專利名稱：改進的發(fā)酵方法
背景技術：
本發(fā)明涉及改進的發(fā)酵培養(yǎng)基和使用所述培養(yǎng)基制備脂肪族聚羧酸的方法。
長鏈α、ω-二羧酸類(即那些帶有9個或9個以上碳原子的二羧酸類)被用作合成各種化學產物和聚合物中的原料。
目前在大多數(shù)情況下僅通過非生物轉化方法來生產帶有4個以上碳原子的二酸類。這些類型的用于生產二酸類的化學方法具有許多局限性和缺點。每種方法基于所用原料而限于生產特定碳鏈長度的二酸類。例如，十二烷二酸(dodecandioic acid)法以丁二烯作為原料，由此該反應過程的產物限于具有4的倍數(shù)的鏈長的酸類。此外，該方法基于不可再生的石化原料且多重反應轉化過程產生了不需要的副產物，它們可導致產量損耗、產生重金屬廢物和必須在還原爐中破壞的氧化氮。
用于生產二酸類的生物轉化方法比現(xiàn)存的非生物轉化方法有許多潛在的優(yōu)點。在這些優(yōu)點中最主要的特征是可再生的原料作為起始物質的應用和產生所述二酸而不會形成必須以昂貴方式進行廢物處理加工的有害化學副產物。
通過使用生物方法獲得的另一個重要優(yōu)點在于可以易于將這類方法用于使用相同生物催化劑和相同設備生產各種二酸類。因為目前的有機化學合成法僅適合于生產單一二酸，所以幾種不同二酸的合成需要開發(fā)針對每種二酸的新合成流程。另一方面，可以將酵母生物催化劑用于使用相同設備、培養(yǎng)基和僅通過為所述酵母提供不同底物的方案而生產不同長度的二酸類。
美國專利US6,004,784中公開了一種半合成發(fā)酵培養(yǎng)基，它使用了玉米漿和釀造酵母提取物以便降低含有昂貴、高標準化酵母提取物和酵母氮堿的常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基的成本，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。
與使用這類低廉替代品有關的困難是成倍的。在噴入空氣時它們使得發(fā)酵肉湯散發(fā)出明顯的氣味。在玉米漿和粗酵母提取物中含有的顆粒物質、尤其是結合了高濃度細菌的顆粒物質難以使得它們自身保持無菌并使培養(yǎng)基滅菌設備染菌。這些替代品還含有許多不可代謝的可產生顏色和顏色穩(wěn)定性困難的成分，這些困難 需要使用其它純化步驟來解決并且固然會使產物損耗。對這些替代品進行選擇、同時降低培養(yǎng)基成本的考慮反而又增加了加工成本。因此，對可為維持酵母生物催化劑生長提供營養(yǎng)物的低成本生物發(fā)酵培養(yǎng)基，從而得到高特定產率的聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類存在需求。
盡管長鏈二羧酸類以其未離解或部分鹽形式具有有限的水溶性，但是存在許多必須在含水培養(yǎng)基中處理它們的情況。實例包括用于生產二羧酸類的發(fā)酵和回收方法、界面聚合反應、乳液聚合反應和酶促反應。
處理二羧酸類的含水混懸液易具有高度粘性且因此難以處理。用于制備二羧酸類的發(fā)酵反應中的主要操作問題包括氧的轉運、熱轉移、發(fā)酵肉湯中氣體的維持和各自受到該肉湯流變學特性影響的存在氣體(發(fā)泡)中肉湯的維持。同樣，在用于從發(fā)酵肉湯中回收二羧酸類的過濾方法中，高粘度可導致不實際的濾過率。在聚合反應和酶反應中，粘度對質量轉運的影響因需要具有快速、可預測接觸的試劑而可能成為主要問題。
在DE 29 09 420 A1中，Watanabe等描述了一種在不含細胞的發(fā)酵肉湯中處理長鏈二羧酸類混懸液的方法以便改善濾過率和回收的二酸類的純度。他證實他可以通過在pH4或pH4以下將含水二羧酸混懸液加熱至50℃以上1小時或1小時以上而控制顆粒大小分布和顆粒形態(tài)。他描述了他可以通過使所述顆粒生長至40-50μm的平均顆粒大小而獲得改善的濾過率、使濾餅水分降低而濾餅中二羧酸的純度較高。令人遺憾的是，這種方法對在遇到長鏈二羧酸類含水混懸液的許多應用而言應用有限。
許多發(fā)酵和酶反應在較寬pH范圍和低于50℃下發(fā)生。在許多情況中，在Watanabe等所述的條件下酶和微生物的活性可能降低或受到破壞。涉及二羧酸含水混懸液的界面和乳液聚合反應可能僅限于熱穩(wěn)定性試劑。因此，對控制長鏈二羧酸類含水混懸液的流變學特性的供替代方法存在需求。
發(fā)明概括本發(fā)明在一個方面中涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)基和使用所述培養(yǎng)基制備聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類的方法。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有(a)可代謝的碳源和能源；(b)無機氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素源。
