專利名稱：人白細(xì)胞白介素－12重組昆蟲病毒株及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，更具體涉及人白細(xì)胞介素-12重組昆蟲病毒株(AcNPV-hIL12)，還涉及一種表達(dá)人白細(xì)胞介素-12重組昆蟲病毒株的制備方法。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素-12(human lnterlukin12，hIL-12)是人體的重要細(xì)胞因子，也稱之為自然殺傷細(xì)胞刺激因子(NKSF)或細(xì)胞毒性淋巴成熟因子(CLMF)。1989年，Kobayashi等首先分離并純化hIL-12(Kobayashi M，et al.J Exp Med，1989ml70827-845)。1991年，Gubler和Wolf克隆了hIL-12 cDNA全序列，并在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)(Gubler U，et al，Proc Nati Acad Sci USA，1991，884143-4147；Wolf S F，et al，J Immunol，1991，1463047-3081)。hIL-12是由不具基因相關(guān)性的兩個蛋白質(zhì)亞基P35和P40通過二硫鍵相連構(gòu)成一個70KDa的糖蛋白異二聚體。P35亞基有197個氨基酸殘基，分子量為31KDa；P40亞基有306個氨基酸殘基，分子量為40KDa。P35亞基是傳遞信息的功能亞單位(Gubler，at al.JBiol Chem，1995，27011)而P40亞基是hIL-12與細(xì)胞受體結(jié)合的功能蛋白質(zhì)(Gillessen S，et al European Journal of Immunology，1995，251)。IL-12主要是由抗原提呈細(xì)胞產(chǎn)生的一種異二聚體細(xì)胞因子，能顯著增強NK/LAK細(xì)胞的殺傷活性，促進特異性CTL細(xì)胞的啟答能力，誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞大量分泌IFN-γ，啟動TH0細(xì)胞向TH1細(xì)胞的發(fā)育，在抗病毒、抗腫瘤、抗細(xì)胞內(nèi)寄生菌感染、艾滋病等多種疾病中將發(fā)揮重要作用。(Lamont AG，et al，lmmunology Today，1996，17214-217)。
國內(nèi)外學(xué)者(楊林等，微生物學(xué)報，2001，41(1)35-41，魏海明等，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000，20(6)584-587，Kazuaki Takehara et al VeterinaryImmunology and Immunopathology，2000，7715-25)利用昆蟲病毒雙表達(dá)載體共表達(dá)白細(xì)胞介素12雙亞基，或者分別表達(dá)P35、P40亞基(沈惠等，生物工程學(xué)報，1998，14(4)360-364)?；蛘呃孟俨《据d體的E1和E3缺陷區(qū)，分別將P40和P35克隆到E1和E3缺陷區(qū)進行表達(dá)(章衛(wèi)平等，中華醫(yī)學(xué)雜志，1998，78(1)33-36；中國專利CN98126748.3，申請日1998年12月13日)，并將能表達(dá)hIL-12的病毒應(yīng)用于治療。
白細(xì)胞介素-12是目前所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子中對體內(nèi)免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)調(diào)節(jié)作用最強且范圍最廣的一種細(xì)胞因子，參與抗體的抗腫瘤、抗過敏、抗感染過程。目前，美國已將IL-12用于治療艾滋患者和腫瘤患者，現(xiàn)已進入臨床III期。IL-12用于抗利什曼原蟲、抗瘧原蟲，抗結(jié)核病、抗血吸蟲病也已進入動物實驗。1997年，Michael Brunda研究組報道，IL-12對多種腫瘤具有明顯作用，包括對腎瘤、黑色素瘤，Colon腫瘤和14種亞性腫瘤。在將IL-12用于治療小鼠16F16黑瘤的模型中，IL-12注射于患瘤鼠，可抑制腫瘤生長；直接把IL-12注射到腫瘤部位導(dǎo)致腫瘤退化，在長期處理后，腫瘤消退，動物治愈。
