專利名稱：一種與心力衰竭相關(guān)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與心力衰竭相關(guān)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，還涉及編碼該蛋白的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體和細(xì)胞，還涉及利用該蛋白和編碼該蛋白的多核苷酸檢測(cè)心力衰竭疾病的方法，以及利用這些蛋白、多核苷酸、載體或細(xì)胞的治療腫瘤和與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的方法和藥物組合物。
背景技術(shù)：
心腦血管病是威脅人類健康的重大疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有260萬(wàn)中國(guó)人死于此病，平均每12秒就有一位同胞被該病奪去生命。在中國(guó)，心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率從1957年的12.1％上升至1990年的35.8％，升高了2.9倍。據(jù)世界銀行預(yù)測(cè)到2020年，全世界心腦血管病死亡人數(shù)占總死亡人數(shù)的比率將從1990年的28.9％升至36.3％，其中70％的心腦血管病發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。因此，心腦血管病的防治對(duì)減輕人類經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，確保人體健康具有十分重要的意義。
1972年，Kerr、Wyllie及Gurrie等首次提出“細(xì)胞凋亡”的概念。如今，細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。凋亡被認(rèn)為是與細(xì)胞的有絲分裂增殖相互平衡的一種機(jī)制。過(guò)度的細(xì)胞凋亡或者細(xì)胞凋亡不足，均能導(dǎo)致人類疾病。過(guò)度的細(xì)胞凋亡將致使器官萎縮及器官衰竭，例如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、病毒性肝炎等。而細(xì)胞凋亡不足，則不能及時(shí)清除發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變、自身免疫、感染的細(xì)胞，以及機(jī)體多余的細(xì)胞，將會(huì)導(dǎo)致腫瘤、自身免疫疾病、病毒感染以及先天性畸形。隨著分子生物學(xué)的深入研究，細(xì)胞凋亡的感應(yīng)器(effector)及調(diào)節(jié)機(jī)制得以闡明，細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步深入研究成為一個(gè)焦點(diǎn)。最近的研究表明細(xì)胞凋亡在許多心血管疾病，包括心肌梗塞、心力衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化以及高血壓中起著重要作用。
細(xì)胞凋亡明顯區(qū)別于由于毒素反應(yīng)、物理刺激、缺血等原因引起的細(xì)胞凋亡。它是一種自主性的細(xì)胞死亡，設(shè)計(jì)一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用。目前，將細(xì)胞死亡分為兩大范疇，一類為急性細(xì)胞死亡，稱為“壞死”(necrosis)，另一類稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed celldeath)或細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞壞死的特征為細(xì)胞溶解，破碎，不具備完整的膜結(jié)構(gòu)，線粒體腫脹，Ca內(nèi)吞，染色質(zhì)分解，沒(méi)有蛋白質(zhì)合成，ATP過(guò)分消耗等。而細(xì)胞凋亡的特征為細(xì)胞膜發(fā)生皺縮、凹陷，但可以具有完整的膜結(jié)構(gòu)，染色質(zhì)變致密，最后斷裂成小碎片，進(jìn)一步發(fā)展，細(xì)胞膜將細(xì)胞質(zhì)分割包圍，形成凋亡小體(apoptotic body)。形成的調(diào)往小體能被其周圍的細(xì)胞或巨噬細(xì)胞所吞噬，因此不至產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。
心肌細(xì)胞數(shù)量的減少是心力衰竭產(chǎn)生和/或惡化的最重要病理基礎(chǔ)。心肌細(xì)胞死亡主要有兩種形式，細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。近年來(lái)的研究表明心肌細(xì)胞凋亡是引起心室心肌細(xì)胞數(shù)目減少的重要原因，在心力衰竭左室功能損害和惡化中起重要作用。心肌細(xì)胞凋亡也是心室重構(gòu)的重要表現(xiàn)。在增齡、缺氧、缺血再灌注、心肌梗塞、肥厚型心肌病等情況下發(fā)現(xiàn)心臟有心肌細(xì)胞凋亡的增加，終末期心力衰竭患者心臟心肌細(xì)胞凋亡更較正常人增加232倍。一些生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子(如血管緊張素II、TNF和心房利尿肽等)均可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但到目前為止細(xì)胞凋亡的分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全闡明。
cDNA文庫(kù)是生物工程領(lǐng)域的重要研究工具之一。通常從細(xì)胞中提取mRNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的DNA拷貝(即cDNA，Compl ementary DNA)。單鏈cDNA分子在DNA聚合酶的作用轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子，然后再插入載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌中長(zhǎng)成克隆。這樣的每個(gè)克隆只包含特定的mRNA信息，這樣的一套克隆就稱為cDNA文庫(kù)。
由于cDNA不含內(nèi)含子，從cDNA文庫(kù)中可以直接篩選到相應(yīng)的表達(dá)基因，故相對(duì)基因庫(kù)而言，cDNA文庫(kù)具有操作簡(jiǎn)單、使用方便的優(yōu)點(diǎn)。人體不同細(xì)胞表達(dá)基因的差異決定了其組織和器官表型的差異，從人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中分離和鑒定特異表達(dá)基因，特別是分離和鑒定疾病相關(guān)基因，是研究遺傳性心血管病的有效方法之一。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種與心力衰竭相關(guān)、并具有細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)作用的carp蛋白，其如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列.
本發(fā)明還提供一種檢測(cè)方法，包括通過(guò)檢測(cè)取自宿主的樣品中carp蛋白的表達(dá)，診斷心力衰竭。
本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的carp蛋白和必要時(shí)的藥物可接受的載體或賦形劑。
因此，本發(fā)明涉及作為藥物的carp蛋白。
本發(fā)明還提供本發(fā)明的carp蛋白在制備抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種治療腫瘤或者細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的方法，包括給予需要此類治療的患者治療有效量的本發(fā)明的carp蛋白。
另外，本發(fā)明涉及編碼上述本發(fā)明carp蛋白的核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列的載體。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列或載體的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供作為藥物的上述本發(fā)明的核苷酸序列、載體或細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及含有上述本發(fā)明核苷酸序列、載體或細(xì)胞的，具有抑制細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用的藥物組合物。
本發(fā)明還涉及一種治療腫瘤或者細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的方法，包括給予需要此類治療的患者治療有效數(shù)量的上述本發(fā)明核苷酸序列、載體或細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示carp在12種組織的表達(dá)。其中，A為Northern雜交結(jié)果；B為Northern雜交表達(dá)量的柱形圖。(1腦；2心臟；3骨骼?。?結(jié)腸；5胸腺；6脾臟；7腎臟；8肝臟；9小腸；10胎盤；11肺；12外周血白細(xì)胞。)圖2顯示carp在8種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。其中，A為Northern雜交結(jié)果；B為Northern雜交表達(dá)量的柱形圖。(1早幼粒白血病HL-60細(xì)胞系；2宮頸癌細(xì)胞系S3株；3慢性粒細(xì)胞白血病K-562細(xì)胞系；4淋巴母細(xì)胞性白血病MOL-4細(xì)胞系；5 Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞系；6結(jié)腸腺SW480細(xì)胞系；7肺癌A549細(xì)胞系；8黑色素瘤G-361細(xì)胞系。)圖3為反義探針的原位雜交結(jié)果。其中①-④示carp在WKY大鼠腎臟、肝臟、腦和脾臟的表達(dá)分布；⑤-⑧示W(wǎng)KY大鼠腎臟、肝臟、腦和脾臟切片的蘇木精和曙紅(HE)染色結(jié)果。
圖4為免疫組織化學(xué)分析結(jié)果。其中，A為正常人心臟組織切片免疫前兔血清；B為人室壁瘤組織切片免疫前兔血清；C為人室壁瘤組織切片抗carp兔血清。
圖5為間接ELISA法檢測(cè)心衰患者血清中carp自身抗體水平的結(jié)果。
圖6為carp蛋白的亞細(xì)胞定位結(jié)果。其中，①-②為pEGFPC2轉(zhuǎn)染HEK293S細(xì)胞的激光共聚焦照片，圖中示綠色熒光蛋白定位于細(xì)胞漿；③-④為pEGFPC2-carp轉(zhuǎn)染HEK293S細(xì)胞的激光共聚焦照片，圖中示carp蛋白定位于細(xì)胞核。