本發(fā)明還涉及一種聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類的制備方法，該方法包括下列步驟(a)提供一種能夠產生聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的有機體；(b)提供一種能夠通過該有機體轉化成聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的底物；(c)提供一種含有下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基(i)可代謝的碳源和能源；(ii)無機氮源；(iii)磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(v)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素源；以及(d)使該有機體在所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵。
本發(fā)明還涉及一種含有至少一種二羧酸的含水混懸液，它還包括水和導致有效形成基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸顆粒的用量的脂肪物質。
本發(fā)明還涉及一種用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，該方法包括下列步驟向所述混懸液中添加使二羧酸顆粒有效成形的用量的脂肪物質以便使具備某種形狀的二羧酸顆粒形成，其中所述的形狀選自基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形組成的組。
發(fā)明詳述將表示組分用量和/或反應條件的所有數(shù)字理解為在所有情況中可改變的術語″約″。
本發(fā)明通過正確選擇維持微生物生長的可替代營養(yǎng)物而提供了一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可以使得使用生物轉化方法以商業(yè)化方式生產大量重要的多功能物質成為可能。本發(fā)明提供了現(xiàn)有技術培養(yǎng)基的低成本替代品及其易于制備和滅菌的使用方法、具有程度較低的氣味、為隨后的下游工藝提供了較低的雜質負載分布、也使得產品的產量至少與現(xiàn)有技術的常規(guī)方法獲得的產量同樣高。令人意外的是玉米漿和酵母提取物中包含的無數(shù)不確定的成分可以被相對極少的成分所代替而不會損害微生物的生長質量和多功能化合物的產率。
因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種能夠有利于不同類型有機底物生物轉化的經濟的發(fā)酵培養(yǎng)基。該發(fā)酵培養(yǎng)基含有下列必不可少的成分(i)可代謝的碳源和能源；(ii)無機氮源；(iii)磷酸鹽源；(iv)至少一種選自堿金屬、堿土金屬及其混合物組成的組的金屬；和(v)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素源。這些物質可以單獨滿足微生物生長的基本營養(yǎng)需求、還可以產生足以進行生物轉化用量和質量的生物質。
可代謝的碳源和能源的合適來源包括但不限于葡萄糖、果糖、麥芽糖、甘油、乙酸鈉、甲醇、短鏈醇類及其混合物。可代謝的碳源和能源的優(yōu)選來源是葡萄糖、優(yōu)選液體葡萄糖糖漿、例如95％葡萄糖當量糖漿乃至95％以下葡萄糖當量糖漿。這類物質含有少量的二糖類、三糖類和可以在發(fā)酵過程中通過添加諸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶這樣的淀粉酶而水解的多糖類。因此，可以在與生物氧化同時進行的反應中在原位提供葡萄糖。
無機氮源包括但不限于諸如硝酸鈉或硝酸鉀這樣的堿金屬硝酸鹽；諸如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨這樣的銨鹽。優(yōu)選的無機氮源是氨或氫氧化銨。
本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中另一種必不可少的成分是包括含磷酸鹽的任意化合物在內的磷酸鹽源。其實例包括但不限于磷酸鉀、磷酸鈉和磷酸銨。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的磷酸鹽源是磷酸鉀。
用于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的合適的金屬包括堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物。特別優(yōu)選的金屬包括組合形式的鉀、鈣和鎂。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基中最關鍵的成分是基本上不含顆粒物質和細菌的生物素。
所述培養(yǎng)基成分中的任意一種可以作為部分原始無菌培養(yǎng)基進料、作為隨后向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的濃縮水溶液進行滅菌或可以大量過量地包含在發(fā)酵罐接種物中以便于將其攜帶入生產發(fā)酵罐。
為了避免與散發(fā)氣味、顏色不穩(wěn)定性和污染相關的問題，必需使生物素不含可使這類問題加重并需要其它工藝純化步驟的顆粒物質和細菌。所需生物素的量低于它替代現(xiàn)有技術培養(yǎng)基中的有機氮源幾個數(shù)量級。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基在水溶液中含有(a)約10g/l-約60g/l、優(yōu)選約20g/l-約40g/l的可代謝的碳源和能源、優(yōu)選葡萄糖；(b)約50ppm-約2000ppm、優(yōu)選約50ppm-約250ppm且最優(yōu)選約100ppm-約250ppm的由包含的無機氮源提供的氮；(c)約1g/l-約10g/l、優(yōu)選約1g/l-約7g/l的磷酸鹽源、優(yōu)選磷酸鉀；(d)約0.01g/l-約2g/l、優(yōu)選約0.01g/l-約1g/l的至少一種選自堿金屬、堿土金屬及其混合物組成的組的金屬、優(yōu)選鈣與鎂的混合物；和(e)約1μg/l-約2000μg/l、優(yōu)選約4μg/l-約200μg/l且最優(yōu)選約4μg/l-約20μg/l的生物素，其中該生物素基本上不含有害的顆粒物質和細菌。