雖然研究表明hIL-12有巨大的應(yīng)用前景，并且具有許多制備hIL-12的方法，但是hIL-12的使用存在量的問題，過量的使用會引起機體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生毒性作用。因此，采用基因工程的方法獲得hIL-12用于臨床治療，適時適量提供病人，優(yōu)于基因治療，并且基因治療中存在著導(dǎo)入的病毒安全性的問題。另外，盡管有學(xué)者分別表達(dá)P35、P40亞基，但由于hIL-12中的P35、P40亞基經(jīng)形成二聚體才具有活性。因此，需P35、P40雙亞基共表達(dá)。國內(nèi)外學(xué)者(魏海明等，中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2000，20(6)584-587)也有利用AcNPV系統(tǒng)共表達(dá)P35和P40雙亞基，但P35亞基cDNA是置于P10啟動子下端，P40亞基cDNA置于Polyhedrin啟動子下游。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效表達(dá)人白細(xì)胞介素-12重組昆蟲病毒株，該昆蟲病毒株不會形成P40亞基的過量表達(dá)形成P40同源二聚體。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備高效表達(dá)人白細(xì)胞介素12的重組昆蟲病毒株的制備方法，用該方法制備的重組昆蟲病毒株不會形成P40亞基的過量表達(dá)形成P40同源二聚體，能高效表達(dá)人白細(xì)胞介素-12，并且產(chǎn)生的人白細(xì)胞介素-12對人體是安全可靠的。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明敘述如下本發(fā)明所提供的重組苜蓿銀紋蛾核型多角體病毒屬一株命名為重組AcNPV毒株(AcNPV—hIL12，CCTCC NOV200108)，一種表達(dá)人白細(xì)胞介素-12(hIL-12)的重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒株，其特征是，該重組病毒株插入了人白細(xì)胞介素-12表達(dá)盒，表達(dá)盒包括雙啟動子序列，人白細(xì)胞介素-12的P35亞基DNA編碼序列和P40亞基DNA編碼序列，P35亞基基因位于Polyhedrin啟動子下游，P40亞基基因位于P10 promoter啟動子下游。
本發(fā)明的一種構(gòu)建重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒株的制備方法，其步驟如下a)分加擴增p35亞基DNA片段和p40亞基DNA片段，并分別克隆到pCR2.1載體中，獲得pCR35和pCR40質(zhì)粒。
b)用Bgl II和Bam HI雙酶切pCR40質(zhì)粒，將P40亞基克隆到經(jīng)Bgl II酶切的pAcUW51質(zhì)粒DNA中，獲得pAcUW51-P40質(zhì)粒；c)用Eag I酶切和T4 DNA多聚酶Kelnow片段平頭處理pCR35質(zhì)粒DNA，并將P35亞基克隆到經(jīng)Bam HI酶切的pAcUW51-P40質(zhì)粒中，獲得pAcUW51-IL12質(zhì)粒；d)pAcUW51-IL12質(zhì)粒與致死缺陷型線性苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Sf9細(xì)胞系；e)空斑篩選；f)PCR鑒定重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒株。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選例中，提供了一種構(gòu)建重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒株的方法，其特征是在于該方法包括a)RT-PCR擴增667bp P35亞基片段和1000bp P40亞基片段，將該兩片段分別克隆到pCR2.1載體中，通過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得二種菌株E.coli(pCR35)和E.coli(pCR40)；b)通過用Bgl II和Bam HI二種酶切pCR40質(zhì)粒DNA獲得1000bp P40亞基片段，將該片段克隆到經(jīng)Bgl II酶切的pAcUW51質(zhì)粒DNA中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定獲得含有重組質(zhì)粒pAcUW51-P40的E.coli(pAcUW51-P40)；c)通過用Eag I酶切和T4 DNA多聚酶Klenow片段平頭處理pCR35質(zhì)粒DNA獲得P35亞基片段，將該片段克隆到經(jīng)Bam HI酶切的pAcUW51-P40質(zhì)粒DNA中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定獲得含有重組質(zhì)粒pAcUW-IL12的E.coli(pAcUW51-IL12)；d)pAcUW51-IL12質(zhì)粒DNA和致死缺陷型線性苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因DNA共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞；e)空斑篩選；f)分離重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒株ANPV-hIL12，CCTCC-V200108。
