專利名稱：電極陣列型基因芯片及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)領(lǐng)域，涉及一種具有對基因進(jìn)行檢測、識別、鑒定、診斷功能的器件。它應(yīng)用于分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)和人類基因組研究，以至臨床診斷等方面。
目前的這些基因芯片，用于基因檢測時普遍存在一個共同的缺點，即需要對被檢測的基因進(jìn)行化學(xué)修飾。這種缺陷一方面使得檢測的過程相對復(fù)雜化，另一方面嚴(yán)重限制了基因檢測在某些方面的應(yīng)用，比如基因的實時檢測、活體基因的檢測等。其次，為了實現(xiàn)對寡核苷酸的精確到一個堿基的檢測，科學(xué)家提出了分子燈塔的方法(參考文獻(xiàn)Sanjay Tyagi and Fred Russell Kramer，(1996)Nature Biotechnology，14303-308)。分子燈塔是兩端有一小段互補堿基序列并在末梢分別用熒光劑和淬滅劑修飾的單鏈DNA，在兩頭的互補堿基序列中間所夾的一段堿基序列作為探測基因。由于分子燈塔兩端的互補堿基序列容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)，它可以形成穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)情況下，熒光劑與淬滅劑相距很近，熒光劑的熒光(必須經(jīng)過一定波長的光的激發(fā))可以被淬滅劑吸收，從而觀測不到熒光信號。當(dāng)中間的那段探測基因與目標(biāo)DNA完全配對雜交后，分子燈塔的環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞，熒光劑和淬滅劑被分離開來，從而使得淬滅劑無法淬滅熒光劑的熒光，以達(dá)到檢測DNA雜交的目的。正是由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得利用分子燈塔設(shè)計的探針DNA具有鑒別一個錯配堿基的目標(biāo)DNA的能力。目前已有人將這種分子燈塔固聯(lián)到固體表面(參考文獻(xiàn)Xiaohong Fang，XiaojingLiu，Sheldon Schuster，and Weihong Tan，(1999)J.Am.Chem.Soc，1212921-2922)，但其檢測手段仍然是熒光方法，并且沒有給出其檢測的靈敏度的情況，也沒有表明其方法具有可復(fù)用性。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述電極陣列型基因芯片的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的電極陣列型基因芯片，選用金絲或表面鍍金的金屬絲作為電極，電極排成陣列并固定在芯片基底上；電極的一端整齊地暴露在芯片基底的一側(cè)，用作探針的探頭，部分或全部探頭表面生長并固化有探測基因；電極的另一端整齊地暴露在芯片基底的另一側(cè)，用作引腳；構(gòu)成具有多個電極引腳和探頭的可檢測的基因芯片。
所述的芯片基底選自在常溫(20攝氏度)下為固態(tài)的絕緣材料，如塑料、有機玻璃、硅片、樹脂、合成材料等。
所述探頭表面生長并固化的探測基因為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因。
本發(fā)明的電極陣列型基因芯片的制備方法如下(1)選擇金絲或表面鍍金的金屬絲為電極的原始材料。若選擇金絲為探針的原始材料，須進(jìn)行預(yù)處理，以使金表面盡可能光滑。預(yù)處理可采用如下方法用鋁粉打磨金表面，直到其表面光滑為止，然后先用雙蒸水沖洗3-5次，并用酒精浸泡，密封后放入超聲波振蕩器內(nèi)，清洗10～20分鐘；用酒精溶液清洗3-5次后，把金絲泡入濃硫酸與雙氧水的混合溶液(7∶3)，密閉振蕩直到白沫出現(xiàn)5分鐘后，便可取出金絲，用雙蒸水沖洗3-5次，氮氣密封保存。若電極原始材料為表面鍍金的金屬絲，不必作上述預(yù)處理，但須在金屬絲鍍金后氮氣密封保存。
(2)將電極嵌入方形芯片基底形成N×N的陣列，N為自然數(shù)，電極的一端整齊地暴露在芯片基底的一側(cè)，用作探針的探頭；電極的另一端整齊地暴露在芯片基底的另一側(cè)，用作引腳，在檢測時插入檢測接口底座；根據(jù)檢測目的，在N2個探頭中選擇M個探頭預(yù)備分別固化M種探測基因，每個探頭上只固化一種探測基因，M代表所需探測基因的種類，為小于或等于N2的自然數(shù)。如果M等于N，則可在每一行的探頭上預(yù)備固化一種探測基因。