發(fā)酵培養(yǎng)基中含有的水可以是通過蒸餾、去離子化或軟化而純化的生產用水。優(yōu)選的水源包括那些來自城市水分布系統(tǒng)、生產用再循環(huán)水流的水或因這些水源中已經含有的礦物而需要考慮調節(jié)礦物含量的井水。例如，水與其它所需組分中可能已經含有足以為有機體生長提供全部或基本上全部所需礦物的礦物成分。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基滿足了微生物生長的基本營養(yǎng)物需求，同時將需要因作為廢物處理和產生工藝氣味散發(fā)而需要從產物中分離的有機和無機成分的添加量減少到最低限度。與本領域中公知的發(fā)酵培養(yǎng)基組成相反，本發(fā)明的培養(yǎng)基不含顆粒物質、特別適合于在自動培養(yǎng)基制備工藝中的連續(xù)滅菌且非常低廉。盡管本發(fā)明提供了營養(yǎng)程度極低的培養(yǎng)基組成，但是在配制培養(yǎng)基方面存在很大的靈活性，同時可獲得高產率的聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類。
在本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基中還可以使用不同類型的輔助成分以便進一步加速生物發(fā)酵過程。其實例包括但不限于不同類型的微量金屬、螯合劑、消泡劑等。
本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基中可以使用任意的產聚羧酸、產多元醇和產聚羥基酸的酵母和各種底物。例如，在所需產物是諸如二酸這樣的聚羧酸的情況中，可以使用任意類型的脂肪酸、脂肪酸酯或烷烴底物。用于生產二酸類的合適底物的實例包括但不限于月桂酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、棕櫚油酸及其甲酯及其混合物。烷烴的實例包括十二烷、十二碳烯、十三烷、十四烷、十八烷等。
因此，本發(fā)明的另一個方面提供了一種聚羧酸、多元醇和聚羥基酸的制備方法。僅為了舉例目的，以制備所需終產物聚羧酸類、多元醇類和聚羥基酸類為基礎描述本發(fā)明的方法。
可以在微生物可以生長和催化所需轉化反應的任意pH范圍內實施該方法。優(yōu)選且特別有利的pH范圍是在酸性環(huán)境中，即pH約為7或7以下。盡管可以將低pH改善用于任意發(fā)酵方法，但是當將它用于生產聚羧酸類的發(fā)酵方法時特別有利。合適的pH調控試劑是氨水、氫氧化銨溶液、濃氫氧化鉀或氫氧化鈉。
有機底物可以是可生物氧化成一-或聚羧酸的任意有機化合物。這類化合物可以是飽和或不飽和的脂肪族化合物或帶有至少一個末端甲基、末端羧基和/或通過生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的任意羧酸或雜環(huán)芳香化合物。屬于羧基衍生物的末端官能基可以存在于底物分子上且可以通過非生物氧化的反應而被轉化成羧基。例如，在發(fā)酵步驟中可以添加例如脂酶以便從其它不可代謝的酯中釋放游離脂肪酸。
烷烴類是用于實施本發(fā)明方法的飽和有機底物的類型。烷烴類可以是線性或環(huán)狀、支鏈或直鏈、取代或不被取代的。特別優(yōu)選的烷烴類是那些帶有約4-約25個碳原子的烷烴，它們的實例包括但不限于丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十八烷等。
可以用于本發(fā)明方法的不飽和有機底物的實例包括但不限于內烯烴類，諸如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；不飽和羧酸類，諸如包括具有相對高油酸含量的甘油三酯類在內的2-己烯酸及其酯類、包括具有相對高芥酸含量的甘油三酯類在內的芥酸及其酯類、包括具有相對高蓖麻油酸含量的甘油三酯類在內的蓖麻油酸及其酯類、包括具有相對高油酸含量的甘油三酯類在內的亞油酸及其酯類；不飽和醇類，諸如3-己烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；不飽和醛類，諸如3-己烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。除上述物質外，可以用于本發(fā)明方法的有機底物還包括帶有至少一個內部碳-碳雙鍵和至少一個末端甲基、末端羧基和/或通過生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的脂環(huán)族化合物。這類化合物的實例包括但不限于3，6-二甲基-1， 4-環(huán)己二烯、3-甲基環(huán)己烯、3-甲基-1，4-環(huán)己二烯等。
