；泳道9對照圖9本發(fā)明不同誘導(dǎo)溫度下hIL-10重組蛋白表達(dá)的電泳分析圖。
泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道9對照泳道1，3，5，7分別為37℃、30℃、25℃、16℃總細(xì)菌蛋白；泳道2，4，6，8分別為37℃、30℃、25℃、16℃總可溶性細(xì)菌蛋白；圖10本發(fā)明不同IPTG濃度誘導(dǎo)下hIL-10重組蛋白表達(dá)的電泳分析圖泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道15對照泳道1，3，5，7，9，11，13分別為1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM等IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的總細(xì)菌蛋白；泳道2，4，6，8，10，12，14分別為1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM等IPTG濃度下誘導(dǎo)表達(dá)的總可溶性細(xì)菌蛋白；圖11本發(fā)明hIL-10重組蛋白表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析圖。
泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道1對照；泳道2總細(xì)菌蛋白；泳道3總可溶性蛋白；泳道4親和層析洗脫的雜蛋白；泳道5親和純化的pTRX-hIL-10融合蛋白；泳道6pTRX-hIL-10/EK酶切；泳道7離子交換純化的hIL-10重組蛋白圖12本發(fā)明hIL-10重組蛋白的Ni2+-Chelating Sepharose親和層析圖譜。
A用50mM PB，500mM NaCl(pH7.8)洗脫；B用50mM PB，500mM NaCl(pH6.0)洗脫；C用50mM PB，500mM NaCl，150mM咪唑(pH6.0)洗脫；D用50mM PB，500mM NaCl，300mM咪唑(pH6.0)洗脫圖13本發(fā)明hIL-10重組蛋白的SP-Sephadex陽離子交換圖譜。
ApTRX穿流峰；B50mM PB，500mM NaCl(pH7.5)洗脫峰圖14本發(fā)明hIL-10重組蛋白Western-blot圖譜。
泳道M蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；泳道1pTRX-hIL-10融合蛋白；泳道2純化的hIL-10重組蛋白；泳道3對照圖15本發(fā)明重組hIL-10活性鑒定分析——對內(nèi)毒素引起的小鼠炎癥休克死亡的保護(hù)作用示意圖OLPS 1mg；□LPS 1mg+hIL-10 150ul；▲LPS 1mg+hIL-10 300ul實施例1.hIL-10基因的克隆與測序根據(jù)Genbank報道的人白細(xì)胞介素-10基因序列，替換序列中的某些稀有密碼子，由上海生工生物工程有限公司合成含大腸桿菌偏愛且使用頻率高的密碼子的IL-10基因，5’端加上EcoR I識別位點(AATTC)，3’端加上Hind III識別位點(AGCTT)，克隆至pUC18質(zhì)粒。測序結(jié)果與預(yù)期一致(見圖3)。2.pTRX-hIL-10重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定按常規(guī)方法克隆至本實驗室構(gòu)建的原核融合表達(dá)載體pTRX上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pTRX-hIL-10(見圖6)。上游引物5’CGGGGT ACCGAT GAC GAT GAC AAGTCT CCG GGC CAG GGC 3’Kpn IEnterokinase site下游引物5’TGG CGG CCG CCT TGC CAA GCT TCT ATC AGT TAC GGA 3’Not I引物由上海生工生物工程有限公司合成，上游引物設(shè)計Kpn I識別位點和腸激酶特異切割位點，下游引物設(shè)計Not I識別位點。兩步法擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)參數(shù)為94℃變性5min，94℃50s，68℃2s，35個循環(huán)，最后一個循環(huán)72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物電泳分析，可見500bp目的帶(見圖4)，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳回收。目的片段和pTRX載體分別用Kpn I和Not I雙酶切，電泳回收，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、重組克隆篩選，構(gòu)建重組質(zhì)粒pTRX-hIL-10。經(jīng)Kpn I和Not I雙酶切鑒定，電泳分析表明結(jié)果正確(見圖7)3.hIL-10重組蛋白的表達(dá)及工程菌的篩選按常規(guī)方法，將pTRX-hIL-10質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。接pTRX-hIL-10-BL21(DE3)單菌落于100ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h-14h至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)菌液按1∶100放大培養(yǎng)至菌密度為OD600nm＝0.6時，加入100mMIPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1.0mM和0.2％，于37℃，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)9h-10h，離心收獲菌體。取適量菌體懸于TE中，超聲破菌(200W，99次一個循環(huán))，離心收集上清。