專利名稱：一種克隆基因的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克隆基因的方法及其應(yīng)用。
在器官原基水平上進(jìn)行基因表達(dá)特征的研究是現(xiàn)代分子發(fā)育生物學(xué)的重要內(nèi)容，但目前存在兩個障礙。首先是植物材料的異質(zhì)性。由于植物的器官發(fā)生和早期的形成過程均在莖端以微米的尺度進(jìn)行，人們很難將簇生在莖端的各種不同特征的器官原基分別分離出來進(jìn)行分子生物學(xué)研究。其次，從人們對突變體研究的現(xiàn)狀看，器官形成過程的遺傳控制程序可能比器官特征決定的遺傳控制程序更復(fù)雜，因?yàn)檫€沒有發(fā)現(xiàn)決定器官形成過程的單基因遺傳突變體。只有發(fā)展新的技術(shù)，克服上述兩個障礙，才能真正在認(rèn)識器官形成過程及其調(diào)控的分子機(jī)制上取得實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。而新技術(shù)的核心應(yīng)該是如何從簇生在莖端的各種不同特征的器官原基中特異性地分離得到某一種原基的cDNA。近年人們已經(jīng)能夠從單細(xì)胞或微量的材料中提取RNA、克隆基因，但活的單細(xì)胞或器官原基的獲得通常受到材料特點(diǎn)的限制，如本發(fā)明的發(fā)明人在對黃瓜器官形成的研究中發(fā)現(xiàn)，由于黃瓜子房下位，因此很難通過解剖的方法獲得早期的雌雄蕊原基。同時，活體解剖通常受到操作者個人差異的影響。總之，利用現(xiàn)有的基因克隆方法，很難以某些特殊部位的組織為材料，建立相應(yīng)的cDNA文庫。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種克隆基因的方法，是自被固定在石蠟切片中的生物材料中分離基因，克隆基因。
具體地說，該方法是以被固定在石蠟切片材料中的mRNA為模版，在載玻片止進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆基因。
為了達(dá)到理想的效果，對所利用的石蠟切片應(yīng)進(jìn)行前處理，包括脫蠟、用蛋白酶處理和基因組DNA的酶解。
所述原位反轉(zhuǎn)錄是在載玻片上加上反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及引物后，在載玻片上進(jìn)行。
為對上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行有效的擴(kuò)增，所述原位反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增前，在切片上對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加尾反應(yīng)。
所述加尾反應(yīng)是用TDT末端轉(zhuǎn)移酶在切片上進(jìn)行的。
為了盡可能多地將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA從切片上取下，用不包含Taq酶的PCR反應(yīng)液從切片中提取所述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
本發(fā)明的方法將在構(gòu)建cDNA文庫中得到廣泛的應(yīng)用。用本發(fā)明的方法，不僅能從植物材料的石蠟切片中克隆基因，構(gòu)建cDNA文庫，也能從動物材料的石蠟切片中克隆基因，構(gòu)建cDNA文庫。
石蠟切片技術(shù)經(jīng)過長期的發(fā)展，無論是方法還是設(shè)備都非常成熟。在石蠟切片中，人們能夠很容易地分辨處于不同發(fā)育階段的各種器官原基。本發(fā)明的發(fā)明人研究證實(shí)，經(jīng)過石蠟切片處理的植物材料中，基因仍然具有本來的時空特異性，在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明的發(fā)明人非常巧妙地將石蠟切片技術(shù)與現(xiàn)代的分子雜交、PCR等技術(shù)相結(jié)合，創(chuàng)造性地提出了一種全新的克隆基因的方法，使了解器官形成過程及其調(diào)控的分子機(jī)理成為可能。在植物發(fā)育生物學(xué)研究中，利用本發(fā)明的方法，可以方便地構(gòu)建cDNA文庫，進(jìn)而在器官原基水平上比較正常發(fā)育的原基和受阻的原基在基因表達(dá)特征上的不同，例如可望揭示單性花的分化機(jī)制，證實(shí)其是否是因?yàn)槠鞴傩纬稍缙陔A段發(fā)育受阻的結(jié)果。
過去，cDNA文庫的構(gòu)建通常需要毫克級的植物材料。近年來，構(gòu)建文庫所需要的起始材料量正在逐步降低。目前有的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)能夠從25個細(xì)胞中構(gòu)建cDNA文庫。利用本發(fā)明的方法，能夠準(zhǔn)確、高效、穩(wěn)定地從生物體特殊部位(例如植物的原基)中將基因克隆出來，為發(fā)育生物學(xué)研究的更進(jìn)一步突破提供了可靠的保證。
下面結(jié)合附圖及具體的實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
圖2為經(jīng)EcoRI酶切的質(zhì)粒電泳圖。
圖3-A為CFL基因在黃瓜萼片形成階段幼花中的表達(dá)特征。
圖3-B為CFL基因在黃瓜心皮形成階段幼花中的表達(dá)特征。
圖4-A是利用TUB基因的引物從4個文庫中擴(kuò)增特異片段。
圖4-B是利用CUM1基因的引物從4個文庫中擴(kuò)增特異片段。