可以用于本發(fā)明方法的芳香化合物的實例包括但不限于芳烴類，諸如鄰-二甲苯、間-二甲苯、對-二甲苯；鄰甲基-苯甲酸、間-甲基苯甲酸、對-甲基苯甲酸；二甲基吡啶等。有機底物還可以含有可生物氧化成羧基的其它官能基、諸如醛基或醇基。有機底物還可以含有不會生物氧化成羧基且不會干擾生物氧化的其它官能基，諸如鹵素、醚類。
當培養(yǎng)物主動將底物氧化成產物時，可以在發(fā)酵階段過程中給該培養(yǎng)物提供共底物。這種情況特別正確，即如果不能從底物反應自身中回收純粹可利用的碳或能量，那么這種碳和能量由所述的共底物提供。
共底物是一種可發(fā)酵的諸如葡萄糖、果糖或麥芽糖這樣的碳水化合物或例如甘油、乙酸鈉、甲醇或短鏈醇類這樣可發(fā)酵的其它有機化合物或其混合物。優(yōu)選的共底物是葡萄糖、優(yōu)選液體葡萄糖糖漿、例如95％葡萄糖當量糖漿乃至95％以下葡萄糖當量糖漿。這類物質含有少量的二糖類、三糖類和可以在發(fā)酵過程中通過添加諸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纖維素酶這樣的淀粉酶而水解的多糖類。因此，可以在與生物氧化同時進行的反應中在原位提供葡萄糖。
如果用于使生物質生長的碳源和能源與用于啟動氧化轉化反應的共底物相同，那么是便利的、但并非絕對必要。實際益處在于需要處理較少的原料且可以充分整合不同的發(fā)酵階段。因此，可以將單一共底物滅菌和轉運系統(tǒng)用于轉運碳源和能源以便使啟動氧化反應的生物質和共底物生長。
可以用于本發(fā)明方法的微生物是能夠使本文所定義的底物生物氧化的任意微生物。微生物可以是任意的微生物，其中通過使一種或多種?；o酶A氧化酶基因受到破壞、失活或缺失而部分或完全阻斷β氧化；任意的酵母，其中使一種或多種?；o酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中斷β氧化；任意的假絲酵母屬菌株，其中使一種或多種?；o酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中斷β氧化反應。當發(fā)酵方法包括使底物生物氧化成羧酸時，所述的微生物通常是酵母。這類微生物能夠以形成的一-和/或二羧酸類不會進一步被導致鏈縮短的降解所氧化的方式使底物氧化。然而，本發(fā)明的方法涉及任意微生物的應用。
當在作為碳源的烷烴或脂肪酸上培養(yǎng)時，已知分泌α、ω-二羧酸類作為副產物的酵母菌株是美國專利US5,254,466中所列的酵母菌株，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。這些菌株是部分或完全氧化阻斷的菌株；即將它們進行遺傳修飾，使得染色體POX4A、POX4B和兩種POX5基因受到破壞。在該菌株上的底物流重新定向于ω-氧化途徑作為通過POX基因破壞而使競爭性B-氧化途徑發(fā)生功能性失活的結果。完全氧化阻斷的菌株是熱帶假絲酵母菌株，即美國專利US5,254,466中所述的菌株H5343(ATCC20962)。
另一種合適的菌株是這樣一種菌株，其中一種或多種還原酶基因被擴增、從而導致限速ω-羥化酶用量通過P450基因擴增而增加且底物流比例通過ω-氧化途徑而增加。選擇性增加已知對脂肪酸氧化重要的酶的量的菌株也是優(yōu)選的。這類菌株含有增加的CYP和CPR基因拷貝。已經將這些基因鑒定為那些與催化氧化途徑中第一個步驟的ω-羥化酶復合物產生相關的基因。菌株HDC1是含有整合入菌株H5343基因組的CYP52A2A基因的多拷貝。該菌株和類似菌株描述在05/01/98提交的未審申請順序號60/083,798中，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。可以在本發(fā)明方法中使用的其它菌株是如PCT/US99/20797中所述的熱帶假絲酵母菌株HDC1、HDC5、HDC10、HDC15、HDC20、HDC23、HDC23-1、HDC23-2和HDC23-3，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。
無機氮的合適來源包括任意的含銨的化合物。其實例包括但不限于堿金屬硝酸鹽或諸如硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和乙酸銨這樣的銨鹽。優(yōu)選的氮源是銨鹽或通過有機體的代謝作用產生氨的化合物、諸如脲。特別優(yōu)選的用于本發(fā)明的無機氮源是氨。
通過使用甘油三酯脂肪或油作為有機底物和共底物的來源可以改變發(fā)酵方法。使用發(fā)酵肉湯配制的脂酶將所述的脂肪或油水解或裂解成脂肪酸和甘油。有機體消耗甘油用于促使裂解反應至完全，同時提供將游離脂肪酸轉化成其相應的二元酸類所必不可少的能量。屬于油特異性的脂酶是特別優(yōu)選的。油特異性脂酶對具有高油酸含量的甘油三酯表現(xiàn)出高選擇性并選擇性地催化油酸酯部分的水解。這類油特異性脂酶的實例包括但不限于由假單胞菌屬的種類、腐質霉屬(Humicolalanuginosa)、皺摺假絲酵母、白地霉和假單胞菌屬(Burkholderia)產生的脂酶。特別優(yōu)選的脂酶是來自美國專利US5,470,741中所述白地霉ATCC No.74170的UNLipase，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。