總菌體和超聲上清經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，經(jīng)誘導(dǎo)后有明顯的目的蛋白帶，分子量約為31kD(見圖8)，與預(yù)期相符，經(jīng)Western-blot鑒定，表達(dá)蛋白為hIL-10(見圖14)。經(jīng)大量篩選，獲得表達(dá)量高且穩(wěn)定的工程菌。該工程菌于2001年9月保藏于武漢市武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 2010344.誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件的摸索發(fā)現(xiàn)，不同的IPTG誘導(dǎo)濃度和不同的誘導(dǎo)溫度對重組蛋白的表達(dá)有明顯影響。接pTRX-hIL-10-BL21(DE3)工程菌落于100ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm培養(yǎng)12h-14h至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)菌液按1∶50-100，例如1∶100放大培養(yǎng)至菌密度為OD600nm＝0.4-0.8時，加入100mM IPTG的終濃度分別為1.0mM，0.5mM，0.3mM，0.2mM，0.1mM，0.05mM，0.01mM，于37℃、30℃、25℃、16℃下，250rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)8h-10h，離心收獲菌體。取適量菌體懸于TE中，超聲破菌(500W，99次5個循環(huán))，離心收集上清。總菌體和超聲上清經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明，實驗表明最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為0.1-0.5mM IPTG誘導(dǎo)下hIL-10重組蛋白的表達(dá)量最高(見圖10)，20-28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)hIL-10重組蛋白的可溶性較好，溫度控制在25℃左右為最好(見圖9)。凝膠密度掃描分析，重組蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的40％，基本上處于可溶狀態(tài)，可溶性高達(dá)95％以上。5.hIL-10重組蛋白的純化將收獲的總菌體用TE(pH8.0)洗滌，懸浮于PBS(5omMPB，500mMNaCl，pH7.8)中，超聲破菌(500W，99次，5cycles)，裂解液離心(10000rpm，40min)，得上清，上Ni2+ChelatingSepharose親和層析柱(上樣速度5ml/min)，在紫外檢測儀監(jiān)控下分別用A液(50mMPB，500mMNaCl，pH7.8)，B液(50mMPB，500mMNaCl，pH6.0)，C液(50mMPB，500mMNaCl，150mM咪唑，pH6.0)，D液(50mMPB，500mMNaCl，300mM咪唑，pH6.0)洗脫蛋白。根據(jù)載體質(zhì)粒pTXR所表達(dá)的外源蛋白與Ni2+Chelating Sepharose親和柱結(jié)合較強(qiáng)的特點以及SDS-PAGE電泳檢測分析，重組蛋白在D液被洗脫下來(見圖11，12)。收集50mMPB，500mMNaCl，300mM咪唑(pH6.0)重組蛋白洗脫峰，上Sephadex G-25柱脫鹽，轉(zhuǎn)換成50mM Tris-Cl，150mMNaCl緩沖液(pH7.5)。利用Folin-酚法測定蛋白濃度。根據(jù)Invitrogen公司腸激酶(EK)產(chǎn)品使用說明書，加入腸激酶及酶切Buffer，在低溫下腸激酶作用12小時，用SDS-PAGE電泳檢測酶切結(jié)果(見圖11)，可明顯見到hIL-10單體蛋白帶(18kD)和TRX融合伴體蛋白帶(14KD)。反應(yīng)液經(jīng)G-25柱換成50mMPB，100mMNaCl緩沖液(pH6.0)，上SP-Sephadex離子交換柱(見圖13)，收集穿流峰，用50mMPB，500mMNaCl，pH7.5緩沖液洗脫蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析和Western-blot檢測(見圖14)，穿流峰為TRX伴體蛋白，蛋白峰為純化的hIL-10重組蛋白。上G-25柱脫鹽轉(zhuǎn)換成50mMPB，150mMNaCl，pH7.5緩沖系統(tǒng)(PBS)，過濾即可直接用于動物和細(xì)胞實驗。以上每步均做SDS-PAGE電泳檢測，經(jīng)凝膠掃描分析，純度達(dá)95％以上，得率約為10mg/升發(fā)酵液(見圖11)。
本工藝流程操作簡單、快速，只需兩步純化即可獲得高純度的hIL-10重組蛋白，且成本低，效率高，非常適合大規(guī)模生產(chǎn)制備。6.hIL-10重組蛋白的活性檢測據(jù)資料報道，hIL-10是非常有效的抗炎癥藥物，特別是對慢性炎癥有非常明顯的療效。
雌性NIH小鼠，20.0±2.0g，分3組，每組30只，分別為NS組(ip LPS1mg+PBS 0.2ml)、hIL-10低劑量組(ip LPS1mg+hIL-10 150ul)和高劑量組(ip LPS1mg+hIl-10 300ul)。腹腔注射和Not I I給藥后觀察記錄72小時動物死亡數(shù)(見表1)。動物實驗結(jié)果表明，純化的重組hIL-10對內(nèi)毒素引起的小鼠炎癥休克死亡有明顯的保護(hù)作用(p＜0.0001)，作用呈劑量依賴性(見圖15)。