專利名稱：多核苷酸序列變異的微陣列型分析的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)參者本申請(qǐng)要求于2000年3月22日遞交的臨時(shí)申請(qǐng)60/191,356的優(yōu)先權(quán)。
近年來(lái)，基于雜合寡聚核苷酸陣列(DNA芯片)已完成了大規(guī)模序列實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的目的是研究基于種群的基因變異，如單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。例如，美國(guó)專利5837832(Chee等)中闡述了包含四組探針陣列的DNA芯片，其中每一組都與其他各組在一個(gè)核苷酸位點(diǎn)上有所不同。目標(biāo)靶聚核苷酸與DNA芯片雜合，并且根據(jù)靶聚核苷酸的優(yōu)選程度和與分散的探針位置的雜合程度來(lái)檢測(cè)特定的序列變異。美國(guó)專利5861242(Chee等)也使用了相同的技術(shù)來(lái)分析各種HIV病毒的DNA序列。
現(xiàn)在的雜合型序列變異檢測(cè)法存在著一些問(wèn)題，因而限制了其應(yīng)用。參見(jiàn)Hacia的文章(Nature Genetics Supp.2142-47)例如，雜合檢測(cè)法的精確度較差，阻礙了它在雜合突變篩選中的應(yīng)用。應(yīng)用在任意兩種序列中的相同實(shí)驗(yàn)方法可能產(chǎn)生有完全不同的精確度的結(jié)果。雜合型突變分析的這種假陰性錯(cuò)誤率需要得到改進(jìn)。由于這種雜合型方法也受由一個(gè)核苷酸引起的雜合差異阻礙，這種雜合型序列分析的專一性也可能明顯受到靶多核苷酸變異和雜合條件變化的影響。當(dāng)靶多核苷酸在樣品中含量較少時(shí)，雜合型突變檢測(cè)就更加不可取。
小劑量基因材料的檢測(cè)為生物學(xué)研究和臨床診斷提出了較大挑戰(zhàn)。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為特定聚核苷酸序列的體外擴(kuò)增提供了有力的工具，這些序列例如基因組DNA，單鏈cDNA或mRNA，并且這種方法具有高靈敏性和專一性。這種方法的一種應(yīng)用即擴(kuò)增來(lái)自于如環(huán)境、食品和藥物源等的生物樣品中的靶基因序列，以識(shí)別樣品中引起疾病的污染或指示微生物的存在。
因而，就需要開(kāi)發(fā)用來(lái)分析序列變異的具有高精確度和高敏感性的方法。
一方面，本發(fā)明提供了檢測(cè)存在于靶聚核苷酸和參照序列之間序列變異的方法，包括單堿基或多堿基替代、缺失或插入和其他更復(fù)雜的變異。此方法將多組低聚核苷酸引物固定到一固相支持物上，構(gòu)成陣列，每一組低聚核苷酸引物用來(lái)延伸參照序列的一個(gè)特定區(qū)域，占據(jù)陣列的一個(gè)非連續(xù)的區(qū)域，并且每一組包含至少四組引物1)第一組完全與參照序列互補(bǔ)；2)其他三組引物除在3’端的核苷酸各不相同外，其余部分與第一組引物是相同的。本發(fā)明的陣列可使用于聚核酶擴(kuò)增反應(yīng)，在反應(yīng)中靶聚核苷酸作為模板來(lái)合成可檢測(cè)的新生多核苷酸，此新生核苷酸是由與靶聚核苷酸完全互補(bǔ)的適當(dāng)引物擴(kuò)增來(lái)的。這些被固定的引物可以在一固相支持物上“原位”雜合并擴(kuò)增靶聚核苷酸的某些特定區(qū)域。在每一引物位置的新生鏈由于其在擴(kuò)增過(guò)程中已插入標(biāo)記物，因此在數(shù)量上是可以檢測(cè)的。在一優(yōu)選實(shí)施例中本發(fā)明的實(shí)際擴(kuò)增方法是PCR。處于固相支持物上的微陣列可能包含大約100,000組引物。同樣的，本方法可用于檢測(cè)靶聚核苷酸大約100,000個(gè)不同的區(qū)域。在大部分應(yīng)用中，雖然清楚存在于支持物上的組數(shù)是沒(méi)有下限的，大家都希望有高的組數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，單獨(dú)用一個(gè)固定的引物來(lái)作靶聚核苷酸的非對(duì)稱PCR，這就造成要在每一個(gè)適當(dāng)?shù)囊镂恢眠B接一個(gè)單獨(dú)的互補(bǔ)鏈到固相載體上，并用插入到鏈中的標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行可見(jiàn)的檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施例，每一靶聚核苷酸的另一引物存在于溶液中，以便于靶聚核苷酸的兩條鏈能夠?qū)ΨQ的合成并留在每一個(gè)引物位點(diǎn)，用于增強(qiáng)檢測(cè)。
本發(fā)明能用來(lái)通過(guò)與參照序列對(duì)比來(lái)檢測(cè)存在于單靶聚核苷酸中的序列變異，在這種情況下，本發(fā)明的DNA陣列包含多組與以上描述的參照序列相應(yīng)和/或有關(guān)的引物。或者，當(dāng)與一個(gè)或許多參照序列對(duì)比時(shí)，本發(fā)明同時(shí)也可用來(lái)檢測(cè)多靶聚核苷酸的序列變異。此靶聚核苷酸可能在結(jié)構(gòu)上相關(guān)或無(wú)關(guān)。當(dāng)非同源序列多靶聚核苷酸根據(jù)本發(fā)明被檢測(cè)時(shí)，將DNA微陣列分成不同區(qū)域，每一區(qū)域都有一特定參照序列與一個(gè)特定靶聚核苷酸相對(duì)應(yīng)。多組引物粘附在該區(qū)域內(nèi)的固定支持物上，每一組被用來(lái)延伸參照序列的一個(gè)特定區(qū)域。如同在單靶聚核苷酸的情況下，每一組包含至少四組引物1)第一組完全與參照序列互補(bǔ)；2)其他三組引物除在3’端的核苷酸各不相同外，其余部分與第一組引物是相同的。
本發(fā)明還提供了試劑盒，使用于前面提到的對(duì)稱PCR或非對(duì)稱PCR方法，用來(lái)檢測(cè)靶聚核苷酸的序列變異。這種試劑盒包括一個(gè)PCR引物的微陣列和其他PCR反應(yīng)、檢測(cè)所需的試劑。此引物微陣列可能包括與特定參照序列對(duì)應(yīng)的100,000個(gè)引物組。在本發(fā)明的一種實(shí)施例中，此試劑盒還包括能在PCR反應(yīng)中插入到合成鏈中的標(biāo)記核苷酸。
本發(fā)明實(shí)施方式本發(fā)明為適應(yīng)高處理量提供了新方法和組分，使靶聚核苷酸序列變異的擴(kuò)增和檢測(cè)敏感度高而簡(jiǎn)單。本發(fā)明能用于多種基因組分析，這些基因組分析可用于基礎(chǔ)生物研究和醫(yī)學(xué)診斷和治療。
