專(zhuān)利名稱(chēng)：類(lèi)胡蘿卜素色素的制備方法
本發(fā)明的領(lǐng)域
本發(fā)明涉及類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物制備方法。更具體地，本發(fā)明涉及類(lèi)胡蘿卜素化合物如蝦青素、金盞花黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone和adonirubin的制備方法。

背景技術(shù)：
類(lèi)胡蘿卜素化合物是用作飼料添加劑、食品添加劑、藥品等的天然色素。蝦青素作為飼料添加劑尤其有高生產(chǎn)價(jià)值，如用作飼養(yǎng)魚(yú)類(lèi)如鮭、鱒或紅海鯛的顏色改良劑，以及用作安全的天然食品添加劑。同樣，金盞花黃質(zhì)有希望作為食品添加劑、飼料添加劑、藥品等等，如創(chuàng)立其工業(yè)制備方法地話(huà)；而且，β-胡蘿卜素已被用作飼料添加劑、食品添加劑、藥品等等；角黃素已被用作食品添加劑、飼料添加劑、化妝品等等；以及玉米黃質(zhì)已被用作食品添加劑、飼料添加劑等等。而且，其它類(lèi)胡蘿卜素化合物如海膽酮、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone和adonirubin也是有希望作為飼料添加劑、食品添加劑等的。作為制備這些類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法，已知的有化學(xué)合成、用微生物制備及從天然產(chǎn)物中提取。對(duì)蝦青素、角黃素和β-胡蘿卜素而言，化學(xué)合成產(chǎn)品已商品化。
蝦青素存在于魚(yú)類(lèi)如紅海鯛、鮭和鱒魚(yú)及甲殼綱動(dòng)物如蝦、蟹、螯蝦和磷蝦中，且可從中提取獲得。制備蝦青素的微生物的實(shí)例包括紅酵母Phaffia rhodozyma；一種屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的細(xì)菌(Journal of General and Applied Microbiology，15，127，1969)；屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))；橙黃瓊脂桿菌(Agrobacterium aurantiacum)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-184688)；及綠藻Haematococcus pluvialis(Phytochemistry，20，2561，1981)。已知化學(xué)合成方法有β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化(Pure Appl.Chem.57，741，1985)和由C15鏻鹽的合成(Helv.Chim.Acta.64，2436，1981)。
已知角黃素存在于某種蘑菇(Botanical Gazette，112，228-232，1950)及魚(yú)類(lèi)和甲殼綱動(dòng)物(Carotenoids of Marine Organisms，Journal of the Japanese Society of Fisheries Science，1978)。制備角黃素的微生物的實(shí)例包括一種屬于短桿菌屬的微生物(Applied andEnvironmental Microbiology，55(10)，2505，1989)；一種屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)2-138996)；屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))；及橙黃瓊脂桿菌(Biosci.Biotechnol.Biochem.58，1842，1994)。已知的化學(xué)合成方法有β-胡蘿卜素的轉(zhuǎn)化(J.Amer.Chem.Soc.，78，1427，1956)和由一種新型3-氧代-C15鏻鹽的合成(Pure Appl.Chem.，51，875，1979)。
已知金盞花黃質(zhì)存在于魚(yú)類(lèi)如金魚(yú)和鯉魚(yú)中。但認(rèn)為其化學(xué)合成困難，并且所知尚無(wú)制備金盞花黃質(zhì)的工業(yè)方法。制備金盞花黃質(zhì)的微生物的實(shí)例包括分別屬于黃桿菌屬(Flavobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、交替單胞菌屬(Alteromonas)、生絲單胞菌屬(Hyphomonas)和顯核菌屬(Caryophanon)的微生物(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)6-165684)；屬于新菌屬的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào)；及橙黃瓊脂桿菌(Biosci.Biotechnol.Biochem.58，1842，1994)。
