專利名稱：在聚合物膜上固定化酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種在不同的聚合物膜上固定酶或其他具有分離和催化活性成分的方法。
據(jù)文獻報道，用于固定化酶的膜材料主要選用聚酰胺、纖維素或膠原質(zhì)的衍生物。即使是采用物理吸附的方法來固定化酶也主要選用這些材料。但是，這些已報道的方法都存在技術(shù)復(fù)雜、成本偏高、膜的選擇范圍小等諸多不利。
本發(fā)明的關(guān)鍵是使用一種中介的聚合物，使基膜和酶連接在一起。這種中介聚合物通常是一種含有多陽離子或多胺基的親水性聚合物(后者可以通過降低pH，使胺基很容易地轉(zhuǎn)化為陽離子)。中介聚合物的親水性對保持酶或其他具有催化和分離功能基團的活性是十分有利的。
按照本發(fā)明，酶在膜上的固定化包括兩個步驟第一步，通過離子反應(yīng)，使多陽離子或多胺基聚合物通過浸泡吸附在含有陰離子基團的聚合物膜上。被吸附的聚合物有時需要經(jīng)過交聯(lián)處理。因為，交聯(lián)能使聚合物以不可逆的方式連接在膜上。不經(jīng)交聯(lián)處理的中介聚合物有可能在介質(zhì)的離子強度增加時或在pH值下降時從膜上脫落。在這種情況下，就需要對膜進行再生，使膜在正常的條件下，可以長時間保存而不會喪失活性。
第二步，經(jīng)過上述方法處理的膜在pH高于酶的等電點的酶溶液中浸泡吸附，使酶固定在中介聚合物膜上。漂洗干凈后，還須浸入含有親水性多官能團試劑的水溶液中進行交聯(lián)。其作用或是使酶分子相互連接在一起，或是使酶分子同聚合物基質(zhì)連接在一起，從而提高酶在聚合物上結(jié)合的牢固性?？梢杂米鹘宦?lián)劑的多官能團試劑有戊二醛、酒石酸或雙偶氮苯并-2，2’-二磺酸等。
本發(fā)明中的中介聚合物通過浸泡吸附在聚合物膜上，浸泡的中介聚合物濃度一般為0.1％～1％，浸泡溫度為室溫，浸泡時間一般為10分鐘～60分鐘。
經(jīng)過上述處理的膜用含酶的溶液吸附時，酶溶液的濃度是0.5mg/mL～5mg/mL，浸泡溫度為室溫，浸泡時間為10分鐘～60分鐘。
常用的中介聚合物有聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、二乙胺基乙基萄聚糖、殼聚糖，聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚乙烯基咪唑等。
本發(fā)明所用的中介聚合物在吸附酶的同時，如能用交聯(lián)劑交聯(lián)，可使中介聚合物和酶穩(wěn)定地吸附在聚合物膜上并較長時間保存，固定化程度更好。交聯(lián)劑是一些親水性的多官能團化合物，如戊二醛、酒石酸、烷基二異氰酸酯、環(huán)氧鹵代物、二鹵代物等。
經(jīng)過預(yù)處理的聚合物膜在含酶的溶液中浸泡吸附的條件是溶液的pH值略高于酶制劑的等電點。這是因為在酶的化學(xué)結(jié)構(gòu)中常含有活性陰離子基團，因此介質(zhì)的pH不能低于酶的等電點。一般酶溶液的pH值應(yīng)比酶的等電點高1-2。
中介聚合物需含有胺基(I級、II級或III級胺)、陽離子基(IV級銨基、磺酸基，磷酸基)或其他非離子型親水基如羥基、醚基、酰胺基等。下述市售聚合物也適用于作為中介聚合物。如含有IV級銨的聚乙烯基亞胺、聚乙烯基胺、聚丙烯酰胺，聚N-二甲基胺乙基丙烯酰胺、聚乙烯基-4-吡啶，聚乙烯基咪唑，二乙胺基乙基萄聚糖，殼聚糖等?？傊?，所有在主鏈或側(cè)鏈上含有上述基團，或可能通過進一步反應(yīng)形成上述基團的親水性聚合物、共聚物、縮聚物或縮合共聚物都能應(yīng)用。為了使交聯(lián)反應(yīng)能夠進行，中介聚合物須帶有能同交聯(lián)劑發(fā)生反應(yīng)的基團。
中介聚合物的交聯(lián)劑以戊二醛較好，因為它溶于水，有較好的生物相容性，而且來源廣泛、價格低廉、使用方便、用量不多。