本發(fā)明基于PCR合成和多核苷酸陣列技術(shù)的新組合。本發(fā)明的基本原理是在模板和相應(yīng)引物的3’端的單核苷酸錯(cuò)配會(huì)嚴(yán)重阻礙新生鏈的延長(zhǎng)。因而，靶聚核苷酸只能在引物與靶序列完全相配的位點(diǎn)上進(jìn)行擴(kuò)增。引物制備和PCR擴(kuò)增方法的某些方面是與在懸而未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/173,618(申請(qǐng)日為1999年12月29日)和美國(guó)專利5837832(Chee等)中所描述的方式是相同。以上專利在此處作為參考被引用。A.定義“多核苷酸”是任何長(zhǎng)度核苷酸不論核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸的聚合形式。這個(gè)詞僅指分子的初級(jí)結(jié)構(gòu)。因此，這個(gè)詞包含雙鏈和單鏈DNA和RNA。它也包括已知的修飾類(lèi)型，例如，已有技術(shù)的標(biāo)記物，甲基化，“帽(caps)”，一種或更多天然核苷酸被其類(lèi)似物替代；核苷酸間修飾，例如，不帶電鍵合(如硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)的，包括懸垂部分例如蛋白質(zhì)(包括如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等)的，帶嵌入劑的(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)，那些包含螯合劑的(例如，金屬、放射性元素等)，那些包含烷基取代物的，那些帶有修飾鍵合(例如，α-異核酸等)；還有聚核苷酸的非修飾形式。
“引物”這個(gè)詞在此處用來(lái)指能作為多核苷酸合成的起始位點(diǎn)的寡聚核苷酸，當(dāng)該引物被置于一定條件下時(shí)合成會(huì)沿著一條互補(bǔ)鏈進(jìn)行，該條件可催化與多聚核苷酸互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成。這些條件包括四種不同的核苷酸三磷酸鹽或核苷類(lèi)似物；一種或多種用來(lái)聚合的試劑，例如DNA聚合酶，和/或逆轉(zhuǎn)錄酶，這些試劑存在于一種適合的緩沖液中(緩沖液包含輔因子替代物，或?qū)H值、離子強(qiáng)度有作用的物質(zhì)等)；并處于合適的溫度下。引物必須足夠長(zhǎng)，當(dāng)存在聚合酶時(shí)可引起擴(kuò)增產(chǎn)物的合成。典型的引物在長(zhǎng)度上至少包括5個(gè)與靶序列很大程度互補(bǔ)的核苷酸，但優(yōu)選稍長(zhǎng)的引物。一般引物包含15-26個(gè)核苷酸，有時(shí)也可以用長(zhǎng)度高達(dá)35個(gè)核苷酸的引物。
引物中總是含有與靶序列在很大程度上互補(bǔ)的序列，也就是將要擴(kuò)增的能退火的特定序列。有時(shí)引物還可能含有啟動(dòng)子序列?！皢?dòng)子序列”此處是指被RNA聚合酶特定識(shí)別的核酸序列單鏈，RNA聚合酶連接在一個(gè)被識(shí)別序列上，啟動(dòng)RNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程并產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物。一般的，可使用任意啟動(dòng)子序列，只要現(xiàn)已知且可獲得的聚合物能夠識(shí)別其起始序列即可。已知有用的啟動(dòng)子是那些可被某些噬菌體，例如噬菌體T3，T7或SP6的聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子。
在此處，“標(biāo)志”、“序列標(biāo)志”或“引物標(biāo)志序列”是指有特定核酸序列的低聚核苷酸，此特定核酸能用來(lái)給含有此標(biāo)記的一組多核苷酸做出標(biāo)志。來(lái)自于同樣生物源的多核苷酸用特定序列的標(biāo)記物共價(jià)地標(biāo)記，以便可在以后的分析中，這樣的多核苷酸能根據(jù)它的來(lái)源識(shí)別它。此序列標(biāo)志物也能作為核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物。
“微陣列”是指優(yōu)選不連續(xù)區(qū)域的線性或二維陣列，每個(gè)區(qū)都有一個(gè)確定的區(qū)域形成于固體支持物的表面上。微陣列上的非連續(xù)區(qū)的密度由位于獨(dú)立固相支持物表面上的待檢靶聚核苷酸的總數(shù)決定，優(yōu)選至少大約50/cm2，較優(yōu)選至少大約100/cm2，更優(yōu)選至少大約500/cm2，至少大約1,000/cm2也是優(yōu)選的。此處，DNA微陣列是指低聚核苷酸引物陣列，該陣列位于用來(lái)擴(kuò)增或克隆靶聚核苷酸的芯片或其他表面上。由于陣列上每一個(gè)特定引物組的位置是已知的，靶聚核苷酸就能通過(guò)它們連接在微陣列上的特定位置來(lái)識(shí)別。
“連接物”是含有限定位點(diǎn)的合成低聚脫氧核糖核苷酸。連接物可以平端連接到DNA片段的末端形成限定位點(diǎn)，用來(lái)在隨后將片段克隆到載體分子中。
“標(biāo)記物”這個(gè)詞是指能產(chǎn)生顯示靶聚核苷酸存在于樣品陣列中的檢測(cè)標(biāo)志的組分。合適的標(biāo)記物包括放射性同位素，核酸發(fā)色團(tuán)，酶，底物，熒光分子，化學(xué)發(fā)光組分，磁組分，生物發(fā)光組分等。例如，標(biāo)記物是任何可通過(guò)分光、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電、光學(xué)、化學(xué)的方式檢測(cè)的組分。
“支持物”是指常規(guī)支持物，例如珠狀物、微粒、探測(cè)條、纖維、濾紙、膜、和硅烷或硅酸鹽的支持物如玻璃滑片。
“擴(kuò)增”用來(lái)泛指產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，可能包括例如外加靶分子，靶類(lèi)似分子，與靶分子互補(bǔ)的分子，它產(chǎn)生于存在于樣品中的靶分子。在靶分子是核酸的情況下，擴(kuò)增產(chǎn)物可由利用DNA或RNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶的酶學(xué)方法產(chǎn)生。