發(fā)酵步驟優(yōu)選按照生長階段、誘導階段和轉化階段這三個階段進行?？梢栽跍囟?、pH、通風等相同或不同的發(fā)酵罐條件下進行每個階段。當將細胞培養(yǎng)物導入發(fā)酵罐時生長階段開始且快速生長階段隨后發(fā)生。生長隨所用培養(yǎng)基組成的不同而可以成指數(shù)狀態(tài)或亞指數(shù)狀態(tài)。這種過程持續(xù)至培養(yǎng)物達到通過耗氧減少而測定的線性生長為止。當生長受到向培養(yǎng)基添加關鍵營養(yǎng)物的速率的限制時，發(fā)生線性生長；由此生長與提供有限營養(yǎng)物的速率成正比。在本發(fā)明的方法中，所述的關鍵營養(yǎng)物通常是共底物。第二個階段是誘導階段。在誘導階段中，開始將所需底物轉化成產物的關鍵代謝活性被啟動。在誘導培養(yǎng)物前可以將該培養(yǎng)物在線性生長階段維持一定的時間期限。誘導劑通常是底物本身，但就不會啟動其自身轉化的化合物而言，可以將另一種誘導劑與底物同步使用?？梢詫⒄T導階段用于使快速生長階段過渡到轉化階段。當將底物轉化成產物時，發(fā)酵過程進入下一階段、即轉化階段。
在轉化階段中，發(fā)酵肉湯處于2-7的酸性pH范圍內。優(yōu)選的操作pH范圍約為3.5-7.0、甚者更優(yōu)選約5.0-約6.5的范圍?？梢酝ㄟ^使用強堿自動滴定來控制pH，所述強堿的實例是氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液、氫氧化銨溶液或氨氣。注意通過在該pH環(huán)境下進行發(fā)酵與可以將氨用于pH控制的現(xiàn)有技術的方法相比較，這是由于氨反應形成不揮發(fā)性含水銨離子。在堿性pH環(huán)境下操作時，制備二羧酸的現(xiàn)有技術的方法不會有效地形成含水銨離子，由此導致肉湯中累積的廢氣和毒性氨中揮發(fā)出不需要的氨蒸汽。發(fā)酵可以在約26℃-約40℃的溫度下進行。
在第一個階段中，給培養(yǎng)基接種諸如熱帶假絲酵母菌株這樣β-氧化阻斷的微生物活性培養(yǎng)物，其中發(fā)生快速指數(shù)生長期。通過添加堿來控制培養(yǎng)基的pH，所述堿的實例包括但不限于氫氧化銨、氫氧化鉀、氫氧化鈉或氨氣。向發(fā)酵罐中添加的共底物優(yōu)選是轉化階段中的補料分批添加。指數(shù)生長階段的終點以葡萄糖耗盡、溶解的氧快速增加和最敏感的是廢氣中氧快速增加和廢氣中CO2減少為標志。在沒有誘導底物存在的情況下，生物質以與葡萄糖進料速率成正比的速率持續(xù)累積(即線性生長)。需要在指數(shù)生長結束或當達到所需生物質水平時啟動轉化階段。如果生產容器中氧轉運特征使得可能不能通過以指數(shù)生長方式維持培養(yǎng)物而達到所需生物質的水平，那么可以將指數(shù)生長、隨后是線性葡萄糖受限生長階段(誘導階段)以組合方式用于獲得給定的生物質水平。
為了在過渡到葡萄糖受限線性生長過程中維持健康狀態(tài)的培養(yǎng)物，需要在生長過程中開始葡萄糖進料，使得在培養(yǎng)物中始終可利用葡萄糖。以使生長過程中投入的微生物用量較少所需的總葡萄糖為基準來選擇最初培養(yǎng)基進料中的葡萄糖濃度。可以從生長開始時的任意時間點開始葡萄糖進料。然而，因為在給生產容器接種后在接種液質量和延遲期方面存在一定的可變性，所以優(yōu)選在指數(shù)生長過程中以通過直接生物質測定值或類似于光密度、二氧化碳放出率或氧攝取率的間接方法判定的某些預定生物質濃度開始葡萄糖進料。葡萄糖可以是精制或未精制的玉米漿。可以將葡萄糖從容器上部經過蒸汽空間作為連續(xù)蒸汽或作為連續(xù)系列脈沖或沖擊方式進料。還可以使葡萄糖進入容器表面下、尤其是進入接近攪拌器的高剪切區(qū)以便使進料在整個容器中快速分布。在大容器中，在相同容器內可以存在多個葡萄糖進料點。
氧化底物的轉化階段通過添加誘導劑和含有可氧化甲基的底物而啟動。就烷烴而言是脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸鹽；這些物質及其組合誘導其自身氧化成二羧酸類且可以用于誘導其它物質的氧化?？梢苑峙蜃鳛檫B續(xù)進料或作為系列連續(xù)脈沖或沖擊方式進料來添加底物?？梢詮娜萜魃喜拷浾羝臻g添加底物或將底物加入到容器表面下、尤其是使其進入高剪切區(qū)。在大容器中，可以存在多個底物進料點。氧化在低于7的酸性pH下進行且優(yōu)選在接近或低于通過氧化形成的羧基的pKa下進行或存在于底物中。
當轉化進行至防止生物質和三?；视王ヮ惱鄯e時，優(yōu)選逐步降低對發(fā)酵罐的葡萄糖進料比例。由于轉化了商品油酸，所以胞內儲存液泡的累積是需要調整的葡萄糖進料比例的有用的指標。通過在轉化階段每24小時將進料比例減少約5％-25％且通常約為10％來進行調整。還可以使用其它指標，諸如堿的利用率、CO2放出率或呼吸商。
發(fā)酵過程中通常遇到的一個難題是形成羧酸皂和作為在傳統(tǒng)堿性pH范圍內操作結果的發(fā)泡。在堿性環(huán)境中，羧酸形成導致發(fā)酵肉湯中不需要的發(fā)泡的皂。形成皂的結果是通過向肉湯中添加諸如強堿這樣的堿以將該肉湯的pH維持在所需值下而調節(jié)的肉湯pH降低。此外，向堿性環(huán)境中添加葡萄糖這一步驟導致形成影響發(fā)酵肉湯pH的碳酸鹽。為了補償對皂pH和碳酸鹽形成的影響，必須加入大量堿以便維持所需水平的肉湯pH。
