專利名稱：生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種能夠生產(chǎn)治療動脈硬化、脂肪肝的彈白酶，以替代胰藏分離出的彈性酶的新型枯草桿菌。
背景技術：
彈性酶是保羅和班格首先從胰臟分離純化出來的，一直作為治療動脈硬化、脂肪肝等的生化藥物，已經(jīng)被列入藥典。由于該種酶原出于動物臟器，原料短缺，多年來世界上開展的是菌源性彈性酶的研究，例如用細菌、霉菌、放射菌分離彈性酶，但是其成本高，產(chǎn)酶率低，資源受限，價格昂貴，一直未能取得工業(yè)應用。
本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，其產(chǎn)量高、適于大規(guī)模生產(chǎn)，可以降低成本，滿足更多的患者需要。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，所述的菌種為Bacillus Subtilis Hw236-5CGMCC No0652，分子量27800，其菌落為圓形，皺褶、不規(guī)則、無光澤、不透明、白色直徑2-3mm，在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂試管穿刺表面生長物變厚，菌體寬度0.7-0.8μM，長度2-3μM，其運動性為鞭毛運動，芽孢為0.5×1.5-1.8、對于過氧化酶試驗、沙氏葡萄糖液固基生長試驗、0.001％溶菌酶生長試驗、檸檬酸與鹽生長產(chǎn)堿試驗，水解酪素試驗90％以上的菌株顯陽性，卵黃反應試驗、55℃0.02％重氮化合物試驗以及7％NaCl中生長90％以上菌株呈陰性。
本發(fā)明的優(yōu)點在于1.具有新的性能。本枯草菌株不同于已有的普通枯草菌，它能夠產(chǎn)生彈性酶，替代傳統(tǒng)的來源于胰臟或者菌源的彈性酶，其成本低，產(chǎn)酶率高，可利用資源豐富，可以大幅度的降低相應的藥品價格，適于大規(guī)模生產(chǎn)，滿足更多的患者需要。
2.原料價低，原材料資源易于得到，生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)量高，因此，價格低。目前世界上菌源類產(chǎn)品尚未能達到工業(yè)實施階段，而利用胰臟生產(chǎn)彈性酶時，1Kg胰臟能夠生產(chǎn)4克彈性酶，每克彈性酶的基礎成本就是0.75元，是本發(fā)明生產(chǎn)的彈性酶價格的2.6倍，而且來源于生物的原料非常缺乏，生產(chǎn)的彈性酶價格偏高。本發(fā)明使用枯草菌來生產(chǎn)彈性酶，所生產(chǎn)的藥品原料價格低廉，降低了彈性酶的生產(chǎn)成本，可以帶動藥價下調，適合普通消費者使用，是一種高性能的低價格藥品原料，具有顯著的技術上的進步。
3.隨這老齡化的嚴重，目前我國每年死于心血管疾病的患者200余萬，占死亡總數(shù)的40％，而目前生產(chǎn)的彈性酶幾乎全部取自胰臟，資源非常有限，特別是由于彈性酶的去除脂肪和溶化血栓的雙重功能是目前其他降脂性藥物所不能取代的，國內外的藥品價格非常高，有限的一點國產(chǎn)藥品也都大多出口國外，國內市場供不應求。這里提供的彈性酶的生產(chǎn)菌種成本低，產(chǎn)量大，工藝簡單，經(jīng)濟效益會十分可觀，可以在低成本的情況下解決這個問題，使我國的普通患者也有可能夠用上彈性酶制劑。該發(fā)明將有深遠的社會意義。
實施例生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，菌種的名稱為Bacillus Subtilis Hw236-5 CGMCCNo0652，其菌落為圓形，皺褶、不規(guī)則、無光澤、不透明、白色直徑2-3mm，在1％葡萄糖營養(yǎng)瓊脂試管穿刺表面生長物變厚，菌體的寬度0.7-0.8μM，長度2-3μM，其運動性為鞭毛運動，芽孢為0.5×1.5-1.8、對于過氧化酶試驗90％以上的菌株顯陽性、沙氏葡萄糖液固基生長試驗90％以上的菌株顯陽性、0.001％溶菌酶生長試驗90％以上的菌株顯陽性、檸檬酸與鹽生長產(chǎn)堿試驗90％以上的菌株顯陽性，水解酪素試驗90％以上的菌株顯陽性，卵黃反應試驗90％以上菌株呈陰性、55℃0.02％重氮化合物試驗90％以上菌株呈陰性以及7％NaCl中生長90％以上菌株呈陰性。