此處，“生物樣品”是指從個(gè)體分離的組織或體液，不僅包括如血液，血漿，血清，脊柱液，淋巴液，皮膚外表層，呼吸、腸道、和泌尿生殖器的切片，淚液，唾液、乳液，細(xì)胞(包括但不限于血細(xì)胞)，腫瘤，器官，還包括體外細(xì)胞培養(yǎng)組分。
“生物源”此處是指產(chǎn)生靶聚核苷酸的來(lái)源。此來(lái)源可以是上述“樣品”的任何形式，不僅包括細(xì)胞、組織或體液?！安煌纳镌础笨梢灾竿粋€(gè)體的不同細(xì)胞/組織/器官，或同一種族不同個(gè)體的細(xì)胞/組織/器官，或不同種族的細(xì)胞/組織/器官。B.參照序列的選擇本發(fā)明能用來(lái)比較靶聚核苷酸和一個(gè)特定參照序列。靶聚核苷酸包含參照序列本身或它的衍生物。所選擇的參照序列可以來(lái)自于任何生物源，不僅僅包括細(xì)胞、組織或體液。參照序列和靶聚核苷酸可以是不同源的。優(yōu)選的，參照序列和靶聚核苷酸來(lái)源于同一種族的不同個(gè)體，或同一種族的不同種群。
參照序列可能含有來(lái)自于特定生物源目標(biāo)基因的至少一部分。優(yōu)選的，本發(fā)明的參照序列占有一個(gè)區(qū)域，已知在此區(qū)域上至少一個(gè)特定核酸位置與某基因的一定功能性有關(guān)。例如，此位點(diǎn)可能是某個(gè)編碼酶的基因的活性位點(diǎn)，該位點(diǎn)的一個(gè)點(diǎn)突變將導(dǎo)致酶活性的喪失。此位點(diǎn)也可以是細(xì)菌基因組的抗藥位點(diǎn)，在此點(diǎn)上野生型基因的核酸替代引起細(xì)菌對(duì)某些抗生素的抗藥性。參照序列也可能包含生物源的全基因組。例如，一種HIV株的全基因組可用來(lái)作為參照序列識(shí)別不同HIV株的序列變異。
參照序列可來(lái)自于特定人群的個(gè)體代表，并用來(lái)識(shí)別不同種群的SNPs。不同人群可以是不同性別、年齡、種族，也可來(lái)自不同地理區(qū)域，和不同家族。優(yōu)選的，參照序列選作代表某人群的一定識(shí)別特性或表型。關(guān)于識(shí)別序列變異和表型特性的相互聯(lián)系的進(jìn)一步研究應(yīng)在種群基因連接或某些疾病的基因基礎(chǔ)方面提供知識(shí)。
參考序列可以是任意長(zhǎng)度，常常在5、10、20、50、100、500、1000、5000或10,000個(gè)堿基之間選擇。參照序列本身可以含有與野生型基因相比的變異序列，只要變異位于對(duì)本發(fā)明目的有重要作用的區(qū)域之外就可。參照序列可以從任意序列源中取得，例如公眾容易獲得的或商業(yè)上可得到的序列庫(kù)。C.低聚核苷酸引物陣列的設(shè)計(jì)1.選擇引物本發(fā)明提供了一種含固相化了的、單獨(dú)的低聚核苷酸引物組的固相支持物。每一引物組與含有參照序列的特定區(qū)域相對(duì)應(yīng)，并包含至少四組引物第一組完全與參照序列的特定區(qū)域互補(bǔ)；其他三組引物除在3’最末端的核苷酸各不相同外，與第一組引物是相同的。例如，對(duì)參照序列中的一個(gè)核苷酸A，第一組中的相應(yīng)引物在其3’最末端有一個(gè)T，而其他三組引物在它們的3’端則是A、C、或，G，即每一組都有一個(gè)不同的核苷酸。雖不是必須，但四組引物的長(zhǎng)度最好是相同的。可以用例如標(biāo)準(zhǔn)PCR引物選擇程序來(lái)選擇或設(shè)計(jì)引物，如麻省理工大學(xué)設(shè)計(jì)的Primer3。
固相支持物大約5-100μm2，在此區(qū)域上大約可將約100,000組引物根據(jù)預(yù)定方式固定在不連續(xù)區(qū)上。準(zhǔn)備好的固相支持物可以有在支持物上任意給定區(qū)域上的引物或引物對(duì)序列的書(shū)寫(xiě)版或電子記錄，并且因此擴(kuò)增的靶在支持物上的位置也可以被識(shí)別。
每一組上與參照序列特定區(qū)域相對(duì)應(yīng)的引物數(shù)量由微陣列上隨后的計(jì)劃擴(kuò)增反應(yīng)的需要決定和限制。這樣，例如，微陣列特定位置上引導(dǎo)PCR所必需的引物的數(shù)量與尤其以下因素有關(guān)，反應(yīng)體積，所需要的靶模板聚核苷酸分子的數(shù)量，建議的PCR循環(huán)的次數(shù)，這些都可幫助決定準(zhǔn)確有多少低聚核苷酸引物在支持物的每一區(qū)域上組成引物組來(lái)確保反應(yīng)的順利進(jìn)行。優(yōu)選的，引物數(shù)量(也就是引物分子數(shù)或引物濃度)應(yīng)與固相支持物上每一給定區(qū)域大致相同(例如，在一DNA微陣列版面上有1000-10,000以至100,000組引物來(lái)擴(kuò)增或檢測(cè)大約100,000個(gè)靶聚核苷酸的區(qū)域)。
固相支持物可用具有特定用途的引物序列制備，該特定用途取決個(gè)待檢多聚核苷酸。對(duì)特定PCR低聚核苷酸引物可以是任意適宜長(zhǎng)度，此處特別應(yīng)考慮將擴(kuò)增的靶多核苷酸的序列和特性。如引物可是4-30個(gè)核酸長(zhǎng)度。
本發(fā)明中的核酸引物也可以有較小數(shù)量的核酸堿基缺少、添加和/或替代，只要這樣的改變不會(huì)對(duì)產(chǎn)量和產(chǎn)物有明顯的副面影響即可。
低聚核苷酸引物可包括自然產(chǎn)生于核酸中的雜環(huán)堿基(尿嘧啶，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，鳥(niǎo)嘌呤)，也可包括修飾堿基和堿基類(lèi)似物。任何與靶序列雜合的引物能共存的修飾堿基或堿基類(lèi)似物對(duì)本發(fā)明的實(shí)踐是有用的。
引物的糖或配糖部分可含有脫氧核糖、核糖和/或糖的修飾形式，例如，2’-O-烷基核糖。在一優(yōu)選例中，糖部分為2’-脫氧核糖，但任何可與雜合到靶序列上的引物相配的糖部分都可用。
在一個(gè)實(shí)施例中，引物的核苷部分與磷酸二酯主鏈連接，可如現(xiàn)有技術(shù)所熟知的。在另外的實(shí)施例中，核酸間的鍵合可以包括已有技術(shù)中特定的引物雜合相配的鍵合，其中包括，但不僅限于硫代磷酸酯，磷酸甲酯、氨基磺酸酯(例如美國(guó)專利54 7 0967)和聚酰胺(也就是肽核酸)。在(1991)Science 2541497-1500Nielsen等，美國(guó)專利5714331，和(1999)Curr.Opin.Biotechnol.1071-75 Nielsen等，對(duì)肽核酸都有描述。
在特定的實(shí)施例中，引物是嵌合分子；也就是可包含多個(gè)堿基或糖亞基，和/或在同一引物中有多種鍵合。
引物可包含使雜合到靶序列上容易的部分，如本領(lǐng)域公知的，例如嵌入劑和/或微溝連接(minor groove binders)。