在本發(fā)明中，人白細(xì)胞介素12編碼序列，包括P35亞基和P40亞基的DNA編碼序列。
在本發(fā)明中，人白細(xì)胞介素12表達(dá)盒是指含有IL-12的P35和P40亞基的DNA編碼的序列以及表達(dá)所需元件的序列組成，包括啟動子。
在本發(fā)明中，可提供使用的昆蟲病毒基因DNA是指昆蟲核型多角體病毒基因DNA，優(yōu)選的是苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因DNA，更優(yōu)選的是致死缺陷型線性苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因DNA。
由于IL-12是由P35、P40兩個亞基經(jīng)二硫鍵組成的異源二聚體，只有正確裝配的IL-12才具有生物學(xué)活性，而P35、P40單體均不能發(fā)揮IL-12的生物學(xué)作用，相反P40二聚體還會起拮抗IL-12的作用，因此IL-12雙亞基共表達(dá)載體更具有應(yīng)用價值。
應(yīng)用質(zhì)粒pAcVW51構(gòu)建含hIL-12P35亞基和P40亞基共表達(dá)載體，如果P40亞基在polyhedrin啟動子下游，則在表達(dá)過程中，由于Polyhedrin啟動子是比P10強的啟動子，則P40表達(dá)過量，形成P40同源二聚體，并且P40同源二聚體是IL-12的拮抗劑，P40亞基的過量表達(dá)抑制有生物活性的IL-12的形成，因此，在本發(fā)明中，通過不同的酶切方式，將P40亞基置于P10啟動子下游，而P35亞基位于強啟動子Polyhedrin下游，構(gòu)建出P35亞基相對于P40亞基過度表達(dá)IL-12雙亞基共表達(dá)的昆蟲病毒株，這樣能高效表達(dá)IL-12，且表達(dá)的IL-12安全可靠。本發(fā)明提供的重組AcNPV毒株含有二個啟動子，分別為P10和Polyhedrin啟動子。在hIL-12表達(dá)盒中，P35亞基基因位于Polyhedrin啟動子下游；P40亞基基因位于P10啟動子下游。這種構(gòu)建有利于P35和P40形成二聚體，而避免P40過表達(dá)形成同源二聚體。利用該重組昆蟲病毒能高效表達(dá)人白細(xì)胞介素-12，純化的人白組介素-12適用于腫瘤、細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染性疾病的治療。


圖1.hIL-12 P35、P40亞基PCR產(chǎn)物鑒定圖2.重組質(zhì)粒pCR35的構(gòu)建圖3.pCR35酶切和PCR鑒定圖4.重組質(zhì)粒pCR40的構(gòu)建圖5.pCR40酶切和PCR鑒定圖6.hIL-12P35DNA序列圖7.hIL-12P40DNA序列圖8.重組質(zhì)粒pAcUW51-P40的構(gòu)建圖9.pAcUW51-P40酶切和PCR鑒定圖10.重組質(zhì)粒pAcUW51-ILl2的構(gòu)建圖11.pAcUW51-ILl2酶切和PCR鑒定圖12.重組病毒Ac-hILl2 PCR鑒定具體實施方式
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述
實施例①人白細(xì)胞介素12的P35亞基cDNA和P40亞基cDNA的克隆和鑒定收集經(jīng)PDBu(100nM，Sigma)刺激培養(yǎng)20hKB細(xì)胞，收集細(xì)胞，采用異硫氰酸胍一步法抽提總RNA，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，以其為模板分別采用下述P35和P40引物PCR擴增P35和P40 DNA片段。P35引物P1 TTGATCA ATG TGT CCA GCG CGC AGCCTP2 AGTGACG AGC TAT CTG AAT GCTTCC TAAP40引物P3 AGATCT ATG TGT CAC CAG CAGTTG GTP4 TGGATCCCTA AC TGCAGGG CAC AGATGPCR反應(yīng)總體積50μl。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循環(huán)30次，最后1次循環(huán)在72℃延伸7min。經(jīng)0.8％Agarose電泳檢測，得到單一的667bp P35 cDNA片段和1000bp P40cDNA片段。0.8％Agarose凝膠電泳結(jié)果見圖1。
