專利名稱：磷酸己酮糖異構(gòu)酶和編碼該酶的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸己酮糖異構(gòu)酶和編碼它的DNA。更精確地說，本發(fā)明涉及起源于耐熱細菌短芽孢桿菌的磷酸己酮糖異構(gòu)酶和編碼它的DNA。
背景技術(shù)：
在可以利用單個碳(C1)化合物如甲烷和甲醇作為碳源(甲基營養(yǎng)型生物中，已知存在代謝這些化合物的核酮糖單磷酸途徑(RuMP)。這一途徑的重要關(guān)鍵酶是催化核酮糖單磷酸途徑的起始反應(yīng)的磷酸己酮糖合成酶(HPS，3-己酮糖-6-磷酸合成酶)和催化隨后的反應(yīng)的磷酸己酮糖異構(gòu)酶(PHI，磷酸-3-己酮糖異構(gòu)酶)。
另外，靶化合物分子的特異位置用穩(wěn)定的同位素，碳13(13C)標(biāo)記的生化物質(zhì)可用于研究生物代謝途徑。并且，利用碳13-NMR技術(shù)研究生物體中代謝產(chǎn)物的行為最近在各種疾病診斷和日常健康檢查中成為非常重要的技術(shù)。對于這樣的新技術(shù)，提供在確定的靶位置經(jīng)碳13低成本標(biāo)記的化合物是必要的并且也是人們期望的。
正如生產(chǎn)上面提到的這樣的靶化合物的一個系統(tǒng)，可以設(shè)想一個方法，其中可以制備利用標(biāo)記的甲醛和5-磷酸核酮糖合成標(biāo)記的6-磷酸-D-果糖的一系列酶，利用這些酶在反應(yīng)系統(tǒng)中能夠有效地制備標(biāo)記的靶化合物。磷酸己酮糖合成酶是本反應(yīng)系統(tǒng)中首先起作用的酶，它已經(jīng)從幾種微生物中分離，并且它的一些特征也已經(jīng)闡明。這些微生物包括，例如莢膜甲基單胞菌(J.R.Quayle，酶學(xué)方法，188，第314頁，1990)，甲基單胞菌M15菌株(酶學(xué)方法，188，第319頁，1990)，和aminofaciens甲基單胞菌77a菌株(生物化學(xué)生物物理Acta.，523，第236頁，1978)，胃分枝桿菌MB19(酶學(xué)方法，188，第393頁，1990)，和喜甲烷醋桿菌MB58(酶學(xué)方法，188，第401頁，1990)。
另外，關(guān)于磷酸己酮糖異構(gòu)酶，已經(jīng)從喜甲烷甲基單胞菌77a菌株中部分地純化(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，41(7)，第1133頁，1977)，并且純化的酶和編碼它的基因也已經(jīng)從革蘭氏陽性甲醇同化細菌，胃分枝桿菌中分離(日本專利Laid-open公開(kokai)號，No.11-127869)。
耐熱細菌產(chǎn)生的酶和蛋白質(zhì)通常在高溫下是穩(wěn)定的，它們中的大多數(shù)對pH的變化和有機溶劑也是穩(wěn)定的。所以，其應(yīng)用已經(jīng)大大地演變成如診斷試劑，工業(yè)催化劑等等。對于耐熱甲醇同化細菌的C1代謝系統(tǒng)的酶，只有磷酸己酮糖合成酶已經(jīng)從甲醇芽孢桿菌C1菌株中純化(酶學(xué)方法，188，393頁，1990)，但它的詳細的結(jié)構(gòu)和其基因仍然是未知的。在另一方面，關(guān)于耐熱細菌的磷酸己酮糖異構(gòu)酶，不僅酶蛋白的結(jié)構(gòu)和其基因，而且酶的純化也未有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在克隆編碼短芽孢桿菌S1菌株的磷酸己酮糖合成酶的基因(也稱為“hps”)的過程中，一個編碼PHI的基因(也稱為”phi”)存在于含有hps的DNA片段中。并且本發(fā)明人分離了phi基因，并將這一基因?qū)肓舜竽c桿菌細胞中，檢測了表達產(chǎn)物的活性，證明了該基因編碼了PHI，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供如下內(nèi)容(1)編碼下面的(A)或(B)定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有包括一個或幾個氨基酸殘基替代，缺失，插入或增加的序列表中顯示的SEQ ID NO3的氨基酸序列并具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
(2)根據(jù)(1)中所述的DNA，它是下面的(a)或(b)中定義的DNA(a)至少含有序列表中列出的SEQ ID NO1的核苷酸序列的編號為1149-1700的核苷酸殘基的核苷酸序列組成的DNA，(b)在嚴(yán)格條件下與至少含有序列表中列出的SEQ ID NO12的核苷酸序列的核苷酸編號1149-1700的核苷酸序列可雜交，并且編碼具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
(3)以可以表達(1)或(2)中的DNA編碼的磷酸己酮糖異構(gòu)酶的方式，導(dǎo)入該DNA的細胞。
(4)生產(chǎn)磷酸己酮糖異構(gòu)酶的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)(3)中的細胞，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累磷酸己酮糖異構(gòu)酶，和從培養(yǎng)基中收集磷酸己酮糖異構(gòu)酶。
(5)在下面的(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表中列出SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，
(B)具有序列表中顯示的SEQ ID NO3的氨基酸序列，其中包括一個或幾個氨基酸的取代，缺失，插入或增加，并具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，得到了編碼磷酸核酮糖異構(gòu)酶的DNA，從而有效地生產(chǎn)了該酶。結(jié)果使大量廉價提供重要的并且是醫(yī)藥或生化基礎(chǔ)研究中需要的標(biāo)記物質(zhì)成為可能。
下面將詳細地說明本發(fā)明。
(1)本發(fā)明的DNA本發(fā)明的DNA是在鄰接并且位于hps基因的下游的短芽孢桿菌S1菌株的hps基因的DNA片段中發(fā)現(xiàn)的，該DNA可以從短芽孢桿菌的染色體DNA中分離和得到。具體地說，如下面的實施例中所示，本發(fā)明的DNA是從如下的短芽孢桿菌的染色體DNA中得到的。
首先，從短芽孢桿菌中純化HPS。關(guān)于短芽胞桿菌可以提到的是短芽孢桿菌的S1菌株。該菌株是NCIMB(國家工業(yè)和海洋細菌收藏中心)的傳代培養(yǎng)物，登記號為NCIMB12524。
通過Q-瓊脂糖柱層析，丁基-東洋珍珠柱層析和Superdex200柱層析從S1菌株的無細胞提取物中可以純化HPS直到在SDS-PAGE中檢測到單一的譜帶的程度。在每個純化步驟中，通過《酶學(xué)方法》第188卷，第397-401頁(1990)中敘述的方法，可以檢測到HPS活性。