已知β-胡蘿卜素的制備方法有由β-芷香酮合成(Pure Appl.Chem.63(1)，45，1979)和從綠色或黃色蔬菜如胡蘿卜、甘薯或南瓜提取(Natural Coloring Agent Handbook，Kohrin(1979)，由Editorial Committeeof Natural Coloring Agent Handbook編輯)。制備β-胡蘿卜素的微生物的實(shí)例包括屬于Dunaliella屬的藻類(lèi)、屬于布拉霉屬(Blakeslea)的真菌(J.Appl.Bacteriol.，70，181，1991)；屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERMBP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))；和橙黃瓊脂桿菌(FEMS Microbiology Letters128，139，1995)。
海膽酮從天然產(chǎn)物如海星如荊冠(crown of thorns)、魚(yú)類(lèi)如紅海鯛的內(nèi)部器官、海膽、甲殼綱動(dòng)物如龍蝦的內(nèi)部器官等提取。制備海膽酮的微生物的實(shí)例包括屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERMBP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))；和橙黃瓊脂桿菌(FEMS Microbiology Letters128，139，1995)。
已知的玉米黃質(zhì)的制備方法有，始于通過(guò)氧代異佛爾酮的不對(duì)稱(chēng)還原得到的光學(xué)活性羥基酮的化學(xué)合成(Pure Appl.Chem.63(1)，45，1991)，和由谷種提取(Biopigments，1974，Asakura Shoten)。制備玉米黃質(zhì)的微生物的例子包括屬于黃桿菌屬的桿菌(Carotenoids，InMicrobial Technology，第二版，卷1，529-544，Academic Press，NewYork)；屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERM BP-4283)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))；和橙黃瓊脂桿菌(FEMS Microbiology Letters 128，139，1995)。
然而，上述制備方法存在各種問(wèn)題。如，合成產(chǎn)物的安全性不能保證；通過(guò)微生物制備的產(chǎn)量低；且從天然產(chǎn)物提取的成本高。如在制備蝦青素時(shí)，從天然產(chǎn)物如磷蝦或螯蝦提取的成本高，因?yàn)槲r青素的含量極低且提取困難。紅酵母Phaffia rhodozyma的生長(zhǎng)速度慢，只能產(chǎn)生少量的蝦青素，且具有堅(jiān)硬的細(xì)胞壁使得蝦青素的提取困難。因此，采用該酵母工業(yè)化制備蝦青素是成問(wèn)題的。綠藻Haematococcus pluvialis也有許多問(wèn)題。它的生長(zhǎng)速度極慢；該微生物很容易被污染；且從中提取蝦青素困難。因此，該微生物的工業(yè)化應(yīng)用是成問(wèn)題的。
屬于一種新菌屬的菌株E-396(FERM BP-4283)和A-581-1(FERMBP-4671)(日本未審查專(zhuān)利公布號(hào)7-79796和8-9964；美國(guó)專(zhuān)利第5,607,839和5,858,761號(hào))有許多優(yōu)點(diǎn)，如高產(chǎn)量、高生長(zhǎng)速度及易提取。然而，由于這些微生物同時(shí)產(chǎn)生了多種類(lèi)胡蘿卜素化合物如蝦青素、金盞花黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone和adonirubin，這些化合物的生成比隨培養(yǎng)基情況而定，因而，難以以穩(wěn)定的比例制備色素。當(dāng)生成的色素混合物作為顏色改進(jìn)劑應(yīng)用于動(dòng)物飼料等時(shí)，顏色改進(jìn)的效果相差很大。這成了應(yīng)用這類(lèi)微生物商業(yè)化生產(chǎn)色素的一個(gè)障礙。
所以，需要一種以恒定的比例穩(wěn)定地制備類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法。
針對(duì)這些情況作出本發(fā)明。本發(fā)明的目的是要控制類(lèi)胡蘿卜素化合物的生成比，并提供一種采取了這種可控、特定比率穩(wěn)定制備類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法。
本發(fā)明的公開(kāi)
作為解決上述問(wèn)題所進(jìn)行的深入與廣泛的研究的結(jié)果，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在制備類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物的培養(yǎng)過(guò)程中適當(dāng)?shù)乜刂婆囵B(yǎng)物中的溶解氧濃度，可控制多種類(lèi)胡蘿卜素化合物的生成比并以可控、特定的比率制備類(lèi)胡蘿卜素化合物。從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
