專利名稱：高生產(chǎn)能力的α－淀粉酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)能力提高了的突變?chǔ)?淀粉酶。
本發(fā)明人近來發(fā)現(xiàn)了來自芽孢桿菌屬嗜堿性菌株KSM-K38(FERMBP-6946)的具有螯合劑和氧化作用抗性的液化堿性α-淀粉酶(日本專利申請(qǐng)平10-362487，日本專利申請(qǐng)平10-362488)；和耐熱性提高了的改良酶(日本專利申請(qǐng)平11-163569)。
除這些特性外，考慮到這些酶的工業(yè)生產(chǎn)，用于洗滌劑的酶還要具有高生產(chǎn)能力。盡管應(yīng)用蛋白質(zhì)工程技術(shù)做了各種試驗(yàn)以提高用于洗滌劑的α-淀粉酶的耐熱性和氧化劑抗性，但對(duì)生產(chǎn)能力的改進(jìn)還沒有被認(rèn)為是足夠的，也沒有試圖通過突變結(jié)構(gòu)基因增加產(chǎn)量的報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提供具有優(yōu)秀生產(chǎn)能力的突變?chǔ)?淀粉酶。
因此，本發(fā)明一方面提供了一種突變的α-淀粉酶，該酶從具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明另一方面提供了一種突變?chǔ)?淀粉酶，該酶從具有SEQ IDNo.2所代表的氨基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基。
本發(fā)明再一方面，還提供了編碼這種突變?chǔ)?淀粉酶的基因、包含該基因的載體、用該載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和突變?chǔ)?淀粉酶的生產(chǎn)方法，該方法包括培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明再一方面還提供了包含該突變?chǔ)?淀粉酶的洗滌劑組合物。
圖2是圖解說明向來自菌株KSM-1378或KSM-K38的α-淀粉酶基因?qū)胪蛔兊姆椒ā?br> 本發(fā)明構(gòu)建了突變?chǔ)?淀粉酶，使得在構(gòu)成α-淀粉酶的氨基酸中，參與生產(chǎn)能力的氨基酸殘基被另外的氨基酸殘基替代或被缺失。這里可用的α-淀粉酶的實(shí)例包括來自解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)或地衣芽孢桿菌的液化α-淀粉酶，以及來自芽孢桿菌屬嗜堿性微生物的液化堿性α-淀粉酶，其中優(yōu)選具有SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶和與上述氨基酸序列有至少60％同源性的α-淀粉酶。
具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶或與其有至少60％同源性的α-淀粉酶的實(shí)例，包括來自芽孢桿菌屬菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)的液化堿性α-淀粉酶(日本專利申請(qǐng)公開文本平8-336392)和通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建的上述酶在耐熱性和氧化劑抗性上的改良酶(WO98/44126)。
具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列的α-淀粉酶或與其有至少60％同源性的α-淀粉酶的實(shí)例，包括來自芽孢桿菌屬菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的液化堿性α-淀粉酶和通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建的上述酶在耐熱性上的改良酶(日本專利申請(qǐng)平11-163569)。
氨基酸序列的同源性用Lipman-Pearson方法計(jì)算(科學(xué)(Science)227，1435(1985))。
本發(fā)明的突變?chǔ)?淀粉酶可通過首先從產(chǎn)生α-淀粉酶的微生物中克隆編碼α-淀粉酶的基因獲得。為此目的，通常利用基因重組技術(shù)，例如可使用日本專利申請(qǐng)公開文本平8-336392中描述的方法。這里可使用的基因?qū)嵗ň幋aSEQ ID No.1或SEQ ID No.2所代表氨基酸序列的SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所代表的基因。也可使用來自上述基因而且耐熱性和氧化劑抗性提高了的突變基因。
為了對(duì)這樣通過克隆獲得的基因進(jìn)行突變，可采用通常使用的任何定點(diǎn)誘變方法。例如，可使用“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-SuperExpress Km”試劑盒(Takara Shuzo有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行突變。
用于獲得本發(fā)明的高生產(chǎn)能力α-淀粉酶的突變可通過例如以下方式實(shí)現(xiàn)在具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列中Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476之任一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基；或在具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或與該序列有至少60％同源性的另一種α-淀粉酶中替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列中Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466之任一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基。優(yōu)選的突變包括，在SEQ ID No.1的氨基酸序列中用Ser或Thr替代相應(yīng)于Pro18的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Gln86的氨基酸殘基，用Val或Gln替代相應(yīng)于Glu130的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Asn154的氨基酸殘基，用Cys或Gln替代相應(yīng)于Arg171的氨基酸殘基，用Val或Asn替代相應(yīng)于Ala186的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Glu212的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Val222的氨基酸殘基，用Cys或Ser替代相應(yīng)于Tyr243的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Pro260的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Lys269的氨基酸殘基，用His替代相應(yīng)于Glu276的氨基酸殘基，用Ser或Phe替代相應(yīng)于Asn277的氨基酸殘基，用Ala替代相應(yīng)于Arg310的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Glu360的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Gln391的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Trp439的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Lys444的氨基酸殘基，用Asp或Glu替代相應(yīng)于Asn471的氨基酸殘基，或用Asp替代相應(yīng)于Gly476的氨基酸殘基；或在SEQ ID No.2的氨基酸序列中，用Val或Gln替代相應(yīng)于Asp128的氨基酸殘基，用Ser替代相應(yīng)于Gly140的氨基酸殘基，用Pro替代相應(yīng)于Ser144的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Arg168的氨基酸殘基，用Val替代相應(yīng)于Gln181的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Glu270的氨基酸殘基，用Ser替代相應(yīng)于Phe272的氨基酸殘基，用Pro替代相應(yīng)于Ser375的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Trp434的氨基酸殘基，或用Asp替代相應(yīng)于Glu466的氨基酸殘基。
在SEQ ID No.1的氨基酸序列的突變中，那些通過用Glu替代相應(yīng)于Gln86的氨基酸殘基，用Val或Gln替代相應(yīng)于Glu130的氨基酸殘基，用Asn替代相應(yīng)于Ala186的氨基酸殘基，用Ser替代相應(yīng)于Tyr243的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Pro260的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Lys269的氨基酸殘基，用Phe替代相應(yīng)于Asn277的氨基酸殘基，以及用Asp或Glu替代相應(yīng)于Asn471的氨基酸殘基產(chǎn)生的突變，能夠使α-淀粉酶在培養(yǎng)基或其脫鹽并濃縮的溶液中的溶解性提高。更具體地說，上述突變可以將在脫鹽并濃縮的溶液中4℃貯存一周后α-淀粉酶的殘余活性與突變前的活性相比提高至少5％，特別地提高10％。因此，對(duì)于通過這種氨基酸突變獲得的本發(fā)明突變?chǔ)?淀粉酶，可以以高產(chǎn)率得到高濃度的發(fā)酵濃縮液，并且在發(fā)酵生產(chǎn)之后可有效地進(jìn)行酶的配制處理如超濾。
兩個(gè)或多個(gè)各種氨基酸殘基的替代或缺失的組合對(duì)這種氨基酸突變也是有效的。也可將上面舉例說明的突變與改善酶特性的突變結(jié)合起來，例如，在具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中，通過缺失相應(yīng)于Arg181或Gly182的氨基酸殘基以提高耐熱性的突變，通過用Thr替代相應(yīng)于Met222的氨基酸殘基以提高氧化劑抗性的突變，或通過用Gln替代的相應(yīng)于Lys484的氨基酸殘基以提高溶解性的突變；或在具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶中，通過用Leu替代相應(yīng)于Met107的氨基酸殘基以進(jìn)一步加強(qiáng)氧化劑抗性的突變，或通過用Ile替代相應(yīng)于Glu188的氨基酸殘基以提高洗衣用洗滌劑的去污力的突變。