純化的HPS的部分氨基酸序列已經(jīng)測定，根據(jù)獲得的氨基酸序列的信息，已經(jīng)合成用于PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))的寡核苷酸引物。然后，利用從短芽孢桿菌S1菌株制備的基因組DNA作為模板進行PCR。利用Saito等人的方法(《生物化學(xué)生物物理Acta》，72卷第619-629頁(1963)中敘述)可以得到該基因組DNA。如果將具有序列表中表示的SEQ ID NOS7和8的核苷酸序列的寡核苷酸用作引物，通過上面的PCR，將得到約400個堿基對的DNA片段。
然后，在如上所述獲得的hps片段的核苷酸序列的基礎(chǔ)上，通過例如逆轉(zhuǎn)的PCR方法(遺傳學(xué)，第120卷，第621-623頁，1988)，利用具有SEQ ID NOS9和10的核苷酸序列作為模板，從短芽胞桿菌S1菌株的染色體DNA獲得了含有全長的hps基因的DNA片段。
首先，本發(fā)明的發(fā)明人試圖利用前面提到的約400堿基對的hps片段作為探針，篩選短芽胞桿菌S1菌株的基因組文庫。但是，雖然并未知道可能的原因，但可能是因為染色體DNA片段與載體的連接中存在的問題，沒有形成具有足以用于篩選的基因組文庫的量的菌落，所以發(fā)明人不得不放棄利用普通的方法。
因此，發(fā)明人嘗試?yán)萌缟纤龅姆崔D(zhuǎn)的PCR技術(shù)的克隆，成功地得到了含有hps基因的DNA片段。對于如上所述獲得的約3kb長度的克隆片段中的約1.8kb的核苷酸序列的測序結(jié)果表示在序列表中的SEQ ID NO1。在這一區(qū)域中含有兩個開放讀碼框架(orfs)。每個orf編碼的氨基酸序列從5’末端開始表示為SEQ ID NO2和3。因為其中的第一個orf與HPS的部分氨基酸序列完全相同，因而證明它是hps。另一方面，通過研究表達第二個orf得到的蛋白質(zhì)的活性，證明該orf是phi，即本發(fā)明的DNA。
當(dāng)利用購買到的軟件(GENETYX)對hps的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列進行同源性研究時，表明在核苷酸水平，他們與枯草芽胞桿菌的yckF有65.6％的同源性，在氨基酸水平，他們有64.3％的同源性。同源性被計算為在yckF和phi中完全相同的氨基酸殘基的數(shù)目與yckF編碼的氨基酸殘基的總數(shù)的比例。
如上所述，在HPS的純化和hps的分離中偶然發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的DNA，在第二個orf應(yīng)該編碼phi的概念的基礎(chǔ)上，通過表達第二個orf和證明表達產(chǎn)物的活性，獲得本發(fā)明的DNA。
如上所述獲得了本發(fā)明的DNA。但是，因為本發(fā)明闡明了本發(fā)明的DNA的核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列，因此，從通過根據(jù)核苷酸序列或氨基酸序列生產(chǎn)的寡核苷酸作為探針的雜交，從芽胞桿菌屬的耐熱細菌，例如短芽胞桿菌S1菌株的基因組DNA文庫可以獲得本發(fā)明的DNA。通過前面提到的寡核苷酸作為引物，芽胞桿菌屬的耐熱細菌的基因組DNA作為模板，進行PCR，也可以得到本發(fā)明的DNA。
構(gòu)建基因組DNA文庫，雜交，PCR，制備質(zhì)粒DNA，消化和連接DNA，轉(zhuǎn)化等等的方法在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.E，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港實驗室出版，1.21(1989)中有敘述。
攜帶包含本發(fā)明的DNA的質(zhì)粒pKPS1，和在tac啟動子的控制下表達PHI，并且在后面提到的實施例中得到，給定的特定編號為AJ13707的大腸桿菌JM109/pKPS1于2000年7月5日以登記號FERM P-17952，保藏于工業(yè)技術(shù)院，生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在的，國際專利生物體保藏處，國家現(xiàn)代工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研院所，獨立管理公司)(Chuo Dai-6，1-1 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵編305-5466)，并且根據(jù)布達佩斯條約2001，6月25日從原始保藏轉(zhuǎn)移到國際保藏，保藏的登記號為FERM BP-7639。
本發(fā)明的DNA可以編碼的PHI，包括在編碼的PHI的活性沒有破壞的前提下，在一個或多個位置具有一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失，插入或增加。根據(jù)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基的位置或類型，“幾個”氨基酸殘基的數(shù)目是不同的。但是，編碼的PHI可以是與構(gòu)成PHI和具有PHI活性的總的氨基酸序列具有65％或更多，優(yōu)選地具有80％或更多的同源性的一個PHI。明確地說，“幾個”氨基酸殘基的數(shù)目優(yōu)選地是2-60，更優(yōu)選地說是2-30個，進一步優(yōu)選的是2-10個。
通過修飾核苷酸序列，例如，采用定點誘變方法以致于氨基酸序列中在特定位點含有一個或多個氨基酸殘基的取代，缺失，插入或增加，可以得到如上所述的編碼與PHI基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA。這樣的如上所述修飾的DNA也可以通過常規(guī)的已知的突變處理得到。這樣的突變處理包括在體外處理編碼PHI的DNA的方法，例如，用羥胺，和處理微生物的方法，例如，用紫外輻射，或常用的突變試劑，如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸進行突變處理微生物，例如含有編碼PHI的DNA的大腸桿菌屬的細菌的方法。
如上所述的核苷酸的取代，缺失，插入，增加或顛換也包括在個體差異或含有phi的微生物的種類或?qū)俚牟煌幕A(chǔ)上天然存在的突變體或變異體。
編碼如上所述的與PHI基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過在適當(dāng)?shù)募毎?，表達如上所述的具有突變的DNA，和檢測表達產(chǎn)物的PHI的活性得到。從編碼具有突變的PHI的DNA或含有該DNA的細胞中，分離在嚴(yán)格條件下，與具有例如對應(yīng)于SEQ ID NO1中顯示的核苷酸序列的核苷酸編號1149-1700的核苷酸序列的DNA，或可以從該核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有PHI活性的蛋白質(zhì)的DNA也可以得到編碼與PHI基本相同的蛋白質(zhì)的DNA。本文的“嚴(yán)格條件”指形成所謂的特異雜交，而不形成非特異雜交的條件。利用數(shù)值表示這一條件是困難的。但是，例如，嚴(yán)格條件包括同源性高的DNA，例如同源性不低于70％的DNA可以相互雜交，同源性低于上面的水平的DNA相互不雜交的條件。或者說，嚴(yán)格條件是在對應(yīng)于Southern雜交洗滌的普通條件，即，1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選地，0.1×SSC，0.1％SDS的鹽濃度下，60℃下DNA相互雜交的條件。