已經令人意外地發(fā)現(xiàn)通過在2-7、優(yōu)選3-7且甚至更優(yōu)選5-6.5的酸性pH范圍而非強堿pH范圍內進行發(fā)酵過程，發(fā)泡現(xiàn)象基本上得到減少且由在葡萄糖代謝過程中產生的二氧化碳形成碳酸鹽的反應減少，由此基本上減少了控制發(fā)酵肉湯pH所需原料的用量。通過在酸性pH下進行發(fā)酵過程，這些問題基本上得到減少，從而使發(fā)酵過程中所用的堿的用量降低。在導致培養(yǎng)基pH下降的生長反應過程中對存在的陽離子當量的凈消耗超過陰離子當量。需要在生長過程中通過在控制pH時添加堿而將該培養(yǎng)基的pH控制在2-7且優(yōu)選約3-6.5的范圍。在這些用于該目的的堿中有氫氧化銨、氨、氫氧化鈉和氫氧化鉀。需要選擇可提供在生長過程中消耗的一種或多種主要營養(yǎng)物的諸如氫氧化銨、氨、氫氧化鈉或氫氧化鉀這樣的堿的組合物。對生長培養(yǎng)基制品的調節(jié)要考慮到添加pH控制試劑。使用控制pH的NH4OH或氨氣減少了通過將pH控制試劑與氮源合并成添加到發(fā)酵罐中的一種原料而使微生物生長所需的原料數(shù)量。
就使用諸如氨或氫氧化銨這樣的氮源而言，在培養(yǎng)基中必須僅含有250ppm或250ppm以下的氮源以便啟動生長和消耗這些pH控制試劑。氨的濃度由此在培養(yǎng)物生長過程中幾乎保持恒定。因此，可以通過向最初培養(yǎng)基裝料中添加氨或銨鹽而方便地預選誘導時培養(yǎng)基中氨的所需濃度。用于最初發(fā)酵罐裝料的氨型氮的有用來源包括磷酸氨(ammoniaphosphate)、硫酸銨、硝酸銨、氨、脲和氫氧化銨。
本發(fā)明的另一個方面涉及一種用于繁殖熱帶假絲酵母的發(fā)酵培養(yǎng)基制品且獲得了將帶有可氧化甲基的底物轉化成羧酸的高產率。通過調節(jié)進入發(fā)酵肉湯中物質的進料速率可以控制微生物的生長。微生物在葡萄糖上生長過程中消耗的主要營養(yǎng)物是氨型氮、鉀、鎂、磷酸鹽和硫酸鹽。并不消耗鈉和鈣，不過，隨接種培養(yǎng)基制品的不同，鈣應以約5-50ppm或5-50ppm以上的濃度存在以便獲得正常生長。在培養(yǎng)基中還包括微量礦物和生物素。這種生物素可以是相對純的等級或作為諸如生物素酵母、酵母提取物或玉米漿形式這樣的較粗制的等級提供。
有用的磷酸鹽來源是磷酸銨、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸三鉀、磷酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉和磷酸三鈉以及磷酸。有用的鉀來源是硫酸鉀、磷酸鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀和苛性鉀。
可以將發(fā)酵助劑用于烷烴類的氧化和/或脂肪酸類的氧化。優(yōu)選的發(fā)酵助劑是脂肪酸酯，特別優(yōu)選的發(fā)酵助劑是甲酯。使用這類發(fā)酵控制試劑的一個主要益處在于控制泡沫和控制發(fā)酵肉湯的液體特性。如果產物的鏈長分布在最終產物的性能上是重要的，那么需要選擇與烷烴或脂肪酸相似的甲酯的鏈長，這是因為還可以將所述甲酯轉化成產物?？梢詫⑦@種酯分批加入或混入進料。如果混入進料，那么它在進料中可以占到約10％或10％以下且優(yōu)選約1％或1％以下。某些商品脂肪酸天然含有一定的甲酯類且可以將它們直接用作二羧酸生產的底物。例如，EMERSOL267(Cognis Corporation)是一種含有約1％或1％以下甲酯類的商品油酸且已經發(fā)現(xiàn)它在本發(fā)明中是一種良好的底物。典型的工業(yè)用油酸、即用于本方法的EMERSOL267具有下列近似組成0.3％C12、2.4％C14、0.6％C14∶1、4.7％C16、4.6％C16∶1、0.2％C17、0.8％C18、69.9％C18∶1、10.5％C18∶2、0.3％C18∶3。
就烷烴氧化成二羧酸類而言，已經進一步發(fā)現(xiàn)有用的是使用脂肪酸或脂肪酸鹽作為發(fā)酵助劑。這種情況會使得所述烷烴在整個發(fā)酵肉湯中具有較好的分布?？梢詫⒅舅岱峙尤牖蚩梢詫⑵渑渲瞥赏闊N進料。如果配制成進料，那么脂肪酸或脂肪酸鹽在所述進料中一般可以占到約10％或10％以下且優(yōu)選約5％或5％以下。這里再次強調，如果產物的鏈長分布在最終產品性能上是重要的，那么需要選擇與烷烴相似的脂肪酸的鏈長分布，這是因為還可以將所述脂肪酸轉化成產物。
已經令人意外地發(fā)現(xiàn)例如脂肪酸類和脂肪酯類這樣的脂肪物質的特定組合在低于50℃的溫度下使長鏈二羧酸類的精制含水混懸液形成高度精細的顆粒。還可以單獨或以組合方式使用包括脂肪醇類、脂肪醚類等在內的其它脂肪物質并將它們看作是本發(fā)明的組成部分。所得的混懸液具有理想的有利于其操作和實際應用的剪切稀化特性。要求在所述混懸液中如此形成的顆粒具有很窄的大小分布內的大小。本發(fā)明的該方面充分適合于在大規(guī)模生產設備中應用。實際上，在這類設備中出現(xiàn)的性能優(yōu)于在實驗室規(guī)模的設備中出現(xiàn)的性能。這一結果提示壁效應可能在顆粒生長過程中起作用。
有用的脂肪物質包括C10-C20的飽和和不飽和脂肪酸類及其酯類，它們包括但不限于向日葵脂肪酸類、向日葵脂肪酸甲酯類、動物脂肪酸類和動物脂肪酸甲酯類。這些物質的典型商品組合物的實例如表1中所示。
下面所列的每種組合物均商購自Cognis Corp.，Cincinnati，OH。