通過以下方式可得到高產(chǎn)率的突變?chǔ)?淀粉酶將突變?chǔ)?淀粉酶結(jié)構(gòu)基因與控制基因和合適的載體適當(dāng)?shù)亟Y(jié)合在一起，由此構(gòu)建用于生產(chǎn)α-淀粉酶的質(zhì)粒，將產(chǎn)生的質(zhì)粒導(dǎo)入微生物如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)或大腸桿菌(Escherichia coli)，優(yōu)選枯草芽孢桿菌，并培養(yǎng)產(chǎn)生的重組微生物。
如后面實(shí)施例所示，這樣獲得的突變?chǔ)?淀粉酶的生產(chǎn)能力提高大約10-500％，同時(shí)保持了作為酶的生化特性，因此具有優(yōu)秀的特性。通過對(duì)具有耐熱性、螯合劑抗性、氧化劑抗性和高溶解性的液化堿性α-淀粉酶的氨基酸殘基進(jìn)行上述突變，可產(chǎn)生在重組微生物中生產(chǎn)能力大大提高但并不喪失上述原有特性的有用的酶。
除了本發(fā)明的α-淀粉酶外，本發(fā)明的洗滌劑組合物還可以包含選自如下酶的一種或一種以上酶脫支酶(例如支鏈淀粉酶、異淀粉酶、新支鏈淀粉酶(neopullulanase))、α-葡糖苷酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、果膠酶、原果膠酶、果膠酸裂合酶、過氧化物酶、漆酶和過氧化氫酶。
另外，洗滌劑組合物還可包含常規(guī)加至洗滌劑中的成分，例如，表面活性劑(如陰離子表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子表面活性劑和陽離子表面活性劑)、螯合劑、堿性劑(alkali agents)、無機(jī)鹽、抗再沉積劑、氯清除劑、還原劑、漂白劑、熒光染料促溶劑、香料、防結(jié)塊劑、酶活化劑、抗氧化劑、殺菌劑、上藍(lán)劑(blueing agents)、漂白活化劑、酶穩(wěn)定劑和調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以用本領(lǐng)域已知的方式從可通過上述方法獲得的高生產(chǎn)能力的α-淀粉酶和上述已知的洗滌劑成分相結(jié)合生產(chǎn)。可根據(jù)使用目的選擇洗滌劑的形式，實(shí)例包括液態(tài)、粉末或顆粒。本發(fā)明的洗滌劑組合物適合用作洗衣洗滌劑、漂白洗滌劑、自動(dòng)洗碟機(jī)使用的洗滌劑、管道清潔劑和假牙清潔劑，其中尤其適合用作洗衣洗滌劑、漂白洗滌劑和自動(dòng)洗碟機(jī)使用的洗滌劑。
本發(fā)明高生產(chǎn)能力的α-淀粉酶也可用作淀粉液化糖化組合物。而且，這些突變?chǔ)?淀粉酶在加入選自葡糖淀粉酶、麥芽糖酶、支鏈淀粉酶、異淀粉酶和新支鏈淀粉酶的一種或一種以上酶之后，可被允許作用于淀粉。
并且，本發(fā)明的突變?chǔ)?淀粉酶可用作纖維的退漿組合物，而且象支鏈淀粉酶、異淀粉酶或新支鏈淀粉酶之類的酶也可加到該組合物中。實(shí)施例淀粉酶活性和蛋白含量的測(cè)定根據(jù)下述方法檢測(cè)從重組枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的每一種酶的淀粉酶活性和蛋白含量。
淀粉酶活性用3，5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定。在含有可溶性淀粉的40mM甘氨酸-NaOH緩沖液(pH10)的反應(yīng)混合物中50℃反應(yīng)15分鐘后，用DNS法定量分析形成的還原糖。作為酶的滴度，在一分鐘內(nèi)形成相當(dāng)于1μmol葡萄糖的還原糖的酶量定義為一個(gè)單位。
蛋白含量用“蛋白檢測(cè)試劑盒”(Protein Assay Kit)(Bio-RadLaboratories產(chǎn)品)測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。參考實(shí)施例1液化堿性淀粉酶的篩選將大約0.5克泥土懸浮于滅菌水中，產(chǎn)生的懸浮液在80℃加熱處理15分鐘。熱處理混合物的上清用足量的滅菌水稀釋，然后涂在一種分離用的瓊脂培養(yǎng)基(培養(yǎng)基A)上。然后該培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)2天以生長菌落。選擇并分離由于淀粉分解而在其周圍形成透明區(qū)的菌落作為產(chǎn)淀粉酶菌株。產(chǎn)生的分離菌株接種于培養(yǎng)基B，然后在30℃通氣振蕩培養(yǎng)2天。培養(yǎng)后測(cè)定離心獲得的上清的螯合劑(EDTA)抗性，另外，測(cè)定最適工作pH。由此獲得了菌株芽孢桿菌屬KSM-K38(FERM BP-6946)。
培養(yǎng)基A胰蛋白胨 1.5％豆胨 0.5％氯化鈉0.5％有色淀粉(colored starch) 0.5％瓊脂 1.5％碳酸鈉0.5％(pH10)培養(yǎng)基B胰蛋白胨1.5％豆胨0.5％氯化鈉 0.5％可溶性淀粉 1.0％碳酸鈉 0.5％(pH10)菌株KSM-K38的真菌學(xué)特性見表1。
表1

參考實(shí)施例2菌株KSM-K38的培養(yǎng)在參考實(shí)施例1的液體培養(yǎng)基B中接種菌株KSM-K38，然后在30℃通氣振蕩培養(yǎng)2天。檢測(cè)離心分離的每一份上清中的淀粉酶活性。結(jié)果1L培養(yǎng)基中的活性為1179U。參考實(shí)施例3液化堿性淀粉酶的純化向參考實(shí)施例2中獲得的菌株KSM-K38的培養(yǎng)基上清中加入硫酸胺到80％的飽和度，然后攪拌。收集由此生成的沉淀并溶于含有2mMCaCl2的10mM Tris-HCl緩沖液中(pH7.5)，產(chǎn)生的溶液對(duì)該緩沖液透析過夜。透析物上樣到用相同緩沖液平衡的DEAE-Toyopearl650M柱上，用在相同緩沖液中的0-1M NaCl線性梯度洗脫蛋白。對(duì)相同緩沖液透析后經(jīng)凝膠過濾柱層析獲得的活性組分對(duì)該緩沖液透析，由此獲得了在聚丙烯酰胺凝膠電泳(凝膠濃度10％)和十二烷基磺酸鈉(SDS)電泳中顯示一條帶的純化酶。參考實(shí)施例4酶學(xué)特性純化酶的特性如下(1)作用對(duì)象它作用于淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉和其部分降解產(chǎn)物α-1，4-葡糖苷鍵，降解它們并從直鏈淀粉生產(chǎn)葡萄糖(G1)、麥芽糖(G2)、麥芽三糖(G3)、麥芽四糖(G4)、麥芽五糖(G5)、麥芽六糖(G6)和麥芽七糖(G7)。但它不作用于普魯蘭(pullulan)。
(2)pH穩(wěn)定性(Britton-Robinson緩沖液)在pH6.5-11.0范圍內(nèi)、在處理?xiàng)l件下40℃處理30分鐘，顯示殘余活性為70％或更高。
(3)工作溫度范圍和最適工作溫度它在20-80℃的很寬溫度范圍內(nèi)起作用，最適工作溫度為50-60℃。
(4)溫度穩(wěn)定性通過在50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH10)中改變溫度，然后在每一溫度處理30分鐘，來測(cè)定酶喪失活性時(shí)的溫度。在40℃酶的殘余活性為80％或更多，甚至在45℃酶的殘余活性約為60％。
(5)分子量用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定的分子量為55,000±5,000。
(6)等電點(diǎn)用等電聚焦電泳測(cè)定的等電點(diǎn)約為4.2。
(7)表面活性劑的影響在0.1％表面活性劑的溶液中在pH10、30℃處理30分鐘，它的活性幾乎不受抑制(活性殘余比為90％或更多)，這些表面活性劑例如支鏈烷基苯磺酸鈉、烷基硫酸酯鈉鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鈉鹽、α-烯烴磺酸鈉、α-磺化脂肪酸酯鈉鹽、烷基磺酸鈉、SDS、肥皂和softanol。
(8)金屬鹽的影響在含有各種不同金屬鹽的每一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中于pH10、30℃處理30分鐘，研究它們的影響。它的活性被1mM Mn2+抑制(抑制比約75％)，被1mM Sr2+和Cd2+輕度抑制(抑制比為約30％)。實(shí)施例1連接有α-淀粉酶基因的各種不同重組質(zhì)粒的制備根據(jù)WO98/44126中敘述的方法，通過缺失來自芽孢桿菌屬菌株KSM-AP1378(FERM BP-3048)并且具有SEQ ID No.1所代表氨基酸序列的α-淀粉酶(“LAMY”)的Arg181和Gly1812；和通過在這種缺失突變之外，再用Thr替代SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列的Met202，分別構(gòu)建編碼耐熱性提高了的突變?chǔ)?淀粉酶(下文將描述為“ΔRG”)和氧化劑抗性和耐熱性都提高了的突變?chǔ)?淀粉酶(“ΔRG-M202T”)的基因。以這些基因?yàn)槟０澹靡風(fēng)AUS(SEQ IDNo.5)和LADH(SEQ ID No.6)通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增編碼這些突變?chǔ)?淀粉酶的基因片段(約1.5kb)。用限制性酶SalI酶切后，將每一片段插入表達(dá)載體pHSP64(日本專利申請(qǐng)公開文本平6-217781)的SalI-SmaI位點(diǎn)，由此構(gòu)建連接有各個(gè)突變?chǔ)?淀粉酶結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒，其中結(jié)構(gòu)基因位于來自芽孢桿菌屬菌株KSM-64(FERM P-10482)的堿性纖維素酶基因的強(qiáng)啟動(dòng)子下游。
同時(shí)，用Saito和Miura的方法(生物化學(xué)生物物理學(xué)報(bào)(Biochim.Biophys.Acta)，72，619(1961))，從芽孢桿菌屬菌株KSM-K38(FERM BP-6946)的細(xì)胞抽提染色體DNA作為模板，用表2所示的引物K38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此擴(kuò)增編碼具有SEQ ID No.2所代表氨基酸序列的α-淀粉酶(下文將描述為“K38AMY”)的結(jié)構(gòu)基因片段(約1.5kb)。經(jīng)限制性酶SalI酶切后，將產(chǎn)生的片段插入到表達(dá)載體pHSP64的SalI-SmaI位點(diǎn)，以構(gòu)建一個(gè)連接有K38AMY結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒(

圖1)，其中結(jié)構(gòu)基因位于pHSP64含有的來自芽孢桿菌屬菌株KSM-64(FERM P-10482)堿性纖維素酶基因的強(qiáng)啟動(dòng)子下游。以該重組質(zhì)粒為模板，用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增含有該強(qiáng)啟動(dòng)子和連接在其上的K38AMY的基因片段。