至于探針，也可以用phi基因的部分序列。利用根據(jù)每個基因的核苷酸序列產(chǎn)生的寡核苷酸為引物，和含有每個基因的DNA片段為模板，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))可以生產(chǎn)這樣的探針。當(dāng)長度約為300bp的DNA片段用作探針時，雜交的洗滌條件可以是50℃，2×SSC和0.1％SDS。
在如上所述的條件下可以雜交的基因包括在基因的編碼區(qū)存在終止密碼的基因，和由于活性中心的突變而失去活性的基因。但是，通過將各個基因連接到購買到的活性表達載體，和通過如上所述的方法測量PHI活性可容易地除去這些突變體。
<2>磷酸己酮糖異構(gòu)酶的生產(chǎn)可以通過利用適當(dāng)?shù)募闹鳌d體系統(tǒng)，允許前面提到的本發(fā)明的DNA的表達來進行生產(chǎn)PHI。
關(guān)于表達phi基因的宿主，可以提到的是各種原核生物的細胞，包括大腸桿菌，各種真核生物的細胞，包括啤酒酵母，動物細胞和植物細胞。在這些細胞中，原核生物細胞，特別是大腸桿菌細胞是優(yōu)選的宿主。
關(guān)于在前面提到的宿主中導(dǎo)入phi基因的載體，可以提到的是，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG298，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219，pMW218等等。除了這些，也可以利用噬菌體DNA的載體。通過連接phi基因與這些載體中的任何一個得到的重組載體轉(zhuǎn)化宿主可以將phi導(dǎo)入宿主。通過利用轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)座(Berg，D.E.和Berg C.M.，生物/技術(shù)，1卷，第417頁，(1983))，Mu噬菌體(日本公開專利，專利號2-109985/1990)或同源重組(分子遺傳學(xué)實驗，冷泉港實驗室，(1972))在宿主的基因組中導(dǎo)入phi基因。
另外，為了達到有效地表達phi基因，可以將在宿主細胞中起作用的啟動子，如lac，trp和PL，與在啟動子的上游區(qū)域編碼PHI的DNA序列連接。如果將含有啟動子的載體用作載體，可以馬上進行phi基因，載體，和啟動子的連接。關(guān)于這樣的載體，可以提到的有含有tac啟動子的pKK223-3(Pharmacia)。
關(guān)于轉(zhuǎn)化，可以利用的方法有，例如，用氯化鈣處理受體細胞使DNA的滲透增加的方法，這在大腸桿菌K-12已有報道(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物學(xué)雜志，第53卷，第159頁(1970))；和從生長期的細胞制備感受態(tài)的細胞，然后將DNA導(dǎo)入其中，這在枯草芽孢桿菌中已有報道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F(xiàn).E.，基因，1卷，153頁(1977))。除了這些，同樣可利用的方法是，在能夠容易地吸收重組DNA的原生質(zhì)體或原生質(zhì)球中生成DNA-受體細胞，然后在這些細胞中導(dǎo)入重組DNA，該方法已知可用于枯草芽孢桿菌，放線菌和酵母中(Chang，S.和Cheon，S.N.，分子遺傳學(xué)168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink G.R，美國科學(xué)院年報，75卷，1929頁(1978))。轉(zhuǎn)化的方法可以根據(jù)用作宿主的細胞，從這些方法中適當(dāng)挑選。
雖然，只要表達時顯示PHI活性，phi基因可以是任何一個，但含有編碼序列表中表示的SEQ ID NO3的氨基酸序列的DNA，或含有序列表中表示的SEQID NO1的核苷酸序列的1149-1700個核苷酸殘基的DNA的基因是優(yōu)選的。進一步，如上所述，該基因還可以是含有編碼，在一個或多個位置，具有一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失，插入，增加或顛換的PHI，而編碼的PHI活性沒有破壞的DNA的一個基因。
通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)用如上所述的phi基因?qū)氲募毎?，在培養(yǎng)物中生產(chǎn)和積累PHI，并且從培養(yǎng)物中收集PHI，可以生產(chǎn)PHI。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)物可以根據(jù)利用的宿主適當(dāng)?shù)剡x擇。當(dāng)利用大腸桿菌作為宿主，和tac啟動子輔助表達phi，如果在37℃，如LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主，在開始培養(yǎng)后幾小時，加入tac啟動子的誘導(dǎo)物IPTG(異丙基-α-D-硫代吡喃半乳糖苷)到最后濃度為0.5毫摩爾/升，繼續(xù)培養(yǎng)，細胞中就積累了PHI。當(dāng)利用適當(dāng)?shù)姆置谙到y(tǒng)，允許PHI分泌到細胞外，培養(yǎng)基中就積累了PHI。
利用常見的用于酶的純化方法如，離子交換層析，凝膠過濾層析，吸收層析和溶劑沉淀等等要求的方法可以從細胞提取物或培養(yǎng)基中純化如上所述產(chǎn)生的PHI。
本發(fā)明得到的PHI可以用于從碳13標(biāo)記的從甲醇生產(chǎn)的[1-13C]D-葡萄糖6-磷酸鹽。根據(jù)下面的實施例可以進行[1-13C]6-磷酸D-葡萄糖的制備。甲醇是利用從同化甲醇酵母博伊丁氏假絲酵母制備的乙醇氧化酶，氧化成甲醛的。通過醛醇縮合和HPS的作用，將得到的甲醛與5磷酸核酮糖一起濃縮形成阿拉伯基-3-核酮糖6-磷酸。在這樣的情況下，由于5-磷酸核酮糖并不穩(wěn)定，在同樣的反應(yīng)系統(tǒng)中，通過磷酸核糖異構(gòu)酶的作用，將5-磷酸核糖異構(gòu)化成5-磷酸核酮糖才可用于HPS反應(yīng)。由于pHI的作用，可以將前面提到的反應(yīng)中產(chǎn)生的3-阿拉伯-6-磷酸核酮糖轉(zhuǎn)換成6-磷酸果糖，進一步在6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶的作用下轉(zhuǎn)換成6-磷酸葡萄糖。因為通常PHI的含量明顯比HPS低，大多數(shù)情況下，利用PHI進行前面提到的反應(yīng)是困難的。另外，應(yīng)該考慮，利用耐熱細菌的PHI，反應(yīng)可以進行相當(dāng)長的時期。因為耐熱細菌的phi已經(jīng)分離，本發(fā)明也已經(jīng)提供了有效地生產(chǎn)PHI的方法，在實際應(yīng)用中穩(wěn)定地進行前面的反應(yīng)已經(jīng)成為可能。
具體實施例方式
參考下面的實施例，本發(fā)明將被更詳細地說明。