圖4-C是利用WER基因的引物從4個文庫中擴(kuò)增特異片段。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、用本發(fā)明的方法構(gòu)建黃瓜的cDNA文庫1、制作石蠟切片1)材料的固定分別取黃瓜的莖尖，不同發(fā)育時期的花芽，葉片及種子萌發(fā)的根尖3mm在FAA固定液(50％乙醇，10％甲醛，5％冰醋酸)中固定，抽氣3-5分鐘后，4固定過夜。
2)石蠟切片F(xiàn)AA固定的材料用系列比例的乙醇(30％，50％，70％，85％，90％，100％，100％)梯度脫水，每級30分鐘。其間可用1％番紅(100％乙醇溶液)進(jìn)行初染。然后再經(jīng)乙醇和二甲苯梯度系列透明，包埋。按常規(guī)方法進(jìn)行切片、展片，切片厚度為12μm。
2、石蠟切片前處理1)脫臘及蛋白酶處理切片經(jīng)二甲苯/乙醇梯度系列脫蠟至100％乙醇，每級10分鐘，再經(jīng)乙醇/水梯度系列入水，每級2分鐘。浸入1×PBS(120mMNaCl，7mMNa2HPO4，3mMNaH2PO4，2.7mM KCl，pH7.4)中5分鐘，用蛋白酶K(Pronase K，Sigma)于37，處理30分鐘，處理濃度為50μg/ml。然后于1×PBS中浸泡2次，每次3分鐘。再經(jīng)乙醇/水系列脫水，自然干燥，-20保存。
2)基因組DNA的消化經(jīng)過前處理的切片上加50U/100μl的RQ1 RNase free DNaseI(Promega)，用塑料膜覆蓋，置于濕盒中。37溫箱中酶解8小時。于1×PBS(經(jīng)DEPC處理)中3次，每次3分鐘。然后乙醇梯度脫水，自然干燥。
3、原位反轉(zhuǎn)錄在經(jīng)過基因組DNA消化的切片上加100μl反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，于42反轉(zhuǎn)錄2小時。1x反轉(zhuǎn)錄緩沖液包含0.01mM的DTT，0.25mM的各種dATP、dCTP、dGTP、dTTP，30U Rnasin，400U Superscript II RNase H-反轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)，引物濃度為1μM，使用自行設(shè)計的用于擴(kuò)增cDNA文庫的引物5’-ATGCGGCCGCT(17)-3’。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在1×PBS中洗2次，每次2分鐘。
4、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNAs)的末端加尾反應(yīng)用TDT末端轉(zhuǎn)移酶(Promega)在切片上進(jìn)行加尾反應(yīng)。在經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄的切片材料上加100μl反應(yīng)液，1×TDT反應(yīng)緩沖液中包含2μM的dCTP，20-60U的TDT轉(zhuǎn)移酶，于37保溫50分鐘。反應(yīng)結(jié)束后放入1×PBS中2次，每次5分鐘，用于洗脫加尾反應(yīng)液。之后經(jīng)過乙醇/水系列脫水，干燥。
5、將加尾過的cDNA轉(zhuǎn)移至eppendoff管將載玻片上的材料圍好，加入PCR反應(yīng)液(Taq酶除外)，包括50mM KCl，10mMTris-HCl(pH9.0)，1.5mM MgCl2，0.1％Triton X-100，0.1％dNTP 0.2mM。引物15’-ATGCGGCCGCT(17)-3’；引物25’-AACTGCAG(13)-3’。經(jīng)65保溫10分鐘和99保溫15分鐘，用于溶解和浸出細(xì)胞中的DNA片段，然后將溶液轉(zhuǎn)入試管中。
6、原位反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增使用上述用于原位反轉(zhuǎn)錄的引物序列和加尾反應(yīng)中所用的序列為PCR引物5’-ATGCGGCCGCT(17)-3’和5AACTGCAG(13)-3’，分別含有Not I和Pst I酶切位點(diǎn)，便于下一步克隆。擴(kuò)增程序?yàn)?4，3分鐘；94，1分鐘，55，30秒，72，30秒，5個循環(huán)；再進(jìn)行94，30秒，55，30秒，72，30秒，35次循環(huán)；72延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物通過0.8％瓊脂糖膠進(jìn)行檢測證實(shí)分離得到大小在300-2000bp之間的cDNA，如

圖1所示，其中1為Marker DL 2000(TaKaRa)；2為正對照，以質(zhì)粒DNA為模板ex為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3為莖尖cDNAs PCR產(chǎn)物經(jīng)過過濾后的二次擴(kuò)增產(chǎn)物；4為幼葉cDNAsPCR產(chǎn)物經(jīng)過過濾后的二次擴(kuò)增產(chǎn)物。
7、cDNA文庫的包裝及酶切檢測將PCR產(chǎn)物經(jīng)過Wizard PCR preps純化系統(tǒng)(Promega)純化后定容于10μl H2O中。
在冰上建立如下反應(yīng)體系2×T4 DNA連接緩沖液5μlpGEM-T Easy Vector 0.5μlPCR產(chǎn)物 3.5μlDNA連接酶 1μl4連接過夜。
8、對包裝的cDNA文庫的檢測將PCR-cDNA產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector載體中，用藍(lán)白斑法檢測其轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果是文庫的滴度達(dá)到3×107。然后隨機(jī)選取若干個單克隆，分別搖菌后提取質(zhì)粒，用EcoR I酶切，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段大小及插入效率，證明其插入效率達(dá)到98％，而插入片段大小在300-1200bp之間，如圖2所示，其中1為DL2000；2-11為經(jīng)EcoR I酶切處理的從cDNA文庫中篩選出的單克窿質(zhì)粒DNA；12為DL15,000。