用下述的重組PCR方法構(gòu)建了一個(gè)編碼K38AMY和LAMY之間的嵌合α-淀粉酶的基因。具體地說，以菌株KSM-K38(FERM BP6946)的染色體DNA為模板，用表2所示的引物K38DH(SEQ ID No.8)和LA-K38(SEQ ID No.10)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增編碼SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列中從Gln20向下游到C-末端的序列的片段。用上述含有LAMY基因和強(qiáng)啟動(dòng)子的重組質(zhì)粒為模板，用表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LA-K38R(SEQ ID No.11)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增編碼SEQ ID No.1的LAMY氨基酸序列中從上游強(qiáng)啟動(dòng)子到Gly21的基因片段。通過用產(chǎn)生的兩個(gè)DNA片段和表2所示的引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，將產(chǎn)生的其末端有分別來自引物L(fēng)A-K38(SEQ IDNo.10)和LA-K38R(SEQ ID No.11)的互補(bǔ)序列的兩個(gè)片段組合在一起，由此擴(kuò)增了嵌合α-淀粉酶(下文將描述為“LA-K38AMY”)的基因片段(約2.1kb)，該嵌合α-淀粉酶連續(xù)地連接有編碼強(qiáng)啟動(dòng)子下游從LAMY的His1到Gly21的區(qū)段和編碼從K38AMY的Gln20到C-末端的區(qū)段。
用“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-Super Express Km”試劑盒(TakaraShuzo有限公司產(chǎn)品)，將下述突變導(dǎo)入K38AMY和LA-K38AMY。首先，將K38AMY和LA-K38AMY的基因片段插入該試劑盒附帶的質(zhì)粒載體pKF19k的SmaI位點(diǎn)，以構(gòu)建誘變重組質(zhì)粒(圖2)。用T4 DNA激酶將表2中的定點(diǎn)誘變寡核苷酸引物N190F(SEQ ID No.50)5’-磷酸化。用該引物和上述誘變重組質(zhì)粒，按照試劑盒的方法進(jìn)行誘變。并且用反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌MV1184(“感受態(tài)細(xì)胞MV1184”，Takara Shuzo有限公司產(chǎn)品)。從這樣獲得的轉(zhuǎn)化體抽提重組質(zhì)粒，然后分析堿基序列，借以證實(shí)用Phe替代Asn190的突變。通過相繼利用引物A209V(SEQ ID No.51)和QEYK(SEQ IDNo.49)以上面的類似方式將誘變反應(yīng)重復(fù)引入該突變基因，由此分別用Phe和Val替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列的Asn190和Gln209，并用SEQ ID No.1所代表的LAMY氨基酸序列的His1-Gly21序列替代SEQ ID No.2所代表的K38AMY氨基酸序列的Asp1-Gly19序列；分別用Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY氨基酸序列的Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，并用LAMY氨基酸序列的His1-Gly21序列替代K38AMY氨基酸序列的Asp1-Gly19序列；以及分別用 Glu、Lys、Phe和Val替代K38AMY的氨基酸序列Gln167、Tyr169、Asn190和Gln209，分別構(gòu)建了編碼一種耐熱性提高了的突變?chǔ)?淀粉酶(此后將描述為“LA-K38AMY/NFQV”)、一種大大提高了耐熱性的突變?chǔ)?淀粉酶(“LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)和一種提高了耐熱性的突變?chǔ)?淀粉酶(“QEYK/NFQV”)的基因。
以這些基因?yàn)槟０澹靡颣38US(SEQ ID No.7)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行PCR反應(yīng)以擴(kuò)增編碼突變?chǔ)?淀粉酶的結(jié)構(gòu)基因片段(約1.5kb)。然后以上述類似方法將其插入表達(dá)載體pHSP64的SalI-SmaI位點(diǎn)，由此構(gòu)建連接了這些突變?chǔ)?淀粉酶的結(jié)構(gòu)基因的重組質(zhì)粒(圖1)。實(shí)施例2引入突變以提高α-淀粉酶的生產(chǎn)能力用“定點(diǎn)誘變系統(tǒng)Mutan-Super Express Km”試劑盒(Takara Shuzo有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行定點(diǎn)誘變以提高重組枯草芽孢桿菌的淀粉酶生產(chǎn)能力。以實(shí)施例1中獲得的各種重組質(zhì)粒為模板，對(duì)ARG和ARG/M202T用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和LADH(SEQ IDNo.6)進(jìn)行PCR反應(yīng)，而對(duì)K38AMY、LA-K38AMY/NFQV、LA-K38AMY/QEYK/NFQV和QEYK/NFQV用引物CLUBG(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行PCR反應(yīng)，由此擴(kuò)增從來自菌株KSM-64的上游強(qiáng)啟動(dòng)子到下游α-淀粉酶基因的約2.1kb的片段。將這些擴(kuò)增片段插入上述試劑盒附帶的質(zhì)粒載體pKF19k的SmaI位點(diǎn)，由此構(gòu)建各種誘變重組質(zhì)粒(圖2)。
用T4 DNA激酶將表2中列出的用于定點(diǎn)誘變的各種寡核苷酸引物(SEQ ID Nos.12-51)5’-磷酸化，并利用產(chǎn)生的產(chǎn)物和上面的誘變重組質(zhì)粒按照試劑盒描述的方法進(jìn)行誘變。用反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化菌株大腸桿菌MV1184(“感受態(tài)細(xì)胞MV1184”，Takara Shuzo有限公司產(chǎn)品)。從產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化體中抽提重組質(zhì)粒，然后分析堿基序列以證實(shí)突變。
表2

在堿基序列中“N”是指A、T、G和C的混合堿基，而“Y”是指T和C的混合堿基。
通過再次以上述類似的方式將一個(gè)表達(dá)啟動(dòng)子區(qū)和突變?chǔ)?淀粉酶基因部分插入pKF19k的SmaI位點(diǎn)，當(dāng)引入另一突變位點(diǎn)時(shí)，該引入突變的基因成為模板質(zhì)粒。這樣以上述方法的類似方式引入另一個(gè)突變。
用這些如此獲得的突變重組質(zhì)粒作為模板，用引物CLUBG(SEQID No.9)和LADH(SEQ ID No.6)或引物CLUBS(SEQ ID No.9)和K38DH(SEQ ID No.8)進(jìn)行PCR，擴(kuò)增突變基因片段。用SalI將它們切割后，插入表達(dá)載體pHSP64的SalI-SmaI位點(diǎn)，以構(gòu)建產(chǎn)生突變?chǔ)?淀粉酶的各種質(zhì)粒(圖1)。實(shí)施例3突變?chǔ)?淀粉酶的生產(chǎn)根據(jù)原生質(zhì)體方法將實(shí)施例2中獲得的產(chǎn)生突變?chǔ)?淀粉酶的各種質(zhì)粒均導(dǎo)入枯草芽孢桿菌ISW1214(LeuA metBS5 hsdM1)中。如此獲得的重組枯草芽孢桿菌在液體培養(yǎng)基中(4％玉米浸液、1％胰蛋白胨、1％肉膏、0.1％磷酸二氫鉀(monopotassium phosphate)、0.01％硫酸鎂、2％麥芽糖、0.1％氯化鈣、15μg/ml四環(huán)素)于30℃培養(yǎng)4天。用培養(yǎng)基上清測(cè)量每一個(gè)突變?chǔ)?淀粉酶的活性。實(shí)施例4淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-1分析下列每一種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力；用Ser替代了ΔRG的Pro18的酶(以下將簡寫為“P18S/ΔRG”)、用Glu替代了Gln86的酶(“Q86E/ΔRG”)、用Val替代了Glu130的酶(“E130V/ΔRG”)、用Asp替代了A8n154的酶(“N154D/ΔRG”)、用Cys替代了Arg171的酶(“R171C/ΔRG”)、用Val替代了Ala186的酶(“A186V/ΔRG”)、用Asp替代了Glu212的酶(“E212D/ΔRG”)、用Glu替代了Val222的酶(“V222E/ΔRG”)、用Cys替代了Tyr243的酶(“Y243C/ΔRG”)、用Glu替代了Pro260的酶(“P260E/ΔRG”)、用Gln替代了Lys269的酶(“K269E/ΔRG”)、用His替代了Glu276的酶(“E276H/ΔRG”)、用Ser替代了Asn277的酶(“N277S/ΔRG”)、用Ala替代了Arg310的酶(“R310A/ΔRG”)、用Gln替代了Glu360的酶(“E360Q/ΔRG”)、用Glu替代了Gln391的酶(“Q391E/ΔRG”)、用Arg替代了Trp439的酶(“W439R/ΔRG”)、用Arg替代了Lys444的酶(“K444R/ΔRG”)、用Asp替代了Asn471的酶(“N471D/ΔRG”)和用Asp替代了Gly476的酶(“G476D/ΔRG”)。用ΔRG作對(duì)照。將ΔRG的淀粉酶生產(chǎn)能力定為100％，測(cè)定淀粉酶生產(chǎn)能力的相對(duì)值(％)。結(jié)果見表3。
表3酶 相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)ΔRG 100P18S/ΔRG277Q86E/ΔRG119E130V/ΔRG 362N154D/ΔRG 146R171C/ΔRG 235A186V/ΔRG 485E212D/ΔRG 327V222E/ΔRG 135Y243C/ΔRG 350P260E/ΔRG 142K269Q/ΔRG 142E276H/ΔRG 231N277S/ΔRG 312R310A/ΔRG 208E360Q/ΔRG 162Q391E/ΔRG 127W439R/ΔRG 312K444R/ΔRG 112N471D/ΔRG 292G476D/ΔRG 296任何一個(gè)突變酶都顯示了比ΔRG高的淀粉酶生產(chǎn)能力，表明在重組枯草芽孢桿菌中，突變提高了淀粉酶的生產(chǎn)能力。特別地，E130V/ΔRG、A186V/ΔRG、E212D/ΔRG、Y243C/ΔRG、N277S/ΔRG和W439R/ΔRG中每一種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力都比ΔRG高至少3倍，并且最突出的是，A186V/ΔRG顯示了顯著高的生產(chǎn)能力，比ΔRG幾乎高5倍。實(shí)施例5淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-2以與實(shí)施例1、2和3描述的方法類似的方式，分析下列每一種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力用Thr替代了ΔRG/MT的Pro18的酶(以下將簡寫為“P18T/ΔRG/MT”)、用Glu替代了Gln86的酶(“Q86E/ΔRG/MT”)、用Val替代了Glu130的酶(“E130V/ΔRG/MT”)、用Asn替代了Ala186的酶(“A186N/ΔRG/MT”)、用Ser替代了Tyr243的酶(“Y243S/ΔRG/MT”)、用Phe替代了Asn277的酶(“N277F/ΔRG/MT”)和用Glu替代了Asn471的酶(“N471E/ΔRG/MT”)。用ΔRG/MT作對(duì)照。結(jié)果見表4。