圖7為依據(jù)血球計(jì)數(shù)結(jié)果繪制的細(xì)胞的增殖曲線。其中，A為pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC和pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的增殖曲線，B為pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的增殖曲線。
圖8為pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的DNA合成柱形圖，依據(jù)甲基-3H胸腺嘧啶核苷法的測(cè)定結(jié)果繪制。
圖9為carp抑制肝癌H7402細(xì)胞系、膀胱癌BIU87細(xì)胞系和黑色素瘤WM451細(xì)胞系增殖的柱狀圖，依據(jù)血球計(jì)數(shù)結(jié)果繪制。
圖10顯示carp誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)。其中，①、⑥是pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的HEK293S細(xì)胞，為陰性對(duì)照；②-⑤和⑦-⑩是pcDNA3.1B-carp轉(zhuǎn)染的HEK293S細(xì)胞，箭頭所示為凋亡細(xì)胞。
圖11顯示carp誘導(dǎo)的細(xì)胞周期改變。其中，A顯示分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549細(xì)胞在G1期、S期和G2期的DNA分布；B顯示分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549細(xì)胞的G2期/G1期DNA分布比較。
發(fā)明詳述本發(fā)明人構(gòu)建了成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)，通過(guò)表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)引物步移法，從文庫(kù)中獲得carp全長(zhǎng)cDNA。進(jìn)而將carp基因成功地引入原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，系統(tǒng)地研究了carp蛋白的生物學(xué)功能，確定了其與心力衰竭相關(guān)，并具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
本發(fā)明一方面提供了carp蛋白，該蛋白由SEQ ID NO。1所示的第196-1533位核苷酸編碼、并具有推定的SEQ ID NO。1所示的氨基酸序列。carp核苷酸編碼序列從成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)中獲得。
根據(jù)核苷酸編碼序列推定的carp蛋白由445個(gè)氨基酸組成。生物信息學(xué)分析表明carp蛋白分子量為49724.5Da，等電點(diǎn)為4.69。氨基酸序列內(nèi)沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，但存在蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、絡(luò)氨酸激酶II磷酸化位點(diǎn)、N-豆蔻?；稽c(diǎn)、G蛋白耦聯(lián)受體復(fù)合物1信號(hào)。
在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的carp蛋白可以與另一種多肽或蛋白形成融合蛋白。在實(shí)施例3中，carp蛋白與硫氧還蛋白融合產(chǎn)物在原核系統(tǒng)獲得了表達(dá)，并通過(guò)純化的融合蛋白制備多克隆抗體。在實(shí)施例4中，carp蛋白與綠色熒光蛋白融合，通過(guò)融合蛋白確定了carp蛋白在真核細(xì)胞中定位于細(xì)胞核。根據(jù)本發(fā)明carp蛋白的生物學(xué)功能，可以設(shè)想將carp蛋白與其它功能性肽或蛋白融合，形成不同形式的多功能融合蛋白。例如，與各類細(xì)胞因子，如IL-2融合，以在抑制細(xì)胞增殖的同時(shí)局部活化T淋巴細(xì)胞等；與特異性抗體或其片段，如腫瘤細(xì)胞抗體或其片段融合，從而使本發(fā)明carp蛋白在體內(nèi)的分布具有靶向性。
本發(fā)明的carp蛋白及其融合蛋白可以是重組的，天然的，或者是合成的。優(yōu)選通過(guò)重組方法獲得，即，通過(guò)在適當(dāng)宿主中表達(dá)含有本發(fā)明carp蛋白或融合蛋白編碼序列的多核苷酸，然后純化表達(dá)的蛋白產(chǎn)物來(lái)獲得。
可以將編碼本發(fā)明carp蛋白的寡核苷酸，與用相應(yīng)限制酶消化的含其它多肽或蛋白編碼序列的適當(dāng)載體用T4連接酶連接，得到編碼融合蛋白的DNA序列。所述其它多肽或蛋白的編碼序列一般是已知的，有些可以以載體形式購(gòu)買得到，或者可以按常規(guī)方法合成或從已知生物體中克隆得到。如上所述得到的本發(fā)明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列可以用常規(guī)方法，如雙脫氧鏈終止法(Sanger等人，PNAS，1977，745463-5467)測(cè)定。這類核苷酸序列測(cè)定也可用商業(yè)測(cè)序試劑盒等。
表達(dá)載體中應(yīng)含有適當(dāng)?shù)膯?dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、終止子等。為了便于表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中定位，在蛋白編碼序列上游可加入適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)序列。合適載體和啟動(dòng)子的選擇為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知。細(xì)菌適用的有效表達(dá)載體可以這樣構(gòu)建將編碼目的蛋白的結(jié)構(gòu)DNA序列隨同適當(dāng)?shù)姆g起始和終止信號(hào)被插入到帶有一個(gè)功能啟動(dòng)子的可操縱的閱讀框中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知用于構(gòu)建含有本發(fā)明核苷酸序列以及合適的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控元件之載體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，根據(jù)本發(fā)明DNA序列所插入的表達(dá)載體或構(gòu)建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達(dá)目的蛋白質(zhì)。
適于表達(dá)本發(fā)明蛋白的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細(xì)胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動(dòng)物細(xì)胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細(xì)胞系，Gluzman(Cell 23175，1981)及其它的能表達(dá)相容載體的細(xì)胞系。將構(gòu)建體導(dǎo)入上述宿主細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，包括但不限于氯化鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(Sambrook，J.(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press；Plainview，N.Y.；Ausubel，F(xiàn).M.(1989)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Hobbs，S.等人，McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology(1992)，McGraw Hill，N.Y.191-196；Engelhard，E.K.等人，PNAS，913224-3227；Logan，J.等人，PNAS，813655-3659)。在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細(xì)胞，使其生長(zhǎng)到恰當(dāng)?shù)募?xì)胞密度之后，用適當(dāng)?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學(xué)藥品誘導(dǎo))誘導(dǎo)所選擇的啟動(dòng)子，并將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。針對(duì)不同的宿主菌株或細(xì)胞選擇以及所表達(dá)的目的蛋白質(zhì)的性質(zhì)相應(yīng)的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領(lǐng)域技術(shù)人員知識(shí)范圍之內(nèi)。所表達(dá)的多肽或融合蛋白按常規(guī)方法從培養(yǎng)物中分離和純化，如離心、沉淀、各種色譜、HPLC等。
另一方面，本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)評(píng)估心力衰竭(如室壁瘤)的方法。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，carp蛋白與心力衰竭的密切相關(guān)，心力衰竭患者血清中carp自身抗體明顯升高(實(shí)施例4)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可以用carp蛋白作為診斷指標(biāo)，通過(guò)檢測(cè)來(lái)自宿主的樣品中carp蛋白的異常表達(dá)，判斷心力衰竭的程度及治療效果?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的各種方法，在體內(nèi)或體外進(jìn)行檢測(cè)。分析來(lái)自宿主的樣品中carp改變水平的方法包括放射免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定、Western印跡分析、ELASA測(cè)定等等。優(yōu)選ELASA法。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，利用間接ELASA法，檢測(cè)到心力衰竭患者血清中高水平的carp自身抗體。