實施例②重組質(zhì)粒pCR35和pCR40構(gòu)建與鑒定(1)重組質(zhì)粒pCR35構(gòu)建與鑒定將實施例①獲得的hIL-12 P35 cDNA片段克隆至pCR2.1載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α，經(jīng)Ampcillin和Kanamycin雙抗平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。該構(gòu)建重組質(zhì)粒命名為pCR35。pCR35質(zhì)粒構(gòu)建見圖2。重組質(zhì)粒pCR35經(jīng)Eag I單酶切，得到0.7kb和3.8kb二條DNA片段。pCR35經(jīng)Not I單酶切，得到～4.5kb一條DNA片段。另外，用P1、P2引物為引物，以pCR35 DNA為模板，PCR擴增得到0.67kb一條DNA片段。PCR反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃120秒，循環(huán)30次，最后1次循環(huán)在72℃延伸7min。凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符，見圖3。
(2)重組質(zhì)粒pCR40構(gòu)建與鑒定將實施例①獲得hIL-12 P40 cDNA片段克隆至pCR2.1載體中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α，經(jīng)Ampcillin和Kanamycin雙抗平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。該構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pCR40。pCR40質(zhì)粒構(gòu)建見圖4。重組質(zhì)粒pCR40經(jīng)Bgl II和Bam HI雙酶切，得到1.0kb和3.9kb二條DNA片段。pCR40經(jīng)Not I單酶切，得到～4.9kb一條DNA片段。另外，以P3、P4為引物，以pCR40 DNA為模板，PCR擴增，得到1.0kb一條DNA片段。PCR反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循環(huán)30次，最后1次循環(huán)在72℃延伸7min。凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符，見圖5。
實施例③hIL-12 P35和P40序列測定將實施例②獲得pCR35和pCR40經(jīng)全自動測序(ABI 373，PE公司)分析，測序結(jié)果與報道一致(Wolf，S.F，et al.1991，J.1mmunol.1463074-3081)， P35、P40DNA序列分別見圖6、圖7。
實施例④重組質(zhì)粒pAcUW51-P40的構(gòu)建與鑒定用Bgl II和Bam HI雙酶切實施例②獲得的質(zhì)粒pCR40 DNA，獲得1.0kb和3.9kb DNA片段。用Bgl II單酶切質(zhì)粒pAcUW51 DNA，獲得5.9kb DNA片段。采用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收1.0kb和5.9kb DNA片段。用T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α，經(jīng)Amp平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。該構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pAcUW51-P40，見圖8。重組質(zhì)粒pAcUW51-P40經(jīng)Bgl II單酶切，得到6.86kb一條DNA片段。Bam HI單酶切出現(xiàn)6.86kb一條DNA片段。pAcUW51-P40經(jīng)Eco RI單酶切，正向連接出現(xiàn)0.26kb和6.61kb二條DNA片段；反向連接出現(xiàn)6.11kb和0.76kb二條DNA片段。另外，P3、P4為引物，以pAcUW51-P40 DNA為模板，PCR擴增 獲得1.0kb一條DNA片段。PCR反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃ 60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循環(huán)30次，最后1次循環(huán)在72℃延伸7min。凝膠電泳結(jié)果見圖9。