表4酶相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)ΔRG/MT 100P18T/ΔRG/MT 200Q86E/ΔRG/MT 144E130V/ΔRG/MT 344A186N/ΔRG/MT 344Y243S/ΔRG/MT 189N277F/ΔRG/MT 256N471E/ΔRG/MT 211可以看出，與ΔRG/MT相比，上述任何一種突變酶都顯示了高的淀粉酶生產(chǎn)能力。特別地，E130V/ΔRG/MT和A186N/ΔRG/MT中每一種酶的生產(chǎn)能力都比ΔRG/MT高至少3倍。實(shí)施例6淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-3
根據(jù)實(shí)施例1、2、3中所用的方法，分析下列每一種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力用Val替代了K38AMY的Asp128的酶(以下將簡寫為“D128V”)、用Ser替代了Gly140的酶(“G140S”)、用Pro替代了Ser144的酶(“S144P”)、用Gln替代了Arg168的酶(“R168Q”)、用Val替代了Asn181的酶(“N181V”)、用Asp替代了Glu207的酶(“E207D”)、用Ser替代了Phe272的酶(“F272S”)、用Pro替代了Ser375的酶(“S375P”)、用Arg替代了Trp434的酶(“W434R”)和用Asp替代了Glu466的酶(“E466D”)。用K38AMY作對(duì)照。結(jié)果見表5。
表5酶 相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)K38AMY 100D128V325G140S209S144P197R168Q264N181V207E207D109F272S175S375P115W434R124E466D212可以看出，與野生型K38AMY相比，任何一種突變酶都顯示了高的淀粉酶生產(chǎn)能力。特別地，D128V顯示了比K38AMY高至少3倍的高生產(chǎn)能力。實(shí)施例7淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-4
根據(jù)實(shí)施例3描述的方法分析實(shí)施例6顯示的突變體中具有S144P和N181V雙突變的突變酶S144P/N181V(以下將簡寫為“SPNV”)的淀粉酶生產(chǎn)能力。用K38AMY、S144P和N181V作對(duì)照。結(jié)果見表6。
表6酶 相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)K38AMY 100S144P 197N181V 207SPNV257結(jié)果如表6所示，雙突變帶來淀粉酶生產(chǎn)能力的進(jìn)一步提高。實(shí)施例8淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-5根據(jù)實(shí)施例1、2、3中描述的方法，分析下列每種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力用Gln替代耐熱性提高了的LA-K38AMY/NFQV基因中的Arg168獲得的酶(以下將簡寫為“R168Q/LA-K38AMY/NFQV”)，用Asp替代上述基因的Glu466獲得的酶(“E466D/LA-K38AMY/NFQV”)和將實(shí)施例6的雙突變引入該基因的酶(“SPNV/LA-K38AMY/NFQV”)。用LA-K38AMY/NFQV作對(duì)照。結(jié)果見表7。
表7酶相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)LA-K38AMY/NFQV100R168Q/LA-K38AMY/NFQV 304E466D/LA-K38AMY/NFQV 264SPNV/LA-K38AMY/NFQV 154
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該實(shí)施例中獲得的每一種酶都顯示了比LA-K38AMY/NFQV高至少約1.5倍的淀粉酶生產(chǎn)能力。特別地，R168Q/LA-K38AMY/NFQV顯示了高約3倍的淀粉酶生產(chǎn)能力。實(shí)施例9淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-6根據(jù)實(shí)施例1、2和3描述的方法，分析下列每一種酶的淀粉酶生產(chǎn)能力用Val替代耐熱性提高了的酶LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因中的Asp128獲得的酶(以下將簡寫為“D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)，和將實(shí)施例6的雙突變引入了該基因的酶(“SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)。用LA-K38AMY/QEYK/NFQV作對(duì)照。結(jié)果見表8。
表8酶相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)LA-K38AMY/QEYK/NFQV 100D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV 602SPNV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV427結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該實(shí)施例獲得的任何一種突變酶都顯示了比LA-K38AMY/QEYK/NFQV顯著高的淀粉酶生產(chǎn)能力。特別地，D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV顯示了生產(chǎn)能力的急劇增加(約6倍)。實(shí)施例10淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)-7根據(jù)實(shí)施例1和2描述的方法，向?qū)嵤├?所示突變酶里生產(chǎn)能力急劇增加的D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV中引入用Leu替代Met107以提高氧化劑抗性的突變(以下該突變將簡寫為“M107L”)(“ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV”)。
然后，根據(jù)實(shí)施例4的方法，分析突變酶MM/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV基因的淀粉酶生產(chǎn)能力。用D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV作對(duì)照。結(jié)果見表9。
表9酶 相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV 100M107L/D128V/LA-K38AMY/QEYK/NFQV115突變酶ML/DV/LA-K38AMY/QEYK/NFQV的相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力為115％，表明引入用以增強(qiáng)氧化劑抗性的M107L突變沒有對(duì)重組枯草芽孢桿菌的高淀粉酶生產(chǎn)能力產(chǎn)生不利影響。實(shí)施例11淀粉酶生產(chǎn)能力的評(píng)價(jià)8根據(jù)實(shí)施例1、2和3描述的方法，分析用Gln替代耐熱性提高了的酶QEYK/NFQV基因的Asp128獲得的酶(產(chǎn)生的酶以下將簡寫為“D128Q/QEYK/NFQV”)的淀粉酶生產(chǎn)能力。用QEYK/NFQV作對(duì)照。結(jié)果見表10。
表10酶 相對(duì)淀粉酶生產(chǎn)能力(％)QEYK/NFQV 100D128Q/QEYK/NFQV247可見突變酶顯示的生產(chǎn)能力比QEYK/NFQV高至少2倍。
表11

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)通過缺失Arg181和Gly182使耐熱性提高了的改良α-淀粉酶(ΔRG)在4℃貯存一周時(shí)，出現(xiàn)了該酶的沉淀，并且上清中剩余的活性只有約一半。另一方面，通過在ΔRG-LAMY上進(jìn)一步引入突變獲得的突變酶在上清中顯示了高的活性殘余比，表明突變提高了溶解性。特別地，用Glu替代了Gln86的酶顯示了最高的酶溶解性，并且在該實(shí)施例條件下上清中剩余80％的酶。實(shí)施例13用于自動(dòng)洗碟機(jī)的洗滌劑組合物制備含有如表12所示成分的用于自動(dòng)洗碟機(jī)的洗滌劑組合物，然后加入在增加生產(chǎn)能力的方法中獲得的各種突變酶。結(jié)果當(dāng)和對(duì)照酶活性相等時(shí)，與對(duì)照酶相比，高產(chǎn)突變酶顯示了相似或更強(qiáng)的去污力。
表12

工業(yè)應(yīng)用能力根據(jù)使用本發(fā)明的突變?chǔ)?淀粉酶，可以從重組微生物得到高產(chǎn)α-淀粉酶，使得它們的工業(yè)生產(chǎn)成本能夠大大降低。本發(fā)明中用于增加生產(chǎn)能力的突變對(duì)酶的生化特性沒有不利影響，因此能夠產(chǎn)生具有耐熱性、螯合劑抗性和氧化劑抗性并可作為洗滌劑用酶使用的高生產(chǎn)能力的液化堿性α-淀粉酶。