堿基、糖、主鏈上核酸間的變異，與引物上任何支鏈(pendantgroup)的存在，應(yīng)以特定序列方式，與引物的連接能力及它的靶序列相配。已知的和將要論述的大量結(jié)構(gòu)修飾可能存在于這些連接中。而且，用來(lái)形成引物的各種雜環(huán)堿基、糖、核苷酸和核酸制備方法，以及特定預(yù)定序列低聚核苷酸的制備在已有技術(shù)中都有說(shuō)明。低聚核苷酸的合成方法在美國(guó)專利5419966中已有論述。
低聚核苷酸引物可設(shè)計(jì)成帶有任意特定外加的部分和序列，這些都可使特定PCR或下面的操作容易一些，如擴(kuò)增靶聚核苷酸的分離。例如，除了與靶聚核苷酸互補(bǔ)的序列外，引物可以包含其他序列。這樣的序列一般是位于引物中靶互補(bǔ)序列的上游(也就是5’端)。例如，當(dāng)含一個(gè)或更多限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(稱為“連接”或“結(jié)合體”)的序列存在于靶互補(bǔ)序列的上游時(shí)，可使擴(kuò)增產(chǎn)物克隆或后續(xù)操作容易。引物中存在的其他有用序列包括那些與后續(xù)引物互補(bǔ)的序列，和那些對(duì)噬菌體RNA聚合酶的啟動(dòng)子起識(shí)別作用的序列，例如，T3 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶和/或SP6 RNA聚合酶。
在本發(fā)明的一種方式中，微陣列引物定義為通過(guò)一種可覆蓋靶聚核苷酸的完整目的區(qū)域的覆蓋方法。例如，第一組引物設(shè)計(jì)成其中每一引物的序列都與目標(biāo)區(qū)域上的5’位置相對(duì)應(yīng)；第二組引物的序列從第一組的核苷酸向本區(qū)域的3’端“移動(dòng)”一個(gè)核苷酸；第三組引物的序列從第二組的核苷酸處向本區(qū)域的3’端“移動(dòng)”一個(gè)核苷酸，等等。理論上，引物組的數(shù)量與目標(biāo)區(qū)域上的核苷酸數(shù)量相同。當(dāng)然，在每一組與該區(qū)域上特定區(qū)域相對(duì)應(yīng)的引物組中，至少有4組如前所述3’端各不相同的引物。當(dāng)根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)多靶聚核苷酸時(shí)，與特定靶聚核苷酸相對(duì)應(yīng)的每一組引物存在于微陣列上的不連續(xù)區(qū)域上。2.固相支持物本發(fā)明的固相支持物可以是任何支持核苷酸雜合和合成的適宜固體材料和結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，固相支持物至少含一個(gè)相當(dāng)堅(jiān)硬的表面，在此表面上可以固定引物和完成PCR反應(yīng)。此固相支持物可由以下材料構(gòu)成，例如，玻璃，合成聚合物，塑料，硬無(wú)孔尼龍或陶瓷制品。其他適宜的固體支持物材料在已有技術(shù)中有論述。固相支持物的尺寸可以是任意標(biāo)準(zhǔn)微陣列尺寸，對(duì)DNA微陣列技術(shù)是有用的，此尺寸應(yīng)適應(yīng)用來(lái)進(jìn)行本發(fā)明的反應(yīng)的特定儀器。用來(lái)固定低聚核苷酸的固相支持物的衍生方法和材料在已有技術(shù)中有描述，例如，美國(guó)專利5919523，此發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容此處作為參考被引用。
固相支持物可以是液體容器的一部分或存在于液體容器中。例如，固相支持物可放置于一帶邊的小室中，因此沿固相支持物的邊就形成一個(gè)封口，以便容納在支持物上發(fā)生的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。在一特定例中，小室矩形支持物的每一側(cè)有壁，以確保PCR混合物保存于支持物上，因此對(duì)于給定的引物所有的表面都是有用的。3.引物固定本發(fā)明的低聚核苷酸引物可使用任何可利用的方式粘附、固定、提供和/或應(yīng)用在固相支持物表面的特定區(qū)域上。例如，可使用影印法(如加拿大Affymetrix，Santa Clara所提供的)應(yīng)用到芯片或固相支持物上的特定區(qū)域中的低聚核苷酸引物中去，如下述美國(guó)專利中所述的，US5919523，US5837832，US5831070，US5770722，以上專利在此處作為參考被引用。用Brown和Shalon在美國(guó)專利5807522(1998)中描述的方式也可將低聚核苷酸引物固定到固相支持物上。在固相支持物上固定引物可使用機(jī)器人系統(tǒng)，如由Genetic MicroSystems(Woburn，MA)，GeneMachines(San Carlos，CA)或Cartesian Technologies(Irvine，CA)制造的系統(tǒng)。D.檢測(cè)靶聚核苷酸中的序列變異根據(jù)本發(fā)明的一種方式，進(jìn)行來(lái)自于一種生物樣品的靶多核苷酸的固相擴(kuò)增，在此過(guò)程中多組低聚核苷酸引物固定于一固相載體上。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，一組中的引物至少包括在序列上完全相同的第一組引物，它與靶多核苷酸的指定序列是互補(bǔ)的，能在適宜條件下與靶多核苷酸雜合，并適宜作為核酸合成(也就是鏈延長(zhǎng)或擴(kuò)展)的起始引物。被選擇的覆蓋于參照序列的特定區(qū)域上的引物作為一個(gè)組固定于一固相支持物的非連續(xù)區(qū)域上。優(yōu)選的，組與組之間的距離應(yīng)比用來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的方法的分辨率高。在一優(yōu)選的實(shí)例中，引物固定成為一微陣列或芯片，它們可通過(guò)自動(dòng)的方式來(lái)處理和檢測(cè)。被固定的引物用于適宜條件下靶多核苷酸以核酸擴(kuò)增方式的固相擴(kuò)增。