另一方面，本發(fā)明的carp蛋白或其融合蛋白可以與藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體結(jié)合，形成藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑是指無(wú)毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料。所述藥物組合物適于胃腸外、舌下、腦池內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、頰內(nèi)、腫瘤內(nèi)或表皮給藥。
胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注。適于胃腸外給藥的藥物組合物包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、分散液、懸浮液或乳液，以及用于在臨使用前在無(wú)菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。適宜的水性或非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑包括水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、羧甲基纖維素、植物油和可注射的有機(jī)酯如油酸乙酯。這些組合物還可以含有防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑和分散劑等佐劑。加入等滲劑如糖類、氯化鈉等可能是有利的。
表皮給藥包括在皮膚、粘膜上、以及在肺和眼的表面給藥。這樣的藥物組合物包括粉劑、軟膏、滴劑、透皮貼劑、離子電滲療法裝置以及吸入劑等。在適于吸入的組合物中，本發(fā)明的蛋白被壓縮或含于壓縮氣體如氮?dú)饣蛞夯瘹怏w推進(jìn)劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白不溶于液化推進(jìn)介質(zhì)中。
直腸給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過(guò)將本發(fā)明的肽與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸腔內(nèi)熔化并釋放出活性化合物。
由于carp蛋白具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，而惡性腫瘤的特性之一是無(wú)限制增殖，因此，本發(fā)明的carp蛋白以及含有carp蛋白的藥物組合物有望成為治療腫瘤和細(xì)胞增殖性疾病的藥物。
當(dāng)以上述或其他方式進(jìn)行治療時(shí)，治療有效量的本發(fā)明的蛋白可以是純凈形式、藥物可接受的鹽形式，使用或不使用藥物可接受的賦形劑。治療有效量是指以適宜治療的、對(duì)腫瘤或?qū)?xì)胞增殖相關(guān)性疾病有效的本發(fā)明蛋白的量。對(duì)任何特定患者的具體治療有效劑量取決于許多因素，包括所治療的疾病和氣其嚴(yán)重程度；所用具體化合物的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時(shí)間；給藥途徑；具體化合物的排泄速度；治療的持續(xù)時(shí)間聯(lián)合或同時(shí)服用的其他藥物等。例如，本發(fā)明的蛋白在局部給藥時(shí)，總的日劑量為0.05-20mg/kg體重，在系統(tǒng)給藥時(shí)的日劑量為0.15-50mg/kg體重。對(duì)于分子量為約2.7萬(wàn)的融合蛋白，在局部給藥時(shí)的日劑量為0.15-60mg/kg體重，傳統(tǒng)給藥時(shí)的日劑量為0.5-150mg/kg體重。如果需要，日劑量可以分成多次給藥。因此，組合物的單一劑量形式可以含有構(gòu)成日劑量的全部或其一部分的量。
另一方面，本發(fā)明還涉及編碼如上所定義本發(fā)明蛋白的多核苷酸。
因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體，以及含有本發(fā)明多核苷酸或載體的細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明涉及一種治療腫瘤或細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病(如血管增生)的藥物組合物，其含有本發(fā)明的多核苷酸、載體或細(xì)胞，和必要時(shí)藥學(xué)上可接受、特別是基因治療適用的賦形劑。
最后，本發(fā)明涉及治療腫瘤或細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的方法，包括給予需要此類治療的患者治療有效量的本發(fā)明的蛋白、多核苷酸、載體或細(xì)胞。
為了更清楚地理解本發(fā)明，現(xiàn)參照以下實(shí)施例對(duì)其進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍沒(méi)有任何限制意義。優(yōu)選實(shí)施例詳述實(shí)施例1.成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的構(gòu)建1.總RNA的提取和mRNA的分離使用RNA gentsTotal RNA Isolation System kit(美國(guó)Promega公司)從成人主動(dòng)脈組織提取細(xì)胞總RNA。具體操作參見試劑盒說(shuō)明。
使用Quick prepmicro mRNA purification kit(Pharmacia公司)，通過(guò)親和層析，得到高純度的mRNA。本實(shí)驗(yàn)采用的柱床介質(zhì)oligo(dT)纖維素含有12-18個(gè)核苷酸(T)多聚鏈，在多鹽條件下，帶oligo(A)尾巴的mRNA與oligo(dT)結(jié)合并掛在柱子上，不帶oligo(A)尾巴的rRNA和tRNA被洗掉。隨后在低鹽條件下洗脫掛在柱子上的mRNA。具體操作參照試劑盒說(shuō)明。
2.雙鏈cDNA的合成使用ZAP ExpressTMcDNA Synthesis Kit(美國(guó)STREGENE公司)合成雙鏈cDNA。
在離心管中依次加入10×第一鏈緩沖液5μl，甲基化的dNTP混合物3μl，含有XhoI酶切位點(diǎn)和Poly(dT)的引物2μl(1.4μg/μl)，DEPC處理的去離子水32.5μl，RNA酶抑制劑1μl(40u/μ1)，mRNA 5μg，置室溫10分鐘。再加入MMLV-反轉(zhuǎn)錄酶1.5μl(50u/μl)，反應(yīng)總體積50μl?；靹?，37℃孵育1小時(shí)，以合成cDNA的第一鏈。
在冰浴中依次加入45μl第一鏈cDNA，20μl 10×第二鏈緩沖液1，6μl dNTP混合物，114μl去離子水，2μl[α-32p]dATP(800ci/mmol)，2μl RNA酶H(1.5u/μl)，11μl DNA聚合酶I(9.0u/μl)，反應(yīng)總體積200μl?；靹?，16℃孵育2.5小時(shí)，以合成cDNA的第二鏈。得到的雙鏈cDNA用酚∶氯仿(1∶1)抽提，乙醇沉淀.
3.cDNA與載體的連接(1)cDNA與連接子的連接使用ZAP ExpressTMcDNA GigapackII Gold Cloning Kit(Stregene公司)。從試劑盒中取9μl EcoRI連接子(5’-AATTCGGCACGAG-3′和3’-GCCGTGCTC-5’)溶解cDNA。取1μl進(jìn)行電泳，在剩余的8μ1中依次加入10×連接酶緩沖液1μl，γ-三磷酸腺苷1μl(10mmol/L)，T4DNA連接酶1μl(4u/μl)。8℃水浴16小時(shí)后，70℃孵育30分鐘。
用限制酶XhoI消化1.5小時(shí)。通過(guò)瓊脂糖凝膠CL-2B柱，除去小于400堿基的核苷酸。
(2)cDNA與ZAP噬菌體載體的連接100ng cDNA，10×連接酶緩沖液0.5μl，10mmol/L γ-ATP 0.5μl(pH7.5)，ZAP表達(dá)載體1.0μl(1μg/μl)，T4 DNA連接酶0.5μl(4u/μl)，加去離子水至總體積5μl。12℃連接16小時(shí)。
(3)連接反應(yīng)物的體外包裝從-70℃快速取出包裝蛋白，冰上溶解后，在25μl的包裝蛋白內(nèi)加1μl連接反應(yīng)物，混勻，22℃包裝2小時(shí).加入500μl SM緩沖液(0.1M Nacl，0.08M MgSO4.7H2O，O.05M Tris-HCl，0.01％明膠)和20μl氯仿。此混合物即為原始的cDNA文庫(kù)，包裝后的重組噬菌體產(chǎn)生轉(zhuǎn)染活性。
4.cDNA文庫(kù)的效價(jià)取5μl原始的cDNA文庫(kù)，用45μl SM緩沖液稀釋。將10μl稀釋液加入200μl感受態(tài)XL1-Blue MRF′宿主菌(OD600＝0.5)。37℃水浴20-30分鐘，加入3ml上層瓊脂糖，混勻后鋪于NZY平板(0.09M NaCl，0.08M MgSO4，0.5％酵母提取液，1％NZ胺A)，凝固后倒置，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，計(jì)數(shù)平板上的克隆。
以噬菌斑成斑單位(pfu/ml)表示cDNA文庫(kù)的效價(jià)。pfu/ml＝噬菌斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×1,000/稀釋液用量(μl)。本發(fā)明人構(gòu)建的成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量為2.4×106個(gè)獨(dú)立重組克隆。
5.cDNA文庫(kù)的擴(kuò)增和保存原始的cDNA文庫(kù)可直接用于篩選，但非野生型的噬菌體容易失活，不夠穩(wěn)定。因此進(jìn)行一次擴(kuò)增，以進(jìn)行多次篩選。
取5×104個(gè)噬菌體轉(zhuǎn)染XL1-Blue MRF′宿主菌，鋪板，37℃孵育8-10小時(shí)。然后將8ml SM緩沖液加至150mm平皿，4℃輕搖過(guò)夜，收集上清，即得到擴(kuò)增后的cDNA文庫(kù)。加入7％的二甲基亞砜，于-70℃長(zhǎng)期保存。
實(shí)施例2.新全長(zhǎng)cDNA的克隆
1.隨機(jī)克隆的PCR反應(yīng)cDNA文庫(kù)鋪盤，噬菌斑密度為200-500個(gè)克隆/培養(yǎng)皿(150mm)。挑取清亮的單個(gè)噬菌斑，轉(zhuǎn)入含有75μl SM緩沖液和5μl氯仿的離心管中，混勻，4℃離心，取5μl上清用于PCR擴(kuò)增。
ZAP載體3′端引物5′-CCAAGCTCGAAATTAACCCTCAC-3′ZAP載體5′端引物5′-CAGTCAATTGTAATACGACTCACT-3′反應(yīng)總體積50μl。擴(kuò)增參數(shù)為94℃，3分鐘；94℃，45秒，55℃，30秒，72℃，3分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃，延伸5-10分鐘。