序列表<110>KAO CORPORATION<120>高生產(chǎn)能力的α-淀粉酶<130>P04831210<160>51<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>485<212>PRT<213>芽孢桿菌屬KSM-AP1378<400>1His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His5 10 15Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala20 25 30Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp35 40 45Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr50 55 60Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly65 70 75 80Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly85 90 95Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp100 105 110Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn115 120 125Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp130 135 140Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr145 150 155 160His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys165 170 175Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp180 185 190Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met195 200 205Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr210 215 220Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His225 230 235 240Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr245 250 255Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu260 265 270Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val275 280 285Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly290 295 300Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys305 310 315 320His Pro Ile His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro325 330 335Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala340 345 350Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr355 360 365Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser370 375 380Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr385 390 395 400Gln His Asp Tyr Phe Asp His His Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu405 410 415Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp420 425 430Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly435 440 445Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile450 455 460Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser465 470 475 480Val Trp Val Lys Gln485<210>2<211>480<212>PRT<213>芽孢桿菌屬KSM-K38<400>2Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu
5 10 15Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu20 25 30Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn85 90 95Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr100 105 110Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp115 120 125Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser130 135 140Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145 150 155 160Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg165 170 175Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn180 185 190Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val195 200 205Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp
210 215 220Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225 230 235 240Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu245 250 255Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe260 265 270Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu275 280 285Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met290 295 300Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305 310 315 320Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu325 330 335Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu340 345 350Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly355 360 365Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu370 375 380Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385 390 395 400Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg405 410 415Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser
420 425 430Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp435 440 445Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp450 455 460Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465 470 475 480<210>3<211>1786<212>DNA<213>芽孢桿菌屬KSM-AP1378<220><221>信號(hào)肽<222>(155)..(247)<220><221>成熟肽<222>(248)..(1702)<220><221>CDS<222>(155)..(1702)<400>3cagcgtgata atataaattt gaaatgaaca cctatgaaaa tatggtagcg attgcgcgac 60gagaaaaaac ttgggagtta ggaagtgata ttaaaggatt ttttttgact tgttgtgaaa 120acgcttgcat aaattgaagg agagggtgct tttt atg aaa ctt cat aac cgt ata 175att agc gta cta tta aca cta ttg tta gct gta gct gtt ttg ttt cca 223tat atg acg gaa cca gca caa gcc cat cat aat ggg acg aat ggg acc 271His His Asn Gly Thr Asn Gly Thr1 5atg atg cag tat ttt gaa tgg cat ttg cca aat gac ggg aac cac tgg 319Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp His Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp10 15 20aac agg tta cga gat gac gca gct aac tta aag agt aaa ggg att acc 367Asn Arg Leu Arg Asp Asp Ala Ala Asn Leu Lys Ser Lys Gly Ile Thr25 30 35 40gct gtt tgg att cct cct gca tgg aag ggg act tcg caa aat gat gtt 415Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Trp Lys Gly Thr Ser Gln Asn Asp Val45 50 55ggg tat ggt gcc tat gat ttg tac gat ctt ggt gag ttt aac caa aag 463Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys60 65 70gga acc gtc cgt aca aaa tat ggc aca agg agt cag ttg caa ggt gcc 511Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Arg Ser Gln Leu Gln Gly Ala75 80 85gtg aca tct ttg aaa aat aac ggg att caa gtt tat ggg gat gtc gtg 559Val Thr Ser Leu Lys Asn Asn Gly Ile Gln Val Tyr Gly Asp Val Val90 95 100atg aat cat aaa ggt gga gca gac ggg aca gag atg gta aat gcg gtg 607Met Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Gly Thr Glu Met Val Asn Ala Val105 110 115 120gaa gtg aac cga agc aac cga aac caa gaa ata tca ggt gaa tac acc 655Glu Val Asn Arg Ser Asn Arg Asn Gln Glu Ile Ser Gly Glu Tyr Thr125 130 135att gaa gca tgg acg aaa ttt gat ttc cct gga aga gga aat acc cat 703Ile