(3)將依基因檢測目的設(shè)計并合成的M種探測未知基因的DNA配成溶液，溶劑為可以保持DNA活性的常用生化緩沖劑，推薦使用含1mM的鈉離子或鎂離子的20mM的Tris-HCl緩沖液(pH＝8.0)；該DNA的5′端修飾巰基，分置于N×N的陣列微容器中，M種探測DNA溶液在陣列微容器的分布根據(jù)基因檢測目的確定；(4)固聯(lián)探測DNA對應(yīng)于微容器，把芯片探頭浸入探測DNA溶液，4攝氏度環(huán)境下靜置12小時以上，實現(xiàn)探測DNA的固聯(lián)，探測DNA在探頭表面的覆蓋率控制在0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2的范圍內(nèi)；(5)修飾氧化還原指示劑取出芯片，清洗后，把芯片探頭浸入包含在0～-0.6V偏壓下表現(xiàn)出氧化還原活性的分子的氧化還原指示劑溶液中，溶劑與步驟(3)中溶解DNA的溶劑相同，室溫下靜置12小時以上；即制得電極陣列型基因芯片。
所述制備方法中，芯片基底選自在常溫(20攝氏度)下為固態(tài)的絕緣材料，如塑料、有機玻璃、硅片、樹脂、合成材料等。
所述制備方法中，如果要求基因檢測達(dá)到鑒別一個突變堿基的精確度，則探測DNA應(yīng)設(shè)計為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，該DNA的3′端可修飾氨基。如附

圖1所示。
所述制備方法中，芯片探頭固聯(lián)探測DNA時，在探測DNA溶液中靜置的時間為24小時以上。
所述制備方法中，氧化還原指示劑推薦使用硫肼(Thionine)，或亞甲基蘭(Methylene Blue)。
所述制備方法中，芯片的探頭固聯(lián)探測DNA以后，還可以進(jìn)行連接PDC步驟，然后再修飾氧化還原指示劑，以增強探頭的穩(wěn)定性，連接PDC的方法如下芯片清洗后，把芯片探頭浸入PDC(0.2％ 1，4-phenylene diisothiocyanate，溶劑為DMF溶液，還含有10％的吡啶)溶液，充入氮氣后密封，在室溫下靜置2小時以上，優(yōu)選的靜置時間為5小時，再把芯片從PDC溶液中取出并用純的DMF溶液清洗。
制備后的芯片探頭應(yīng)當(dāng)保存在氧化還原指示劑溶液中。
本發(fā)明的使用中，所有制備及檢測過程均應(yīng)使用同一種氧化還原指示劑和緩沖劑。
本發(fā)明的電極陣列型基因芯片檢測分析方法如下在檢測時，雜交液采用20mM的Tris緩沖液，pH＝8.0，含50～100nM的TH，在37攝氏度下適度雜交。雜交后，在三電極系統(tǒng)中進(jìn)行檢測。對電極為Pt電極，參比電極為Ag-AgCl電極。電解液為20mM的Tris緩沖液，pH＝8.0，含1mM的鎂離子。掃描參數(shù)設(shè)置為最低電壓-0.3V，最高電壓0V，起始電壓0V，掃描速度0.1V/s，取樣間隔0.001V。
從雜交液中取出基因芯片，將基因芯片插入檢測接口底座，對探針陣列進(jìn)行逐行線性伏安掃描，取得每個電極引腳的ΔIpeak(37℃)值，ΔIpeak如附圖6所示。然后再將基因芯片從檢測接口底座上拔出，放回雜交液，溫度調(diào)至20攝氏度，靜置20～30分鐘，再重復(fù)上述檢測，同樣取得相應(yīng)的ΔIpeak(20℃)值，由此可以得到每個電極引腳的S值，這些標(biāo)志量被采集到計算機中可供基因芯片分析軟件分析。其中，S＝(ΔIpeak(20℃)-ΔIpeak(37℃))/ΔIpeak(37℃)。根據(jù)我們的科學(xué)研究結(jié)果表明，如果探測DNA與目標(biāo)DNA完全配對，則S在區(qū)間(-0.05，0.05)內(nèi)，否則，S大于0.1。由此法則便可判斷基因檢測的結(jié)果。
上述檢測方法不會破壞電極引腳的檢測活性，每次使用后，經(jīng)過甲醛或尿素溶液洗脫后，可以反復(fù)使用5～10次。
本發(fā)明的巧妙之處在于利用探測DNA尤其是發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測DNA(分子燈塔)來修飾電極，然后將這些電極按要求組裝成陣列，并固定在芯片基底，得到本發(fā)明的電極陣列型基因芯片。由此帶來了如下優(yōu)點和積極效果首先，這種基因芯片不需要對目標(biāo)基因做任何修飾，從而大大簡化了檢測、識別的過程；其次，這種基因芯片具有理想的高靈敏度，能夠鑒別具有一個錯配堿基的基因，這是大多數(shù)基因檢測方法所不及的；第三，這種芯片使相鄰的基因探針尖不會形成串?dāng)_，因而用此芯片對基因進(jìn)行檢測、識別、鑒定、診斷會得出準(zhǔn)確可信的結(jié)果，即高可靠性；第四，這種基因芯片具有良好的復(fù)用性，一般可以重復(fù)使用5至10次。
本發(fā)明提供了對基因進(jìn)行檢測、識別、鑒定、診斷的優(yōu)良生物材料，可廣泛引用于分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、人類基因組研究，以至臨床診斷等方面。
37 參比電極圖6為線性掃描伏安曲線圖
