專利名稱：一種從可更新的原料制備發(fā)酵培養(yǎng)基的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從可更新的原料制備發(fā)酵培養(yǎng)基的特定方法。
更具體地說，本發(fā)明涉及一種加工可更新的原料的特定方法，使得該原料可以直接在發(fā)酵中用于生產(chǎn)高純度的代謝物，而不必要進行多個費時且昂貴的提純步驟來分離代謝物。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明的公開中，術(shù)語“可更新的原料”指來自食品工業(yè)的廢料，它是廉價的、未精制的且通常是無毒的，并富含氮和碳源。
在本發(fā)明的公開中，術(shù)語“代謝物”指通過能直接被微生物同化的碳源發(fā)酵而轉(zhuǎn)變得到的產(chǎn)物。它們是有利的代謝物，選自有機酸、維生素、氨基酸和抗生素，優(yōu)選有機酸，例如L-乳酸。
通常認(rèn)為，所述可更新的原料的選擇是基于其可行性、成本和達到高產(chǎn)率的潛力。
還認(rèn)為，發(fā)酵培養(yǎng)基必須含有碳源和氮源，并向其中加入礦物質(zhì)和有機鹽。
“碳源”可以從可更新的原料獲得，例如糖漿，來自小麥、玉米、大米、木薯或馬鈴薯的淀粉水解物，但“能直接被同化的碳源”是從所述碳源精制或純化得到的糖，例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和糊精。
“氮源”或蛋白質(zhì)類營養(yǎng)素的例子是酵母抽提物、玉米漿、非變性乳品、糖漿蛋白、肉羹或豆粉。但是，通常優(yōu)選使用酵母抽提物作為氮源，并提供額外的維生素和礦物質(zhì)。
包括“能直接被同化的碳源”即葡萄糖或蔗糖的或包括酵母抽提物的發(fā)酵培養(yǎng)基可以基本上用于多種發(fā)酵方法，例如用于生產(chǎn)有機酸的發(fā)酵方法，有機酸例如乳酸、丙酸、葡糖酸、檸檬酸等酸類，基礎(chǔ)氨基酸，例如賴氨酸，抗生素或任何其它有工業(yè)價值的代謝物。
這些培養(yǎng)基還適用于生產(chǎn)生物量(例如，用于制備乳酸酵素(lactic ferments))。
但是，認(rèn)為這些培養(yǎng)基的缺點是不能從它們外推以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)相同的經(jīng)濟可行的代謝物(因為難以提供具有標(biāo)準(zhǔn)組成的培養(yǎng)基，和因為從隨后純化步驟產(chǎn)生的額外費用)。
為了降低成本，所以必須選擇使用這樣的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中氮源或烴源的一種通過價廉的原料提供，并對發(fā)酵培養(yǎng)基的其它組分進行精制或純化。
為了制備有機酸例如乳酸，例如-美國專利5416020描述了一種從乳清和乳清的滲透物制備L-乳酸的方法，但酵母抽提物也在二價錳的存在下加入，其含有戴爾布呂克氏乳桿菌保加利亞亞種ATCC 55163(Lactobacillus delbrueckiisub.bulgarious)的突變菌株，其基本上制得L-乳酸。
乳清的滲透物確實含有75-80重量％的乳糖，但不含有任何大量的蛋白質(zhì)。所以其缺乏對于微生物的生長所必要的氮源。因此需要加入酵母抽提物。所加入的乳清基本上含有約65-70重量％的乳糖。
然后酵母抽提物提供了含有營養(yǎng)素的發(fā)酵培養(yǎng)基，其不能通過乳清的滲透物或乳清本身來充足地供應(yīng)。
美國專利4467034顯示可能從作為原料的乳清制備乳酸，使用新菌株保加利亞乳桿菌DSM 2129。
但是，乳清必須仍然具有額外的氮源，即肉羹、玉米漿或豆粉，并含有維生素和無機鹽。
盡管在以上條件下使用這些發(fā)酵培養(yǎng)基會略微降低所用原料的成本，但需要慎重地選擇氮/碳比例的組合，以及為達到有效產(chǎn)率所必需的添加劑。
此外，這些“重組”的培養(yǎng)基不適合生產(chǎn)高純度的代謝物，例如乳酸，其必須然后通過許多標(biāo)準(zhǔn)方法來分離和提純，例如膜分離、離子交換、溶劑萃取、電滲析和乳酸鹽的沉淀。
在用乳桿菌(Lactobacillus)制備光學(xué)純的乳酸方面，美國專利4769329解釋了為了促進微生物的生長，必要的是加入許多不能自己生產(chǎn)的物質(zhì)，例如生物素、維生素B1、煙酸、吡哆胺、對氨基苯甲酸、泛酸和維生素B12。