Glu Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr His140 145 150tcc aac ttt aaa tgg cgc tgg tat cat ttt gat ggg aca gat tgg gat 751Ser Asn Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp Gly Thr Asp Trp Asp155 160 165cag tca cgt cag ctt cag aac aaa ata tat aaa ttc aga ggt acc gga 799Gln Ser Arg Gln Leu Gln Asn Lys Ile Tyr Lys Phe Arg Gly Thr Gly170 175 180aag gca tgg gac tgg gaa gta gat ata gag aac ggc aac tat gat tac 847Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Ile Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr185 190 195 200ctt atg tat gca gac att gat atg gat cat cca gaa gta atc aat gaa 895Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Met Asp His Pro Glu Val Ile Asn Glu205 210 215ctt aga aat tgg gga gtt tgg tat aca aat aca ctt aat cta gat gga 943Leu Arg Asn Trp Gly Val Trp Tyr Thr Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly220 225 230ttt aga atc gat gct gtg aaa cat att aaa tac agc tat acg aga gat 991Phe Arg Ile Asp Ala Val Lys His Ile Lys Tyr Ser Tyr Thr Arg Asp235 240 245tgg cta aca cat gtg cgt aac acc aca ggt aaa cca atg ttt gca gtt 1039Trp Leu Thr His Val Arg Asn Thr Thr Gly Lys Pro Met Phe Ala Val250 255 260gca gaa ttt tgg aaa aat gac ctt gct gca atc gaa aac tat tta aat 1087Ala Glu Phe Trp Lys Asn Asp Leu Ala Ala Ile Glu Asn Tyr Leu Asn265 270 275 280aaa aca agt tgg aat cac tcc gtg ttc gat gtt cct ctt cat tat aat 1135Lys Thr Ser Trp Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu His Tyr Asn285 290 295ttg tac aat gca tct aat agt ggt ggc tat ttt gat atg aga aat att 1183Leu Tyr Asn Ala Ser Asn Ser Gly Gly Tyr Phe Asp Met Arg Asn Ile300 305 310tta aat ggt tct gtc gta caa aaa cac cct ata cat gca gtc aca ttt 1231Leu Asn Gly Ser Val Val Gln Lys His Pro Ile His Ala Val Thr Phe315 320 325gtt gat aac cat gac tct cag cca gga gaa gca ttg gaa tcc ttt gtt 1279Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Gly Glu Ala Leu Glu Ser Phe Val330 335 340caa tcg tgg ttc aaa cca ctg gca tat gca ttg att ctg aca agg gag 1327Gln Ser Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Leu Ile Leu Thr Arg Glu345 350 355 360caa ggt tac cct tcc gta ttt tac ggt gat tac tac ggt ata cca act 1375Gln Gly Tyr Pro Ser Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr365 370 375cat ggt gtt cct tcg atg aaa tct aaa att gat cca ctt ctg cag gca 1423His Gly Val Pro Ser Met Lys Ser Lys Ile Asp Pro Leu Leu Gln Ala380 385 390cgt caa acg tat gcc tac gga acc caa cat gat tat ttt gat cat cat 1471Arg Gln Thr Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe Asp His His395 400 405gat att atc ggc tgg acg aga gaa ggg gac agc tcc cac cca aat tca 1519Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp Ser Ser His Pro Asn Ser410 415 420gga ctt gca act att atg tcc gat ggg cca ggg ggt aat aaa tgg atg 1567Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asp Gly Pro Gly Gly Asn Lys Trp Met425 430 435 440tat gtc ggg aaa cat aaa gct ggc caa gta tgg aga gat atc acc gga 1615Tyr Val Gly Lys His Lys Ala Gly Gln Val Trp Arg Asp Ile Thr Gly445 450 455aat agg tct ggt acc gtc acc att aat gca gat ggt tgg ggg aat ttc 1663Asn Arg Ser Gly Thr Val Thr Ile Asn Ala Asp Gly Trp Gly Asn Phe460 465 470act gta aac gga ggg gca gtt tcg gtt tgg gtg aag caa taaataagga 1712Thr Val Asn Gly Gly Ala Val Ser Val Trp Val Lys Gln475 480 485acaagaggcg aaaattactt tcctacatgc agagctttcc gatcactcat acacccaata 1772taaattggaa gctt 1786<210>4<211>1753<212>DNA<213>芽孢桿菌屬KSM-K38<220><221>信號(hào)肽<222>(162)..(224)<220><221>成熟肽<222>(225)..(1664)<220><221>CDS<222>(162)..(1664)<400>4gtatgcgaaa cgatgcgcaa aactgcgcaa ctactagcac tcttcaggga ctaaaccacc 60ttttttccaa aaatgacatc atataaacaa atttgtctac caatcactat ttaaagctgt 120ttatgatata tgtaagcgtt atcattaaaa ggaggtattt g atg aga aga tgg gta 176gta gca atg ttg gca gtg tta ttt tta ttt cct tcg gta gta gtt gca 224gat gga ttg aac ggt acg atg atg cag tat tat gag tgg cat ttg gaa 272Asp Gly Leu Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Tyr Glu Trp His Leu Glu1 5 10 15aac gac ggg cag cat tgg aat cgg ttg cac gat gat gcc gca gct ttg 320Asn Asp Gly Gln His Trp Asn Arg Leu His Asp Asp Ala Ala Ala Leu20 25 30agt gat gct ggt att aca gct att tgg att ccg cca gcc tac aaa ggt 368Ser Asp Ala Gly Ile Thr Ala Ile Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly35 40 45aat agt cag gcg gat gtt ggg tac ggt gca tac gat ctt tat gat tta 416Asn Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu50 55 60gga gag ttc aat caa aag ggt act gtt cga acg aaa tac gga act aag 464Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys65 70 75 80gca cag ctt gaa cga gct att ggg tcc ctt aaa tct aat gat atc aat 512Ala Gln Leu Glu Arg Ala Ile Gly Ser Leu Lys Ser Asn Asp Ile Asn85 90 95gta tac gga gat gtc gtg atg aat cat aaa atg gga gct gat ttt acg 560Val Tyr Gly Asp Val Val Met Asn His Lys Met Gly Ala Asp Phe Thr100 105 110gag gca gtg caa gct gtt caa gta aat cca acg aat cgt tgg cag gat 608Glu Ala Val Gln Ala Val Gln Val Asn Pro Thr Asn Arg Trp Gln Asp115 120 125att tca ggt gcc tac acg att gat gcg tgg acg ggt ttc gac ttt tca 656Ile Ser Gly Ala Tyr Thr Ile Asp Ala Trp Thr Gly Phe Asp Phe Ser130 135 140ggg cgt aac aac gcc tat tca gat ttt aag tgg aga tgg ttc cat ttt 704Gly Arg Asn Asn Ala Tyr Ser Asp Phe Lys Trp