本說(shuō)明書(shū)包括在日本專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?000-175124(本申請(qǐng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)的根據(jù))中的說(shuō)明書(shū)中描述的內(nèi)容和/或圖表。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式
下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
本發(fā)明的方法是采用微生物制備類(lèi)胡蘿卜素化合物。這類(lèi)微生物的實(shí)例包括產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的細(xì)菌、酵母和真菌。這類(lèi)細(xì)菌的一個(gè)實(shí)例是這樣一種細(xì)菌，其中與其16S核蛋白體RNA對(duì)應(yīng)的DNA核苷酸序列與所述核苷酸序列(參見(jiàn)SEQ ID NO1)具有98％或更多的同源性。具體說(shuō)來(lái)有，菌株E-396(FERM BP-4283)和A-581-1(FERMBP-4671)；可通過(guò)突變/改進(jìn)這類(lèi)菌株獲得的各種突變株；以及可被計(jì)數(shù)的這些菌株的相關(guān)種類(lèi)。對(duì)應(yīng)于E-396菌株的16S核蛋白體RNA的核苷酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO1(DNA)，而對(duì)應(yīng)于A(yíng)-581-1菌株的16S核蛋白體RNA的核苷酸序列參見(jiàn)SEQ ID NO2(DNA)。
由于以游動(dòng)性、營(yíng)養(yǎng)缺陷性、糖化物的同化作用等作為依據(jù)的傳統(tǒng)分類(lèi)法存在當(dāng)自然突變等已經(jīng)改變微生物的特征時(shí)微生物會(huì)被錯(cuò)誤鑒別的問(wèn)題，所以，近來(lái)，以16S核蛋白體RNAs的核苷酸序列的同源性為依據(jù)的微生物分類(lèi)法已成為微生物的主要分類(lèi)方法。因?yàn)檫@些核苷酸序列遺傳非常穩(wěn)定，所以以16S核蛋白體RNAs的核苷酸序列的同源性為依據(jù)時(shí)，分類(lèi)法的可靠性顯著提高。E-396菌株和A-581-1菌株的16S核蛋白體RNAs的核苷酸序列的同源性為99.4％。這表明這是一些緊密相關(guān)的菌株。因此這些菌株形成了一組產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的細(xì)菌。E-396菌株和A-581-1菌株以及在本發(fā)明的培養(yǎng)條件下起作用的那些菌株被認(rèn)為是，與作為突變株的E-396菌株或E-396菌株或A-581-1菌株的相關(guān)種類(lèi)的16S核蛋白體RNA的核苷酸序列具有98％或更大同源性的微生物。
下面將描述用于本發(fā)明微生物的具體實(shí)例的E-396菌株。該菌株新近被本發(fā)明者分離出并于1993年4月27日以FERM BP-4283保藏在International Patent Organism Depository，National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。另一微生物的具體實(shí)例是A-581-1菌株(FERM BP-4671)。該菌株新近被本發(fā)明者分離出并于1994年5月20日以FERM BP-4671保藏于International PatentOrganism Depository，National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology(AIST Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)。
根據(jù)本發(fā)明的發(fā)酵方法如下所述。簡(jiǎn)要說(shuō)來(lái)，制備類(lèi)胡蘿卜素的微生物在含有該微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素色素所必需的組分的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
發(fā)酵方法可為傳統(tǒng)的好氣培養(yǎng)，如通氣攪拌培養(yǎng)、泡罩塔培養(yǎng)或流化床培養(yǎng)。優(yōu)選采用通氣攪拌培養(yǎng)。比如，E-396菌株(FERMBP-4283)同時(shí)產(chǎn)生含β-胡蘿卜素、海膽酮、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone、角黃素、玉米黃質(zhì)、adonirubin、金盞花黃質(zhì)和蝦青素的類(lèi)胡蘿卜素化合物。