首先將說明的是用于實施例中的HPS活性的測量方法(酶學(xué)方法，188卷，第397-401頁(1990))。
在0.15毫升水中，加入下面的溶液A和B各0.05毫升，在小杯(d＝1.0厘米)中混合，然后，在30℃首先加熱約3分鐘。在小杯中加入0.1毫升10毫摩爾/升的甲醛溶液，開始反應(yīng)。允許在30℃反應(yīng)5分鐘，然后混合物中加入0.1毫升0.5當(dāng)量/毫升的鹽酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物稀釋20倍，加入2毫升的納氏試劑(生物化學(xué)雜志，第55卷，第416頁，1953)，可以檢測到反應(yīng)混合物中甲醛減少。在對照實驗中，利用水而不是5-磷酸核糖溶液。
A500毫摩爾/升磷酸鉀緩沖液，pH7.5B50毫摩爾/升的氯化鎂水溶液C50毫摩爾/升5-磷酸核糖水溶液D100單位/毫升的磷酸核酮糖異構(gòu)酶溶液E酶每制備液(含有1毫摩爾/升的DTT的50毫摩爾/升磷酸緩沖液(pH 7.5))實施例1純化短芽孢桿菌S1菌株產(chǎn)生的磷酸己酮糖合成酶(HPS)首先，為了純化HPS，在含有500毫升下面成分的培養(yǎng)基A的2升的燒瓶中加入短芽也桿菌S1菌株(NCIMB12524)到1升的體積，并且在45℃振搖培養(yǎng)16小時。
甲醇 2毫升/升磷酸氫二鉀 4.65克/升磷酸氫鈉單水化合物 1.5克/升硫酸銨 1.5克/升七水硫酸鎂 0.2克/升酵母提取物 0.5克/升蛋白胨 0.5克/升酪蛋白氨基酸 0.5克/升維生素溶液*1 1毫升/升痕量金屬溶液*20.2毫升/升(pH7)*1在100毫升中，含有10毫克泛酸，10毫克核黃素，1毫克維生素B12，1毫克硫辛酸，1毫克葉酸，10毫克生物素，10毫克硫胺素，10毫克尼克酰胺，2毫克對氨基苯甲酸和10毫克磷酸吡哆醛。
*2在100毫升中，含有0.55克CaCl2.2H2O，0.51克MnCl2.4H2O，2.2克ZnSO4.7H2O，0.16克CuSO4.5H2O，0.50克FeSO4.7H2O，0.16克CoCl2.6H2O，0.011克(NH4)Mo7O24.4H2O，和5.0克EDTA(乙二胺四乙酸)。
在培養(yǎng)后，收集細胞，約11.3克。將細胞懸浮于含有1毫摩爾/升的DTT的106毫升的50毫摩爾/升的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中，用超聲波裂解。在12000rpm，4℃，離心裂解的細胞懸浮液20分鐘，上清液為無細胞提取液。然后，在含有1毫摩爾/升的DTT，0.15毫摩爾/升的PMSF(氟化磺酰甲苯)和5毫摩爾/升MgCl2的20毫摩爾/升的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)中透析，加到用同樣的緩沖液平衡好的Q瓊脂糖柱(Pharmacia)，用0摩爾/升到0.5摩爾/升的氯化鉀線性梯度洗脫，得到顯示HPS活性的組分(16毫升)。通過這一純化步驟，HPS純化了約2.9倍。
然后，在前面提到的純化的組分中加入固體硫酸銨，攪拌直到濃度為1.7摩爾/升，在8000rpm下離心10分鐘，收集上清液。進一步，將上清液通過孔大小為0.22微米的過濾器，除去微小顆粒，然后，加到用含有1毫摩爾/升DTT，0.15毫摩爾/升的PMSF和5毫摩爾/升的MgCl2的50毫摩爾/升的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)平衡過的丁基-東洋珍珠(TOSOH公司)柱上，用1.7摩爾/升到0摩爾/升的硫酸銨的線性梯度洗脫(洗脫速度2毫升/分鐘)。經(jīng)過這步驟，得到了HPS活性高的組分(12毫升)。
隨后，將上面得到的組分在Centriprep(Millipore公司)中濃縮到2毫升的體積，然后，加到用含有1毫摩爾/升DTT，0.15毫摩爾/升的PMSF和5毫摩爾/升MgCl2的100毫摩爾/升的Tris-HCl緩沖液(pH7.5)平衡過的Superdex 200(Pharmacia)，用同樣的緩沖液洗脫(洗脫速度2毫升/分鐘)，得到高活性的組分。通過這些純化步驟，可以純化目的產(chǎn)物HPS。
當(dāng)純化的樣品進行SDS-PAGE，在15％的聚丙烯酰胺凝膠電泳時，只檢測到確定的單一的譜帶，這樣的事實證明了酶的均一化。經(jīng)SDS-PAGE確定的分子量為25000。
實施例2短芽孢桿菌S1菌株產(chǎn)生的磷酸己酮糖合成酶(HPS)的部分結(jié)構(gòu)隨后，確定實施例1中得到的HPS的部分氨基酸序列。用常規(guī)的方法，將SDS-PAGE展開的HPS的蛋白帶影印到PVDF(聚氟乙烯)膜上，切下該譜帶。然后，用Edman降解方法分析蛋白質(zhì)的N末端氨基酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，是MQLQLALDLVNIEEAKQVVAEVQEYVDIVE(SEQ ID NO4)。另外，對于該蛋白質(zhì)的內(nèi)部氨基酸序列，用V8蛋白酶部分降解蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE，同樣影印到PVDF膜上。然后，切下所有的可以檢測到的肽片段的譜帶，用Edman降解方法分析其氨基酸序列，結(jié)果，序列確定為VAKAAEHGADIVTILAAAEDVSIKGAVEEAKKLGXK(SEQ ID NO5)和MGVDYIXVHAGYDLQAVGKN(SEQ ID NO6)。
實施例3得到短芽孢桿菌S1菌株的基因組DNA在5毫升培養(yǎng)基B(CM129培養(yǎng)基(OXOID公司))中接種短芽孢桿菌S1菌株，45℃過夜培養(yǎng)。將這一培養(yǎng)物以1％的比例接種到500毫升的培養(yǎng)基B中，直到培養(yǎng)物的OD(610nm)達到1.0，然后將培養(yǎng)肉湯離心收集細胞。用鹽-EDTA溶液(組成0.15摩爾/升NaCl，0.01摩爾/升的EDTA，pH8.0)洗滌細胞，然后，懸浮于500毫升相同的溶液，在懸浮液中加入80毫克的溶菌酶，在37℃下保留3小時。
然后，在懸浮液中加入2毫升25％的SDS，和10毫升的蛋白酶K(10毫克/毫升)，在37℃下，振搖過夜。然后，在60℃下處理懸浮液20分鐘，加入14毫升5摩爾/升的高氯酸鈉和30毫升的氯仿/異戊醇混合物(混合的比例24∶1)，溫和攪拌30分鐘。在20℃，3000rpm下離心懸浮液30分鐘，收集水層，加入30毫升酚/氯仿混合物，溫和攪拌30分鐘。然后，在20℃，3000rpm下離心30分鐘。收集水層。
在上面的水層上清液中加入2倍量的冷乙醇，使DNA纏繞在巴斯德移液器吸頭上收集之。用70％的乙醇洗滌DNA，空氣干燥，然后，溶解于5毫升TE溶液(10毫摩爾/升含有1毫摩爾/升的EDTA的Tris-HCl緩沖液(pH7.5))中。然后，在溶液中加入50毫升的10毫克/毫升的RNase，允許在37℃下反應(yīng)30分鐘。在溶液中加入30毫升0.1×SSC溶液，并用酚/氯仿處理。收集水層，加入0.5-倍量的冷異丙醇。在巴士德管中離心收集DNA，用70％的乙醇洗滌，空氣干燥，在10毫升的TE溶液中溶解，得到基因組DNA片段(濃度0.12微克/微升)。