Arg Trp Phe His Phe145 150 155 160aat ggt gtt gac tgg gat cag cgc tat caa gaa aat cat att ttc cgc 752Asn Gly Val Asp Trp Asp Gln Arg Tyr Gln Glu Asn His Ile Phe Arg165 170 175ttt gca aat acg aac tgg aac tgg cga gtg gat gaa gag aac ggt aat 800Phe Ala Asn Thr Asn Trp Asn Trp Arg Val Asp Glu Glu Asn Gly Asn180 185 190tat gat tac ctg tta gga tcg aat atc gac ttt agt cat cca gaa gta 848Tyr Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Asn Ile Asp Phe Ser His Pro Glu Val195 200 205caa gat gag ttg aag gat tgg ggt agc tgg ttt acc gat gag tta gat 896Gln Asp Glu Leu Lys Asp Trp Gly Ser Trp Phe Thr Asp Glu Leu Asp210 215 220ttg gat ggt tat cgt tta gat gct att aaa cat att cca ttc tgg tat 944Leu Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Pro Phe Trp Tyr225 230 235 240aca tct gat tgg gtt cgg cat cag cgc aac gaa gca gat caa gat tta 992Thr Ser Asp Trp Val Arg His Gln Arg Asn Glu Ala Asp Gln Asp Leu245 250 255ttt gtc gta ggg gaa tat tgg aag gat gac gta ggt gct ctc gaa ttt 1040Phe Val Val Gly Glu Tyr Trp Lys Asp Asp Val Gly Ala Leu Glu Phe260 265 270tat tta gat gaa atg aat tgg gag atg tct cta ttc gat gtt cca ctt 1088Tyr Leu Asp Glu Met Asn Trp Glu Met Ser Leu Phe Asp Val Pro Leu275 280 285aat tat aat ttt tac cgg gct tca caa caa ggt gga agc tat gat atg 1136Asn Tyr Asn Phe Tyr Arg Ala Ser Gln Gln Gly Gly Ser Tyr Asp Met290 295 300cgt aat att tta cga gga tct tta gta gaa gcg cat ccg atg cat gca 1184Arg Asn Ile Leu Arg Gly Ser Leu Val Glu Ala His Pro Met His Ala305 310 315 320gtt acg ttt gtt gat aat cat gat act cag cca ggg gag tca tta gag 1232Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Glu Ser Leu Glu
325 330 335tca tgg gtt gct gat tgg ttt aag cca ctt gct tat gcg aca att ttg 1280Ser Trp Val Ala Asp Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Thr Ile Leu340 345 350acg cgt gaa ggt ggt tat cca aat gta ttt tac ggt gat tac tat ggg 1328Thr Arg Glu Gly Gly Tyr Pro Asn Val Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly355 360 365att cct aac gat aac att tca gct aaa aaa gat atg att gat gag ctg 1376Ile Pro Asn Asp Asn Ile Ser Ala Lys Lys Asp Met Ile Asp Glu Leu370 375 380ctt gat gca cgt caa aat tac gca tat ggc acg cag cat gac tat ttt 1424Leu Asp Ala Arg Gln Asn Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His Asp Tyr Phe385 390 395 400gat cat tgg gat gtt gta gga tgg act agg gaa gga tct tcc tcc aga 1472Asp His Trp Asp Val Val Gly Trp Thr Arg Glu Gly Ser Ser Ser Arg405 410 415cct aat tca ggc ctt gcg act att atg tcg aat gga cct ggt ggt tcc 1520Pro Asn Ser Gly Leu Ala Thr Ile Met Ser Asn Gly Pro Gly Gly Ser420 425 430aag tgg atg tat gta gga cgt cag aat gca gga caa aca tgg aca gat 1568Lys Trp Met Tyr Val Gly Arg Gln Asn Ala Gly Gln Thr Trp Thr Asp435 440 445tta act ggt aat aac gga gcg tcc gtt aca att aat ggc gat gga tgg 1616Leu Thr Gly Asn Asn Gly Ala Ser Val Thr Ile Asn Gly Asp Gly Trp450 455 460ggc gaa ttc ttt acg aat gga gga tct gta tcc gtg tac gtg aac caa 1664Gly Glu Phe Phe Thr Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Tyr Val Asn Gln465 470 475 480taacaaaaag ccttgagaag ggattcctcc ctaactcaag gctttcttta tgtcgcttag 1724cttaacgctt ctacgacttt gaagcttta 1753<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gagtcgacca gcacaagccc atcataatgg 30<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6taaagcttca atttatattg g 21<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>7gggtcgacca gcacaagccg atggattgaa cggtacgatg 40<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8taaagctttt gttattggtt cacgtacac 29<210>9<211>27<212>DNA<213>人工序列 nce<400>9ccagatctac ttaccatttt agagtca 27<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列 lce<400>10atttgccaaa tgacgggcag cattggaatc ggtt 34<210>11<211>34<212>DNA<213>人工序列 lce<400>11aaccgattcc aatgctgccc gtcatttggc aaat 34<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>12tttgaatggc atttgtcaaa tgacggggaa ccac 34<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>13acaaggagtc agttggaagg tgccgtgaca tct 33<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>14cgaaaccaag taatatcagg t 21<210>15<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>15aatacccatt ccgattttaa atggcgc 27<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>16gattgggatc agtcatgyca gcttcagaac aaa 33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>17aaattcaccg gaaaggtatg ggactgggaa gta 33<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>18tcatccagat gtaatcaatg 20<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>19cttagaaatt ggggagaatg gtatacaaat aca 33<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>20gtgaaacata ttaaatgcag ctatacgaga gat 33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>21aacaccacag gtaaagaaat gtttgcagtt gca 33<210>22<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>22agaattttgg caaaatgacc t 21<210>23<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>23ttgctgcaat ccataactat ttaaat 26<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>24cttgctgcaa tcgaaagyta tttaaataaa aca 33<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>25ggctattttg atatggcaaa tattttaaat ggt 33<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>26tctgacaagg cagcaaggtt a 21<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>27gatccacttc