以上組分必須以復(fù)合培養(yǎng)基的形式加入，例如由MAN、ROGOSA和SHARPE開發(fā)的MRS培養(yǎng)基，盡管該方法不能用于工業(yè)生產(chǎn)乳酸(因為成本過高，且難以獲得標(biāo)準(zhǔn)組成的培養(yǎng)基)。
復(fù)合培養(yǎng)基例如制糖甜菜、或蔗糖蜜或玉米漿，它們盡管能促進細(xì)菌的生長，但是不能用于制備光學(xué)純的乳酸，因為它們本身含有顯著量的外消旋乳酸。
光學(xué)純的酸可以從所述的外消旋混合物僅僅通過沉淀和重結(jié)晶D-乳酸和L-乳酸的鹽來獲得，該方法是復(fù)雜且昂貴的。
為了得到光學(xué)純的乳酸，美國專利4769329建議使用baker酵母作為維生素、氮、糖和痕量礦物元素的來源。該培養(yǎng)基還含有葡萄糖、蔗糖或乳糖作為碳源，它們能直接被同化，并能轉(zhuǎn)化成乳酸。
所以必要的是恢復(fù)使用精制的且昂貴的培養(yǎng)基來生產(chǎn)高純度代謝物，在這種情況下是光學(xué)純的高純度乳酸。
已提出許多解決方案來嘗試解決上述現(xiàn)有技術(shù)的問題。
第一個解決方案是使用對特定發(fā)酵條件有特殊抵抗力的微生物，或使用微生物的混合物。第二個解決方案是對可更新的原料進行預(yù)處理。這兩個解決方案也可以組合。
在美國專利4963486中，例如使用玉米作為可更新的原料，這受限于其與Rhizopus oryzae的組合，它具有貢獻用于糖化原料的酶以及用于將其發(fā)酵制成L-乳酸的獨特能力。
發(fā)酵在20-40℃溫度下進行，優(yōu)選30℃。必須加入中和劑以穩(wěn)定pH值。碳酸鈣是優(yōu)選的，因為它具有形成乳酸鈣的特定特征，乳酸鈣在4℃下沉淀，并能選擇性地回收高純度乳酸。
但是純化乳酸的方法不是最優(yōu)化的，因為該方法產(chǎn)生大量對環(huán)境有害的石膏。
美國專利5464760指出通常是無毒的并能直接發(fā)酵的食品廢產(chǎn)品的充足供應(yīng)，提供了大量和濃縮的用于各種需氧和厭氧細(xì)菌的碳和氮源。乳酸然后可以直接從乳清、糖甘蔗或制糖甜菜通過各種乳桿菌類型的乳酸菌，通過從玉米、馬鈴薯或大米中水解淀粉，然后用所述微生物進行生物轉(zhuǎn)化而以高產(chǎn)率制得。
但是，必要的是使用乳酸菌的五種菌株的混合培養(yǎng)基并進行糖化和發(fā)酵。
淀粉被部分液化，然后經(jīng)受特定的pH和溫度條件，該條件能使葡糖淀粉酶同時作為乳酸菌而被引入。
但是不建議使用該解決方案，因為認(rèn)為水解的淀粉，例如從馬鈴薯廢料制得的馬鈴薯的水解產(chǎn)物，或從任何淀粉生產(chǎn)者得到的葡糖漿，通常含有最高5％的“糖雜質(zhì)”，即戊糖、麥芽糖和寡糖，其在發(fā)酵結(jié)束時保持未使用，或被轉(zhuǎn)化成其它副產(chǎn)物例如乙酸，這引起在隨后純化步驟中的問題。
仍然必要的是加入另一種基于有機和無機鹽和酵母抽提物的營養(yǎng)素。
根據(jù)MOTOYOSHI等人在Appl.Environ.Microbiol，1986，52(2)，314-319中所述，甚至必要的是當(dāng)在發(fā)酵培養(yǎng)基中形成乳酸時，通過連續(xù)電滲析除去乳酸，以避免所引入的微生物群體不平衡。
相似地，TIWARI等在Zbl.Bakt.II.Abt.Bd.，134，544-546(1970)中描述了使用含有保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌、含有或不含戴爾布呂克氏乳桿菌的、以及含有稀釋糖漿的混合培養(yǎng)基來生產(chǎn)乳酸。
該技術(shù)用于試圖提高從糖漿制備乳酸的產(chǎn)率。
但是，該產(chǎn)率至多不超過57.9％，且菌株通常在其相應(yīng)的生產(chǎn)容量方面互相干擾。
至于第二個解決方案，其包括對可更新的原料的特殊處理，美國專利3429777發(fā)明的一個目的是利用乳酸鎂的突出特性，即從含有足夠純度的糖漿的發(fā)酵培養(yǎng)基中自發(fā)結(jié)晶，從而由所述乳酸鎂生產(chǎn)高純度的乳酸。
所以，與文獻中所述的常用方法例如使用鈣的方法相比，看來使用鎂的方法較簡單和較經(jīng)濟。但是，乳酸鎂在“加糖的原液”中的純度確實隨著所用可更新的原料的性質(zhì)和質(zhì)量而變化，即使其質(zhì)量比乳酸鈣的質(zhì)量好。
最后，第三個解決方案包括允許使用微生物和對引入發(fā)酵培養(yǎng)基的可更新原料進行處理。
例如，通常推薦淀粉作為便宜的碳源，但不是所有微生物能都對其起代謝作用，而大多數(shù)微生物能代謝葡萄糖。