本發(fā)明也適用于含陰離子的膜。這類膜可以直接選用市售的陰離子膜如含有磺酸基的丙烯腈類共聚膜、磺化聚砜膜、含過量負(fù)電荷的復(fù)合聚電解質(zhì)膜；也可以通過蒸發(fā)或凝膠的方法用含陰離子基的聚合物溶液通過澆鑄成膜。這些膜在使用前可以進行適當(dāng)?shù)母男裕Ｓ玫母男苑椒ㄓ谢瘜W(xué)改性、電化學(xué)改性、電射流改性或輻照改性等。
陰離子基可以是硫酸基、磺酸基、羧基、磷酸基或膦酸酯基。這些基團可能分布在整個膜中，也可能只是分布在膜或膜孔的表面。如果這些基團僅處于膜的表面，那么這些基團在膜中所占的比例與膜的總重量相比是很小的。
本發(fā)明中陰離子膜可以通過接枝反應(yīng)獲得含有陰離子基團的聚合物膜。如丙烯酸接枝的聚乙烯膜，聚乙烯磺酸膜等。
用Ce(IV)鹽作引發(fā)劑，通過含陰離子單體接枝共聚的方法，可以將纖維素膜改性為含陰離子基團的聚合物膜。如丙烯酸或丙烯酰胺接枝纖維素膜等。
本發(fā)明適用的膜可以用任何一種聚合物制成，可以通過陰離子單體接枝共聚的方法來改性。其方法是將聚合物膜浸泡在含有陰離子單體和雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的水溶液中，采用輻照的方法引發(fā)接枝聚合反應(yīng)。
用于血液透析的丙烯腈-甲基丙烯基磺酸共聚膜或磺化聚砜膜用于本發(fā)明也能獲得良好的效果。
本發(fā)明方法對聚合物膜厚度的要求不高，因此是對現(xiàn)有固定化酶技術(shù)的很大革新。根據(jù)本發(fā)明，只要能通過浸泡的方法吸附中介聚合物和酶的陰離子膜均可使用。所有厚度為10～200μm的聚合物膜都能用于固定化酶的目的。
顯然，本發(fā)明所介紹的方法可以適用于具有不同物理結(jié)構(gòu)的膜，如致密均質(zhì)膜、含有致密皮層的不對稱膜、含有微孔皮層的不對稱膜及均質(zhì)微孔膜等。
本發(fā)明也可用于不同構(gòu)型的膜，如平板膜、管式膜、中空纖維膜或其他類型的膜。
符合本發(fā)明的固定化酶膜可用于不同的領(lǐng)域，如酶膜反應(yīng)器、膜電極等各類含活性酶的膜產(chǎn)品。
用本發(fā)明方法可在聚合物膜上固定具有分離和催化活性成份的化合物，使聚合物膜在化學(xué)反應(yīng)或化工分離中具有分離和催化功能，從而應(yīng)用于各種化學(xué)產(chǎn)品，尤其是生物產(chǎn)品的合成和分離。
本發(fā)明方法經(jīng)中介聚合物吸附的聚合物膜若因時間長或保存不當(dāng)而失效，可以用同樣的方法進行再生，從而節(jié)約制備成本。
與文獻中報道的方法相比，本發(fā)明中所用的方法有如下一些優(yōu)點-膜的選擇范圍更大它能將酶固定在不同性質(zhì)的膜上，可以根據(jù)膜的物理化學(xué)性質(zhì)獨立地進行選擇。因此，根據(jù)固定化酶膜在應(yīng)用上的要求，可以選用厚度很薄的膜(如厚度僅十幾微米的中孔纖維膜)或孔徑及空孔率合適的膜。后面我們將舉一些例子來說明初始膜的選擇能明顯改善固定化酶的效果。
-經(jīng)中介聚合物層處理后的膜有很高的穩(wěn)定性(膜的穩(wěn)定性與基膜相當(dāng))，而且能很簡便而快捷地在這些經(jīng)過預(yù)處理的膜上固定化酶。它能在即將使用時將酶固定在預(yù)先經(jīng)過合適處理的膜上，這樣就能大大增加固定化酶膜的保存和使用期，因此，經(jīng)濟效益是顯而易見的。
-固定化效果好。由于支撐膜的表面積很大，且在聚合物上有很多活性基團，因此固定化酶的量也很大，效率很高。
-由于中介層聚合物形成的親水性環(huán)境，固定化酶有很好穩(wěn)定性。
-固定化酶的形式非常隨意，可以將酶可逆或不可逆地固定在膜上，還可以將酶固定在膜的一個表面，兩個表面，或固定在膜的內(nèi)孔中
1)用化學(xué)改性的方法使膜帶上負(fù)電荷，反應(yīng)發(fā)生在孔的表面。為此，在室溫下，將膜在濃度為0.01mol/L的Ce(IV)稀硫酸溶液中浸泡15分鐘，然后用濾紙將膜吸干。再將膜在0.1mol/L的丙烯酸在0.05N硫酸的溶液中在室溫下浸泡20小時，使發(fā)生丙烯酸在膜上的接枝聚合反應(yīng)。這樣制得的改性膜性能十分穩(wěn)定，可在室溫下以干態(tài)或濕態(tài)長期保存。