表1重組hIL-10對內(nèi)毒素引起的小鼠炎癥休克死亡的保護(hù)作用Tab.1 The protective effect of the recombinant hIL-10 on mice inflammatory lethal induced by endotoxemia組別動物數(shù) 72小時死亡動物數(shù)LPS1mg+PBS 200 μl 30 17LPS1mg+IL-10 150μl 30 9*LPS1mg+IL-10 300μl 30 1***與NS比，*p＜0.05，***p＜0.000權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素-10(hIL-10)基因序列，其特征在于在Human interleukin-10(hIL-10)基因序列中的以下核苷酸位點51，72，78，81，91，94，136，139，142，144，159，193，210，234，249，252，285，294，304，306，310，312，315，318，330，339，342，378，393，423，450，465，471，474，477進(jìn)行密碼子的替換，替換成大腸桿菌偏愛的密碼子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因序列，其特征在于5’端加上AATTC以構(gòu)成EcoR I識別位點，3’端加上AGCTT以構(gòu)成Hind III識別位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基因序列，其特征在于AATTCTCTCCGGGCCAGGGCACCCAGTCTGAGAACAGCTGCACCCACTTCCCAGGTAACC 60TGCCTAACATGCTTCGTGATCTGCGTGATGCCTTCAGCCGTGTGAAGACTTTCTTTCAAAT120GAAGG ATCAGCTGGACAACCTGCTGCTGAAGGAGTCCTTGCTCGAGGACTTTAAGGGTTA180CCTGGGTTGCCAAGCCCTGTCTGAGATGATCCAATTTTACCTGGAGGAGGTGATGCCGCA 240AGCTGAGAACCAGGATCCAGACATCAAGGCGCATGTGAACTCCCTGGGCGAGAACCTTAC 300AGACCTCCGTCTGCGTCTGCGTCGCTGTCATCGTTTTCTTCCGTGCGAAAACAAGAGCAAG360GCCGT GGAGCAGGTGAAGAACGCCTTTAATAAGCTGCAGGAGAAAGGCATCTACAAAGC 420CATGAGCGAGTTTTGACATCTTCATCAACTACATCGAAGCCTACATGACTATGAAAATCC 480GTAACTGAAGCTT
4.一種權(quán)利要求3所述基因序列的上游引物及下游引物，其特征在于上游引物5’CGGGGT ACCGAT GAC GAT GAC AAGTCT CCG GGC CAG GGC 3’下游引物5’TGG CGG CCG CCT TGC CAA GCT TCT ATC AGT TAC GGA 3’
5.一種權(quán)利要求4所述上游引物中的腸激酶切割位點，其特征在于GAT GAC GAT GAC AAG
6.一種權(quán)利要求4所述上游引物中的KpnI識別序列，其特征在于GGT ACC
7. 一種權(quán)利要求4所述下游引物中的Not I識別序列，其特征在于G CGG CCG C
8.一種含有權(quán)利要求3所述基因序列的表達(dá)質(zhì)粒，其特征如下pTRX原核融合表達(dá)載體中含有具優(yōu)化翻譯起始序列TIR的T7強(qiáng)啟動子、TRX伴體蛋白基因、6個組氨酸純化位點的一段組合序列。
9.一種權(quán)利要求8所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，其特征在于將pTRX-hIL-10原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，然后進(jìn)行重組克隆的篩選，獲得大腸桿菌工程菌。
10.一種權(quán)利要求9所述的大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法，其特征在于工程菌于35-39℃搖菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期，取培養(yǎng)菌液按1∶50-100放大培養(yǎng)至菌密度為OD600nm＝0.4-0.8時，加入IPTG和葡萄糖至終濃度分別為0.1-0.5mM和0.1-0.5％，于20-28℃，200-280rpm誘導(dǎo)培養(yǎng)7h-12h，離心收獲菌體。
11.一種權(quán)利要求10誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的菌體所表達(dá)的重組融合蛋白，其特征在于經(jīng)hIL-10重組蛋白的Ni2+-Chelating Sepharose親和層析；再經(jīng)hIL-10重組蛋白的SP-Sephadex陽離子交換層析。
12.一種從權(quán)利要求11所述重組融合蛋白中獲得人白細(xì)胞介素-10的切割方法，其特征在于在2-10℃低溫下以腸激酶作用10-15小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人白細(xì)胞介素－10基因序列的人工合成及含該序列的大腸桿菌，其主要特征在于在Humaninterleukin－10的35個位點進(jìn)行密碼子替換，替換成大腸桿菌偏愛密碼子；并在以上基礎(chǔ)上進(jìn)行pTRX－h(huán)IL－10表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，在大腸桿菌中獲得穩(wěn)定高效表達(dá)，經(jīng)分離純化，制備高純度、高活性的hIL－10重組蛋白。本發(fā)明實現(xiàn)了人白細(xì)胞介素－10的體外表達(dá)，為該物質(zhì)的藥品化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12N1/21GK1408863SQ0112970
公開日2003年4月9日 申請日期2001年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月28日
發(fā)明者徐安龍, 吳文言, 楊紅, 彭立勝, 鐘肖芬, 梁東, 衛(wèi)劍文, 楊文利 申請人:中山大學(xué)