所以，在FR2635534中所述的方法在至少一種糖化淀粉酶的存在下進行乳酸發(fā)酵，但其中沒有公開任何從以這種方式處理的發(fā)酵培養(yǎng)基清除雜質(zhì)的方法。
MANHEIM和CHERYAN在JAOCSS，69，12，1992中描述了可控地使用水解酶和用于分離特定的麥谷蛋白級分的膜技術(shù)。這些技術(shù)還可以推廣到大豆。
為了促進從麥谷蛋白粉得到的蛋白質(zhì)食品的更廣泛應(yīng)用，研究小組開發(fā)了使用蛋白酶來改進其部分功能性能。
但是，沒有描述或暗示在發(fā)酵工業(yè)中使用這些蛋白質(zhì)，或從所述發(fā)酵培養(yǎng)基制備容易純化的代謝物。
其它策略沒有顯著改進發(fā)酵培養(yǎng)基，而是保證生產(chǎn)菌株的生長以加快微生物產(chǎn)生的速率和對乳酸高濃度的抵抗性。
為此目的的傳統(tǒng)途徑是生物量循環(huán)和固定細(xì)胞。
在這種情況下，乳酸必須在生成時被回收，以防止其抑制細(xì)菌的生長和產(chǎn)生。
各種與發(fā)酵組合的技術(shù)已用于從發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)地除去乳酸，即滲析、電滲析、離子交換樹脂、兩種顆粒的流化床生物反應(yīng)器、反向滲透和液液萃取。
但是，培養(yǎng)基的成本則占總生產(chǎn)成本的30％以上。所以，價廉的營養(yǎng)素是必要的。
所以顯然的是，已進行許多嘗試來降低生產(chǎn)高純度代謝物例如乳酸的成本。
但是，從上述討論可見，仍然需要簡單有效的通過發(fā)酵來生產(chǎn)易于提純的代謝物的方法，且不需要使用許多復(fù)雜和昂貴的工藝步驟來制備發(fā)酵培養(yǎng)基或從發(fā)酵培養(yǎng)基回收所述代謝物。
所以，必要的是開發(fā)能清除所有雜質(zhì)的發(fā)酵條件，這些雜質(zhì)通常伴隨著經(jīng)濟可行的代謝物的生產(chǎn)而產(chǎn)生且最重要的是使其純化復(fù)雜化。
在乳酸的情況下，這些雜質(zhì)意味著已經(jīng)存在于可更新的原料中的D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物，以及所有上述在發(fā)酵結(jié)束時堵塞培養(yǎng)基的“糖雜質(zhì)”。
發(fā)明概述對于開發(fā)比現(xiàn)有方法對實際限制有更好的解決途徑的方法，申請人已發(fā)現(xiàn)該目的可以通過這樣的方法來實現(xiàn)，該方法包括通過酶催步驟和特定的分離步驟的組合來處理可更新的原料，其中酶催步驟用于從其中釋放出能直接被微生物同化的碳源和氮源，特定的分離步驟通過微量過濾和納米級過濾或電滲析來進行，以從培養(yǎng)基中除去可能改變要分離的代謝物的質(zhì)量和能阻礙和/或使隨后的純化步驟復(fù)雜化的所有組分。
那么，申請人開發(fā)的方法可以有利地用于生產(chǎn)任何經(jīng)濟可行的代謝物，優(yōu)選生產(chǎn)選自有機酸、維生素、氨基酸和抗生素的代謝物。
根據(jù)本發(fā)明的方法特別適用于制備選自有機酸的代謝物，優(yōu)選L-乳酸。
如下所述，申請人開發(fā)的方法可以同樣地用于生產(chǎn)經(jīng)濟可行的微生物群體，因為其提供沒有可能污染所述群體的雜質(zhì)或沒有特定的生長抑制劑的發(fā)酵培養(yǎng)基。
本發(fā)明的從可更新的原料制備用于生產(chǎn)高純度代謝物的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法的特征在于其包括a)任選地處理所述的可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并清除不溶性雜質(zhì)，
b)獨立地或組合使用選自納米級過濾和電滲析的技術(shù)，以從所述可更新的原料除去低分子量雜質(zhì)，而不改變能被直接同化的碳源的濃度，c)對已通過上述方式除去低分子量雜質(zhì)的原料進行處理，以便補充能被微生物直接同化的碳源或氮源，和d)回收所得的發(fā)酵培養(yǎng)基。
具體實施方案的描述本發(fā)明的第一步任選地包括處理可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并從其中清除不溶性雜質(zhì)。
上述處理可以根據(jù)可更新的原料的性質(zhì)而變化。
在本發(fā)明方法的第一個實施方案中，可更新的原料選自生產(chǎn)淀粉例如從來自麥、玉米、木薯、馬鈴薯的淀粉所得到的副產(chǎn)物，或者加工大麥和豆等得到的副產(chǎn)物。