2)將這種膜在室溫下在聚乙烯基亞胺的水溶液(10～20g/L)中浸泡20分鐘，溶液中加入少許H2SO4調(diào)節(jié)pH為10。然后用水漂洗干凈，用1％的戊二醛溶液在室溫下處理30秒。制得的改性膜可在室溫下以干態(tài)或濕態(tài)長期保存。
葡萄糖氧化酶的固定將用2)法制得的膜在室溫下，在濃度為1mg/mL的葡萄糖氧化酶水溶液中浸泡30分鐘。該膜可以專門用于測定葡萄糖在水溶液中的濃度。測定是在一臺電流計中進行的，所用的極化電流為0.6V，緩沖液為pH 5.5的醋酸鹽?？赏瑫r測得葡萄糖水溶液的電流強度和訊號的響應(yīng)時間。所謂響應(yīng)時間是指將一定量的葡萄糖一次加入到pH為5.5的緩沖溶液中配成濃度為0.5mM的溶液，當(dāng)信號達到穩(wěn)定時的時間。
用例1所描述的方法制成的膜測定濃度為0.5mM的葡萄糖溶液時，相應(yīng)的電流強度為170nA，響應(yīng)時間為60秒。例2所用的膜為濕態(tài)的再生纖維素銅氨滲析膜(ENKA GLANZSTOFF生產(chǎn))，牌號210PM，濕膜的厚度為20μm。
該膜采用例1中的1)和2)所描述的方法進行處理。葡萄糖氧化酶的固定方法也與例1相同。
用電流計測定0.5mM葡萄糖溶液的電流強度為28nA，響應(yīng)時間為18秒。例3所用的膜為濕態(tài)的丙烯腈共聚物制的滲析膜(RHONE-POULENC生產(chǎn))，牌號AN69，濕膜的厚度為40μm。
該膜已帶有負(fù)電荷，可不經(jīng)處理直接使用。聚乙烯基亞胺的吸附和葡萄糖氧化酶的固定化均采用與前面介紹相同的方法進行。
用電流計測定0.5mM葡萄糖溶液的電流強度為22nA，響應(yīng)時間為18秒。例4所用的膜為實驗室自制的丙烯腈(PAN)膜、磺化聚砜膜或磺化芳香族聚醚酮膜，可以用均聚膜也可以用同其他聚合物共混制成的合金膜。
用自由基聚合法合成帶有負(fù)電性基團的聚丙烯腈(約40mgEq/kg)，引發(fā)劑為過硫酸鹽-硫代硫酸鹽，反應(yīng)介質(zhì)為水。將制成的聚合物溶于DMSO中，配制成濃度為10％的溶液。然后，將得到的粘稠溶液在玻璃板上刮制成薄膜，并迅速浸入沉淀浴中。沉淀浴由濃度約10％(體積)的DMSO水溶液組成。工業(yè)上用相同方法生產(chǎn)的PAN膜也能使用。制成的膜還需在5M的堿溶液中，在10℃～60℃的溫度下處理一定的時間，使產(chǎn)生一定濃度的負(fù)電性羧基。羧基的含量可用常規(guī)的容量法測定。
磺化聚砜或磺化芳香聚醚酮采用文獻報道的方法制備。這些聚合物采用與PAN膜相似的方法制備不對稱膜。
所得的聚合物薄膜具有不對稱結(jié)構(gòu)，所得的膜厚為60μm，采用前面所述方法固定葡萄糖氧化酶。
用電流計測定0.5mM葡萄糖溶液的電流強度為200nA，響應(yīng)時間為20秒。例5所用的膜同例4。
制備了固定化葡萄糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶的雙酶膜。為此我們采用了與前面的例子相同的方法，但所用的酶制劑中含1mg/mL葡萄糖氧化酶和2mg/mL葡萄糖淀粉酶。
用電流計測定0.5mM飴糖溶液的電流強度為90nA，響應(yīng)時間為50秒。
根據(jù)文獻報道，單純固定葡萄糖氧化酶的膠原膜對同樣濃度的葡萄糖溶液的響應(yīng)時間大于2分(見THEVENOT D.R.，STERNBERG R.，COULET P.R.，LAURENT J.et GAUTHERON D.C.，Anal.chem.51，96(1979)，而一種磁性雙酶膜對乳糖的響應(yīng)時間為15分(見CORDONNIER M.，LAWNY F.，CHAPOT D.，THOMAS D.，F(xiàn)EBS Lett.，59，263(1975)。例6一只市售的中孔纖維膜組件(如纖維素，PAN，或AN 69)，采用前述方法固定化葡萄糖淀粉酶。改性后的組件能用于將可溶性淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖。其方法為將淀粉溶液在組件中在20℃～70℃的溫度下，反復(fù)循環(huán)一段時間，直至達到所期望的水解度。