2.表達(dá)序列標(biāo)簽的測(cè)定使用PE公司的ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(ABI PRISMTM377 DNA sequencer)和測(cè)序試劑盒(BigDyeTMTerminator Ready Reaction Mix)，測(cè)定每個(gè)cDNA克隆的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)。操作步驟參見試劑盒說(shuō)明。
用BIAST(Basic Local Alignment Search Tool)軟件，將EST與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性比較。根據(jù)BLAST的結(jié)果，堿基同源序列小于100-200個(gè)堿基，Score值小于100的EST是新的表達(dá)序列標(biāo)簽。
3.EST引物步移法測(cè)序(1)ZAP噬菌體的體內(nèi)環(huán)化ZAP噬菌體(ZAP Express cDNA Synthesis kit和ZAP Express cDNAGigapackTMGold Doning kit)能將目的DNA片段直接在體內(nèi)從λ噬菌體載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒，環(huán)化為帶CMV病毒早期啟動(dòng)子的噬菌粒(PBK-CMV)。
用3μl含新EST的噬菌體和1μl輔助噬菌體共轉(zhuǎn)染300μl大腸桿菌XL1-Blue MRF’株(OD600＝1.0)菌液，獲取單鏈DNA后再轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLOLR株。加入5ml LB培養(yǎng)液，25μl卡那霉素，37℃搖床培養(yǎng)12-16小時(shí)。
(2)質(zhì)粒的提取和鑒定使用QIAPrep Spin Miniprep kit(德國(guó)QIAGEN公司)，參照試劑盒推薦的步驟提取質(zhì)粒DNA。
對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，反應(yīng)體系包括3μl 10×酶切緩沖液3，1μl NotI內(nèi)切酶(15u/μl)，1μl EcoRI內(nèi)切酶(15u/μl)，1μl BSA，2μl DNA，22μl去離子水，總體積30μl。混勻，37℃溫育4-6小時(shí)。
(3)引物步移法測(cè)定carp全長(zhǎng)cDNA使用ABI PRISMTM377 DNA測(cè)序儀和BigDyeTMTerminator ReadyReaction Mix試劑盒，測(cè)定陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒DNA序列。
通過(guò)逐級(jí)引物引導(dǎo)的方法測(cè)定全長(zhǎng)cDNA，即根據(jù)上輪測(cè)序反應(yīng)獲得的末端堿基序列確定下輪測(cè)序反應(yīng)的引物。引物設(shè)計(jì)采用oligo 4.0軟件。
本發(fā)明人從成人主動(dòng)脈cDNA文庫(kù)隨機(jī)測(cè)定5000個(gè)ESTs，共獲得182條新的全長(zhǎng)cDNA。carp全長(zhǎng)cDNA是其中之一。
4.carp的生物信息學(xué)分析carp基因全長(zhǎng)2371bp，如SEQ ID NO.1所示。193bp-199bp為Kozak序列(ATCATGT)，2332bp-2337bp為加尾信號(hào)為AATAAA。196bp-1533bp為開放讀碼框架。carp基因定位于10號(hào)染色體10p13-10p14。
推斷的carp蛋白由445個(gè)氨基酸組成。生物信息學(xué)分析表明蛋白分子量為49724.5Da，等電點(diǎn)為4.69。carp蛋白內(nèi)沒(méi)有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，有5個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(69-71SEK，73-75SWR，157-159SFR，274-276SPK，438-440TDR)，12個(gè)絡(luò)氨酸激酶II磷酸化位點(diǎn)(36-39SESE，41-44SALE，73-76SWRD，78-81SEEE，89-92TLCD，115-118TTEE，125-128SPAE，160-163SLPE，258-261TLME，326-329SLLE，339-342SDPE，375-378SGPE)，4個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)(20-25GLSDTI，48-53GGPCAV，176-181GNKFGV，387-392GLKQSN)，1個(gè)G蛋白耦聯(lián)受體復(fù)合物1信號(hào)(136-152SSALAVEELGFERFHAL)。
實(shí)施例3.carp的原核表達(dá)1.PCR擴(kuò)增目的片斷正向引物5′-CGG GAC CGG GAT TAC C-3′反向引物5′-ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA-3′反應(yīng)體系0.5μl carp測(cè)序質(zhì)粒(模板)，正向引物和反向引物各2.0μl(25uM)，5.0μl dNTPs(2mM)，5.0μl 10×Taq酶緩沖液，2.0μl Taq DNA聚合酶(2u/μl)，加去離子水至總體積50.0μl。
反應(yīng)參數(shù)94℃，2分鐘；94℃×40秒，55℃×40秒，72℃×1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸，10分鐘。
反應(yīng)產(chǎn)物用6倍體積醋酸銨/乙醇(1∶5)沉淀，75％乙醇洗滌，室溫干燥，溶于10μl ddH2O，-20℃保存。
2.原核表達(dá)載體的構(gòu)建(1)酶切pTrxFus載體(Invitrogen公司)20.0μl，限制性內(nèi)切酶SmaI和XbaI(GIBCOBRL)各1.0μl，10×緩沖液4(GIBCOBRL)4.0μl，加去離子水至總體積40.0μl。37℃溫育3小時(shí)。
carp PCR產(chǎn)物10.0μl，限制性內(nèi)切酶SmaI和XbaI(GIBCOBRL)各1.0μl；10×緩沖液4(GIBCOBRL)2.0μl，加去離子水至總體積20.0μl。37℃溫育3小時(shí)。酶切產(chǎn)物用240μl醋酸銨/乙醇(1∶5)純化。
(2)連接、轉(zhuǎn)化和篩選pTrxFus酶切產(chǎn)物1.0μl，PCR酶切產(chǎn)物3.0μl，T4DNA連接酶1.0μ1，連接緩沖液1.0μl，加去離子水至總體積10.0μl。16℃溫育過(guò)夜。
用CaCl2法制備感受態(tài)GI724細(xì)胞，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入GI724細(xì)胞。
挑取陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，用SmaI和XbaI進(jìn)行酶切鑒定，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。篩選出的重組質(zhì)粒pTRX-carp50保存在15％甘油中，于-70℃存放。
3.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)(1)誘導(dǎo)取50μl含pTRX-carp50的菌液，接種于5ml RM-Amp培養(yǎng)基中，30℃，220-250rpm搖床過(guò)夜。取250μl過(guò)夜菌，接種入5ml IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(1000ml TM培養(yǎng)基含有6g無(wú)水Na2HPO4，3g KH2PO4，0.5g NaCl，1g NH4Cl，2g酸水解酪素；0.095g MgCl2，1ml 100mg/ml氨卡青霉素，25ml 20％葡萄糖，pH7.0±0.2)，30℃，220-250rpm搖床培養(yǎng)3小時(shí)。
菌液OD550約0.5時(shí)，加色氨酸至終濃度為100ug/ml。37℃，220-250rpm繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。4300g離心10分鐘，收獲菌體。
(2)超聲釋放融合蛋白用溶液II(20mM Tris-HCl，pH8，2.5mM EDTA)重懸菌體，OD550約100。以3×10秒脈沖，于冰上進(jìn)行超聲破碎。超聲后立即將菌液置于液氮中速凍，再迅速置于37℃水浴中速溶，重復(fù)該步驟兩次。4℃，4300g離心10分鐘，收集上清，冷凍保存。上清中含有硫氧環(huán)蛋白和carp蛋白的融合表達(dá)產(chǎn)物。
3.聚丙烯酰氨凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交按照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的方法進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳和蛋白質(zhì)免疫印跡雜交。
(1)聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)取20μl融合蛋白溶液，加適量的載樣緩沖液(5％濃縮膠和15％分離膠)，煮沸5分鐘，5000rpm離心5分鐘，取20μl上清上樣。60V恒壓進(jìn)濃縮膠。120V恒壓進(jìn)分離膠?？捡R斯亮蘭染色，隨后脫色。
(2)蛋白質(zhì)免疫印跡雜交(Western Blot)半干系統(tǒng)(Bio-Rad)轉(zhuǎn)膜1小時(shí)。取下硝酸纖維素膜，置10ml封閉液(1×TBS，3％BSA)中作用1小時(shí)，用20ml TBST(1×TBS，05％Tween-20(w/v))洗膜。
將膜轉(zhuǎn)移到1∶20,000稀釋的一抗緩沖液(1×TBST，1％BSA)中浸潤(rùn)1-2小時(shí)，用20ml TBST洗膜。再將膜轉(zhuǎn)移到10ml 1∶5000稀釋的二抗緩沖液中浸潤(rùn)1小時(shí)，依次用20ml的TBST和TBS洗膜。
用20ml堿性磷酸酶緩沖液(100mM Tris-Cl，100mM NaCl，5mM MgCl2，pH9.5)洗膜。加10ml底物溶液(66μl氮藍(lán)四唑，33μl BCIP，10ml堿性磷酸酶緩沖液)顯色10-30分鐘。用20ml高壓水終止顯色。
4.重組蛋白TRX-carp50表達(dá)條件的優(yōu)化(1)活化時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響TRX-carp50表達(dá)菌株于30℃，220-250rpm分別活化1、2、3、4、5和6小時(shí)，然后加色氨酸至終濃度為100ug/ml。37℃，220-250rpm誘導(dǎo)4小時(shí)，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白表達(dá)量的變化，活化6小時(shí)的菌株的蛋白表達(dá)量最高.