例如生產(chǎn)麥淀粉的副產(chǎn)物有利地用于生產(chǎn)L-乳酸，更特別是麥的溶解物(wheat solubles)，或玉米淀粉生產(chǎn)得到的副產(chǎn)物，更特別是玉米漿。
此處，可更新的原料含有淀粉作為剩余葡萄糖或碳的來源，和高分子量蛋白質(zhì)、以及游離氨基酸和肽作為氮源。
但是，盡管認(rèn)為一些微生物能直接同化淀粉或高分子量的蛋白質(zhì)，以便其自身生長和生產(chǎn)經(jīng)濟可行的代謝物，因為它們具有必要的酶催設(shè)備來降解它們，但是其它微生物要求這樣的條件，其中對碳和氫源進行處理，以使它們能被直接同化。
麥溶解物例如來自從在濕麥淀粉生產(chǎn)工藝中從淀粉分離得到的B麥淀粉的分離流。B淀粉也稱作第二淀粉，基本上包括絕大部分比例的淀粉的小顆?；蚴軗p顆粒，并含有雜質(zhì)例如戊糖、蛋白質(zhì)和類脂。
在這些淀粉的水解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)這些雜質(zhì)，其中一部分未被傳統(tǒng)提純和軟化工藝所除去，所以使得B淀粉不適合生產(chǎn)例如食品級右旋糖。這些種類的B淀粉所以難以在工業(yè)上應(yīng)用。
申請人建議將B淀粉加熱到至少60℃的溫度，并用α-淀粉酶和葡糖淀粉酶處理B淀粉以便從其中釋放出能發(fā)酵的糖，并任選地用能降解植物纖維的酶處理，選自半纖維素、果膠酶和木聚糖酶，如下所述。
對于直接從干物質(zhì)含量為約9-10％的玉米秣得到的玉米漿，作為玉米漿基本組分的35-40重量％的蛋白質(zhì)的缺點是難以被同化。
申請人已顯示這些蛋白質(zhì)可以用選自堿性蛋白酶的解蛋白酶在使得這些蛋白質(zhì)易于在隨后的發(fā)酵步驟中進行代謝的pH和溫度條件下處理?？梢杂欣厥褂迷趐H為7、溫度60℃下，以1％/干物質(zhì)的速率處理約6小時的條件進行處理。
在本發(fā)明方法的第二個實施方案中，可更新的原料選自加工乳品、大麥、豆、糖甘蔗、制糖甜菜所得的副產(chǎn)品，獨立地或組合使用。
例如，為了生產(chǎn)L-乳酸，有利的是選擇從加工乳品得到的副產(chǎn)物，更特別是乳清，以及從加工制糖甜菜得到的副產(chǎn)物，更特別是糖漿。
在這里，所用的可更新的原料含有能更容易地被大多數(shù)微生物直接同化的碳源。
因此，制糖甜菜糖漿例如基本上含有蔗糖作為能被微生物直接同化的碳源來生產(chǎn)乳酸。
以相同的方式，乳糖作為乳清的基本糖化組分容易地被同化。
但是，這些蛋白質(zhì)難以被一些微生物同化。
在使用加工乳品的副產(chǎn)物制備乳酸的情況下，例如，所以可以有利地在用微生物處理之前對從含有乳糖的乳品得到的初始副產(chǎn)物進行蛋白分解作用。
蛋白分解步驟形成對微生物生產(chǎn)乳酸有活化作用的肽。
從含有乳糖的乳品得到的原料可以是例如中性或酸性乳清，乳清的超過濾滲透物，乳糖、乳糖結(jié)晶源液，這些原料還可以含有絲膠蛋白或酪蛋白。
可用于蛋白水解的蛋白酶選自胰酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶等。
根據(jù)所選擇的可更新的原料，則必要的是從所述富含能被直接同化的碳或氮源的原料除去高分子量的不溶性雜質(zhì)。
不溶性雜質(zhì)大多數(shù)是纖維。
例如，不溶物有利地從麥溶解物中分離出來，該麥溶解物已通過本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的技術(shù)被用于液化或糖化的酶處理，例如離心和微量過濾，單獨或組合使用，如下所述。
本發(fā)明方法的作為其基本特征之一的第二個步驟，包括處理原料，以便從中除去大多數(shù)低分子量雜質(zhì)，而不改變能被直接同化的碳源的濃度，其中使用選自納米級過濾和電滲析的技術(shù)，單獨或組合使用。
申請人所以已克服了這樣的技術(shù)偏見，即必須在發(fā)酵結(jié)束時對乳酸生產(chǎn)培養(yǎng)基進行納米級過濾和/或電滲析，而不是對發(fā)酵培養(yǎng)基本身在用微生物培植之前進行。
基于可更新的原料的發(fā)酵培養(yǎng)基含有許多“低分子量雜質(zhì)”，即，在本發(fā)明的公開內(nèi)容中指妨礙由所述發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)的代謝物的隨后純化步驟的小分子。
小分子可以是例如不能被微生物同化的糖的殘余物，例如C5糖，這些殘余物污染了發(fā)酵培養(yǎng)基。