(3)將事先設(shè)計并合成的4種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測DNA配成溶液，溶劑為含1mM的鎂離子的Tris緩沖液，pH＝8.0，該DNA的3′端修飾氨基，5′端修飾巰基，分置于如圖3所示的4×4的陣列型微容器中，圖3(a)為陣列型微容器的垂直投影圖，圖3(b)為陣列型微容器的側(cè)面投影圖，陣列型微容器型基底17上有微容器陣列18，每行容器加入一種探測基因的溶液19。
(4)如圖4(a)所示，組裝發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA對應(yīng)于陣列型微容器，把芯片的電極陣列探頭浸入發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測DNA溶液20中，4攝氏度環(huán)境下靜置24小時，實現(xiàn)DNA的固聯(lián)組裝，將DNA在金表面的覆蓋率控制在0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2的范圍內(nèi)。
(5)組裝完畢后，取出電極芯片，先用雙蒸水清洗3次，再用酒精清洗3次后，如圖4(b)所示，連接PDC把電極芯片探頭浸入PDC溶液(0.2％ 1，4-phenylene diisothiocyanate，溶劑為DMF溶液，還含有10％的吡啶)21中，充入氮氣后密封，在室溫下靜置5小時。
(6)把芯片從PDC溶液21中取出后，先用純的DMF溶液清洗3-5次，再用雙蒸水清洗3-5次，如圖4(c)所示，修飾氧化還原劑TH把芯片探頭浸入TH(硫肼，Thionine)溶液22中，溶劑為含0.1mM的鎂離子的Tris緩沖液，pH＝8.0，室溫下靜置12小時以上。即制得一個4×4電極陣列型基因芯片。
雜交結(jié)束后，從雜交液中取出基因芯片，采用如圖5所示的三電極系統(tǒng)中進(jìn)行檢測。如圖5(b)所示，為檢測系統(tǒng)示意圖，被檢測的基因芯片31的引腳插入檢測基因芯片的接口底座34上的插槽24中，接口底座34通過逐行掃描邏輯控制電路模塊27聯(lián)至電化學(xué)工作站或線性掃描伏安儀29，被檢測的基因芯片31的基因探頭36浸入盛有電解液33的電解池32中。對電極35為Pt電極，參比電極37為Ag-AgCl電極。電解液33為20mM的Tris緩沖液，pH＝8.0，含1mM的鎂離子。檢測基因芯片的接口底座及電路如圖5(a)所示，底座的基底25上有基因芯片引腳的插槽24，通過電路23與逐行掃描邏輯控制電路模塊27連接。
對電極陣列進(jìn)行逐行線性伏安掃描，掃描參數(shù)設(shè)置為最低電壓-0.3V，最高電壓0V，起始電壓0V，掃描速度0.1V/s，取樣間隔0.001V，得到如圖6所示的線性掃描伏安曲線，從而獲得每個電極引腳的ΔIpeak(37℃)值。然后再將基因芯片從檢測接口底座上拔出，放回雜交液，溫度調(diào)至20攝氏度，靜置20～30分鐘，再重復(fù)上述檢測，同樣取得相應(yīng)的ΔIpeak(20℃)值，由此可以得到每個電極引腳的S值，這些標(biāo)志量被采集到計算機28中可供基因芯片分析軟件分析。其中，S＝(ΔIpeak(20℃)-ΔIpeak(37℃))/ΔIpeak(37℃)。正常P53基因可完全雜交，15個探頭的S值都在(-0.05，0.05)區(qū)間。若某電極引腳的S值大于0.1，則對應(yīng)的基因片段存在突變位點，有癌變的可能。該方法可用于癌癥早期診斷。
為了檢測這些基因，可設(shè)計如下四種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因(a’)5′-AAAAGCTCGCGTTCATGCCGCCCATAGCGAGC-3′(b’)5′-AAAACGACGCAGGTCTTGGCCAGTGCTCG-3′(c’)5′-AAAAGCACGCTGAGGAGGGGCCAGACGTGC-3′(d’)5′-AAAAGCTCGCCCGCCCATGTTCATGAGCGAGC-3′故可設(shè)計帶有4×4的引腳和探頭的電極陣列型基因芯片(圖2)，第一行的四個探頭均固聯(lián)(a’)種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因，第二行的四個探頭均固聯(lián)(b’)種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因，第三行的四個探頭均固聯(lián)(c’)種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因，第四行的四個探頭均固聯(lián)(d’)種發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因。檢測后，求出每個電極單元的S值。正常情況下，9個S值都應(yīng)在(-0.05，0.05)區(qū)間，若某行四個電極單元的S值在全部大于0.1，則說明此行對應(yīng)的待檢測基因不存在于被檢測溶液中，即該基因片段存在突變位點。檢測過程同實例3。