實施例4通過PCR克隆短芽孢桿菌S1菌株的磷酸己酮糖合成酶基因hps的部分序列根據(jù)實施例2闡述的氨基酸序列，用常規(guī)方法合成N末端區(qū)的混合核苷酸引物，HPS-BaN2(5’-GARGTNCARGARTAYGTNGAYATHGTNGA-3’，SEQ ID NO7)，和蛋白質(zhì)的內(nèi)部區(qū)域的混合核苷酸引物，HPS-BaI3(5’-TTYTTNCCNACNGCYTGNARRTCRTAQ-3’，SEQ ID NO8)。然后，利用實施例3中制備的基因組DNA作為模板，和上述DNA引物，HPS-BaN2和HPS-BaI3進行PCR反應(yīng)(25個循環(huán)反應(yīng)，每個循環(huán)的步驟為在95℃1分鐘，52℃1分鐘和72℃3分鐘)。
將反應(yīng)混合物進行瓊脂糖凝膠電泳，純化PCR擴增的DNA片段(約400bp)。然后，利用第二套的連接試劑盒(Takara Shuzo)將上面的DNA片段與pT7Blue連接，用連接溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α得到轉(zhuǎn)化體。將其中包含的一個質(zhì)粒命名為pTHS1。用常規(guī)方法確定pTHS1中插入的DNA片段部分的核苷酸序列，后來，在應(yīng)用BLAST檢索進行同源性檢索中，發(fā)現(xiàn)插入的DNA片段具有376個堿基對的長度并且與含有hps的其它甲基營養(yǎng)生物的序列高度同源。
實施例5克隆短芽孢桿菌S1菌株的hps的磷酸己酮糖合成酶的基因和檢測phi基因的存在。
首先，利用Southern分析檢測了基因組中hps基因的存在位置。按照Southern方法，用各種限制酶消化如上所述制備的基因組，進行電泳，影印到尼龍膜上(分子生物學(xué)雜志，第98卷，第503頁，1975年)。將含有hps基因部分，長度約為400bp的DNA片段作為探針，該探針是用限制酶BamHI和SpeI消化實施例4中生產(chǎn)的，含有hps部分的pTHS1，并且在2％的瓊脂糖凝膠上電泳分離得到的。
用常規(guī)的方法預(yù)雜交固定DNA的膜，加入標(biāo)記的探針，允許在55℃過夜雜交。用Alk.Phos.DIRECT試劑(Amersham)標(biāo)記探針。用第一和第二洗滌溶液，在55℃洗滌膜兩次，探針的標(biāo)記物在X光膠片上曝光。結(jié)果，用EcoRI，BamHI和SalI消化基因組DNA得到的產(chǎn)物分別在6.0kb，5.5kb和3.0kb處形成單一的譜帶。
根據(jù)上面的結(jié)果，本發(fā)明人嘗試將BamHI或SalI消化的S1菌株的基因組與用同樣的限制酶消化的載體pUC19連接生產(chǎn)質(zhì)粒文庫。但是，這一方法還不能得到連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大量大腸桿菌細胞。所以，用常見的克隆方法還不能得到目的產(chǎn)物hps基因。
所以，本發(fā)明人決定用倒轉(zhuǎn)的PCR方法(遺傳學(xué)，第120卷，第621-623頁，1988年)克隆靶基因。為了用于倒轉(zhuǎn)的PCR反應(yīng)中，本發(fā)明人根據(jù)hps片段的核苷酸序列，合成了來自HPS到N末端的內(nèi)部區(qū)域的引物，hps-ivB1(5’-TAACCGGAGTACCGATTTCC-3’，SEQ ID NO9)，和來自HPS到C末端之間的內(nèi)部區(qū)域引物hps-ivS1(5’-CACGTGGATACGATCTCCA-3’，SEQ ID NO10)。
在另一方面，利用SalI消化的基因組DNA，通過倒轉(zhuǎn)PCR方法獲得了含有hps基因的上游和下游區(qū)的約3000個堿基對的片段，然后自我連接成模板。PCR的條件如下每個循環(huán)包括，在95℃1分鐘，56℃1分鐘，和72℃3分鐘，重復(fù)25個循環(huán)。通過電泳純化PCR產(chǎn)物，并且與pGEM-T載體(Promega)連接。用連接的溶液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。從轉(zhuǎn)化體收集質(zhì)粒，驗證它們的結(jié)構(gòu)，得到目標(biāo)pGHS1。
然后，為了研究hps基因周圍的結(jié)構(gòu)，將pGHS1亞克隆。首先，用限制酶SalI消化pGHS1，通過瓊脂糖凝膠電泳分離兩個DNA片段(約2kb和4kb)。用SalI消化較小的DNA片段，然后與用CLAP處理的pBluescriptII SK+(Stratagene)連接產(chǎn)生pGHS1-HN。在另一方面，將較大的4kbp的片段自我連接，用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到質(zhì)粒pGHS1-HC。利用這些質(zhì)粒，確定插入在載體中的序列的核苷酸序列。結(jié)果證實，在前面提到的倒轉(zhuǎn)PCR導(dǎo)到的約3kb的片段中存在hps的上游和下游區(qū)，從而闡明了hps周圍的結(jié)構(gòu)。序列表示在SEQ ID NO1。
在如上所述得到的DNA片段的核苷酸序列推測的氨基酸序列中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了部分實施例2中確定的酶蛋白的氨基酸序列，并且發(fā)現(xiàn)這一基因剛好編碼HPS。這一氨基酸序列表示在SEQ ID NO2。
在另一方面，本發(fā)明人注意到了存在于前面提到的hps基因的下游的另一個開放讀碼框架(縮寫為“orf”)。研究了已知的序列中與該orf推導(dǎo)的氨基酸序列(SEQ ID NO3)同源的序列，結(jié)果表明，這樣的序列與枯草芽孢桿菌的yckF基因有64％的同源性，并且證實它編碼的是PHI(細菌學(xué)雜志，181卷，第7154頁，1999)。所以，本發(fā)明人通過表達這一基因，試圖證明這一orf是否編碼PHI。
實施例6在大腸桿菌中表達新的短芽孢桿菌S1菌株的磷酸己酮糖異構(gòu)酶基因phi通過PCR，從短芽胞桿菌S1菌株(NCIMB12524)的基因組DNA得到phi基因。用常規(guī)方法合成了5’末端的引物PHI-ESDN(5’-GGAATTCCTAAGGAGGTTTTTATATGATGCAGACAACTGATTC-3’，SEQ ID NO11)和3’末端引物PHI-EcCl(5’-GGAATTCCCTACTCGAGATTGGCATGTCT-3’，SEQ IDNO12)。在95℃將DNA熱變性處理5分鐘，利用短芽孢桿菌S1菌株的基因組DNA作為模板，上面的引物和ExTaq--DNA聚合酶(Takara Shuzo)，用常規(guī)的方法進行PCR(循環(huán)反應(yīng)95℃1分鐘，56℃1分鐘，和72℃2分鐘，重復(fù)30個循環(huán)，然后在72℃下將反應(yīng)系統(tǒng)停留3分鐘)。從而得到了含有phi基因的DNA片段。