它們還可以是有機酸，例如外消旋D-乳酸和L-乳酸，其在生產(chǎn)作為經(jīng)濟可行的代謝物的乳酸情況下，阻礙順利地回收光學(xué)純的乳酸。
常規(guī)用于除去這些小分子的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括例如膜過濾技術(shù)，或傳統(tǒng)的電滲析，適用于所述低分子量雜質(zhì)的尺寸范圍。
但是，熟練技術(shù)人員通常不采用以上技術(shù)方案來處理發(fā)酵培養(yǎng)基，因為分離界限還導(dǎo)致除去能被微生物直接同化的、尺寸在雜質(zhì)尺寸范圍內(nèi)的碳源。
如上所述，所有以上技術(shù)實際上已用于發(fā)酵培養(yǎng)基，不僅僅是在發(fā)酵結(jié)束時。
申請人所以已顯示，與文獻中的常規(guī)方法相比，這些膜過濾技術(shù)和更特別的是納米級過濾，或傳統(tǒng)的滲析技術(shù)能清除低分子量雜質(zhì)，并驚奇地和未預(yù)料到的是，能在不改變能直接被微生物同化的碳源的含量的情況下進行過濾由申請人進行的研究已確定了用于達到預(yù)期效果的上述技術(shù)的應(yīng)用條件。
例如，為了從麥溶解物生產(chǎn)乳酸，申請人已顯示通過使由本發(fā)明方法的前兩個步驟制備的微量過濾液的干物質(zhì)含量，對于納米級過濾分離達到2-10％，優(yōu)選約4％，如下所述，或?qū)τ陔姖B析處理達到5-30％的值，優(yōu)選約20％，這樣可以保持所有碳源不受影響，并除去基本上全部D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物。
例如，為了從經(jīng)堿性蛋白酶處理的玉米漿生產(chǎn)乳酸，如在本發(fā)明方法的第一步所述，進行處理以達到1-16％的干物質(zhì)，優(yōu)選約2％，以及傳統(tǒng)的電滲析處理，如在下面所述，也除去基本上所有D-乳酸和L-乳酸的外消旋混合物，而不會改變被直接同化的碳源的濃度。
本發(fā)明方法的第三步包括處理已除去低分子量雜質(zhì)的原料，以補充能被微生物直接同化的碳或氮源。
已從中除去雜質(zhì)的可更新原料的氮源例如可以在納米級過濾步驟之后補充。
在麥溶解物的情況下，從納米級過濾得到的保留物用ALCALASE堿性蛋白酶(來自NOVO)處理，以釋放出肽。
在玉米漿的情況下，額外的碳源可以通過葡萄糖或通過根據(jù)本發(fā)明方法處理的可更新的原料來提供。
本發(fā)明的最后步驟包括將所轉(zhuǎn)化的可更新的原料回收，并直接用作發(fā)酵培養(yǎng)基。
能被直接同化的碳和氮源的富集以及通過納米級過濾膜或傳統(tǒng)電滲析的便利分離技術(shù)進行不溶性雜質(zhì)和低分子量雜質(zhì)的清除，得到了完全適用于生產(chǎn)經(jīng)濟可行的代謝物的培養(yǎng)基，甚至用于生產(chǎn)已除去雜質(zhì)的微生物群體。
在生產(chǎn)有機酸的特定情況下，更特別地是生產(chǎn)L-乳酸，得到能滿足藥物純度標(biāo)準(zhǔn)(“United States Pharmacopeia”的熱穩(wěn)定性測試)并符合“Food Chemicals Codex”標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)純的乳酸，只需要不超過有限數(shù)目的純化步驟。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將通過以下說明性和非限定性實施例表現(xiàn)出來。
實施例1將從“B”麥淀粉的分離流中得到的并具有4％干物質(zhì)的麥溶解物加熱到60℃ 15小時，用NOVO的TERMAMYL LC α-淀粉酶以0.05％/干物質(zhì)的速率和GENENCOR的OPTIDEX L 300 A糖化酶以1％/干物質(zhì)的速率處理，以釋放出可發(fā)酵的糖。通過微量過濾法在0.14微米膜上除去不溶物。
所得的具有3.3％干物質(zhì)的濾液具有下表I所列的組成。
表I
然后將微量過濾的濾液在配備有DL 2540納米級過濾膜的2.5米2EURODIA實驗組件上在約20巴壓力下進行納米級過濾；通過外部冷卻將溫度調(diào)節(jié)到30℃。滲透物含有0.3％干物質(zhì)，并主要由1克/升的D-乳酸和L-乳酸以及約1克/升的C5糖(木糖和阿糖)組成。
保留物，在通過納米級過濾濃縮4.5倍之后，含有16％干物質(zhì)，并具有下表II所列的組成。
表II
該步驟還從麥溶解物中顯著清除了外消旋D-乳酸和L-乳酸。
