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一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法

文檔序號:596521閱讀:296來源:國知局
專利名稱:一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及一種生物制氫技術(shù),具體地說涉及一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法。
到目前為止,利用含有碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過厭氧細(xì)菌進(jìn)行生物制氫的研究主要采用純菌種發(fā)酵,有文獻(xiàn)(Fumiaki Taguchi,NaokiMizukami,et al.,Enzyme ang Microbial Technology 17147-150,1995.)報道利用纖維物質(zhì),液態(tài)培養(yǎng)單一厭氧菌制氫,該文獻(xiàn)利用含有碳水化合物、蛋白質(zhì)等物質(zhì)通過厭氧細(xì)菌進(jìn)行生物制氫的研究主要采用純菌種發(fā)酵,同時也在采用纖維物質(zhì)替代碳水化合物。
現(xiàn)在研究方向一方面尋找產(chǎn)氫量高的微生物,另一方面則致力于產(chǎn)氫工藝的研究,使微生物產(chǎn)氫技術(shù)向?qū)嵱没A段發(fā)展。這方面的報道可參閱微生學(xué)通報,1993,20(5),259-262。
本發(fā)明采用兩株厭氧菌丁酸梭菌1.209和1.335以及兩株兼性需氧菌麥芽糖假絲酵母2.1376和產(chǎn)氣腸桿菌1.2021,并以PYFG培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加微量元素溶液配制成種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基,制備氫氣的步驟如下(1)將兩株兼性需氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行好氧培養(yǎng);將兩株厭氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行厭氧培養(yǎng);(2)將步驟(1)培養(yǎng)的兩株兼性需氧菌分別接種于液體種子培養(yǎng)基上好氧培養(yǎng);將步驟(1)培養(yǎng)的厭氧菌分別接種于液體種子養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng);(3)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝于發(fā)酵罐中,滅菌,將上述四種菌的種子液同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,混合均勻后發(fā)酵產(chǎn)氫。
具體地說,本發(fā)明提供的一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法如下(1)采用的菌種為兩株厭氧菌丁酸梭菌1.209和1.335(Clostridium butylicum 1.209、Clostridium butylicum 1.335);兩株兼性需氧菌麥芽糖假絲酵母2.1376(Candida malota 2.1376)和產(chǎn)氣腸桿菌1.2021(Enterobacter aerogenes 1.2021);(2)以PYFG培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加微量元素制得種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其配方如下Trypticase(BBL)10g,Yeast extract(Difco)5g,F(xiàn)ildes solution 40ml,Saltssolution 40ml,L-Cysteine HCL·H2O 0.5g,葡萄糖10g,微量元素溶液10ml,蒸餾水920ml,pH7.2。
其中Fildes solution的配制為生理鹽水150ml,濃鹽水6ml,脫纖維馬血液50ml,胃蛋白酶(1∶10,000,Difco)1g,將上述成分250ml混合,55℃恒溫水浴10小時保持消化,加20%氫氧化鈉溶液12ml調(diào)整pH為7.6(用鹽酸或氫氧化鈉修正),加2ml氯仿后4℃冷藏保存。
其中Salts solution的配制為無水CaCl20.2g,KH2PO41g,MgSO40.2g,K2HPO41g,NaCl 2g,NaHCO310g,蒸餾水100ml。先將CaCl2、MgSO4在300ml蒸餾水中溶解,然后邊攪拌邊添加蒸餾水至500ml,再將其他鹽類加入,待完全溶解后,再添加200ml蒸餾水,混合后在4℃冷藏保存。
其中微量元素溶液的配制為在1L培養(yǎng)基中加入生物素0.2mg,對氨基苯甲酸2mg,維生素B12mg,維生素B12 0.2mg,泛酸鈣2mg,尼克酸2mg,鹽酸吡哆醛2mg,葉酸0.5mg。