蝦青素的生物合成法評(píng)估如下。在處于上游的β-胡蘿卜素的兩端的六元環(huán)分別被酮酶和羥化酶所修飾，最終產(chǎn)生蝦青素。然而，觀(guān)察到這樣的現(xiàn)象并非所有的類(lèi)胡蘿卜素化合物都轉(zhuǎn)化成蝦青素，即使延長(zhǎng)發(fā)酵期，且這些化合物的一部分直到發(fā)酵結(jié)束也沒(méi)有發(fā)生轉(zhuǎn)化。另外，這些化合物的生成比隨培養(yǎng)條件而變化。比如，在一種培養(yǎng)條件下，認(rèn)為處于生物合成途徑上游的β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、adonirubin和3-羥基海膽酮的比例高，在另一培養(yǎng)條件下，蝦青素的生成比高；而在另一培養(yǎng)條件下，金盞花黃質(zhì)的生成比高。
因?yàn)樯鲜鲈?，?dāng)生成的色素混合物在動(dòng)物飼料等中用作顏色改進(jìn)劑時(shí)，顏色改進(jìn)效果區(qū)別很大。因此，這種色素混合物不能作為商品出售。這已成為商業(yè)化生產(chǎn)這類(lèi)色素的一個(gè)障礙。作為解決該問(wèn)題的各種研究結(jié)果，本發(fā)明者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)影響色素生產(chǎn)比例的原因是培養(yǎng)物中的溶解氧。已發(fā)現(xiàn)，在以特定的攪拌/旋轉(zhuǎn)速度的攪拌培養(yǎng)中，培養(yǎng)物中的溶解氧濃度受微生物的耗氧速率方面的微妙差別所影響，并因而令色素的生成比隨培養(yǎng)堆而變化。通過(guò)控制培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)物中溶解氧濃度，可控制類(lèi)胡蘿卜素化合物即，β-胡蘿卜素、海膽酮、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone、角黃素、玉米黃質(zhì)、adonirubin、金盞花黃質(zhì)和蝦青素的生成比。
將培養(yǎng)物中的溶解氧濃度調(diào)低，可增加認(rèn)為位于生物合成途徑上游的β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、3-羥基海膽酮和adonirubin的生成比。將培養(yǎng)物中的溶解氧濃度調(diào)至適中水平，可增加蝦青素的生成比。將培養(yǎng)物中的溶解氧濃度調(diào)高，可增加金盞花黃質(zhì)的生成比。
比如，為增加蝦青素的生成比，將培養(yǎng)物中的溶解氧濃度控制在飽和氧濃度的15-40％，優(yōu)選20-30％的范圍內(nèi)。在溶解氧濃度為飽和氧濃度的20-30％的條件下，蝦青素的生成比可提高至40％或更多。
當(dāng)溶解氧濃度為飽和氧濃度的0-15％，優(yōu)選0-10％的范圍內(nèi)時(shí)，β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、3-羥基海膽酮和adonirubin大量積聚，其中蝦青素產(chǎn)出受到抑制。這種條件下，產(chǎn)生的β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、3-羥基海膽酮和adonirubin的總量占全部化合物總得率的60％或更多。因此，蝦青素的生成比可減至40％或更少。
為增加金盞花黃質(zhì)的生成比，將培養(yǎng)物中的溶解氧濃度控制在飽和氧濃度的35-100％，優(yōu)選40-100％的范圍內(nèi)。在這種條件下金盞花黃質(zhì)的生成比可提高到35％或更多。
對(duì)培養(yǎng)期而言，溶解氧濃度在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期是重要的。比如，在該時(shí)期提高溶解氧濃度，金盞花黃質(zhì)的生成比增加，即使后來(lái)溶解氧濃度變低。
可通過(guò)用于微生物培養(yǎng)的傳統(tǒng)方法控制溶解氧的濃度。比如，根據(jù)用溶解氧電極測(cè)定的培養(yǎng)物中溶解氧濃度，通過(guò)自動(dòng)調(diào)整送料至發(fā)酵器的空氣或氧氣的流速來(lái)進(jìn)行所述控制。也可根據(jù)用溶解氧電極測(cè)定的培養(yǎng)物中溶解氧濃度，通過(guò)自動(dòng)調(diào)整葉輪的轉(zhuǎn)速來(lái)進(jìn)行所述控制。
實(shí)施例
下面，參考下列實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的描述。但，本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1