半纖維素將在發(fā)酵結(jié)束時以生物量被除去，但其可有利地在納米級過濾步驟之前用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的內(nèi)-和外-木聚糖酶進行水解。
納米級過濾步驟之后，可以在以下條件下用蛋白酶處理，以釋放出形成發(fā)酵培養(yǎng)基的能直接同化的碳源所必要的肽。所以在這種情況下，不加入來自外源的肽是必要的。
將pH調(diào)節(jié)至7，溫度調(diào)節(jié)到60℃。來自NOVO的ALCALASE蛋白酶以1％/干物質(zhì)的速率加入，并在60℃下培養(yǎng)4小時。
在用蛋白酶水解的步驟之后，該培養(yǎng)基通過加熱到120℃ 10分鐘來消毒，之后可以直接用作發(fā)酵培養(yǎng)基。
下表III列出了在可用容積為15升(其中含有13升具有16％干物質(zhì)的麥溶解物，處理的和未處理的)的發(fā)酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的組成。
包括7小時預(yù)培植的乳酸乳球菌(Lactococcus Lactis)菌株的1.5升培養(yǎng)基用于接種這些發(fā)酵桶。
pH值設(shè)定為6.5，并用12N的NH4OH調(diào)節(jié)。溫度為40℃。
表III
因此，對于通過納米級過濾預(yù)處理的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的最終組成只顯示痕量的D-乳酸。
所以，如上處理的麥溶解物能確保有效地發(fā)酵成L-乳酸，且沒有顯著量的能妨礙隨后純化的雜質(zhì)。
當(dāng)用2.4升ALCALASE預(yù)處理培養(yǎng)基時，得到較高的產(chǎn)率。
實施例2將從“B”麥淀粉的分離流中得到的并具有20％干物質(zhì)的麥溶解物加熱到60℃ 12小時，用NOVO的TERMAMYL LC α-淀粉酶以0.05％/干物質(zhì)的速率，GENENCOR的OPTIDEX L 300 A糖化酶以1％/干物質(zhì)的速率和GENENCOR的SPEZYME CP半纖維素以0.5％/干物質(zhì)的速率處理，以釋放出可發(fā)酵的糖。通過微量過濾法在0.14微米膜上除去不溶物。
所得的具有16％干物質(zhì)的濾液具有下表IV所列的組成。
表IV
然后將微量過濾液在配備有CMX-S陽離子或AMX SB陰離子交換膜的活性表面積為5.6米2的EUR6B EURODIA電滲析組件(NEOSEPTA-TOKUYAMA SODA)上按照產(chǎn)品說明書進行傳統(tǒng)的電滲析處理，生成被稀釋到13.6％干物質(zhì)并具有下表V組成的級分。
表V
該步驟還顯著除去了被麥溶解物引入的外消旋D-乳酸和L-乳酸。
在該電滲析步驟之后，可以在以下條件下進行蛋白酶處理，以釋放出形成發(fā)酵培養(yǎng)基的能直接同化的碳源所必要的肽。
所以在這種情況下，不加入來自外源的肽是必要的。將pH調(diào)節(jié)至7，溫度調(diào)節(jié)到60℃。加入2.4升NOVO的1％/干物質(zhì)的ALCALASE，并在60℃下培養(yǎng)4小時。
在用蛋白酶水解的步驟之后，該培養(yǎng)基通過加熱到120℃ 10分鐘來消毒，之后可以直接用作發(fā)酵培養(yǎng)基。
下表VI列出了在可用容積為15升(其中含有13升具有15％干物質(zhì)的麥溶解物，處理的和未處理的)的發(fā)酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的組成。包括7小時預(yù)培植的乳酸乳球菌菌株的1.5升培養(yǎng)基用于接種這些發(fā)酵桶。pH值設(shè)定為6.5，并用12N的NH4OH調(diào)節(jié)。溫度為40℃。
表VI
因此，對于通過電滲析處理的培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基的最終組成只顯示痕量的D-乳酸。
所以，如上處理的麥溶解物能確保有效地發(fā)酵成L-乳酸，且沒有顯著量的能妨礙隨后純化步驟的雜質(zhì)。
實施例3從中間體玉米秣中得到的并具有3.3％干物質(zhì)的玉米漿具有下表VII所列的組成。
表VII
因為玉米蛋白質(zhì)難以同化，所以在pH為7和60℃下用1％/干物質(zhì)的NOVO公司的ALCALASE預(yù)處理6小時。
然后將由此得到的水解產(chǎn)物在配備有CMX-S陽離子或AMX SB陰離子交換膜的活性表面積為5.6米2的EURODIA EUR6B電滲析組件(NEOSEPTA-TOKUYAMA SODA)上按照產(chǎn)品說明書進行傳統(tǒng)的電滲析處理，生成被稀釋到2％干物質(zhì)并具有下表VIII組成的級分。