(3)將兩株兼性需氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上,分別于28℃和37℃好氧培養(yǎng)18-24小時;將兩株厭氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上于30-37℃厭氧培養(yǎng)24-48小時;(4)將步驟(3)培養(yǎng)的兩株兼性需氧菌分別接種于20-50ml液體種子培養(yǎng)基上于28℃和37℃好氧培養(yǎng)18-24小時;將步驟(3)培養(yǎng)的厭氧菌分別接種于20-50ml液體種子養(yǎng)基上于30-37℃厭氧培養(yǎng)20-36小時;(5)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基500-2000ml裝于發(fā)酵罐中,121℃滅菌20-30分鐘。將上述四種菌的種子液,按總接種量5-20%同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,各菌接種比例為1-3∶1-3∶1-3∶1-3,混合均勻后于37℃連續(xù)發(fā)酵2-5天;(6)采用氣相色譜儀檢測氫氣含量,以氬氣為載氣,進(jìn)樣量為500μl,以外標(biāo)法計算氫含量,收集并測定總氣體體積。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)采用的四種菌株具有繁殖速度快,生長旺盛,產(chǎn)氫能力強等特點;(2)采用多菌種聯(lián)合發(fā)酵法,利用這四種菌株間的協(xié)同作用,發(fā)酵過程中首先利用兼性需氧菌生長過程中對氧氣的需要和消耗,為厭氧菌創(chuàng)造一個比較好的厭氧環(huán)境,同時,兼性需氧菌的代謝產(chǎn)物為厭氧菌的生長提供了一定的物質(zhì)基礎(chǔ),接著包括兩種嚴(yán)格厭氧菌在內(nèi)的四種菌株開始發(fā)酵產(chǎn)氫;(3)四種菌株在厭氧條件下聯(lián)合發(fā)酵產(chǎn)氫,比單一菌種發(fā)酵產(chǎn)氫量高;(4)四種菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)生的氣體只有氫氣和二氧化碳,從而便于大量地分離和收集氫氣。
其中Fildes solution的配制為生理鹽水150ml,濃鹽水6ml,脫纖維馬血液50ml,胃蛋白酶(1∶10,000,Difco)1g,將上述成分250ml混合,55℃恒溫水浴10小時保持消化,加20%氫氧化鈉溶液12ml調(diào)整pH為7.6(用鹽酸或氫氧化鈉修正),加2ml氯仿后4℃冷藏保存。
其中Salts solution的配制為無水CaCl20.2g,KH2PO41g,MgSO40.2g,K2HPO41g,NaCl 2g,NaHCO310g,蒸餾水100ml。先將CaCl2、MgSO4在300ml蒸餾水中溶解,然后邊攪拌邊添加蒸餾水至500ml,再將其他鹽類加入,待完全溶解后,再添加200ml蒸餾水,混合后在4℃冷藏保存。
其中微量元素溶液的配制為在1L培養(yǎng)基中加入生物素0.2mg,對氨基苯甲酸2mg,維生素B12mg,維生素B12 0.2mg,泛酸鈣2mg,尼克酸2mg,鹽酸吡哆醛2mg,葉酸0.5mg。
2、配制液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其成分及配制方法同種子培養(yǎng)基。
3、發(fā)酵工藝(1)將麥芽糖假絲酵母2.1376和產(chǎn)氣腸桿菌1.2021分別接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上,分別于28℃和37℃好氧培養(yǎng)24小時,將丁酸梭菌1.209和1.335分別接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上于37℃厭氧培養(yǎng)48小時;(2)將麥芽糖假絲酵母2.1376和產(chǎn)氣腸桿菌1.2021分別接種于20ml液體種子培養(yǎng)基上于28℃和37℃好氧培養(yǎng)18小時,將丁酸梭菌1.209和1.335分別接種于20ml液體種子養(yǎng)基上于37℃厭氧培養(yǎng)24小時;(3)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基1500ml裝于發(fā)酵罐中,121℃滅菌30分鐘,將上述四種菌種的種子液,按總接種量10%同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,各菌接種比例為1∶1∶1∶1,混合均勻后于37℃連續(xù)發(fā)酵2天,每隔6小時取樣一次,測定產(chǎn)氫量,收集并測定總氣體體積;(4)采用GC-9790氣相色譜儀檢測氫氣含量,以氬氣為載氣,進(jìn)樣量為50μl,以外標(biāo)法計算氫含量;連續(xù)發(fā)酵時間48小時,代謝產(chǎn)生的氣體只有氫氣和二氧化碳,總共收集取得氣體3.6L,其中氫氣產(chǎn)生量約0.76L,氫氣平均濃度約為21%。
實施例2發(fā)酵工藝中,四種菌種的種子液按總接種量5%同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,各菌種比例為1∶2∶2∶1,連續(xù)發(fā)酵5天,其余同實施例1。
實施例3四種菌種的種子液按總接種量20%同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,各菌種比例為3∶1∶2∶3,連續(xù)發(fā)酵3天,其余同實施例1。