在發(fā)酵肉湯中制備的二羧酸類一般作為1-10μm長的針狀晶體存在。該二酸類的組成反映出所氧化底物的鏈長。這類發(fā)酵肉湯可以高度粘化成固體點。當將本文所述的脂肪物質用于這類發(fā)酵時，它能夠在低于約50℃的溫度下在原位生長成基本上盤形、基本上部分球形(例如杯形)和/或基本上球形的約15-40μm或15-40μm以上直徑和約1-5μm厚度的二羧酸顆粒。在本發(fā)明的一個實施方案中，產生具有約1cm直徑的基本上球形的顆粒。因此，關注的是按照本發(fā)明生產的二羧酸顆?？梢跃哂屑s1μm-約1cm或1cm以上范圍的直徑和/或厚度。當將本文所述的脂肪物質用于生產或含有二羧酸類的發(fā)酵時，所得肉湯具有低表觀粘度，使得可以在最佳條件下持續(xù)處理發(fā)酵肉湯。為方便起見，本文所用的術語″盤形″還可以指基本上部分球形的顆粒。本文所用的″基本上″指的是近似精確。
就產生二羧酸類的發(fā)酵反應而言，使用這類脂肪物質的有益之處在于也能夠將這些試劑添加劑轉化成二羧酸類。這一結果簡化了從肉湯中回收二羧酸類的步驟，使得不再需要為除去添加劑而進行其它加工處理。
可以直接使用某些商購脂肪酸制品以便形成盤形顆粒，這是因為在其制備過程中，導致發(fā)酵過程中所需顆粒生長和大小分布的脂肪衍生物被遺留下來。這些脂肪酸制品的實例包括含有低濃度甲酯的Emersol267 Oleic acid(商購自Cognis Corp.，Cincinnati，Ohio)和含有低濃度甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的部分水解的脂肪酸類。就二羧酸發(fā)酵而言，可以由此使得從由本發(fā)明方法獲知的商購底物中正確選擇底物成為可能。
關注的是可以在本文所述的各種發(fā)酵培養(yǎng)基中與諸如硅氧烷聚丙二醇這樣的消泡劑一起使用脂肪物質而不會對顆粒生長產生抑制作用。
可以按照分批或批量進料方式向二羧酸含水混懸液中添加脂肪物質。一般來說，以二羧酸的質量為基準，所用脂肪物質的濃度可以在約10ppm-約5％或5％以上、而優(yōu)選約50ppm-約1％的范圍。顆粒開始生長，條件是含有最低濃度的添加劑。認為脂肪酸添加劑有助于二羧酸顆粒生長，而脂肪酸酯類和其它脂肪衍生物有助于提供很窄的顆粒大小分布。
就由烴類生產二羧酸類的發(fā)酵而言，需要添加包括脂肪酸類和脂肪酸甲酯類在內的脂肪衍生物的組合。最適宜的是將這些物質混入烴類進料以便簡化進入發(fā)酵的添加劑的準備、滅菌和進料步驟。
同樣，就由脂肪酸生產二羧酸類的發(fā)酵而言，需要添加類似相應的甲酯。因此，添加劑不會改變二羧酸產物的鏈長分布。
在實施具有使二羧酸盤形顆粒生長并描述對所述混懸液流變學特性益處的公開的這些方法的本發(fā)明過程中許多組合和應用是可能的。
已經令人意外地發(fā)現(xiàn)通過將溶解的氧濃度水平維持在占飽和空氣的約25％以下且優(yōu)選20％以下，在轉化階段中所需的共底物的用量減少。當溶解的氧的濃度低于這些水平時，葡萄糖更有效地用于提供氧化用能量。添加過多葡萄糖的結果包括在轉化階段中生物質和三?；视王ヮ愡M一步累積，而產生的二羧酸減少。
可以部分通過調節(jié)最初培養(yǎng)基進料中鎂的濃度或鎂與磷酸鹽的比例來控制含油酵母中三?；视王サ男纬苫驅⑵錅p少到最低限度。優(yōu)選的鎂在發(fā)酵接種物中的濃度約為0.1-約1.0gm/L且更優(yōu)選約0.2-約0.8g/L的濃度。優(yōu)選的磷酸鹽∶鎂之比為20∶1-約2∶1、優(yōu)選15∶1-約3∶1。
還令人意外地發(fā)現(xiàn)在轉化階段中發(fā)酵肉湯中累積了可消耗H2O2的熱不穩(wěn)定性過氧化氫酶樣活性。這種情況可能干擾測定由葡萄糖氧化酶產生的H2O2的葡萄糖濃度試驗。
本發(fā)明方法的一個優(yōu)選的實施方案是通過對油酸進行生物氧化來制備9-十八碳烯二酸(octadecenedioic acid)。盡管可以將任意等級的油酸用作底物，但是典型的工業(yè)用油酸由下列羧酸組成0.42％C12；2.7％C14；0.86％C141；6.3％C16；4.6％C161；0 93％C17；2.8C18；71.8％C1818.3％C182；0.58％C183。該油酸還可以是獲自例如美國專利US4,627,192中所述向日葵(Helianthus annuus)(向日葵籽油)種類脂肪油的高等級油酸，將該文獻的全部內容引入本文作為參考。還可以將其它油籽變種的高級油酸用于本方法。這類油富含大量油酸且至少含有70-80％(重量)的油酸。
根據(jù)下列實施例可以更好地理解本發(fā)明，所有這些實施例僅用于解釋目的而不意味著以任何方式來過度限制本發(fā)明的范圍。在所有的實施例中，成分的濃度以其無水形式表示?？梢允褂盟谐煞值纳藤徦衔?，條件是適當調節(jié)該濃度以便包括水合物中的水。
表2合成成分 生產培養(yǎng)基濃度(g/L)葡萄糖 27.0硫酸銨 7.0磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.5氯化鈣 0.1檸檬酸 0.06氯化鐵 0.023生物素 0.0002微量金屬硼酸 0.0009硫酸銅 0.00007碘化鉀 0.00018氯化鐵 0.00036硫酸錳 0.00072鉬酸鈉 0.00036硫酸鋅 0.00072水 平衡SAG471(E)消泡劑0.8ml以合適的方式對表2中的培養(yǎng)基成分進行加熱滅菌以避免任何沉淀反應，然后將它們混入無菌發(fā)酵罐容器、同時冷卻。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基完全澄清并帶有輕度的稻草色且沒有強烈的氣味。添加消泡劑產生輕度渾濁。使熱帶假絲酵母H5343ALK2-1在無菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內在表2中所列培養(yǎng)基上生長，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為12L。