據(jù)本發(fā)明所述，起始靶多核苷酸是雙鏈，一條鏈為意義鏈(“積極鏈”)一條為互補(bǔ)鏈(“消極鏈”)。在引導(dǎo)擴(kuò)增前，靶多核苷酸已被變性，例如熱變性，由此兩條鏈在反應(yīng)液中被變性和分離。優(yōu)選的，本發(fā)明中所使用的引物相對(duì)于靶多核苷酸的預(yù)計(jì)濃度是大量過(guò)量的，以阻止兩條靶多核苷酸鏈的復(fù)性。或者，起始聚核苷酸引物是一單鏈，也就是一條單鏈DNA或RNA。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，核苷酸的擴(kuò)增由一聚合酶介導(dǎo)。更優(yōu)選的，擴(kuò)增在適宜PCR反應(yīng)的條件下進(jìn)行。如已有技術(shù)中描述的，PCR反應(yīng)一般包括在不同反應(yīng)溫度下進(jìn)行退火一延伸一變性步驟的多個(gè)循環(huán)，在此過(guò)程中初生鏈的多個(gè)復(fù)制體以起始靶多核苷酸作為模板被合成。結(jié)果是，起始靶序列被線形或指數(shù)倍地?cái)U(kuò)增，它取決于PCR反應(yīng)的條件和所受的限制。
根據(jù)本發(fā)明，在PCR反應(yīng)過(guò)程中，固定化的引物陣列與靶聚核苷酸在反應(yīng)混合體系中接觸，若靶多核苷酸是雙鏈則接下來(lái)變性。在退火的適宜條件下，單鏈靶多核苷酸與固定化的單引物雜合，該引物含與單鏈靶多核苷酸指定序列區(qū)互補(bǔ)的序列。在鏈延長(zhǎng)的適宜條件下(包括但不僅限于存在DNA聚合酶和自由核苷酸dNTPs)，每一靶多核苷酸鏈作為初生互補(bǔ)鏈合成的起始模板，合成從初生引物的3’-羥基處啟動(dòng)，延伸至靶模板的5’端。當(dāng)鏈延長(zhǎng)已完成后，改變反應(yīng)條件進(jìn)行變性，在此過(guò)程中，靶鏈和初生鏈分離以便于靶鏈釋放到樣品液中，而初生鏈通過(guò)固相引物保存在固體支持物上。
在本發(fā)明的實(shí)際操作過(guò)程中，固相化的引物可以單獨(dú)使用或者與反應(yīng)液中與初生固相鏈3’端序列互補(bǔ)的引物聯(lián)合使用。而且，液相引物可以是可擴(kuò)增所有靶多核苷酸的通用引物，也可以是特定引物的組合，即引物中每一個(gè)對(duì)特定靶序列都是特有的。
本發(fā)明的一個(gè)方式中，不使用液相引物。因此，上述的起始擴(kuò)增反應(yīng)在每一引物位點(diǎn)產(chǎn)生粘附到固相載體上的初生鏈，它是一單鏈或是與起始靶多核苷酸退火后的鏈，依賴于延長(zhǎng)后是否引用退火步驟。初生鏈的存在可用下面介紹的檢測(cè)方法檢測(cè)。
本發(fā)明的另一方式中，液相引物與固相引物共同使用來(lái)擴(kuò)增多核苷酸。起始擴(kuò)增反應(yīng)之后將進(jìn)行另一擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，在此過(guò)程中先前形成的其3’端與液相引物互補(bǔ)的初生鏈與液相引物退火，并作為第二初生鏈接下來(lái)合成的模板，此初生鏈相當(dāng)大部分與靶多核苷酸相同。作為結(jié)果，形成雙鏈初生多核苷酸并在每一引物位點(diǎn)粘接到固相支持物上。
依照本發(fā)明的目的，靶多核苷酸可以是雙鏈DNA，單鏈DNA或RNA。靶多核苷酸的實(shí)例包括，但不僅限于基因組DNA、cDNA、mRNA、線粒體DNA、病毒DNA、擴(kuò)增DNA和病毒RNA。雙鏈靶多核苷酸要經(jīng)過(guò)擴(kuò)增反應(yīng)起始階段的變性，以提供單鏈模板。
mRNA靶多核苷酸可直接作為經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶介導(dǎo)的擴(kuò)增反應(yīng)的模板。當(dāng)開(kāi)始于每一固定引物位置的鏈延長(zhǎng)完成后，雜合體RNA模板鏈可通過(guò)以下方式破壞，例如RNA酶H，留下初生互補(bǔ)DNA鏈粘接到固相支持物上去。如果第二引物(不論是特定的還是通用的)存在于液相中，第一初生cDNA將作為另一初生鏈合成的模板，因而形成雙鏈初生DNA分子在每一固定引物位置或連接兩固相引物。
或者，樣品中的mRNA靶多核苷酸可首先逆轉(zhuǎn)錄到互補(bǔ)DNA上，此DNA鏈反過(guò)來(lái)又作為本發(fā)明固相PCR反應(yīng)的起始模板。逆轉(zhuǎn)錄可開(kāi)始于，例如根據(jù)本發(fā)明可作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)液相通用引物的聚-T通用引物。起始于多聚-T的cDNA產(chǎn)物在3’端與固定在固相載體上的特定引物退火，并作為模板進(jìn)行下面初生互補(bǔ)鏈在3’端有聚-A序列的合成。經(jīng)變性步驟后，固定化單初生鏈可與液相聚-T通用引物雜合，并作為接下來(lái)PCR擴(kuò)增循環(huán)的模板，并形成粘接到固相載體上的雙鏈初生多核苷酸。
本發(fā)明的靶多核苷酸可來(lái)自于單生物源，或多生物源，例如不同物種或組織。例如，從健康個(gè)體分離的靶多核苷酸群體在PCR反應(yīng)中可與來(lái)自于疾病患者的靶多核苷酸的另一群體混和，在用以上詳細(xì)描述的技術(shù)中檢測(cè)方法識(shí)別兩個(gè)來(lái)源的擴(kuò)增產(chǎn)物。因而，本發(fā)明可用于靶多核苷酸的交叉種群比較分析。5.PCR反應(yīng)在本發(fā)明的實(shí)際操作中，含有適當(dāng)?shù)陌卸嗪塑账岷鸵龑?dǎo)聚合酶鏈接反應(yīng)(PCR)的必須試劑的反應(yīng)混合物與固體載體上的每一固定引物對(duì)或單獨(dú)引物群接觸。合適的靶多核苷酸可以是雙鏈DAN，產(chǎn)生于RNA模板的逆轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA，或mRNA群體。反應(yīng)混合物含有可使與靶序列互補(bǔ)的多核苷酸的合成容易的酶，例如，聚合酶。適宜的聚合酶包括熱穩(wěn)定聚合酶，如Taq DNA聚合酶，Tth1 DNA聚合酶，Vent DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶。反應(yīng)混合物也可含有能在聚合酶鏈接反應(yīng)中插入到初生鏈中去的標(biāo)記分子，以便于在PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物在固相支持物上檢測(cè)。標(biāo)記物可根據(jù)已有方法直接或間接檢測(cè)。直接檢測(cè)的適宜標(biāo)記可以是任意熒光分子，如熒光異硫氰酸鹽，德克薩斯紅，堿性蕊香紅。容易間接檢測(cè)的分子，如生物素、洋地黃毒苷，也能在PCR過(guò)程中插入到初生鏈中。之后生物素可通過(guò)標(biāo)記的鏈霉抗生物素或標(biāo)記的抗生物素抗體檢測(cè)。同樣地，插入洋地黃毒苷可通過(guò)標(biāo)記或不標(biāo)記抗洋地黃毒苷抗體，不標(biāo)記的抗洋地黃毒苷抗體可通過(guò)連接標(biāo)記的抗-抗洋地黃毒苷抗體檢測(cè)出來(lái)。