組成為下表1所示的培養(yǎng)基(100ml)被放置在500ml的錐形瓶中并于121℃下蒸汽滅菌15分鐘。將E-396菌株(FERM BP-4283)接種于其中并于28℃下以150轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)下培養(yǎng)一天，接著，將600ml該培養(yǎng)物接種于裝在30L通氣攪拌發(fā)酵器中的20L組成如下表2所示的培養(yǎng)基中，并于28℃下以通氣速率為1.0vvm的需氧條件培養(yǎng)90小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中用20％的NaOH持續(xù)將pH控制在7.2。隨著微生物的生長(zhǎng)會(huì)消耗蔗糖，因此在培養(yǎng)過(guò)程的第1天和第2天分別加入300g蔗糖。通過(guò)聯(lián)鎖葉輪電機(jī)與溶解氧電極并根據(jù)溶解氧的測(cè)定值改變?nèi)~輪的旋轉(zhuǎn)速度，自動(dòng)控制培養(yǎng)物中的溶解氧。最小轉(zhuǎn)速設(shè)為80轉(zhuǎn)/分。
溶解氧濃度為相對(duì)于所用培養(yǎng)基的飽和氧濃度的比值。本實(shí)驗(yàn)中，溶解氧濃度設(shè)為飽和氧濃度的5％、15％、20％、25％、30％和35％。
各種條件下生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物的濃度和比例列于下表4和5(表示這些化合物的字母在表3中進(jìn)行了說(shuō)明)。表1組成 加入量玉米漿 30g/L蔗糖 30g/LKH2PO4 0.54g/LK2HPO4 2.78g/LMgSO4·7H2O12.0g/LCaCl2·2H2O0.1g/LFeSO4·7H2O0.3g/LpH7.2表2組成 加入量玉米漿 30g/L蔗糖 30g/LKH2PO4 1.5g/LNa2HPO4·12H2O3.8g/LMgSO4·7H2O3.0g/LCaCl2·2H2O0.2g/LFeSO4·7H2O1.0g/LpH7.2表3字母化合物A β-胡蘿卜素B 海膽酮C 3-羥基海膽酮D 角黃素E adonirubinF β-隱黃質(zhì)G 蝦青素H asteroidenoneI 金盞花黃質(zhì)J 玉米黃質(zhì)表4
表5前體A+B+C+D+E+F
實(shí)施例2
組成為上表1所示的培養(yǎng)基(100ml)被放置在500ml的錐形瓶中并于121℃下蒸汽滅菌15分鐘。將E-396菌株(FERM BP-4283)接種于其中并于28℃下以150轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)下培養(yǎng)一天，接著，將100ml該培養(yǎng)物接種于裝在5L通氣攪拌發(fā)酵器的2L組成如上表2所示的培養(yǎng)基中，并于28℃下以通氣速率為1.0vvm的需氧條件培養(yǎng)90小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中用20％的NaOH持續(xù)將pH控制在7.2。隨著微生物的生長(zhǎng)會(huì)消耗蔗糖，因此在培養(yǎng)過(guò)程的第1天和第2天分別加入30g蔗糖。通過(guò)聯(lián)鎖葉輪電機(jī)與溶解氧電極并根據(jù)溶解氧的測(cè)定值改變?nèi)~輪的旋轉(zhuǎn)速度，自動(dòng)控制培養(yǎng)物中的溶解氧。最小轉(zhuǎn)速設(shè)為100轉(zhuǎn)/分。溶解氧濃度為相對(duì)于所用培養(yǎng)基的飽和氧濃度的比值。本實(shí)驗(yàn)中，溶解氧濃度設(shè)為飽和氧濃度的25％。
為比較起見(jiàn)，將同樣的菌株在未控制溶解氧的條件下進(jìn)行培養(yǎng)(即，以450轉(zhuǎn)/分的恒定旋轉(zhuǎn)速度進(jìn)行攪拌)。
在各種條件下生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物的濃度列于表6。表6
實(shí)施例3
用NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍)突變E-396菌株(FERM BP-4283)，選擇帶深紅色的菌落。分析這些菌落的培養(yǎng)物中類(lèi)胡蘿卜素化合物，然后選出提高了蝦青素產(chǎn)量的突變克隆Y-1071。組成為上表1所示的培養(yǎng)基(100ml)被放置在500ml的錐形瓶中并于121℃下蒸汽滅菌15分鐘。將Y-1071克隆接種于其中并于28℃下以150轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)下培養(yǎng)一天。
接著，將100ml該培養(yǎng)物接種于裝在5L通氣攪拌發(fā)酵器的2L組成如上表2所示的培養(yǎng)基中，并于28℃下以通氣速率為1.0vvm的需氧條件培養(yǎng)90小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中用20％的NaOH持續(xù)將pH控制在7.2。隨著微生物的生長(zhǎng)會(huì)消耗蔗糖，因此在培養(yǎng)過(guò)程的第1天和第2天分別加入30g蔗糖。通過(guò)聯(lián)鎖葉輪電機(jī)與溶解氧電極并根據(jù)溶解氧的測(cè)定值改變?nèi)~輪的旋轉(zhuǎn)速度，自動(dòng)控制培養(yǎng)物中的溶解氧。最小轉(zhuǎn)速設(shè)為100轉(zhuǎn)/分。
溶解氧濃度為相對(duì)于所用培養(yǎng)基的飽和氧濃度的比值。本實(shí)驗(yàn)中，溶解氧濃度設(shè)為飽和氧濃度的5％、15％、20％、25％、30％和35％。