表VIII
用ALCALASE進行預(yù)處理，并通過傳統(tǒng)電滲析除去氨基酸，提供了在開始發(fā)酵時水解度為44的玉米蛋白水解產(chǎn)物，這由胺化氮與總氮量的比例確定，而未處理液體的水解度為36。
下表IX列出了在可用容積為15升(其中含有8.8升具有2％干物質(zhì)的麥溶解物，處理的和未處理的)的發(fā)酵桶中得到的D-乳酸和L-乳酸的組成，向其中加入60克/升葡萄糖作為能被直接同化的碳源。
包括7小時預(yù)培植的乳酸乳球菌菌株的1.5升培養(yǎng)基用于接種這些發(fā)酵桶。
pH值設(shè)定為6.5，并用12N的NH4OH調(diào)節(jié)。溫度為40℃。
表IX
所以，通過電滲析預(yù)處理的玉米漿能確保有效地發(fā)酵成乳酸，且沒有顯著量的能妨礙隨后純化步驟的雜質(zhì)。通過用ALCALASE預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基再次提高了產(chǎn)率。
實施例4濃縮的制糖甜菜糖漿，再次稀釋到10％干物質(zhì)，通過傳統(tǒng)的電滲析在與實施例2相同的條件下處理。
在電滲析之前，產(chǎn)品的干物質(zhì)的組成列于下表X中。
表X
電滲析步驟制得具有5.3％干物質(zhì)的溶液，其中糖的含量大于70％，蛋白質(zhì)含量為約16％。
由此從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去了大于90％的不需要的有機酸。
實施例5在與實施例4相同的條件下，濃縮的制糖甜菜糖漿，再次稀釋到20％干物質(zhì)，在微量過濾之后通過傳統(tǒng)的電滲析在與實施例2相同的條件下進行處理。
在電滲析之前，產(chǎn)品的干物質(zhì)的組成列于下表XI中。
表XI
在這種情況下，電滲析步驟制得具有16.5％干物質(zhì)的溶液，其中糖的含量大于70％，蛋白質(zhì)含量為約11％。
由此從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去了大于90％的不需要的有機酸。
制備了發(fā)酵培養(yǎng)基，其含有80克/升的糖漿、5克/升的(NH4)2SO4、2克/升的KH2PO4和0.5克/升的MgSO4，其中糖漿通過上述方式進行電滲析(培養(yǎng)基B)，或不經(jīng)過電滲析(培養(yǎng)基A)。
這些生產(chǎn)培養(yǎng)基用10％ baker酵母(釀酒酵母，S.Cerevisiae)接種，得自在含有50克/升葡萄糖和5克/升酵母抽提物的培養(yǎng)基中預(yù)培植24小時。
用1N NaOH將pH調(diào)節(jié)到5，溫度是30℃，生物量的生成在可用容積為15升的反應(yīng)器中在600rpm攪拌下和1vvm通風(fēng)下進行17小時。
下表XII和XIII列出了在制備培養(yǎng)基A和B中分別生產(chǎn)釀酒酵母的結(jié)果。
表XII
*Nd＝未測表XIII
從這些結(jié)果可見，在糖漿經(jīng)過電滲析的培養(yǎng)基中，生長的初始速率是0.29小時-1，生物量產(chǎn)率是24％，而如果使用未電滲析的糖漿，生長的初始速率僅僅是0.26小時-1，生物量產(chǎn)率是17％。
所以可見，根據(jù)本發(fā)明方法對糖漿的處理非常適用于有效地生產(chǎn)酵母。
實施例6乳清通過傳統(tǒng)的電滲析在與實施例2相同的條件下進行處理。
具有6.6％干物質(zhì)的乳清的初始組成列于下表XIV中。
表XIV
傳統(tǒng)電滲析步驟制得具有4.3％干物質(zhì)的溶液。糖的含量大于80％，蛋白質(zhì)含量為約14％。所有污染性的有機酸被從培養(yǎng)基中除去。
表XV
傳統(tǒng)電滲析步驟制得具有14.6％干物質(zhì)的溶液。糖的含量大于80％，蛋白質(zhì)含量為約9％。所有污染性的有機酸被從培養(yǎng)基中除去。
以上述方式電滲析的乳清在以下條件下引入生物量生產(chǎn)培養(yǎng)基中，即乳酸酵素(乳鏈球菌streptococcus lactis)和酵母酵素(釀酒酵母)。
從在陪替氏培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的群體中取出等“ose”當(dāng)量的細(xì)胞，加入2升Erlenmeyer燒瓶中，其中含有500毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基，由80克/升在150rpm攪拌下電滲析或未電滲析(對比)的乳清組成，對于釀酒酵母在需氧條件下溫度為30℃，對于乳鏈球菌在厭氧條件下溫度為40℃。