在編導(dǎo)PCR的試劑與微陣列上的固定化引物接觸后，使用如原位PCR儀的自動(dòng)系統(tǒng)來(lái)將微陣列置于PCR容易發(fā)生的條件中。PCR過(guò)程的反應(yīng)條件可如原位PCR儀器手冊(cè)中介紹的那樣，也可以變化如適應(yīng)給定使用的模板屬性或適應(yīng)引物和模板雜合所可能遇到的任何其他困難。溫度和循環(huán)數(shù)可以如同建議的那樣，與給定引物的選擇和模板序列相適應(yīng)，或任何其他有關(guān)條件。在微陣列上發(fā)生的原位型PCR反應(yīng)基本上已在如下文獻(xiàn)中記述，例如，Embretson等Nature 362359-362(1993)；Gosden等，BioTechniques 15(1)78-80(1993)；Heniford等，Nuc.Acid Res.21(14)3159-3166(1993)；Long等，Histochemistry99151-162(1993)；Nuovo等，PCR Methods and Applications2(4)305-312(1993)；Patterson等，Science260976-979(1993)。6.標(biāo)記和檢測(cè)本發(fā)明的PCR方法用來(lái)檢測(cè)樣品中的多靶聚核苷酸。當(dāng)存在適宜的標(biāo)記試劑使PCR完成后，擴(kuò)增和標(biāo)記了的靶多核苷酸可在微陣列上每一起始引物位置被檢測(cè)出來(lái)。可用以前已使用的檢測(cè)標(biāo)記序列的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增或標(biāo)記靶多核苷酸，包括例如，檢測(cè)已插入到擴(kuò)增或新合成的DNA鏈中去的標(biāo)記物。因此，例如熒光標(biāo)記物或放射性標(biāo)記可以直接檢測(cè)。其他的標(biāo)記技術(shù)可能需要如生物素或洋地黃毒苷的標(biāo)記物在合成過(guò)程中插入DNA中并被已標(biāo)記或連接標(biāo)記物分子本身的抗體或其他連接分子(如鏈霉抗生物素)，例如被標(biāo)記的分子可以是如抗-鏈霉抗生物素的抗體或抗洋地黃毒苷抗體，這些抗體連接到熒光分子上(如熒光異硫氰酸鹽，德克薩斯紅和堿性蕊香紅)或連接到具有酶活性的分子上。不論新合成分子上的標(biāo)記物是什么，也不論標(biāo)記物是直接存在于DNA上還是連接于DNA的附帶分子上(或附帶DNA的附帶分子)標(biāo)記物(如熒光的，酶的，化學(xué)發(fā)光的或比色的標(biāo)記物)可依賴于標(biāo)記物通過(guò)激光掃描儀，CCD照像儀，X-射線膠片或其他適宜的方式來(lái)檢測(cè)。
靶多核苷酸可使用在PCR過(guò)程中將標(biāo)記了的核苷酸(例如dNTP熒光標(biāo)記物來(lái)直接標(biāo)記；dNTP抗生素或dNTP洋地黃毒苷來(lái)間接標(biāo)記)插入到擴(kuò)增DNA中去的方法檢測(cè)。對(duì)于間接標(biāo)記DNA，檢測(cè)通過(guò)熒光物或其他酶連接的鏈霉抗生素或抗洋地黃毒苷抗體的方式實(shí)行的。PCR方法包括通過(guò)檢測(cè)插入到新合成的與靶多核苷酸互補(bǔ)的鏈中標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)多核苷酸。為此目的，任何能在DNA合成時(shí)插入到其中去的標(biāo)記物都可以被使用，例如，如上所述的熒光dNTP，生物素dNTP，洋地黃毒苷-dNTP。在溶液中使用一個(gè)或多個(gè)通用引物引導(dǎo)的PCR擴(kuò)增為檢測(cè)固相支持物上某區(qū)域的擴(kuò)增靶提供了選擇，此方法通過(guò)檢測(cè)通用引物。因而，在使用多個(gè)通用引物處，來(lái)自于不同源的靶鏈在固相支持物上可特異性地檢測(cè)。
在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，來(lái)自不同生物源的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過(guò)對(duì)基于它們?cè)吹臄U(kuò)增鏈的不同標(biāo)記來(lái)檢測(cè)，如“C.來(lái)自于不同生物源的基因的不同表達(dá)比較”描述的那樣。在一種方式中，此處所用的檢測(cè)方法與單源靶的檢測(cè)方法不同之處在于，在溶液中將不同標(biāo)記物(例如紅染料[red dye]和綠染料[green dye])預(yù)先插入到引物片段中去，而不是在擴(kuò)增過(guò)程中將引物插入到初生鏈中。或者，除特異引物，第三引物也可在擴(kuò)增過(guò)程中插入到初生鏈中，以便于對(duì)特異表達(dá)對(duì)照的全面敏感性加強(qiáng)了。7.檢測(cè)試劑盒本發(fā)明還提供了用來(lái)實(shí)行本發(fā)明方法的試劑盒。此試劑盒包括，例如用來(lái)檢測(cè)其他情況下在固相支持物上難于檢測(cè)的大多數(shù)靶多核苷酸的材料和試劑。試劑盒還包括固相支持物，對(duì)靶多核苷酸組特定的低聚核苷酸引物，聚合酶鏈反應(yīng)試劑和其他成分，如，DNA合成酶，標(biāo)記材料，和其他緩沖液和洗脫試劑。試劑盒還可能有使用該試劑盒擴(kuò)增固相載體上靶分子的說(shuō)明。試劑盒含有已粘接了引物組的固相支持物，如可擴(kuò)增特定靶多核苷酸的引物，已制備好的固相支持物的設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)如上所述。根據(jù)顧客需要檢測(cè)的靶多核苷酸可將固體載體制成各不相同的試劑盒。試劑盒中也含引導(dǎo)固相載體上PCR所必需的試劑，例如使用原位或固相型PCR，在此過(guò)程中支持物可使用原位型PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。支持物能與PCR試劑接觸。潛在含有多靶聚核苷酸的樣品在反應(yīng)前加入到PCR試劑混合物中。PCR試劑含有常用的PCR緩沖液，熱穩(wěn)定性的聚合酶(如Taq DNA聚合酶)，核苷酸(如dNTPs)，其他成分和標(biāo)記分子(如前面所述的直接或間接標(biāo)記)。固相支持物提供已粘附在其上設(shè)定區(qū)域上的引物。為引導(dǎo)PCR，帶固定化引物的載體與引導(dǎo)PCR的試劑和靶多核苷酸模板在反應(yīng)混合物中接觸，反應(yīng)在PCR(如原位型或固相型PCR)適宜的條件下進(jìn)行。使用試劑盒的說(shuō)明可包括，例如，以上描述的方法過(guò)程的詳細(xì)闡述。試劑盒可用來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增不論單獨(dú)使用固相化引物，或者與液相引物一起使用。D.多靶聚核苷酸的高處理量分析上述擴(kuò)增方法可用于在單獨(dú)的固相載體上進(jìn)行多靶聚核苷酸的高處理量分析。多組引物，不論是以單獨(dú)形式還是以成對(duì)形式固定于固相支持物上以形成預(yù)定形式的微陣列。每一組引物對(duì)應(yīng)于一個(gè)特定的靶多核苷酸并占有微陣列上的一個(gè)不連續(xù)位置。當(dāng)含有或可能含有多靶聚核苷酸的樣品與微陣列在上述PCR反應(yīng)的適宜條件下接觸，每一靶多核苷酸擴(kuò)增并粘接到有互補(bǔ)引物固定的微陣列上的非連續(xù)區(qū)上。