(2)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響TRX-carp50表達(dá)菌株活化6小時(shí)，然后加色氨酸至終濃度為100ug/ml，37℃，220-250rpm分別誘導(dǎo)0、1、2、3、4、5和6小時(shí)，SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白TRX-carp50表達(dá)量的變化，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。
5.融合蛋白的純化和濃縮(1)親和層析純化用20mM的β巰基乙醇(β-ME)平衡并填充樹脂。
約2ml融合蛋白溶液上樣，以2ml/12×75試管收集，每管取5μl稀釋到500μl。用8ml的1mM β巰基乙醇洗柱。分別以6ml的5mM、10mM、50mM、100mM、200mM、500mM、1000mM β-ME洗脫。大多數(shù)目的蛋白在10-200mM的β-ME之間被洗脫。
(2)透析與濃縮以1×腸激酶緩沖液(50mM Tris-HCl，pH8.0，1mM CaCl2，0.1％Tween-20)為透析液，4℃，磁力攪拌透析。每4小時(shí)換液一次，換液4次。
用聚乙二醇(德國(guó)Merck公司)濃縮至約1ml，4℃保存。用Bradford法測(cè)定純化的融合蛋白的濃度。
4.多克隆抗體的制備新西蘭大耳白兔4只(2.5公斤/只)，飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行第一次免疫。免疫前取血清，將耳緣靜脈切開，收集約10-15ml血，4℃放置過(guò)夜。3,000rpm離心15分鐘，收集上血清，加NaN3至終濃度0.02％，-20℃凍存。
第一次免疫用約0.5-1.0ml融合蛋白(約300ug)加等體積的不完全弗氏佐劑，進(jìn)行背部多點(diǎn)注射。每隔3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫時(shí)將不完全弗氏佐劑換為完全弗氏佐劑。每次加強(qiáng)免疫后，自白兔耳緣靜脈取血少許，收集血清，ELISA測(cè)定抗體效價(jià)。
實(shí)施例4.carp的組織分布1.Northern雜交(1)探針標(biāo)記以carp測(cè)序質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增得到約850bp的carp片段。純化后稀釋至25ng/μl，用作Northern雜交的探針。
在0.5ml離心管中加入carp片段(25ng/μl)l.0μl，5×標(biāo)記緩沖液10.0μl，dNTPs(無(wú)dCTP)2.0μl，BSA 2.0μl，Klenow片斷1.0μl，[α-32P]dCTP 5.0μl，加無(wú)離子水至總體積50.0μl。室溫放置1-3小時(shí)，進(jìn)行探針標(biāo)記。
(2)雜交用6×SSC浸泡多組織膜和腫瘤細(xì)胞系尼龍膜(CLONTECHTM)5分鐘。將9.3μg/μl鮭精DNA煮沸5分鐘，置冰上約2分鐘；向5ml 68℃預(yù)熱的雜交液中加入50μl變性鮭精DNA，混勻，迅速加入雜交管，68℃預(yù)雜交1小時(shí)。
小心倒掉雜交液，加入5ml 68℃預(yù)熱的雜交液，加入變性探針(98℃變性5分鐘，冰上冷卻約2分鐘)，68℃雜交3小時(shí)。
(3)洗膜和壓片雜交后取出尼龍膜，置200ml洗液I(2×SSC，0.05％SDS)中，水浴搖床，室溫洗膜3次，每次10分鐘。再用200ml洗液II(0.1×SSC，0.1％ SDS)50℃洗膜20分鐘，56℃洗膜20分鐘。壓片，-70℃曝光。沖洗X光膠片。
結(jié)果多組織膜雜交結(jié)果如圖1所示，carp核酸序列在心臟、骨骼肌、腎臟和肝中的表達(dá)水平相對(duì)較高。
腫瘤細(xì)胞系雜交結(jié)果如圖2所示，carp核酸序列在早幼粒白血病HL-60細(xì)胞系、宮頸癌細(xì)胞系S3株(Helas)、慢性粒細(xì)胞白血病K-562細(xì)胞系、淋巴母細(xì)胞性白血病MOL-4細(xì)胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji細(xì)胞系、結(jié)腸腺SW480細(xì)胞系、肺癌A549細(xì)胞系和黑色素瘤G-361田胞系中均有表達(dá)。其中，以肺癌A549細(xì)胞系和Helas中表達(dá)最高。
2.RNA-RNA原位雜交選用DIG RNA標(biāo)記試劑盒和DIG核酸檢測(cè)試劑盒(德國(guó)Boehringermannheim公司).操作步驟依照試劑盒說(shuō)明。
(1)探針的制備和標(biāo)記設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增carp中約300bp DNA片段。
上游引物5’-TGA CGG GAC ATG CTG TTT CT-3，下游引物5’-TCT TCT GGG TCG TAG GTT TGA-3’將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到T載體(Promega)。提取重組質(zhì)粒，純化，測(cè)序以確定基因片斷的插入方向。按照試劑盒的說(shuō)明，進(jìn)行探針標(biāo)記。
(2)標(biāo)本制備對(duì)玻片進(jìn)行清潔及消毒處理。0.01％的多聚賴氨酸(PLL)以1∶9的比例加入DEPC，混合均勻，將玻片浸入以進(jìn)行包被。
新鮮標(biāo)本0.4cm×0.4cm，用1×PBS沖洗。制備8um切片，置于有1mg/mlPLL的載玻片上，室溫晾干。用4％多聚甲醛固定15-20分鐘，1×PBS沖冼切片。
(3)雜交前處理為提高組織的通透性和核酸探針的穿透性，對(duì)切片進(jìn)行以下處理。
用0.2N HCl浸泡25分鐘，0.3％ TritonX-100浸泡5分鐘。用1×PBS洗兩次，每次5分鐘。4％多聚甲醛后固定6分鐘，用1×PBS洗兩次。將5ml乙酸酐加入1000ml 0.1mol/L三乙醇胺溶液(pH8.0)，完全溶解后，浸入切片10分鐘。以上反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。
(4)雜交反應(yīng)將切片從乙?；芤褐腥〕觯稍?，加入預(yù)雜交液30μl，濕盒內(nèi)42℃溫育2小時(shí)。
甩去預(yù)雜交液，加入雜交液25μl(用去離子甲酰胺，20×SSC，100×Denhardt’s液，10％SDS，10mg/ml變性的鯡魚精子DNA配制)。小心覆蓋Parafilm膜，濕盒內(nèi)42℃溫育16小時(shí)。
(4)顯色反應(yīng)將玻片從溫盒取出，去掉Parafilm膜，分別用2×SSC、1×SSC沖洗三次。使用Dig核酸檢測(cè)試劑盒(Boehringer Mannheim)進(jìn)行顯色反應(yīng)，操作參照試劑盒說(shuō)明。
結(jié)果原位雜交結(jié)果見圖3，(1)-(4)示carp在WKY大鼠腎臟、肝臟、腦和脾臟的表達(dá)分布情況，由圖可見，carp在腎小管中高表達(dá)。(5)-(8)示大鼠腎臟、肝臟、腦和脾臟切片的HE染色結(jié)果，顯示細(xì)胞形態(tài)。
實(shí)施例4.carp與心力衰竭1.免疫組織化學(xué)法制作正常人心臟組織和室壁瘤患者病理組織的石蠟切片。除另有說(shuō)明以外，以下反應(yīng)均在室溫下進(jìn)行。
每張切片脫蠟和水化后，用PBS(pH7.4)沖洗。滴加50μl過(guò)氧化酶阻斷溶液，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，孵育10分鐘，用PBS沖洗。
加50μl非免疫性動(dòng)物血清，孵育5分鐘，PBS沖洗。加50μl的一抗(多克隆兔抗血清)，孵育60分鐘或4℃過(guò)夜，PBS沖洗。加50μl生物素標(biāo)記的二抗，孵育10分鐘，PBS沖洗。
加50μl鏈親和素-過(guò)氧化物酶溶液，孵育10分鐘，PBS沖洗。加100μl新鮮的DAB溶液，顯微鏡下觀察3-10分鐘。自來(lái)水沖洗，蘇木素淺染，自來(lái)水沖洗，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。
結(jié)果如圖4所示，正常人心臟組織幾乎無(wú)著色(見A)，患者室壁瘤組織著色最深(見C)，且著色在細(xì)胞核。由于室壁瘤是由于心肌梗塞后，壞死心肌組織心壁變薄失去收縮能力，在心肌收縮時(shí)構(gòu)成無(wú)效縮區(qū)，從而導(dǎo)致心力衰竭。因此，在室壁瘤組織檢測(cè)到carp的高水平表達(dá)，提示該蛋白與心力衰竭有關(guān)。
2.間接ELISA法檢測(cè)心衰患者血清中carp自身抗體水平以10例心衰患者的血清作為檢測(cè)樣品，以健康志愿者的血清作為正常對(duì)照。健康志愿者的年齡、性別與心衰患者相匹配。
抗原多肽為人工合成de carp 72-83位的氨基酸序列S-S-W-R-D-C-S-E-E-E-Q-K，經(jīng)HPLC純化、鑒定。
用50mM的檸檬酸溶液(pH5.0)溶解抗原多肽，配成5mg/l抗原包被液，以50ul/孔包被，37℃，2小時(shí)。洗板2次，37℃封閉1小時(shí)。洗板2次，加入稀釋的待測(cè)血清，37℃孵育1小時(shí)。洗板3次，羊抗人HRP-IgG 37℃孵育1小時(shí)。洗板3次，OPD顯色，490nm讀數(shù)。2M硫酸終止。
結(jié)果ELISA結(jié)果如圖5所示，心衰患者血漿中的carp自身抗體水平明顯比正常人高，n＝10，p＜0.001。
實(shí)施例5.carp真核表達(dá)載體的構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1B(INVITROGEN)和pEGFPC2(CLONTECH)。重組質(zhì)粒pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC、pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pEGFPC2-carp的構(gòu)建過(guò)程相似，除引物和酶切位點(diǎn)不同之外，其余步驟相同。以下pcDNA3.1B-carp的構(gòu)建為例，說(shuō)明重組載體的構(gòu)建方法。
1.真核表達(dá)載體引物(1)pcDNA-carp正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-TTA TGA ATT CTT AGA CAA ATT AAT TTA GTG AAG-3′(2)pcDNA-carp-MYC正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-AGA CGA ATT CAT TTA GTG AAG GAG AGC GAT C-3′(3)pcDNA-carp-ANTISENSE正向引物5′-ATG TCT AGA TCA TAG AGC ACG AA 3′反向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA ASA-3′(4)pEGFP-carp正向引物5′-CCG GTT CTC GAG CAT GTC CGA ACT GAC TAA AGA-3′反向引物5′-TTA TGA ATT CTT AGA CAA ATT AAT TTA GTG AAG-3′上述引物由上海生工生物公司合成，用聚丙烯酰氨凝膠電泳純化，OD260＝5。用去離子水溶解引物，使其終濃度為25uM，-20℃保存。
2.目的片斷的擴(kuò)增反應(yīng)體系0.5μl carp測(cè)序質(zhì)粒(模板)，正向引物和反向引物各2.0μl(25uM)，5.0μl dNTPs(2mM)，5.0μl 10×Taq酶緩沖液，2.0μlTaq DNA聚合酶(2u/μl)，加去離子水至總體積50.0μl。