tggaagcacg tcaaacg 27<210>28<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>28gggggtaata aaagaatgta tgtcggg 27<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>29atgtatgtcg ggcgacataa agctgg 26<210>30<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>30gatggttggg gggatttcac tgtaa 25<210>31<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>31ttcactgtaa acgatggggc agtttcg 27<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>32ggtttgggtg cagcaataaa t<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>33tttgaatggc atttgnnnaa tgacgggaac cac 33<210>34<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>34aaattcaccg gaaagnnntg ggactgggaa gta 33<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>35gtgaaacata ttaaannnag ctatacgaga gat 33<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>36cttgctgcaa tcgaannnta tttaaataaa aca 33<210>37<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>37gatggttggg gggaattcac tgtaa 25<210>38<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>38ccaacgaatc gttggcaggt aatttcaggt gcctacacg 39<210>39<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>39attgatgcgt ggacgagttt cgacttttca ggg 33<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>40tttcgacttt ccagggcgta a 21<210>41<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>41ggtgttgact gggatcagca atatcaagaa aatcatattt tcc 43<210>42<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>42catattttcc gctttgcaaa tacggtntgg aacaggcgag tg 42<210>43<211>44<212>DNA<213>人工序列<400>43aatatcgact ttagtcatcc agatgtacaa gatgagttga agga 44<210>44<211>43<212>DNA<213>人工序列<400>44gacgtaggtg ctctcgaatc ttatttagat gaaatgaatt ggg 43<210>45<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>45cgataacatt ccagctaaaa a 21<210>46<211>38<212>DNA<213>人工序列<400>46gacctggtgg ttccaagaga atgtatgtag gacgtcag 38<210>47<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>47aatggcgatg gatggggcga tttctttacg aatggaggat ct 42<210>48<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>48ccaacgaatc gttggcagnn natttcaggt gcctacacg 39<210>49<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>49gttgactggg atgagcgcaa acaagaaaat cat 33<210>50<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>50tggatgaaga gttcggtaat tatga 25<210>51<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>51agtcatccag aggtcgtaga tgagttgaag gat 3權(quán)利要求
1.突變的α-淀粉酶，其從具有SEQ ID No.1所代表的氨基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列的Pro18、Gln86、Glu130、Asn154、Arg171、Ala186、Glu212、Val222、Tyr243、Pro260、Lys269、Glu276、Asn277、Arg310、Glu360、Gln391、Trp439、Lys444、Asn471和Gly476中任何一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基。
2.突變的α-淀粉酶，其從具有SEQ ID No.2所代表的氨基酸序列或顯示與該序列有至少60％同源性的α-淀粉酶衍生而來，衍生方式是替代或缺失相應(yīng)于該氨基酸序列的Asp128、Gly140、Ser144、Arg168、Asn181、Glu207、Phe272、Ser375、Trp434和Glu466中任何一個(gè)的至少一個(gè)氨基酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的突變?chǔ)?淀粉酶，其中替代或缺失至少一個(gè)氨基酸殘基是用Ser或Thr替代相應(yīng)于Pro18的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Gln86的氨基酸殘基，用Val或Gln替代相應(yīng)于Glu130的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Asn154的氨基酸殘基，用Cys或Gln替代相應(yīng)于Arg171的氨基酸殘基，用Val或Asn替代相應(yīng)于Ala186的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Glu212的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Val222的氨基酸殘基，用Cys或Ser替代相應(yīng)于Tyr243的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Pro260的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Lys269的氨基酸殘基，用His替代相應(yīng)于Glu276的氨基酸殘基，用Ser或Phe替代相應(yīng)于Asn277的氨基酸殘基，用Ala替代相應(yīng)于Arg310的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Glu360的氨基酸殘基，用Glu替代相應(yīng)于Gln391的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Trp439的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Lys444的氨基酸殘基，用Asp或Glu替代相應(yīng)于Asn471的氨基酸殘基，或用Asp替代相應(yīng)于Gly476的氨基酸殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的突變?chǔ)?淀粉酶，其中替代或缺失至少一個(gè)氨基酸殘基是用Val或Gln替代相應(yīng)于Asp128的氨基酸殘基，用Ser替代相應(yīng)于Gly140的氨基酸殘基，用Pro替代相應(yīng)于Ser144的氨基酸殘基，用Gln替代相應(yīng)于Arg168的氨基酸殘基，用Val替代相應(yīng)于Gln181的氨基酸殘基，用Asp替代相應(yīng)于Glu270的氨基酸殘基，用Ser替代相應(yīng)于Phe272的氨基酸殘基，用Pro替代相應(yīng)于Ser375的氨基酸殘基，用Arg替代相應(yīng)于Trp434的氨基酸殘基，或用Asp替代相應(yīng)于Glu466的氨基酸殘基。
5.編碼權(quán)利要求1-4之任意一項(xiàng)的突變?chǔ)?淀粉酶的基因，或含有所述基因的載體。
6.用根據(jù)權(quán)利要求5的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
7.用于生產(chǎn)突變?chǔ)?淀粉酶的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求6的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
8.洗滌劑組合物，其含有權(quán)利要求1-4之任意一項(xiàng)的突變?chǔ)?淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明提供高生產(chǎn)能力的突變?chǔ)粒矸勖?其來自具有SEQ ID No.1或2代表的氨基酸序列或顯示與該序列有60%同源性的α－淀粉酶,并被構(gòu)建成用另外的氨基酸殘基替代或缺失了參與生產(chǎn)能力的特定氨基酸殘基。本發(fā)明還提供編碼此突變?chǔ)粒矸勖傅幕?、載體、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和生產(chǎn)突變?chǔ)粒矸勖傅姆椒?該方法包括培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明還提供含有突變?chǔ)粒矸勖傅南礈靹┙M合物。根據(jù)本發(fā)明,能夠從重組微生物中生產(chǎn)高產(chǎn)量的α－淀粉酶,使得它們的工業(yè)生產(chǎn)成本能夠大大降低。這導(dǎo)致了具有耐熱性、螯合劑抗性和氧化劑抗性并可作為洗滌劑用酶使用的液化堿性α－淀粉酶的產(chǎn)量增加。
文檔編號(hào)C12N9/28GK1348000SQ0114125
公開日2002年5月8日 申請(qǐng)日期2001年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月11日
發(fā)明者荒木裕行, 遠(yuǎn)藤圭二, 萩原浩, 五十嵐一曉, 林康弘, 尾崎克也 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社