實施例⑤重組質(zhì)粒pAcUW51-IL12的構(gòu)建用Eag I單酶切并用T4 DNA聚合酶Klenow片段平頭處理將實施例②獲得質(zhì)粒pCR35 DNA，獲得0.7kb和3.8kb二條DNA片段。用BamHI單酶切并用T4 DNA聚合酶Klenow片段平頭處理將實施例④獲得質(zhì)粒pAcUW51-P40DNA，獲得6.86kb DNA片段。采用0.8％低熔點瓊脂糖凝膠電泳，回收0.7kb P35cDNA片段和6.86kb DNA片段。用T4DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，經(jīng)Amp平板篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子。該構(gòu)建的重組質(zhì)粒命名為pAcUW51-IL12，見圖10。重組質(zhì)粒pAcUW51-IL12經(jīng)Bgl II單酶切，得到7.59kb DNA片段。pAcUW51-IL12經(jīng)EcoRI單酶切，正向連接出現(xiàn)0.26kb、1.77kb和5.57kb三條DNA片段；反向連接出現(xiàn)0.26kb、1.18kb和6.16kb三條DNA片段。另外，用P1、P2為引物，以pAcUW51-IL12 DNA為模板，PCR擴增，獲得657kjp P33cDNA片段；P3、P4為引物，以pAcUW51-IL12 DNA為模板，PCR擴增，獲得1000bp P40 cNDA片段。凝膠電泳結(jié)果見圖11。
實施例⑥表達(dá)hIL-12重組桿狀病毒AcNPV-hIL12的構(gòu)建將實施例⑤獲得pAcUW51-IL12 DNA與BaculoGoldTMLinearized BaculovirusDNA共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾細(xì)胞Sf9接種2×106個Sf9細(xì)胞于60mm培養(yǎng)皿，在含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，27℃ 50min。將20μl lipofectin和67.5μl無菌水混合，再加入7.5μl 10ng/μl BaculoGoldTM Linearized Baculovirus DNA和5μl 100ng/μl的pAcUW51-IL12。室溫溫育15min。棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用1.5ml不含胎牛血清的完全培養(yǎng)液代替培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液。在培養(yǎng)皿中加入lipofectin-DNA復(fù)合物，27℃溫育4.5h。移棄上述轉(zhuǎn)染緩沖液，換入新的無血清培養(yǎng)基，27℃培養(yǎng)96h，收獲病毒上清。
實施例⑦表達(dá)hIL-12重組桿狀病毒AcNPV-hIL12的純化將從實施例⑥收獲的病毒上清用不含胎牛血清的完全培養(yǎng)液稀釋，按103、104、105、106、107和108的稀釋度感染60mm培養(yǎng)皿(2×106個細(xì)胞)，27℃孵育1.5h后移棄上述培養(yǎng)基，加入4ml 0.5％瓊脂糖(含0.25mg/ml的X-Gal)，待其凝固后，于27℃孵育5d，觀察空斑形成。挑選無色空斑，將其分別收入1ml無血清的完全培養(yǎng)基中。
用無菌吸管挑取一個純的空斑，將瓊脂塊移入100μl無血清培養(yǎng)液的EP管中，接種一含2.5×106Sf9細(xì)胞和5ml含10％胎牛血清完全培養(yǎng)液的25cm2培養(yǎng)瓶中，27℃溫育5天直到細(xì)胞被感染。確定病毒滴度為7×107pfu/ml，將1ml該毒種貯液于凍存管中，-80℃保存。該重組桿狀病毒命名為AcNPV-hIL-12，并于2001年9月14日送交武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為CCTCC-V200108。
實施例⑧表達(dá)hIL-12重組桿狀病毒AcNPV-hIL12的鑒定按照《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F·奧斯伯等，1998，科學(xué)出版社，670-671)中所述方法提取實施例⑦所收獲的重組桿狀病毒DNA。以每瓶1.8×107細(xì)胞的密度接種Sf9細(xì)胞于150cm2培養(yǎng)瓶中。27℃溫育2h，以0.1的感染復(fù)數(shù)用重組桿狀病毒Ac-hIL12感染，4-5天后收集上清，4℃100,000g離心30min，獲得病毒沉淀。用抽提緩沖液(100mmol/L Tris，pH7.5，90mmol/LEDTA，200mmol/LKCl)懸浮，加入45μg/ml蛋白酶K，50℃保溫2h，加入1％N-十二烷基肌氨酸鈉，50℃溫育2h，用等體積的25∶24∶1的份∶氯仿∶異戊的抽提DNA2次。沉淀DNA，用1×TE緩沖液(10mmol/L Tris Cl，1mM EDTA，pH7.4)重懸DNA。加入1/10體積3.0mol/L乙酸鈉和2倍體積100％乙醇重新沉淀DNA。用1×TE緩沖液重懸DNA，保存于4℃。