反應(yīng)參數(shù)94℃，2分鐘；94℃×40秒，55℃×40秒，72℃×1分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸，10分鐘。
反應(yīng)產(chǎn)物用6倍體積醋酸銨/乙醇(1∶5)沉淀，75％乙醇洗滌，室溫干燥，溶于10μl ddH2O，-20℃保存。
3.酶切、連接和轉(zhuǎn)化真核表達(dá)載體pcDNA3.1 B 20.0μl，EcoRI和XhoI(BioLabs)各1.0μl，10×緩沖液4.0μl，去離子水14.0μl，總體積40.0μl。37℃溫育3小時(shí)。
PCR產(chǎn)物10.0μl，EcoRI和XhoI各1.0μl，10×緩沖液2.0μl，去離子水6.0μl?？傮w積20.0μl，37℃溫育3小時(shí)。酶切產(chǎn)物經(jīng)醋酸銨/乙醇純化，溶于10μl去離子水。
酶切后的載體和目的片斷以1∶3的比例，在T4DNA連接酶的作用下，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入CaCl2法制備的感受態(tài)DH5α細(xì)胞。
挑取陽(yáng)性克隆，用XhoI和EcoRI酶切反應(yīng)和PCR反應(yīng)進(jìn)行鑒定，測(cè)定陽(yáng)性克隆的序列。篩選到真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1B-carp，保存于15％甘油中，-70℃存放。
實(shí)施例6.carp的亞細(xì)胞定位使用LIPOFECTAMINE2000(INVITROGEN公司)試劑盒提供的試劑和方法，將真核表達(dá)載體pEGFPC2-carp(實(shí)驗(yàn))和pEGFPC2(對(duì)照)轉(zhuǎn)染入HEK293S細(xì)胞。
將1μg質(zhì)粒DNA稀釋到50μl無(wú)血清、無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)液中。將1μl LIPOFECTAMINE2000試劑稀釋到50μl無(wú)血清、無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)液中，室溫放置5分鐘?；旌辖?jīng)稀釋的質(zhì)粒DNA和LIPOFECTAMINE2000試劑，混勻，室溫放置20分鐘。
將HEK293S細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板，孵箱內(nèi)培養(yǎng)18-24小時(shí)后，將培養(yǎng)液換為無(wú)血清、無(wú)抗生素的1640培養(yǎng)液，滴加100μl混合液，混勻。孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)后，將培養(yǎng)液換為完全培養(yǎng)液(1640，10％FBS)。
轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，在激光共聚焦顯微鏡下照相。
結(jié)果如圖6所示，①-②為pEGFPC2轉(zhuǎn)染HEK293S細(xì)胞的激光共聚焦照片，示綠色熒光蛋白的亞細(xì)胞定位-細(xì)胞漿；③-④為pEGFPC2-carp轉(zhuǎn)染HEK293S細(xì)胞的激光共聚焦照片，示carp蛋白的亞細(xì)胞定位-細(xì)胞核。
實(shí)施例7.carp的抑制細(xì)胞增殖效應(yīng)1.對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制增殖效應(yīng)(1)血球計(jì)數(shù)板法A.轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞使用LIPOFECTAMINE2000(Ivitrogen)，依照試劑盒說(shuō)明書，將真核載體pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC、pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B(對(duì)照)轉(zhuǎn)染入HUVEC304細(xì)胞和肺癌A549細(xì)胞。
B.挑取陽(yáng)性克隆顯微鏡下觀察已形成克隆的細(xì)胞，標(biāo)記各個(gè)克隆的位置。棄培養(yǎng)液，用0.9％NaCl清洗。將經(jīng)過(guò)0.125％胰蛋白酶消化液浸潤(rùn)的濾紙片(3mm×3mm)置于標(biāo)記的克隆處，5-20秒。取出已粘附克隆細(xì)胞的濾紙片，置于24孔培養(yǎng)板的培養(yǎng)孔中(每孔含1.0ml G418選擇培養(yǎng)基)。涮洗濾紙片數(shù)次，使粘附的細(xì)胞脫下。將長(zhǎng)有克隆細(xì)胞的培養(yǎng)板，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2-5天。待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用0.125％的胰蛋白酶消化，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)。然后，傳代到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，收獲細(xì)胞，凍存。
C.細(xì)胞計(jì)數(shù)25cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞達(dá)70％-80％融合，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用5ml 0.9％NaCl清洗細(xì)胞，加入1.5ml 0.125％的胰蛋白酶消化液。倒置顯微鏡下觀察至細(xì)胞剛剛變圓，吸出消化液，加入2ml完全培養(yǎng)液，用滴管吹勻細(xì)胞，用微量加樣器將懸液加到血球計(jì)數(shù)板上，計(jì)4個(gè)大格內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。
用新鮮的完全培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，至細(xì)胞懸液終濃度為1×104細(xì)胞/毫升。以2.0毫升/孔，將細(xì)胞懸液接種到96孔培養(yǎng)板，每種細(xì)胞接3-4孔。約16小時(shí)后，換新鮮培養(yǎng)液。此后每隔48小時(shí)換一次培養(yǎng)液。從接種細(xì)胞48小時(shí)后起，每天計(jì)細(xì)胞數(shù)一次，每次每種細(xì)胞計(jì)3-4孔。
結(jié)果如圖7所示，A為pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B-carp-MYC和pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的增殖曲線。由圖可見，相對(duì)于pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞(對(duì)照)，pcDNA3.1B-carp和pcDNA3.1B-carp-MYC轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞增殖明顯較為緩慢。
B為pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的增殖曲線。由圖可見，相對(duì)于pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞(對(duì)照)，pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的增殖明顯加快。
(2)MTT法吸取1×104細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液，以100μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板。每48小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。待生長(zhǎng)最快的細(xì)胞達(dá)到90％-100％融合時(shí)，直接加入10μl MTT溶液(5mg/ml)，37℃放置4小時(shí)。每孔加100μl DMSO)，測(cè)定560nm處的光吸收值(OD)。
(3)酸性磷酸酶法吸取1×104細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液，以100μl/孔接種到96孔培養(yǎng)板。每48小時(shí)更換一次培養(yǎng)液。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.9％NaCl洗滌細(xì)胞。棄洗液，加酸性磷酸酶底物100μl/孔。37℃放置約2小時(shí)，405nm測(cè)OD值。
(4)甲基-3H胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)法以4×104細(xì)胞/毫升/孔，將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE和pcDNA3.1B(對(duì)照)的肺癌A549細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板(含有10％FBS的1640培養(yǎng)基)。16小時(shí)后換為含有10％FBS的1640培養(yǎng)基。32小時(shí)后換為含有0.4％FBS的1640培養(yǎng)基。
饑餓44小時(shí)后，換為含有10％FBS、100uCi3H/ml的1640培養(yǎng)基，0.5ml/孔。4小時(shí)后，吸出培養(yǎng)基，加0.5ml 4℃預(yù)冷的三氯乙酸(TCA)，4℃固定細(xì)胞30分鐘。棄TCA，加0.5ml 4℃預(yù)冷的0.9％NaCl，洗2次，加0.5ml 1％SDS，0.1N NaOH，37℃過(guò)夜。將過(guò)夜的裂解液收集到含有8.0ml閃爍液(800ml二甲苯，200ml TROTON X-100，4.5g PPO，0.45gPOPOP)的測(cè)量杯中。搖勻、測(cè)量。
結(jié)果如圖8所示，pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞的DNA合成明顯比pcDNA3.1B轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞快。2.對(duì)腫瘤細(xì)胞系的抑制增殖效應(yīng)用上述方法，將carp真核表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入乳腺癌MCF-7細(xì)胞系、肝癌H7402細(xì)胞系、膀胱癌BIU87細(xì)胞系和黑色素瘤WM451細(xì)胞系。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察carp對(duì)4種腫瘤細(xì)胞系的作用。
結(jié)果細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖9顯示，carp能夠抑制肝癌H7402細(xì)胞系、膀胱癌BIU87細(xì)胞系和黑色素瘤WM451細(xì)胞系的增殖。
實(shí)施例8.carp誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡效應(yīng)將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B的HEK293S細(xì)胞分別接種到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。0.125％胰蛋白酶消化細(xì)胞，0.9％NaCl洗滌細(xì)胞。加終濃度為10ug/ml的DMSO，37℃染色30分鐘。離心，棄染液，滴片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