然后，pGEM-T easy載體(Promega)中導(dǎo)入前面提到的DNA片段，產(chǎn)生pGPS1。進一步用限制酶NotI消化這一pGPS1，然后用T4-DNA聚合酶將消化的末端平齊化得到末端平齊化的phi基因片段。另一方面，用限制酶SmaI消化表達載體pKK223-3(Pharmacia)。利用DNA連接酶連接phi基因片段和載體片段產(chǎn)生含有載體的啟動子控制下的phi基因的目標(biāo)質(zhì)粒pKPS1。用常規(guī)方法，用這一pKPS1轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109得到轉(zhuǎn)化體JM109/pKPS1。將這一菌株命名為AJ13707，以登記號FERM P-17952，在2000年7月5號保藏于工業(yè)技術(shù)院，生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(現(xiàn)在，國際專利生物體保藏處，國家現(xiàn)代工業(yè)科學(xué)和技術(shù)研究所，獨立管理公司)(Chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵編305-5466)，并根據(jù)布達佩斯條約于2001年6月25日，從原始保藏轉(zhuǎn)為國際保藏，保藏的登記號是FERM BP-7639。
在37℃，在含有氨芐青霉素(50微克/毫升)的LB瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)AJ13707，將出現(xiàn)的菌落接種到含有相同量的氨芐青霉素的5毫升LB液體培養(yǎng)基中。在37℃開始培養(yǎng)。在4-5小時后，在培養(yǎng)基中加入0.5毫摩爾/升IPTG(異丙基-α-D-硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)從pKPS1上存在的tac啟動子開始的轉(zhuǎn)錄。更進一步，在培養(yǎng)14小時后，離心3毫升培養(yǎng)肉湯收集細胞。用50毫摩爾/升的磷酸鉀緩沖液(pH7.5)洗滌這些細胞2次，然后懸浮于100微升含有1毫摩爾/升的DTT(二硫蘇糖醇)的相同的緩沖液。然后，將細胞懸浮液加載到攪拌器上裂解，離心裂解的細胞懸浮液(15000rpm，40分鐘)，將上清液用作粗細胞提取液。
實施例7短芽孢桿菌S1菌株的phi基因產(chǎn)物的活性測量利用實施例6中得到的粗細胞提取液進行PHI的活性的檢測。關(guān)于活性測量的方法，可以以測量甲醛的同化作為用6-磷酸葡萄糖脫氫酶對氧化的磷酸二核苷酸腺嘌呤尼克酰胺的最后還原。
如下所述，混合試劑制備試劑溶液。1毫升溶液A，0.5毫升溶液B，0.5毫升溶液C，和1毫升溶液D混合，制備3毫升反應(yīng)緩沖液。另一方面，混合各1毫升溶液G，H，I和J制備總體積4毫升的酶溶液。
(試劑)A1摩爾/升的磷酸鉀緩沖液，pH7.5B100毫摩爾/升NADP水溶液C100毫摩爾/升的氯化鎂水溶液D50毫摩爾/升的5-磷酸核糖水溶液E酶制備液(50毫摩爾/升的磷酸緩沖液，含有1毫摩爾/升的DTT，pH7.5)F50毫摩爾/升的甲醛水溶液G100單位/毫升的磷酸核酮糖異構(gòu)酶(PRI)H100單位/毫升的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(PGI)I100單位/毫升的6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G6PDH)J100單位/毫升的純化的HPS(酶學(xué)方法，第188卷，397-401頁，1990)在0.55毫升水中加入0.15毫升前面提到的反應(yīng)緩沖液和0.20毫升酶溶液，加入小杯(d＝1.0)中，進一步加入0.05毫升前面提到的酶制備液E，攪拌并在30℃加熱2分鐘。在混合物中加入0.05毫升溶液F，充分混合，用分光光度計測量混合物在340納米處的吸光值的增加，將水作為空白。從吸光值曲線的開始的線性部分可以得到每分鐘的吸光變化值(這值表示為“Δ測試”)。對于空白測試，進行了同樣的如上所述的過程，除了加入的是0.05毫升稀釋的酶溶液而不是酶制備液，得到了每分鐘的變化的吸光值(這一值表示為“Δ空白”)。
一個單位的酶活性為根據(jù)下面的方程計算每分鐘1微摩爾NADP還原成NADPH的酶量PHI活性(單位/毫升)＝(Δ測試-Δ空白)×D×V/6.22×LD酶的稀釋比例V反應(yīng)混合物的量(這種情況下是1毫升)L反應(yīng)混合物中酶制備液的量(這時為0.05毫升)NADPH的分子淬滅系數(shù)(30nm)＝6.22×103M-1cm-1結(jié)果，在用含有載體pKK223-3，不攜帶phi基因的大腸桿菌JM109制備的粗提取液中不能檢測到PHI活性，而在含有pKPS1的大腸桿菌(AJ13707)制備的粗細胞提取液中發(fā)現(xiàn)了高的PHI活性(187個單位/毫克蛋白質(zhì))。這證明了本發(fā)明人得到的基因編碼PHI。
序列表<110>Ajinomoto公司<120>磷酸己酮糖異構(gòu)酶和其基因<130>OP1187<140>
<141>2000-07-07<150>JP2000-<151>2000-07-07<160>12<170>PatentIn第二版<210>1<1830>
<212>DNA<213>短芽孢桿菌<220>
<221>CDS<222>(508)...(1140)<220>
<221>CDS<222>(1149)...(1700)<400>1agccaatgac ggaaaatgat tgaggcattt tttgatccag aaataaatta tacaaagcag 60gatagatttt ccttttagct aaatcccctg tcgcgccaaa caagacaaag gtcatcgaat 120ccacttttca tacctccaca ttaacatttg ttgcggcaaa tattagtata atatgtatat 180tttttatatg taagtacgca cttattaatc ttatagttac aaatttatat aaagtataaa 240taatatacta taaaaaatct tatggaaagt gatggatcat tcataccttt ttttcccgta 300ttgtttacat tttctatagg aattttttct taatagtata ctttttatac tatgtgttaa 360taaagtgcgt actttttaaa aaatttgata gatagtatat taacagtgta caggcaaaag 420aaggaataca cacatttgct tgtacaatac aaagttacat aattgtaaca aaaaaaacta 480aaaattttga aaaggagtgt ataattt atg caa ctt caa tta gct cta gat ttg 534Met Gln Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu1 5gta aac att gaa gaa gca aaa caa gta gta gct gag gtt cag gag tat 582Val Asn Ile Glu Glu Ala Lys Gln Val Val Ala Glu Val Gln Glu Tyr10 15 20 25gtc gat atc gta gaa atc ggt act ccg gtt att aaa att tgg ggt ctt 630Val Asp Ile Val Glu Ile Gly Thr Pro Val Ile Lys Ile Trp Gly Leu30 35 40caa gct gta aaa gaa gtt aaa gac gca ttc cct cat