以重組桿狀病毒DNA為模板，分別采用P1、P2和P3、P4二對引物，PCR方法擴增P35和P40亞基cDNA片段。PCR反應(yīng)總體積50μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，PCR循環(huán)參數(shù)94℃60秒、58℃ 90秒、72℃ 120秒，循環(huán)30次，最后1次循環(huán)在72℃延伸7min。分別得到0.67kb和1.0kb DNA片段。凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符，見圖12。
權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞白介素-12重組昆蟲病毒株，其特征在于重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV—hIL12毒株，CCTCCNO.V200108。
2.根據(jù)權(quán)利要求所述的一種人白細(xì)胞白介素-12重組昆蟲病毒株，其特征在于重組病毒株插入了人白細(xì)胞介素-12表達(dá)盒，表達(dá)盒包括雙啟動子序列，人白細(xì)胞介素-12的P35亞基DNA編碼序列和P40亞基DNA編碼序列，P35亞基基因位于Polyhederin下游，P40亞基基因位于P10 Promoter下游。
3.一種實現(xiàn)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞白介素-12重組昆蟲病毒株的制備方法，其步驟如下A、RT-PCR擴增667bp P35亞基片段和1000bp P40亞基片段，將該兩片段分別克隆到pCR2.1載體中，通過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定，獲得二種菌株E.coli(pCR35)和E.coli(pCR40)；B、通過用BglII和Bam HI二種酶切pCR40質(zhì)粒DNA，獲得1000bp P40亞基片段，將該片段克隆到經(jīng)BglII酶切的pAcUW51質(zhì)粒DNA中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定獲得含有重組質(zhì)粒pAcUW51-P40的E.coli(pAcUW51-P40)C、通過用Eag I酶切和T4 DNA多聚酶Klenow片段平頭處理pCR35質(zhì)粒DNA，獲得667bp P35亞基片段，將該片段克隆到經(jīng)Bam HI酶切和T4DNA多聚酶Klenow片段平頭處理的pAcUW51-P40質(zhì)粒DNA中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定獲得含有重組質(zhì)粒pAcUW51-IL12的E.coli(pAcUW51-IL12)；D、pAcUW51-IL12質(zhì)粒DNA和致死缺陷型線性苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒基因DNA共轉(zhuǎn)染草地貪夜蛾Sf9細(xì)胞，經(jīng)篩選、鑒定獲得重組病毒AcNPV-hIL12。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞白介素-12重組昆蟲病毒株，其特征在于人白細(xì)胞介素-12 P35亞基引物P1TTGATCAATGTGTCCA GCG CGC AGC CTP2AGTGACG AGC TAT CTG AAT GCT TCC TAA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞白介素-12重組昆蟲病毒株，其特征在于人白細(xì)胞介素-12 P40亞基引物P3AGATCTATG TGT CAC CAG CAG TTG GTP4TGGATCC CTA ACT GCA GGG CAC AGA TG。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人白細(xì)胞白介素－12重組昆蟲病毒株及其制備方法,重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV－h(huán)IL12毒株,CCTCC NO.V200108。重組病毒株插入了人白細(xì)胞介素－12表達(dá)盒,表達(dá)盒包括雙啟動子序列,人白細(xì)胞介素－12的P35亞基DNA編碼序列和P40亞基DNA編碼序列,P35亞基基因位于Polyhederin下游,P40亞基基因位于P
文檔編號C12N7/01GK1357622SQ0113363
公開日2002年7月10日 申請日期2001年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月2日
發(fā)明者孟小林, 徐進平, 于在林, 富巖 申請人:武漢大學(xué)