權(quán)利要求
1.電極陣列型基因芯片，其特征在于選用金絲或表面鍍金的金屬絲作為電極，電極排成陣列并固定在芯片基底上；電極的一端整齊地暴露在芯片基底的一側(cè)，用作探針的探頭，部分或全部探頭表面生長并固化有探測基因；電極的另一端整齊地暴露在芯片基底的另一側(cè)，用作引腳；構(gòu)成具有多個電極引腳和探頭的可檢測的基因芯片。
2.如權(quán)利要求1所述的電極陣列型基因芯片，其特征在于芯片基底選自在常溫下為固態(tài)的絕緣材料。
3.如權(quán)利要求1所述的電極陣列型基因芯片，其特征在于探頭表面生長并固化的探測基因為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測基因。
4.制備如權(quán)利要求1所述的電極陣列型基因芯片的方法，步驟包括(1)選擇經(jīng)預(yù)處理的金絲或表面鍍金的金屬絲為電極的原始材料；(2)將電極嵌入方形芯片基底形成N×N的陣列，N為自然數(shù)，電極的一端整齊地暴露在芯片基底的一側(cè)，用作探針的探頭；電極的另一端整齊地暴露在芯片基底的另一側(cè)，用作引腳，在檢測時插入檢測接口底座；(3)將依基因檢測目的設(shè)計并合成的M種探測未知基因的DNA配成溶液，溶劑為含1mM的鈉離子或鎂離子的Tris緩沖液，pH＝7.0～8.0；該DNA的5′端修飾巰基，分置于N×N的陣列微容器中，M種探測DNA溶液在陣列微容器的分布根據(jù)基因檢測目的確定；M為自然數(shù)，代表探測DNA的種類，M≤N2；(4)固聯(lián)探測DNA對應(yīng)于微容器，把芯片探頭浸入探測DNA溶液，4攝氏度環(huán)境下靜置12小時以上，實現(xiàn)探測DNA的固聯(lián)，探測DNA在探頭表面的覆蓋率控制在0.1×10-10～0.5×10-10mol/cm2的范圍內(nèi)；(5)修飾氧化還原指示劑取出芯片，清洗后，把芯片探頭浸入包含在0～-0.6V偏壓下表現(xiàn)出氧化還原活性的分子的氧化還原指示劑溶液中，溶劑為含0.1mM的鎂離子的Tris緩沖液，pH＝7.0～8.0，室溫下靜置12小時以上；即制得電極陣列型基因芯片。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于芯片基底選自在常溫下為固態(tài)的絕緣材料。
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于探測DNA為發(fā)夾結(jié)構(gòu)的探測DNA，該DNA的3′端還修飾氨基。
7.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于芯片探頭固聯(lián)探測DNA時，在探測DNA溶液中靜置的時間為24小時以上。
8.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于氧化還原指示劑為硫肼或亞甲基蘭。
9.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于芯片的探頭固聯(lián)探測DNA以后，還要進(jìn)行連接PDC步驟，然后再修飾氧化還原指示劑，連接PDC的方法如下芯片清洗后，把芯片探頭浸入PDC(0.2％ 1，4-phenylene diisothiocyanate，溶劑為DMF溶液，還含有10％的吡啶)溶液，充入氮氣后密封，在室溫下靜置5小時以上，再把芯片從PDC溶液中取出并用純的DMF溶液清洗。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于芯片的探頭連接PDC時，在室溫下靜置時間為5小時以上。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種電極陣列型基因芯片及其制作方法,屬于生命科學(xué)領(lǐng)域,涉及一種具有對基因進(jìn)行檢測、識別、鑒定、診斷功能的器件。該基因芯片選用金絲或表面鍍金的金屬絲作為電極,電極排成陣列并固定在芯片基底上;電極的一端用作探針的探頭,部分或全部探頭表面生長并固化有探測基因;電極的另一端用作引腳。其制備方法為:將電極嵌入方形芯片基底形成陣列,電極的一端作探頭,另一端作引腳;將依基因檢測目的設(shè)計合成的探測基因配成溶液;在探頭上固聯(lián)探測基因、并修飾氧化還原劑。該基因芯片的電極利用探測基因修飾,使得檢測過程簡化,應(yīng)用廣泛,克服探針斷裂或探針間串?dāng)_問題,提高檢測可靠性。
文檔編號C12Q1/68GK1366075SQ0113695
公開日2002年8月28日 申請日期2001年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月26日
發(fā)明者毛有東, 歐陽頎 申請人:北京大學(xué)