各種條件下生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物的濃度和比例列于下表7和8。表7表8
實(shí)施例4
組成為上表1所示的培養(yǎng)基(100ml)被放置在500ml的錐形瓶中并于121℃下蒸汽滅菌15分鐘。將A-581-1菌株(FERM BP-4671)接種于其中并于28℃下以150轉(zhuǎn)/分的速度旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)下培養(yǎng)一天。接著，將100ml該培養(yǎng)物接種于裝在5L通氣攪拌發(fā)酵器的2L組成如上表2所示的培養(yǎng)基中，并于28℃下以通氣速率為1.0vvm的需氧條件培養(yǎng)90小時(shí)。培養(yǎng)過(guò)程中用20％的NaOH持續(xù)將pH控制在7.2。隨著微生物的生長(zhǎng)會(huì)消耗蔗糖，因此在培養(yǎng)過(guò)程的第1天和第2天分別加入30g蔗糖。通過(guò)聯(lián)鎖葉輪電機(jī)與溶解氧電極并根據(jù)溶解氧的測(cè)定值改變?nèi)~輪的旋轉(zhuǎn)速度，自動(dòng)控制培養(yǎng)物中的溶解氧。最小轉(zhuǎn)速設(shè)為100轉(zhuǎn)/分。溶解氧濃度為相對(duì)于所用培養(yǎng)基的飽和氧濃度的比值。本實(shí)驗(yàn)中，溶解氧濃度設(shè)為飽和氧濃度的5％、15％、20％、25％、30％和35％。
各種條件下生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物的濃度和比例列于下面表9和表10中。
表9表10
所有的公開(kāi)、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用以參考文獻(xiàn)的形式全文結(jié)合到本說(shuō)明書(shū)中。
工業(yè)適用性
在多種類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物制備方法中，通過(guò)控制培養(yǎng)過(guò)程中的培養(yǎng)物中的溶解氧濃度，可改變生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物的生成比。
序列表<110>日石三菱株式會(huì)社(Nippon Mitsubishi Oil Corporation)<120>類(lèi)胡蘿卜素色素的制備方法<130>PH-1223-PCT<140><141><150>JP 2000-175124<151>2000-06-12<160>2<170>Patentln Ver.2.0<210>1<211>1452<212>DNA<213>未知<220><223>未知生物的描述E-396<400>1agtttgatcc tggctcagaa cgaacgctgg cggcaggctt aacacatgca agtcgagcga 60gaccttcggg tctagcggcg gacgggtgag taacgcgtgg gaacgtgccc ttctctacgg 120aatagccccg ggaaactggg agtaataccg tatacgccct ttgggggaaa gatttatcgg 180agaaggatcg gcccgcgttg gattaggtag ttggtggggt aatggcccac caagccgacg 240atccatagct ggtttgagag gatgatcagc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300ctacgggagg cagcagtggg gaatcttaga caatgggggc aaccctgatc tagccatgcc 360gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa agctctttca gctgggaaga taatgacggt 420accagcagaa gaagccccgg ctaactccgt gccagcagcc gcggtaatac ggagggggct 480agcgttgttc ggaattactg ggcgtaaagc gcacgtaggc ggactggaaa gtcagaggtg 540aaatcccagg gctcaacctt ggaactgcct ttgaaactat cagtctggag ttcgagagag 600gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaggaa caccagtggc 660gaaggcggct cactggctcg atactgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 720attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgaatgc cagacgtcgg caagcatgct 780tgtcggtgtc acacctaacg gattaagcat tccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 840aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 900aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat ggcaggaccg ctggagagat tcagctttct 960cgtaagagac ctgcacacag gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttc 1020ggttaagtcc ggcaacgagc gcaacccacg tccctagttg ccagcaattc agttgggaac 1080tctatggaaa ctgccgatga taagtcggag gaaggtgtgg atgacgtcaa gtcctcatgg 1140gccttacggg ttgggctaca cacgtgctac aatggtggtg acagtgggtt aatccccaaa 1200agccatctca gttcggattg tcctctgcaa ctcgagggca tgaagttgga atcgctagta 1260atcgcggaac agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1320accatgggag ttggttctac ccgacgacgn tgcgctaacc ttcggggggc aggcggccac 1380ggtaggatca gcgactgggg tgaagtcgta acaaggtagc cgtaggggaa cctgcggctg 1440gatcacctcc tt 1452<210>2<211>1426<212>DNA<213>未知<220><223>未知生物的描述A-581-1<400>2tagagtttga tcctggctca gaacgaacgc tggcggcagg cttaacacat gcaagtcgag 60cgagaccttc gggtctagcg gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgtg cccttctcta 120cggaatagcc ccgggaaact gggagtaata ccgtatacgc cctttggggg aaagatttat 180cggagaagga tcggcccgcg ttggattagg tagttggtga ggtaacggct caccaagccg 240acgatccata gctggtttga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga 300ctcctacggg aggcagcagt ggggaatctt agacaatggg ggcaaccctg atctagccat 360gccgcgtgag tgatgaaggc cttagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac 420ggtaccagca gaagaagccc cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg 480gctagcgttg ttcggaatta ctgggcgtaa agcgcacgta ggcggactgg aaagtcagag 540gtgaaatccc agggctcaac cttggaactg cctttgaaac tatcagtctg gagttcgaga 600gaggtgagtg gaattccgag tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt 660ggcgaaggcg gctcactggc tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac 720aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa tgccagacgt cggcaagcat 780gcttgtcggt gtcacaccta acggattaag cattccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga 900agcaacgcgc agaaccttac caacccttga catggcagga ccgctggaga gattcagctt 960tctcgtaaga gacctgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020ttcggttaag tccggcaacg agcgcaaccc acgtccctag ttgccagcat tcagttgggc 1080actctatgga aactgccggt gataagccgg aggaaggtgt ggatgacgtc aagtcctcat 1140ggcccttacg ggttgggcta cacacgtgct acaatggtgg tgacagtggg ttaatcccca 1200aaagccatct cagttcggat tgtcctctgc aactcgaggg catgaagttg gaatcgctag 1260taatcgcgga acagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1320acaccatggg agttggttct acccgacgac gctgcgctaa cccttcgggg aggcaggcgg 1380ccacggtagg atcagcgact ggggtgaagt cgtaacaagg tagcca142權(quán)利要求