生物量的富集通過監(jiān)測細(xì)胞數(shù)目來確定。
表XVI顯示在培養(yǎng)24小時后得到的結(jié)果。
表XVI
所以，根據(jù)本發(fā)明通過電滲析進行處理對于所測試的兩種菌株的培養(yǎng)十分有效。在傳統(tǒng)酵母的情況下，經(jīng)電滲析的培養(yǎng)培養(yǎng)基制得基本上兩倍的生物量，而在乳酸酵素的情況下，經(jīng)微量過濾的乳清甚至含有能被電滲析清除的生長抑制劑。
權(quán)利要求
1.一種從可更新的原料制備用于生產(chǎn)高純度代謝物的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法，其特征在于該方法包括a)任選地，處理所述的可更新的原料，以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源，并清除不溶性雜質(zhì)，b)獨立地或組合使用選自納米級過濾和電滲析的技術(shù)，以從所述可更新的原料除去低分子量雜質(zhì)，而不改變能被直接同化的碳源的濃度，c)對通過上述方式已除去低分子量雜質(zhì)的原料進行處理，以補充能被微生物直接同化的碳源或氮源，和d)回收所得的發(fā)酵培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于由發(fā)酵生成的代謝物選自有機酸、維生素、氨基酸和抗生素，優(yōu)選有機酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其特征在于所述有機酸是L-乳酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其特征在于可更新的原料選自淀粉生產(chǎn)所得的副產(chǎn)物，優(yōu)選來自麥、玉米、木薯、馬鈴薯的淀粉生產(chǎn)所得的副產(chǎn)物，或者加工大麥和豆所得的副產(chǎn)物，優(yōu)選包括麥溶解物或玉米漿。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其特征在于可更新的原料選自乳品、豆、糖甘蔗、制糖甜菜的加工所得的副產(chǎn)物，優(yōu)選包括乳清或糖漿。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項的方法，其特征在于可更新的原料富含碳源，該碳源能通過使用用于液化和糖化淀粉的酶和任選地用能降解植物纖維的酶而被微生物同化，選自半纖維素、果膠酶和木聚糖酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其特征在于選自堿性蛋白酶和酸性蛋白酶的解蛋白酶用于使可更新的原料富含或補充能被同化的氮源。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項的方法，其特征在于加入葡萄糖以向可更新的原料補充能被同化的碳源。
9.通過根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項的方法得到的發(fā)酵培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的發(fā)酵培養(yǎng)基在生產(chǎn)微生物群體中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從可更新的原料制備用于生產(chǎn)高純度代謝物的發(fā)酵培養(yǎng)基的方法,其特征在于該方法包括:任選地處理所述的可更新的原料,以使其富含能被微生物直接同化的碳源或氮源,并清除不溶性雜質(zhì);獨立地或組合使用選自納米級過濾和電滲析的技術(shù),以從所述可更新的原料除去低分子量雜質(zhì),而不降低能被直接同化的碳源的濃度;對通過上述方式已除去低分子量雜質(zhì)的原料進行處理,以補充能被微生物直接同化的碳源或氮源;和回收所得的發(fā)酵培養(yǎng)基。
文檔編號C12P7/56GK1353191SQ01137869
公開日2002年6月12日 申請日期2001年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月9日
發(fā)明者J－J·卡博徹, P·杜福勒特, C·福阿克, L·塞古爾哈 申請人:火箭兄弟公司