根據(jù)《伯杰鑒定手冊》第九版及《一般細菌常用鑒定方法》的要求與中科院鑒定的的枯草芽苞桿菌為模式株，根據(jù)以上性能認定，該菌屬于枯草芽孢菌系。
上述的生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，所述的菌種也可以采用標準的枯草桿菌誘變取得，能夠生產(chǎn)彈性蛋白酶。
本產(chǎn)品的培植方法1.所用培養(yǎng)基a.彈性蛋白0.3-0.9，加酵母膏0.1-0.4，葡萄糖0.1-0.5，硫酸鎂0.01。磷酸氫二鉀和磷酸二氫鉀0.15，中性。
b.干酪素2-5，葡萄糖2-5，玉米提取液0.1-0.5，磷酸氫二鉀0.1-0.5，硫酸鎂0.01，基本為中性。
c.重量基本相等的牛肉膏、蛋白凍、蔗糖，加少許氯化鈉，基體為中性。
2.培養(yǎng)方法將稻草數(shù)根剪碎，至于三角瓶中，加水沒過干草，裝量不超過瓶容量的1/2，加石灰少許，塞好棉塞，煮沸5分鐘，殺死無芽孢菌，于28-42度培養(yǎng)45小時，液面出現(xiàn)白色菌膜后，取培養(yǎng)液在平面培養(yǎng)基c上涂布、劃線，進行菌種分離，將單菌落劃線到斜面培養(yǎng)基c上。
3.菌種篩選將菌種稀釋涂布到另一培養(yǎng)基b上，形成單菌落后，點種于培養(yǎng)基a，選擇水解彈性蛋白所形成的透明圈直徑與菌徑比較大的菌落劃線到另一培養(yǎng)基b上，進行搖瓶發(fā)酵，然后采用國家衛(wèi)生部藥品標準測定彈性蛋白酶的活力。
其中進行菌種誘變的方法可以采用硫酸二乙脂誘變法，也可以采用鈷60誘變法。
4.實際置備時，從稻草中篩出了17株可以使彈性蛋白溶解的桿菌，經(jīng)液體培養(yǎng)后復篩出4株產(chǎn)彈性酶比較高的菌株，再次進行誘變，又得到17株，經(jīng)比較彈性蛋白的溶解透明圈與菌徑之比，選取較大的4株進行液體發(fā)酵試驗，選定具有上述特征的菌株作為產(chǎn)彈性蛋白酶的菌株。重復以上篩選操作3-6次后，得到高產(chǎn)量的彈性酶，在完成上述操作過程中，干酪素和葡萄糖均是生產(chǎn)蛋白酶的比較適合的氮、碳源，其價格性能比比較高。置備過程中，以pH8.5為最佳值，培養(yǎng)溫度以28、32、37℃的產(chǎn)酶活力相近，42℃產(chǎn)率較佳，在操作過程中通氣量大的產(chǎn)率也相應提高，在發(fā)酵20-28小時間產(chǎn)酶率較高，由此得到了穩(wěn)定的產(chǎn)彈性酶高的菌種和高產(chǎn)量的彈性酶，經(jīng)測定，蛋白酶活力118.1μ/ml，彈性酶活力達到122μ/ml。
由上可以看出，生產(chǎn)彈性酶的管養(yǎng)要求簡單，產(chǎn)酶迅速，經(jīng)過中試證實可以作為工業(yè)菌種應用于彈性酶生產(chǎn)過程。
5.酶的提取方法將發(fā)酵液離心棄菌體，濃縮后，將預冷丙酮按適當比例加入離心液體中沉淀出彈性酶，將其真空干燥后得到彈性酶粗粉。
或者將發(fā)酵液離心棄菌體，以硫酸銨分級沉淀鹽析，離心分離，棄菌體，用0.05mol/L的Tris-CI(pH8.5)緩沖液透析后，再經(jīng)過DETA-纖維素柱并洗滌，然后用pH8.0的0.1mol/L的Tris-cl洗脫，收集活性部分于透析袋中，以聚乙二醇濃縮后以平衡好的Scphadex G-7.5柱進行凝膠過濾，收集活性峰冷凍后得到彈性酶的精酶粉。
實施例2提供一種實驗室實施的過程1.菌種置備，將試管中的菌活化后轉接到茄子瓶培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的成份同上，在25-42℃恒溫培養(yǎng)18-36小時，取瓶中的菌接入滅菌的三角瓶培養(yǎng)基中，至于旋轉搖床上以180r/min培養(yǎng)18-36小時，培養(yǎng)溫度25-45℃，按10％接種量將將三角瓶菌種接入已經(jīng)滅菌的種子罐的培養(yǎng)基中，攪拌通風，在25-45℃下恒溫培養(yǎng)18-36小時，制成種子液。