根據(jù)本發(fā)明，可能含有的靶多核苷酸的數(shù)量?jī)H受用于生產(chǎn)和分析的小密集微陣列的可用技術(shù)的限制。例如，使用已知的技術(shù)通過(guò)利用固相載體上不連續(xù)區(qū)的大約100,000組不同的引物對(duì)，可分析單固相載體上的上至大約100,000多核苷酸，在此過(guò)程中使支持物與PCR溶液接觸，樣品至少含有一套引物可檢測(cè)的靶多核苷酸。實(shí)例例1.微陣列上G3PDF基因的PCR檢測(cè)編碼人G3PDH的基因通過(guò)在微陣列上的擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)，這樣的擴(kuò)增可以是引物對(duì)中的二者都固定于載體上的對(duì)稱PCR，也可以是引物對(duì)的一個(gè)被固定而另一個(gè)在溶液中的非對(duì)稱PCR。
基于人G3PDH(hG3PDH)的已知序列，設(shè)計(jì)四組引物用于分析。四組引物除3’端的最后一個(gè)堿基不同外，其余有著與hG3PDH相同的基因序列，而在3’端每一組都有不同核苷酸A、T、C、G。引物在5’端由胺修飾合成以幫助將引物固定在固體支持物上。引物成對(duì)的或單獨(dú)以不同濃度設(shè)置于由Sigma Chemicals公司(St.Louis，MO)購(gòu)置的一硅烷化玻璃載片上。
帶有引物的載片室溫下于飽和NaCl液中過(guò)夜水合化。用4XSSC漂洗水合化的載片5分鐘，然后再用水洗。載片用SurModics公司(Madison，WI)的封閉液在50℃中止15分鐘，然后用水2X漂洗，室溫中干燥。然后載片就可以使用了。
PCR反應(yīng)液的最終濃度為dATP，dGTP，dTTP各200μM，100μM dCTP，100μM生物素-14-dCTP。反應(yīng)液中還含1X Taq反應(yīng)緩沖液(含1.5mM MgCl2)，人G3PDH基因質(zhì)粒作為DNA模板(100ng噬菌粒DNA或500ng單鏈cDNA庫(kù))，2.5單位的Taq聚合酶。70μl反應(yīng)液的組成如下7μl 2mM d3TP(dATP，dGTP，dTTP)12.5μl 0.4mm dCTP12.5μl 0.4mM生物素-14-dCTP7μl 10X反應(yīng)緩沖液(含15mM MgCl2)5μl DNA模板25.5μl 水0.5μl 5單位/μl Taq DNA聚合酶將它們配成總體積為70μl的溶液。
HyBaid容器(HyBaid USA，F(xiàn)ranklin，MA)置于載片上以保證中間有陣列區(qū)，將反應(yīng)液移入容器中，并用塑料蓋密封。PCR儀已預(yù)熱，循環(huán)如下所述開(kāi)始階段 ……94℃5分鐘主循環(huán)(階段1-3)重復(fù)35X-階段1……94℃30秒-階段2……55℃30秒-階段3……72℃30秒最終擴(kuò)展階段 ……72℃7分鐘結(jié)束階段 ……4℃保存PCR完成后，載片于室溫封閉于Bochringer Mannheim公司(Indianapolis，Indiana)的洋地黃毒苷封閉液中30分鐘。用鏈霉抗生物素(5μg/μl)(1∶250稀釋于洋地黃毒苷封閉液)將載片在室溫下振搖染色30分鐘。用洋地黃毒苷洗液將載片在室溫下洗15分鐘，2次。室溫下將載片用洋地黃毒苷封閉液作用30分鐘。
室溫下將載片與第一抗體(兔抗鏈霉抗生物素)作用保溫1小時(shí)，抗體1∶100稀釋于洋地黃毒苷封閉液中。再用洋地黃毒苷洗液于室溫下將載片漂洗15分鐘，2次。室溫下將載片與第二抗體(Cy3共軛羊抗-兔抗抗體)作用保溫30分鐘，抗體1∶100稀釋于洋地黃毒苷封閉液中。再用洋地黃毒苷洗液于室溫下將載片漂洗15分鐘，2次。用基因微系統(tǒng)(Genetic MicroSystems)GMS418的綠光掃描載片。
對(duì)稱PCR的結(jié)果如圖2所示。50ngG3PDH DNA片段當(dāng)作PCR模板，從縱行1至6的引物濃度分別是250，125，62，31，15，7.8pmol/μl。依標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程在有生物素化的dCTP存在下進(jìn)行15個(gè)PCR循環(huán)，用鏈霉抗生物素和Cy3共軛抗體檢測(cè)信號(hào)。顯示的斑點(diǎn)表示此處hG3PDH模板成功擴(kuò)增，在此點(diǎn)處在3’端有殘基的野生型hG3PDH引物被固定。相反地，未發(fā)現(xiàn)靶hG3PDH模板可在有不同3’端核苷酸固定化hG3PDH引物處被檢測(cè)。
說(shuō)明書(shū)中引用的所有出版物和專利申請(qǐng)作為參考插入，如同每一篇出版物和專利申請(qǐng)作為一個(gè)整體都是明確和獨(dú)立的。
上述發(fā)明為清楚理解已詳細(xì)作了闡述和舉例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)發(fā)明所作的一定的改變和修飾在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍和宗旨內(nèi)的。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)與參照序列比較識(shí)別樣品靶多核苷酸的序列變異的方法，該方法包括如下步驟a)將含一組或多組低聚核苷酸引物的陣列與含樣品和試劑的反應(yīng)混合物接觸，該試劑是用來(lái)進(jìn)行聚合酶介導(dǎo)的多核苷酸擴(kuò)增的，其中低聚核苷酸引物陣列通過(guò)低聚核苷酸5’端固定于固相支持物上，而且其中每一組低聚核苷酸引物被選作延伸參照序列的一個(gè)特定的區(qū)域，占據(jù)陣列上的一個(gè)非連續(xù)區(qū)，至少含兩組引物1)第一組與參照序列完全互補(bǔ)；2)其余一組或更多組除了在3’端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的；b)進(jìn)行聚合酶介導(dǎo)的多核苷酸擴(kuò)增，由此靶多核苷酸作為可檢測(cè)的初生多核苷酸合成的模板，該初生多核苷酸是由與靶多核苷酸完全互補(bǔ)的引物組延伸的；c)經(jīng)相應(yīng)固定化引物檢測(cè)捕獲在固相支持物非連續(xù)區(qū)上合成的聚核苷酸的存在；和d)根據(jù)在固定支持物上合成多核苷酸的檢測(cè)型，識(shí)別靶多核苷酸的序列變異。