結(jié)果如圖10所示，①、⑥是轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B的HEK293S細(xì)胞，作為本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照；②-⑤和⑦-⑩是轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp的HEK293S細(xì)胞，顯示出不同程度的細(xì)胞凋亡(箭頭指示為凋亡細(xì)胞)。
實(shí)施例9.carp誘導(dǎo)細(xì)胞周期改變復(fù)蘇轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp、pcDNA3.1B和pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549細(xì)胞株。按1∶8傳代，在25cm2的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。24小時(shí)后，換成不完全1640培養(yǎng)液(0.4％FBS)繼續(xù)培養(yǎng)。24小時(shí)后，換成完全1640培養(yǎng)液(10％FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。棄培養(yǎng)液，加入2ml 0.l25％的胰蛋白酶消化細(xì)胞。
加入4ml 1×PBS液，吹打細(xì)胞使之成為單細(xì)胞懸液。1,500rpm離心5分鐘，取約0.5ml上清液，振蕩。加入2.5ml冰預(yù)冷的70％乙醇，4℃固定1小時(shí)。1,500rpm離心5分鐘，棄固定液，加3ml 1×PBS液重懸5分鐘。400目篩網(wǎng)過(guò)濾，1,000rpm離心5分鐘，棄PBS。用PI染液于4℃避光染色30分鐘，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
結(jié)果如圖11A所示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp的肺癌A549細(xì)胞主要處在G1期和S期；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B的肺癌A549細(xì)胞(對(duì)照)在G1期、S期和G2期的分布比較平均；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549細(xì)胞主要處在S期和G2期。
3種細(xì)胞的G2/G1比較結(jié)果如圖11B所示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp的肺癌A549細(xì)胞DNA合成變慢，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1B-carp-ANTISENSE的肺癌A549細(xì)胞DNA合成變快。
SEQUENCE LISTING<110> 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院<120> 一種與心力衰竭相關(guān)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白<130> D0111012F<160> 2<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 2371<212> DNA<213> 智人(Homo sapiens)<220><221> CDS<222> (196)..(1533)<400> 1aaaactcgct gctgccccaa cctggcttga caggcttggt ctctgcaagt ggctctcagc 60cccttcttct ttcctgcctc accttccaat tcgtttgccg ccgccgtccc gcagctgctg120tttccggagt tgccccttcc ccatgttccg gggcaggagt ccgcaaagcg aagatccgcc180cgccggttcc ccatc atg tcc gaa ctg act aaa gag ctg atg gag ctg gtg 231Met Ser Glu Leu Thr Lys Glu Leu Met Glu Leu Val1 5 10tgg ggc acc aag agc agc ccc ggt ctc tcg gac acc att ttc tgc cgc 279Trp Gly Thr Lys Ser Ser Pro Gly Leu Ser Asp Thr Ile Phe Cys Arg15 20 25tgg acg caa ggg ttt gtg ttt agt gaa tca gag gga tct gca tta gaa 327Trp Thr Gln Gly Phe Val Phe Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ala Leu Glu30 35 40cag ttt gaa ggt ggc ccc tgt gct gtt att gca cct gtt cag gca ttt 375Gln Phe Glu Gly Gly Pro Cys Ala Val Ile Ala Pro Val Gln Ala Phe45 50 55 60ctt ttg aag aag ctc ctg ttt tct tcg gag aag tct tct tgg cgg gat 423Leu Leu Lys Lys Leu Leu Phe Ser Ser Glu Lys Ser Ser Trp Arg Asp65 70 75tgt tca gag gaa gag cag aag gaa ctc ctt tgt cat acc ttg tgt gat 471Cys Ser Glu Glu Glu Gln Lys Glu Leu Leu Cys His Thr Leu Cys Asp80 85 90att tta gaa agt gct tgt tgt gac cac tct gga tca tac tgc ttg gtt 519Ile Leu Glu Ser Ala Cys Cys Asp His Ser Gly Ser Tyr Cys Leu Val95 100 105tca tgg tta aga gga aag aca act gag gaa act gct agt att tct ggg 567Ser Trp Leu Arg Gly Lys Thr Thr Glu Glu Thr Ala Ser Ile Ser Gly110 115 120agt cct gca gag tct agt tgc caa gtg gaa cat tct tct gcc ttg gct 615Ser Pro Ala Glu Ser Ser Cys Gln Val Glu His Ser Ser Ala Leu Ala125 130 135 140gtc gaa gag ctt ggc ttt gag cga ttt cat gca tta att caa aaa aga 663Val Glu Glu Leu Gly Phe Glu Arg Phe His Ala Leu Ile Gln Lys Arg145 150 155tcg ttc aga agt tta cca gaa tta aaa gat gct gtc ttg gac cag tat 711Ser Phe Arg Ser Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gln Tyr160 165 170tca atg tgg gga aat aaa ttt gga gta ttg ctt ttt ctg tat tct gta 759Ser Met Trp Gly Asn Lys Phe Gly Val Leu Leu Phe Leu Tyr Ser Val175 180 185tta ctg aca aag ggc att gaa aac ata aaa aac gaa att gaa gat gca 807Leu Leu Thr Lys Gly Ile Glu Asn Ile Lys Asn Glu Ile Glu Asp Ala190 195 200agt gaa ccc ttg ata gat cct gta tat gga cat ggc agc caa agt tta 855Ser Glu Pro Leu Ile Asp Pro Val Tyr Gly His Gly Ser Gln Ser Leu205 210 215 220att aat ctc ctg ctg acg gga cat gct gtt tct aat gta tgg gat ggt 903Ile Asn Leu Leu Leu Thr Gly His Ala Val Ser Asn Val Trp Asp Gly225 230 235gat aga gag tgc tca gga atg aaa ctt ctt ggt ata cat gaa caa gca 951Asp Arg Glu Cys Ser Gly Met Lys Leu Leu Gly Ile His Glu Gln Ala240 245 250gca gta gga ttt tta aca cta atg gaa gct tta aga tac tgt aag gtt 999Ala Val Gly Phe Leu Thr Leu Met Glu Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Val255 260 265ggt tct tac ttg aaa tct cca aaa ttc cct att tgg att gtt ggc agt 1047Gly Ser Tyr Leu Lys Ser Pro Lys Phe Pro Ile Trp Ile Val Gly Ser