1.一種通過(guò)培養(yǎng)可生成多種類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物來(lái)制備類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法，其中所得類(lèi)胡蘿卜素化合物的生成比通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中控制培養(yǎng)物中的溶解氧濃度保持恒定。
2.權(quán)利要求1的方法，其中微生物為一種細(xì)菌，該細(xì)菌中對(duì)應(yīng)于它的16S核蛋白體RNA的DNA核苷酸序列有98％或更多與列于SEQID NO1的核苷酸序列同源。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物選自E-396菌株(FERMBP-4283)和其突變株及A-581-1菌株(FERM BP-4671)和其突變株。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述類(lèi)胡蘿卜素化合物為一種或多種選自蝦青素、金盞花黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone和adonirubin的化合物。
5.一種通過(guò)培養(yǎng)能生成多種類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物來(lái)制備類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法，其中所得類(lèi)胡蘿卜素化合物的生成比通過(guò)在培養(yǎng)過(guò)程中控制培養(yǎng)物的溶解氧濃度來(lái)改變。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物為一種細(xì)菌，在該細(xì)菌中對(duì)應(yīng)于它的16S核蛋白體RNA的DNA核苷酸序列有98％或更多與列于SEQ ID NO1的核苷酸序列同源。
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述微生物選自E-396菌株(FERMBP-4283)和其突變株及A-581-1菌株(FERM BP-4671)和其突變株。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述類(lèi)胡蘿卜素化合物為一種或多種選自蝦青素、金盞花黃質(zhì)、β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、玉米黃質(zhì)、β-隱黃質(zhì)、3-羥基海膽酮、asteroidenone和adonirubin的化合物。
9.權(quán)利要求5的方法，其中在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制培養(yǎng)物的溶解氧濃度在飽和氧濃度的40-100％范圍內(nèi)，提高金盞花黃質(zhì)的生成比。
10.權(quán)利要求5的方法，其中在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制培養(yǎng)物的溶解氧濃度在飽和氧濃度的20-30％范圍內(nèi)，提高蝦青素的生成比。
11.權(quán)利要求5的方法，其中在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制培養(yǎng)物的溶解氧濃度在飽和氧濃度的0-10％范圍內(nèi)，提高β-胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、3-羥基海膽酮和adonirubin的生成比。
全文摘要
多種類(lèi)胡蘿卜素化合物的微生物制備方法,其中所生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物之比不同。在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)控制液態(tài)培養(yǎng)基的溶解氧的濃度,改變這樣生成的類(lèi)胡蘿卜素化合物(蝦青素、金盞花黃質(zhì)、β－胡蘿卜素、海膽酮、角黃素、玉米黃質(zhì)、β－隱黃質(zhì)、3－羥基海膽酮、adonirubin等)之比。
文檔編號(hào)C12P23/00GK1388830SQ0180234
公開(kāi)日2003年1月1日 申請(qǐng)日期2001年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月12日
發(fā)明者坪倉(cāng)章, 水田美能 申請(qǐng)人:日石三菱株式會(huì)社