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)混合物還含有多組液相引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中多組液相引物含有通用引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中通用引物是寡聚dT引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中通用引物含T7，T3，和SP6啟動(dòng)子。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中液相多組引物含有每個(gè)有特定序列的多個(gè)引物。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中至少兩個(gè)不同靶多核苷酸來(lái)自于不同生物源。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)混合物含有插入到初生多核苷酸的可檢測(cè)標(biāo)記物，由此使初生多核苷酸可被檢測(cè)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光分子。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物至少是放射性dNTP，熒光dNTP，生物素化dNTP或洋地黃毒苷dNTP中的一種。
11.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物與連接到初生核苷酸上的分子共軛。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物與連接到插入初生聚核苷酸的第二標(biāo)記物的分子共軛。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該陣列至少含大約100-100,000組固定化寡聚核苷酸引物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中該陣列至少含大約1,000組固定化寡聚核苷酸引物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該陣列至少含大約10,000組固定化寡聚核苷酸引物。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中固相支持物由以下所選的材料制成玻璃，塑料，合成聚合物，陶瓷制品和尼龍。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中聚合酶是Taq聚合酶，TthI聚合酶，Vent聚合酶，Pfu聚合酶或其他任何熱穩(wěn)定聚合酶。
18.一種通過(guò)與參照序列比較識(shí)別樣品靶多核苷酸的序列變異的試劑盒，它包括a)由多組固定到固相支持物上的寡聚核苷酸引物組成的陣列，其中每一組寡聚核苷酸引物被選作延伸參照序列的一個(gè)特定的區(qū)域，占據(jù)陣列上的一個(gè)非連續(xù)區(qū)，至少含四組引物1)第一組與參照序列完全互補(bǔ)；2)其余三組除了在3’端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的；b)適宜在陣列上進(jìn)行聚合酶介導(dǎo)的聚核苷酸擴(kuò)增反應(yīng)的試劑；和c)檢測(cè)陣列上擴(kuò)增的聚核苷酸的檢測(cè)工具。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中檢測(cè)工具包括一種在擴(kuò)增反應(yīng)中插入到擴(kuò)增多核苷酸中的可檢測(cè)標(biāo)記物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是熒光分子。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的試劑盒，其中可檢測(cè)的標(biāo)記物是生物素化11-dNTP或洋地黃毒苷dNTP。
22.一種通過(guò)聚合酶介導(dǎo)的多核苷酸擴(kuò)增的參照序列比較，識(shí)別樣品靶多核苷酸的序列變異的陣列，該陣列含有一組或多組固定于固相支持物上不連續(xù)區(qū)內(nèi)的寡聚核苷酸引物，其中寡聚核苷酸引物組被選作延伸參照序列的一個(gè)特定的區(qū)域，每一組包括至少含兩組引物1)第一組與參照序列完全互補(bǔ)；2)其余一組或更多組除了在3’端的核苷酸互不相同外與第一組引物是相同的，由此靶多核苷酸作為可檢測(cè)的初生多核苷酸合成的模板，該初生多核苷酸是由與靶多核苷酸完全互補(bǔ)的引物組延伸的。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該陣列至少含大約100-100,000組固定化寡聚核苷酸引物。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中該陣列至少含大約1,000組固定化寡聚核苷酸引物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中該陣列至少含大約10,000組固定化寡聚核苷酸引物。
26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，聚合物固相支持物由以下所選的材料制成玻璃，塑料，合成樹(shù)脂，陶瓷制品和尼龍。
27.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中該寡聚核苷酸引物陣列適合用來(lái)識(shí)別兩個(gè)或更多靶多核苷酸中的序列變異。
全文摘要
一種用固定于微陣列上的引物進(jìn)行固相聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增的方法，該方法可檢測(cè)靶多核苷酸中的序列變異。此處的方法和組合物可用于研究和臨床應(yīng)用，特別適于目標(biāo)生物樣品基因信息的大規(guī)模分析。
文檔編號(hào)C12M1/00GK1426481SQ01801039
公開(kāi)日2003年6月25日 申請(qǐng)日期2001年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月22日
發(fā)明者于在林, 彭早元, 胡前進(jìn) 申請(qǐng)人:默金有限公司