tta caa gtt tta 678Gln Ala Val Lys Glu Val Lys Asp Ala Phe Pro His Leu Gln Val Leu45 50 55gct gac atg aaa act atg gat gct gca gca tat gaa gtt gct aaa gca 726Ala Asp Met Lys Thr Met Asp Ala Ala Ala Tyr Glu Val Ala Lys Ala60 65 70gct gag cat ggc gct gat atc gta aca att ctt gca gca gct gaa gat 774Ala Glu His Gly Ala Asp Ile Val Thr Ile Leu Ala Ala Ala Glu Asp75 80 85gta tca att aag ggt gct gta gaa gaa gcg aaa aaa ctt ggc aaa aaa 822Val Ser Ile Lys Gly Ala Val Glu Glu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Lys90 95 100 105atc ctt gtt gac atg atc gca gtt aaa aat tta gaa gag cgt gca aaa 870Ile Leu Val Asp Met Ile Ala Val Lys Asn Leu Glu Glu Arg Ala Lys110 115 120caa gtg gat gaa atg ggt gta gac tac att tgt gtt cac gct gga tac 918Gln Val Asp Glu Met Gly Val Asp Tyr Ile Cys Val His Ala Gly Tyr125 130 135gat ctc caa gca gta ggt aaa aac cca tta gat gat ctt aag aga att 966Asp Leu Gln Ala Val Gly Lys Asn Pro Leu Asp Asp Leu Lys Arg Ile140 145 150aaa gct gtc gtg aaa aat gca aaa act gct att gca ggc gga atc aaa 1014Lys Ala Val Val Lys Asn Ala Lys Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ile Lys155 160 165tta gaa aca ttg cct gaa gtt atc aaa gca gaa ccg gat ctt gtc att 1062Leu Glu Thr Leu Pro Glu Val Ile Lys Ala Glu Pro Asp Leu Val Ile170 175 180 185gtc ggc ggc ggt att gct aac caa act gat aaa aaa gca gca gct gaa 1110Val Gly Gly Gly lle Ala Asn Gln Thr Asp Lys Lys Ala Ala Ala Glu190 195 200aaa ata aat aaa tta gtt aaa caa ggg tta tgatcagc atg cag aca act 1160Lys lle Asn Lys Leu Val Lys Gln Gly Leu Met Gln Thr Thr205 2101gaa ttc tta tct gaa atc gta aaa gaa tta agt aat tcg gtt aac caa 1208Glu Phe Leu Ser Glu Ile Val Lys Glu Leu Ser Asn Ser Val Asn Gln5 10 15 20atc gcc gat gaa gaa gcg gaa gca ctg gta aac gga att ctt caa tca 1256Ile Ala Asp Glu Glu Ala Glu Ala Leu Val Asn Gly Ile Leu Gln Ser25 30 35aag aaa gta ttt gtt gcc ggt gca gga aga tcc ggt ttt atg gca aaa 1304Lys Lys Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly Phe Met Ala Lys40 45 50tcc ttt gcg atg cgc atg atg cac atg gga att gat gcc tat gtc gtt 1352Ser Phe Ala Met Arg Met Met His Met Gly Ile Asp Ala Tyr Val Val55 60 65ggc gaa acc gta act cct aac tat gaa aaa gaa gac att tta att att 1400Gly Glu Thr Val Thr Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Asp Ile Leu Ile Ile70 75 80gga tcc ggc tct gga gaa aca aaa ggt ctc gtt tcc atg gct caa aaa 1448Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Gly Leu Val Ser Met Ala Gln Lys85 90 95 100gca aaa agc ata ggt gga acc att gcg gct gta acg att aat cct gaa 1496Ala Lys Ser Ile Gly Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr Ile Asn Pro Glu105 110 115tca aca atc gga caa tta gcg gat atc gtt att aaa atg cca ggt tcg 1544Ser Thr Ile Gly Gln Leu Ala Asp Ile Val Ile Lys Met Pro Gly Ser120 125 130cct aaa gat aaa tca gaa gca agg gaa act att caa cca atg gga tcc 1592Pro Lys Asp Lys Ser Glu Ala Arg Glu Thr Ile Gln Pro Met Gly Ser135 140 145ctt ttc gag caa aca tta tta tta ttc tat gat gct gtc att ttg aga 1640Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp Ala Val Ile Leu Arg150 155 160ttc atg gag aaa aaa ggc ttg gat aca aaa aca atg tac gga aga cat 1688Phe Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Thr Lys Thr Met Tyr Gly Arg His165 170 175 180gcc aat ctc gag taggcgtgga attaagaaaa ggaagaccgc gatgctttgc 1740Ala Asn Leu Gluggtctttcct tgtttttttt acattacatg atgtttatat agtgtcgacc atatgggaga 1800gctcccaacg cgttggatgc ata 1823