270 275 280gag act cac ctc acc gta ttt ttt gcc aag gat atg gct tta gtt gcc 1095Glu Thr His Leu Thr Val Phe Phe Ala Lys Asp Met Ala Leu Val Ala285 290 295 300cct gaa gct cct tca gaa caa gcc aga aga gtt ttt caa acc tac gac 1143Pro Glu Ala Pro Ser Glu Gln Ala Arg Arg Val Phe Gln Thr Tyr Asp305 310 315cca gaa gat aat gga ttc ata ccc gat tca ctt ctg gaa gat gtg atg 1191Pro Glu Asp Asn Gly Phe Ile Pro Asp Ser Leu Leu Glu Asp Val Met320 325 330aaa gca ttg gac ctt gtt tca gat cct gaa tat ata aat ctc atg aag 1239Lys Ala Leu Asp Leu Val Ser Asp Pro Glu Tyr Ile Asn Leu Met Lys335 340 345aat aaa tta gat cca gaa gga tta gga atc ata tta ttg ggc cca ttt 1287Asn Lys Leu Asp Pro Glu Gly Leu Gly Ile Ile Leu Leu Gly Pro Phe350 355 360ctt caa gaa ttt ttt cct gat cag ggc tcc agt ggt cca gaa tct ttt 1335Leu Gln Glu Phe Phe Pro Asp Gln Gly Ser Ser Gly Pro Glu Ser Phe365 370 375 380act gtc tac cac tac aat gga ttg aag cag tca aat tat aat gaa aag 1383Thr Val Tyr His Tyr Asn Gly Leu Lys Gln Ser Asn Tyr Asn Glu Lys385 390 395gtc atg tac gta gaa ggg act gca gtt gtg atg ggt ttt gaa gat ccc 1431Val Met Tyr Val Glu Gly Thr Ala Val Val Met Gly Phe Glu Asp Pro400 405 410atg cta cag aca gat gac act cct att aaa cgc tgt ctg caa acc aaa 1479Met Leu Gln Thr Asp Asp Thr Pro Ile Lys Arg Cys Leu Gln Thr Lys415 420 425tgg cca tac att gag tta ctc tgg acc aca gat cgc tct cct tca cta 1527Trp Pro Tyr Ile Glu Leu Leu Trp Thr Thr Asp Arg Ser Pro Ser Leu430 435 440aat taa tttgtctaag tatttataag gaagatctta ataacagatg ttgaaagaag 1583Asn445gagtcaagac tggcaattgg ctggattaag ctaaacactg gtatcactga ttaactgtaa 1643ataacaatta aaaacacatt ttcagtgttt atgatatgtt taaattattt gtcctaaagc 1703tttatgttaa agattatcct attttacccc ttcgtgtgaa atttactagc aaaattaagc 1763tttcatcaaa gttcatcact tttgcattca gatacttggt catttactta ccaaattaca 1823aacgcaatac tacagcattt gtatattaag tatcacagtt actattgata aactactttt 1883gggttttatt tcattgaggc acttttttta ttgtttgaat gattccggct tgtaatatat 1943cagcctctac aatgaaatgc agaagagttc atttttctaa gatctgtttt tcattagaaa 2003tattgacaaa taacacattg tcaacctgga tcctttgaca atttacttaa ctctggcatg 2063ttcacaaaaa gtagaaactt taagagacca ttaccattta ttcacagatg tataggggat 2123gtattctaaa aactgacaga aaagagaatc tgatagtcaa cactgttaac ttttactgtg 2183taattgccaa atacactttt ccaaatttgt cccaacagcc ctgtaagcca gctttcttgt 2243atatttataa acgcgataaa tgcatgagaa gatctgttat tccattagta tagtacgtta 2303tttattatga tcctagtgtg atggcctaaa taaacacctt tttctttaaa aaaaaaaaaa 2363aaaaaaaa2371<210> 2<211> 445<212> PRT<213> 智人(Homo sapiens)<400> 2Met Ser Glu Leu Thr Lys Glu Leu Met Glu Leu Val Trp Gly Thr Lys1 5 10 15Ser Ser Pro Gly Leu Ser Asp Thr Ile Phe Cys Arg Trp Thr Gln Gly20 25 30Phe Val Phe Ser Glu Ser Glu Gly Ser Ala Leu Glu Gln Phe Glu Gly35 40 45Gly Pro Cys Ala Val Ile Ala Pro Val Gln Ala Phe Leu Leu Lys Lys50 55 60Leu Leu Phe Ser Ser Glu Lys Ser Ser Trp Arg Asp Cys Ser Glu Glu65 70 75 80Glu Gln Lys Glu Leu Leu Cys His Thr Leu Cys Asp Ile Leu Glu Ser85 90 95Ala Cys Cys Asp His Ser Gly Ser Tyr Cys Leu Val Ser Trp Leu Arg100 105 110Gly Lys Thr Thr Glu Glu Thr Ala Ser Ile Ser Gly Ser Pro Ala Glu115 120 125Ser Ser Cys Gln Val Glu His Ser Ser Ala Leu Ala Val Glu Glu Leu130 135 140Gly Phe Glu Arg Phe His Ala Leu Ile Gln Lys Arg Ser Phe Arg Ser145 150 155 160Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp Gln Tyr Ser Met Trp Gly165 170 175Asn Lys Phe Gly Val Leu Leu Phe Leu Tyr Ser Val Leu Leu Thr Lys180 185 190Gly Ile Glu Asn Ile Lys Asn Glu Ile Glu Asp Ala Ser Glu Pro Leu195 200 205Ile Asp Pro Val Tyr Gly His Gly Ser Gln Ser Leu Ile Asn Leu Leu210 215 220Leu Thr Gly His Ala Val Ser Asn Val Trp Asp Gly Asp Arg Glu Cys225 230 235 240Ser Gly Met Lys Leu Leu Gly Ile His Glu Gln Ala Ala Val Gly Phe245 250 255Leu Thr Leu Met Glu Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Val Gly Ser Tyr Leu
260 265 270Lys Ser Pro Lys Phe Pro Ile Trp Ile Val Gly Ser Glu Thr His Leu275 280 285Thr Val Phe Phe Ala Lys Asp Met Ala Leu Val Ala Pro Glu Ala Pro290 295 300Ser Glu Gln Ala Arg Arg Val Phe Gln Thr Tyr Asp Pro Glu Asp Asn305 310 315 320Gly Phe Ile Pro Asp Ser Leu Leu Glu Asp Val Met Lys Ala Leu Asp325 330 335Leu Val Ser Asp Pro Glu Tyr Ile Asn Leu Met Lys Asn Lys Leu Asp340 345 350Pro Glu Gly Leu Gly Ile Ile Leu Leu Gly Pro Phe Leu Gln Glu Phe355 360 365Phe Pro Asp Gln Gly Ser Ser Gly Pro Glu Ser Phe Thr Val Tyr His370 375 380Tyr Asn Gly Leu Lys Gln Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Val Met Tyr Val385 390 395 400Glu Gly Thr Ala Val Val Met Gly Phe Glu Asp Pro Met Leu Gln Thr405 410 415Asp Asp Thr Pro Ile Lys Arg Cys Leu Gln Thr Lys Trp Pro Tyr Ile420 425 430Glu Leu Leu Trp Thr Thr Asp Arg Ser Pro Ser Leu Asn435 440 44權(quán)利要求
1.一種具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的蛋白，其與心力衰竭相關(guān)，并具有抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
2.一種檢測(cè)心力衰竭的方法，包括檢測(cè)來(lái)自宿主的樣品中權(quán)利要求1的蛋白的表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述來(lái)自宿主的樣品是室壁瘤組織。
4.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1的蛋白和必要時(shí)的藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。
5.作為藥物、特別是作為治療腫瘤和細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病之藥物的權(quán)利要求1的蛋白。
6.權(quán)利要求1的蛋白在制備治療腫瘤和細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的藥物中的應(yīng)用。
7.編碼權(quán)利要求1的肽的多核苷酸。
8.含有權(quán)利要求7的多核苷酸的載體。
9.含有權(quán)利要求7的多核苷酸或權(quán)利要求8的載體的細(xì)胞。
10.作為藥物的權(quán)利要求7的多核苷酸、權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9的細(xì)胞。
11.一種治療腫瘤和細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的藥物組合物，其含有權(quán)利要求7的多核苷酸、權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9的細(xì)胞。
12.一種治療腫瘤和細(xì)胞增殖相關(guān)性疾病的方法，包括給予需此治療的患者治療有效數(shù)量的權(quán)利要求1的肽、權(quán)利要求7的多核苷酸、權(quán)利要求8的載體或權(quán)利要求9的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與心力衰竭相關(guān)的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白，還涉及編碼該蛋白的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體和細(xì)胞。本發(fā)明還公開了利用該蛋白和編碼該蛋白的多核苷酸檢測(cè)心力衰竭疾病的方法，以及利用本發(fā)明的蛋白、多核苷酸、載體或細(xì)胞，治療腫瘤和與細(xì)胞增殖相關(guān)的疾病的方法和藥物組合物。
文檔編號(hào)C12N15/03GK1424324SQ0114036
公開日2003年6月18日 申請(qǐng)日期2001年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月11日
發(fā)明者惠汝太, 劉寶華, 劉玉清, 陳敬洲, 于暉, 徐平, 張禪娜 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院