權(quán)利要求
1.一種在聚合物膜上固定化酶的方法，其關(guān)鍵是通過中介聚合物將酶同聚合物膜連接在一起，本發(fā)明的特征是將含有多陽離子或多胺基的中介聚合物通過浸泡，吸附在含有陰離子基團的聚合物膜上，然后，再在含酶的溶液中浸泡吸附，漂洗干凈，即可使酶固定在聚合物膜上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定化酶的方法，其特征是在聚合物膜上首先吸附一個中介聚合物，通常需對該中介聚合物膜進行交聯(lián)，以提高其在膜上吸附的穩(wěn)定性。交聯(lián)反應(yīng)可在酶吸附前或在酶吸附的同時進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是上述膜在pH值比酶的等電點高1～2的條件下進行浸泡。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是中介聚合物帶有陽離子、胺基或非離子型親水基。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是常用的交聯(lián)劑是戊二醛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜可以是通過改性后獲得的含有陰離子基的膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜可以是通過接枝反應(yīng)獲得的含陰離子基團的膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是用IV價鈰鹽作引發(fā)劑，通過陰離子單體接枝共聚的方法改性，獲得含有陰離子基團的纖維素類聚合物膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是可以將聚合物膜浸泡在含有陰離子單體及親水性交聯(lián)劑的水溶液中，通過紫外輻照引發(fā)接枝聚合的方法獲得含陰離子基團的聚合物膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜的厚度為10～200μm。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜是均質(zhì)膜，或不對稱膜，或微孔膜。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是聚合物膜是平板膜，或管式膜，或中空纖維膜。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是使用該方法還可以在聚合物膜上固定具有分離和催化作用的活性成份。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚合物膜上固定酶的方法，其特征是經(jīng)過中介聚合物處理的聚合物膜可以用本發(fā)明同樣的方法再生。
全文摘要
本發(fā)明是一種在聚合物膜上固定化酶的方法?，F(xiàn)有技術(shù)中在膜上固定化酶是十分困難的。即使有文獻報道,也存在技術(shù)復(fù)雜、成本偏高等不足。本發(fā)明提供了一種在性質(zhì)不同的聚合物膜上固定酶或其他具有分離和催化活性物質(zhì)的方法。其關(guān)鍵是采用浸泡的方法,使一種含有陽離子或胺基的親水性聚合物吸附在含有陰離子活性中心的聚合物膜上,然后用酶制劑或其他含有分離或催化活性的試劑進行處理,使制成固定化酶膜。通過適度的交聯(lián)可以提高固定化酶膜的穩(wěn)定性。本發(fā)明方法可以同樣用于聚合物膜上固定具有分離和催化活性的物質(zhì),制成具有分離和合成功能的活性膜。
文檔編號C12N11/00GK1358856SQ0113925
公開日2002年7月17日 申請日期2001年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者阮光重, 平鄭驊 申請人:復(fù)旦大學(xué)