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<212>PRT<213>短芽孢桿菌<400>3Met Gln Thr Thr Glu Phe Leu Ser Glu Ile Val Lys Glu Leu Ser Asn1 5 10 15Ser Val Asn Gln Ile Ala Asp Glu Glu Ala Glu Ala Leu Val Asn Gly20 25 30Ile Leu Gln Ser Lys Lys Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly35 40 45Phe Met Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Met Met His Met Gly Ile Asp50 55 60Ala Tyr Val Val Gly Glu Thr Val Thr Pro Asn Tyr Glu Lys Glu Asp65 70 75 80Ile Leu Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Gly Leu Val Ser85 90 95Met Ala Gln Lys Ala Lys Ser Ile Gly Gly Thr Ile Ala Ala Val Thr100 105 110Ile Asn Pro Glu Ser Thr Ile Gly Gln Leu Ala Asp Ile Val Ile Lys115 120 125Met Pro Gly Ser Pro Lys Asp Lys Ser Glu Ala Arg Glu Thr Ile Gln130 135 140Pro Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp Ala145 150 155 160Val Ile Leu Arg Phe Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Thr Lys Thr Met165 170 175Tyr Gly Arg His Ala Asn Leu Glu180<210>4<211>30<212>PTR<213>短芽孢桿菌<400>4Met Gln Leu Gln Leu Ala Leu Asp Leu Val Asn Ile Glu Glu Ala Lys1 5 10 15Gln Val Val Ala Glu Val Gln Glu Tyr Val Asp Ile Val Glu20 25 30<210>5<211>36<212>PRT<213>短芽孢桿菌<400>5Val Ala Lys Ala Ala Glu His Gly Ala Asp Ile Val Thr Ile Leu Ala1 5 10 15Ala Ala Glu Asp Val Ser Ile Lys Gly Ala Val Glu Glu Ala Lys Lys20 25 30Leu Gly Xaa Lys35<210>6<211>20<212>PRT<213>短芽孢桿菌<400>6Met Gly Val Asp Tyr Ile Xaa Val His Ala Gly Tyr Asp Leu Gln Ala1 5 10 15Val Gly Lys Asn20<210>7<211>29<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>7gargtncarg artaygtnga yathgtnga<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>8ttyttnccna cngcytgnar rtcrta<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明引物<400>9taaccggagt accgatttcc<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.編碼下面的(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)的DNA(A)具有序列表中顯示的SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有序列表中顯示的SEQ ID NO3的氨基酸序列，其中包括一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失，插入或增加和具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA，它是下面的(a)或(b)中定義的DNA(a)至少包括序列表中表示的SEQ ID NO1的核苷酸序列中1149-1700號核苷酸殘基的核苷酸序列的DNA，(b)在嚴(yán)格條件下，與至少包括序列表中列出的SEQ ID NO12的核苷酸1149-1700的核苷酸序列可雜交，并且編碼具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
3.用可以表達權(quán)利要求1所述的DNA編碼的磷酸己酮糖異構(gòu)酶的方式導(dǎo)入該DNA的細胞。
4.生產(chǎn)磷酸己酮糖的異構(gòu)酶的方法，包括步驟在培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3所述的細胞，在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和積累磷酸己酮糖異構(gòu)酶，從培養(yǎng)基中收集磷酸己酮糖異構(gòu)酶。
5.一種蛋白質(zhì)，具有下面的(A)或(B)中定義的蛋白質(zhì)(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，(B)具有序列表中列出的SEQ ID NO3的氨基酸序列，其中包括一個或幾個氨基酸殘基的取代，缺失，插入或增加，并且具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了編碼磷酸己酮糖異構(gòu)酶的DNA,該酶是下面的(A)或(B)定義的蛋白質(zhì),同時提供了生產(chǎn)該酶的方法:(A)具有序列表中列出的SEQ ID NO:3的氨基酸序列的蛋白質(zhì),(B)具有序列表中列出的SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白質(zhì),其中包括一個或幾個氨基酸的取代,缺失,插入或增加,并且具有磷酸己酮糖異構(gòu)酶的活性。
文檔編號C12N1/19GK1362518SQ0113798
公開日2002年8月7日 申請日期2001年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者加藤暢夫, 安枝壽 申請人:味之素株式會社