比較例(1)將丁酸梭菌1.209和1.335分別接種于新鮮斜面培養(yǎng)基上于37℃厭氧培養(yǎng)48小時;(2)將丁酸梭菌1.209和1.335分別接種于20ml液體種子養(yǎng)基上于37℃厭氧培養(yǎng)24小時;(3)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基1500ml裝于發(fā)酵罐中,121℃滅菌30分鐘,將上述菌種的種子液,按總接種量10%同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,混合均勻后于37℃連續(xù)發(fā)酵2天,每隔6小時取樣一次,測定產(chǎn)氫量,收集并測定總氣體體積;(4)采用GC-9790氣相色譜儀檢測氫氣含量,以氬氣為載氣,進(jìn)樣量為50μl,以外標(biāo)法計算氫含量;連續(xù)發(fā)酵時間48小時,代謝產(chǎn)生的氣體只有氫氣和二氧化碳,總共收集取得氣體0.9L,其中氫氣產(chǎn)生量約0.036L,氫氣平均濃度約為4.0%。
權(quán)利要求
1.一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,采用兩株厭氧菌丁酸梭菌1.209和1.335以及兩株兼性需氧菌麥芽糖假絲酵母2.1376和產(chǎn)氣腸桿菌1.2021,并以PYFG培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加微量元素溶液配制成種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基,其特征在于,制備氫氣的步驟如下(1)將兩株兼性需氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行好氧培養(yǎng);將兩株厭氧菌分別接種于斜面培養(yǎng)基上,進(jìn)行厭氧培養(yǎng);(2)將步驟(1)培養(yǎng)的兩株兼性需氧菌分別接種于液體種子培養(yǎng)基上好氧培養(yǎng);將步驟(1)培養(yǎng)的厭氧菌分別接種于液體種子養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng);(3)將液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝于發(fā)酵罐中,滅菌,將上述四種菌的種子液同時加入到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中,混合均勻后發(fā)酵產(chǎn)氫。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,其特征在于,步驟(1)中好氧培養(yǎng)的條件是,培養(yǎng)溫度分別為28℃和37℃,培養(yǎng)時間18-24小時;厭氧培養(yǎng)的條件是,培養(yǎng)溫度為30-37℃,培養(yǎng)時間24-48小時。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,其特征在于,步驟(2)中接種的液體種子培養(yǎng)基的體積均為20-50ml,好氧培養(yǎng)的條件為,培養(yǎng)溫度分別為28℃和37℃,培養(yǎng)時間18-24小時;厭氧培養(yǎng)的條件為,培養(yǎng)溫度為30-37℃,培養(yǎng)時間20-36小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,其特征在于,步驟(3)中裝于發(fā)酵罐中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的四種菌的種子液加入量為總接種量5-20%,各菌接種比例為1-3∶1-3∶1-3∶1-3,發(fā)酵溫度為37℃,時間為2-5天。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,其特征在于,步驟(3)進(jìn)行發(fā)酵后后采用氣相色譜儀檢測氫氣含量。
全文摘要
一種由多菌株聯(lián)合液態(tài)發(fā)酵制備氫氣的方法,采用四種菌株,其中兩株厭氧菌,兩株兼性需氧菌;以PYFG培養(yǎng)基為基礎(chǔ),添加微量元素制得種子培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基;將培養(yǎng)的四種菌株同時加入到裝有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中,連續(xù)發(fā)酵數(shù)天;采用氣相色譜儀檢測氫氣含量,以氬氣為載氣,以外標(biāo)法計算氫含量,收集并測定總氣體體積。
文檔編號C12P3/00GK1403578SQ01142019
公開日2003年3月19日 申請日期2001年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月6日
發(fā)明者李雪駝, 劉波, 王海巖, 徐和利, 趙靜玫, 孫艷 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
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