實(shí)施例2、原位反轉(zhuǎn)錄后cDNA分布仍然具有其本來的時空特異性為了解經(jīng)過蛋白酶K處理及DNA酶消化后，基因是否仍然能夠保持在原位，進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄后的檢測。利用在黃瓜分生組織特異表達(dá)的基因CFL的3’端進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，由圖3-A可見CFL基因在花芽分化的早期在萼片原基及分生組織部位有表達(dá)，在非分生組織部位沒有表達(dá)。圖3-B顯示的是CFL基因在萼片、花瓣、雄蕊和心皮原基部位有表達(dá)，而在其他部位沒有表達(dá)，證實(shí)通過以上各步反應(yīng)后，基因并沒有從細(xì)胞中擴(kuò)散出去，仍然保持在原位。
實(shí)施例3、通過PCR方法從cDNAs中分離基因，檢測用本發(fā)明的方法構(gòu)建的cDNA文庫的可靠性分別利用組成型表達(dá)的基因TUB、在心皮特異表達(dá)的基因CUM1、根中特異表達(dá)的基因WER的引物在用本發(fā)明的方法建立的相應(yīng)的文庫中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測是否能夠從相應(yīng)的庫中擴(kuò)增出特異表達(dá)的基因片段。如圖4-A、圖4-B、圖4-C所示，三個圖中1是Makker DL(TaKaRA)；2是由莖尖擴(kuò)增的產(chǎn)物；3是由幼花庫中擴(kuò)增的產(chǎn)物；4是由根尖庫中擴(kuò)增的產(chǎn)物；5是由成熟葉片擴(kuò)增的產(chǎn)物；6是Maker 100bp ladder(華美)，實(shí)驗(yàn)表明能夠從莖尖、幼花和根尖中得到Tub引物擴(kuò)增的相應(yīng)片段(圖4-A)；能夠從莖尖和幼花庫中擴(kuò)增出CUM1引物的相應(yīng)片段(圖4-B)，因?yàn)榍o尖中也包括了幼小花芽；只能從根尖庫中擴(kuò)增出Wer引物的相應(yīng)片段(圖4-C)。所以用本發(fā)明的方法得到的cDNA文庫是完全正確可信的。
權(quán)利要求
1.一種克隆基因的方法，其特征在于是自被固定在石蠟切片中的生物材料中分離基因，克隆基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述方法是以被固定在石蠟切片材料中的mRNA為模版，在載玻片上進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種克隆基因的方法，其特征在于對所利用的石蠟切片進(jìn)行前處理，包括脫蠟、用蛋白酶處理和基因組DNA的酶解。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述原位反轉(zhuǎn)錄是在載玻片上加上反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液及引物后，在載玻片上進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述原位反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增前，在切片上對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加尾反應(yīng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述加尾反應(yīng)是用TDT末端轉(zhuǎn)移酶在切片上進(jìn)行的。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3或4或5或6所述的一種克隆基因的方法，其特征在于用不包含Taq酶的PCR反應(yīng)液從切片中提取所述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述石蠟切片是植物材料的石蠟切片。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種克隆基因的方法，其特征在于所述石蠟切片是動物材料的石蠟切片。
10.權(quán)利要求1的方法在構(gòu)建cDNA文庫中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的名稱為一種克隆基因的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效、準(zhǔn)確地提取生物體特殊部位基因的方法。本發(fā)明技術(shù)方案是一種克隆基因的方法，是自被固定在石蠟切片中的生物材料中分離基因，克隆基因。具體地說，該方法是以被固定在石蠟切片材料中的mRNA為模版，在載玻片上進(jìn)行原位反轉(zhuǎn)錄，然后利用PCR技術(shù)擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，克隆基因。為了達(dá)到理想的效果，對所利用的石蠟切片應(yīng)進(jìn)行前處理，包括脫蠟、用蛋白酶處理和基因組DNA的酶解。為了使提取的效果更好，原位反轉(zhuǎn)錄后，PCR擴(kuò)增前，在切片上對反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行加尾反應(yīng)。本發(fā)明的方法在構(gòu)建cDNA文庫中將得到廣泛的應(yīng)用。
文檔編號C12P19/34GK1414106SQ0113664
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月24日
發(fā)明者白素蘭, 白書農(nóng) 申請人:北京大學(xué)