2.發(fā)酵液的制備按培養(yǎng)基b的配方作培養(yǎng)基，置備的發(fā)酵液在0.1MPa壓力下進行滅菌，20-40min冷卻到30℃以下，按10％接種量接入種子液。在25-45℃下通風、攪拌發(fā)酵培養(yǎng)18-36小時，中止發(fā)酵。
3.彈性酶粗粉的提取將已經(jīng)發(fā)酵好的發(fā)酵液離心棄菌體，將離心上清液冷卻至10℃左右，打入沉淀罐中，加入預冷丙酮，沉淀，離心后脫水處理，真空干燥得到彈性酶粉。
4.彈性酶精粉的提取將已經(jīng)發(fā)酵好的發(fā)酵液離心棄菌體，調pH3.0-6.0后打入D-152樹脂吸附，2-10小時，洗滌后洗脫，收集峰液，濃縮后加入預冷的丙酮，沉淀，離心到出現(xiàn)沉淀后進行脫水，得到精粉。
5.茄子瓶培養(yǎng)基推薦的其他配方干酪素1-5％，葡萄糖1-6％，玉米漿0.1-0.4％，磷酸氬二鉀0.1-0.4％，硫酸鎂0.1以下。pH值應當在6.0-9.0。
如果制成斜面，加入1-3％的瓊脂即可。
在0.1MPa高壓蒸氣滅菌20-40分鐘后備用。
6.發(fā)酵液培養(yǎng)基推薦的其他配方干酪素1-5％，馬鈴薯淀粉/大麥皮/葡萄糖1-8％，玉米漿0.1-0.4％，磷酸氫而鉀0.1-0.4％，硫酸鎂0.1以下。其pH應當在6.0-9.0。應當在D.1MPa高壓蒸氣下滅菌20-40分鐘，冷卻后備用。
權利要求
1.一種生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，其特征是所述的菌種為BacillusSubtilis Hw236-5 CGMCC No0652，分子量27800，其菌落為圓形，皺褶、不規(guī)則、無光澤、不透明、白色直徑2-3mm，在1％葡萄糖管養(yǎng)瓊脂試管穿刺表面生長物變厚，菌體寬度0.7-0.8μM，長度2-3μM，其運動性為便毛運動，芽孢為0.5×1.5-1.8、對于過氧化酶試驗、沙氏葡萄糖液固基生長試驗、0.001％溶菌酶生長試驗、檸檬酸與鹽生長產(chǎn)堿試驗，水解酪素試驗90％以上的菌株顯陽性，卵黃反應試驗、56℃0.02％重氮化合物試驗以及7％NaCl中生長90％以上菌株呈陰性。
2.根據(jù)權利要求1所述的生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌，其特征是所述的菌種采用標準的枯草桿菌經(jīng)3-6次誘變取得，置備過程中，以pH8.5為最佳值，培養(yǎng)溫度以28、32、37℃的產(chǎn)酶活力相近，42℃產(chǎn)率較佳，在操作過程中通氣量大的產(chǎn)率也相應提高，在發(fā)酵20-28小時間產(chǎn)酶率較高，能夠生產(chǎn)彈性蛋白酶。
全文摘要
生產(chǎn)彈性酶的枯草桿菌,是一種能夠生產(chǎn)治療動脈硬化、脂肪肝的彈白酶,以替代胰藏分離出的彈性酶的新型枯草桿菌。現(xiàn)有的菌源彈性酶成本高,產(chǎn)酶率低。本發(fā)明的菌種其菌落為圓形,皺褶、不規(guī)則、無光澤、不透明、白色直徑2－3mm,在1%葡萄糖營養(yǎng)瓊脂試管穿刺表面生長物變厚,菌體寬度0.7－0.8μM,長度2－3μM,其運動性為便毛運動,芽孢為0.5×1.5－1.8、對于過氧化酶、沙氏葡萄糖液固基生長、0.001%溶菌酶生長、檸檬酸與鹽生長產(chǎn)堿,水解酪素時90%以上的菌株均顯陽性,在卵黃反應、55℃0.02%重氮化合物以及7%NaCl中生長90%以上菌株呈陰性。
文檔編號C12N9/66GK1369551SQ0113881
公開日2002年9月18日 申請日期2001年12月9日 優(yōu)先權日2001年12月9日
發(fā)明者劉宇峰, 奚新偉, 王金英 申請人:黑龍江省科學院應用微生物研究所