給該無菌培養(yǎng)基接種5％的熱帶假絲酵母H5343ALK2-1接種液并使其在35℃和pH5.8下生長約10小時，同時攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。當培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長且溶解的氧開始增加時，通過以0.7g/L/小時的速率開始通入混有發(fā)酵助劑1.25％Emersol267(工業(yè)用油酸)和1.25％Emery2203(工業(yè)用牛油酸甲酯)的Exxon Developmental Fluid137(含有約94.4％十三烷的烴，用于平衡的主要是十二烷)的連續(xù)進料流而啟動轉化階段。同時發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風率降低至0.4vvm并將0.4巴的反壓施用于容器。在生長和轉化階段中用6N KOH將pH維持在5.8-5.9。當生物質的濃度達到約10g/L時，開始向發(fā)酵罐中以1.58g/L/小時的速率通入連續(xù)的葡萄糖進料流。根據(jù)顯微鏡觀察和對酵母細胞內累積儲存液泡的估計發(fā)現(xiàn)基于每天轉化過程中的葡萄糖進料比例減少了0-15％。在轉化過程中向發(fā)酵罐中添加7ml的PPG(聚丙二醇)消泡劑以控制輕度發(fā)泡。在50小時的轉化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有41.5g/Kg1，13-十三烷二酸。
微量金屬硫酸銅 0.00007硫酸錳 0.00432硫酸鋅 0.00072檸檬酸鹽0.00708水 平衡SAG471(E)消泡劑 0.6ml以合適的方式對表3中的培養(yǎng)基成分進行加熱滅菌以避免任何沉淀反應并將它們混入無菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基完全澄清并帶有輕度的稻草色且沒有強烈的氣味。使熱帶假絲酵母H5343 HDC23-3在無菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內在表3中所列培養(yǎng)基上生長，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為12L。給該無菌培養(yǎng)基接種3％的熱帶假絲酵母H5343 HDC 23-3接種液并使其在35℃下生長約12小時，同時攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在該生長階段中通過添加6N NH4OH將pH調節(jié)至并維持在5.8-5.9，其中6N NH4OH也是培養(yǎng)基中無機氮的來源。當培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長且溶解的氧開始增加時，通過添加誘導進料且同時以2.0g/L/小時的速率開始通入高油酸向日葵脂肪酸(High Oleic Sunflower Fatty Acids)(含有84.4％油酸、5.2％亞油酸、4.7％硬脂酸、3.9％棕櫚酸，其中平衡物包括少量二十烷酸(20∶0)、二十碳烯酸(eicosaenoic acid)(20∶1)、十五烷酸、月桂酸和肉豆蔻酸)的連續(xù)進料流而啟動轉化階段。同時發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風率降低至0.4vvm并將pH控制試劑由NH4OH切換成NaOH。在轉化階段用6N NaOH將pH維持在5.8-5.9。當生物質的濃度達到約10g/L時，開始向發(fā)酵罐中以1.22g/L/小時葡萄糖的速率通入連續(xù)的葡萄糖進料流。根據(jù)顯微鏡觀察和對酵母細胞內累積儲存液泡的估計發(fā)現(xiàn)基于每天轉化過程中的葡萄糖進料比例減少了0-45％。在轉化階段中沒有再使用消泡劑。在50小時的轉化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有71g/Kg總二羧酸類。實施例3表4合成培養(yǎng)基制品培養(yǎng)基成分 濃度(g/L)葡萄糖 20.0硫酸銨 0.5磷酸二氫鉀 5.1硫酸鎂 0.9NaCl0.5氯化鈣 0.1生物素 0.0002微量金屬硼酸0.00075硫酸銅 0.00006碘化鉀 0.00015硫酸鐵 0.04氯化鐵 0.0003硫酸錳 0.0006鉬酸鈉 0.0003硫酸鋅 0.0006水 平衡SAG 471(E)消泡劑2滴以合適的方式對表4中的培養(yǎng)基成分進行加熱滅菌以避免任何沉淀反應，然后將它們混入無菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)該培養(yǎng)基完全澄清而帶有輕度顏色且?guī)缀鯖]有氣味。添加消泡劑產生輕度渾濁。最初使用6N氫氧化銨溶液將該培養(yǎng)基的pH調節(jié)至pH5.8。使用在具有相似組成的培養(yǎng)基中制備的4％接種液使熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)在攪拌和通風的發(fā)酵罐內的該培養(yǎng)基上生長。在短暫延遲期后開始指數(shù)生長。當通過光密度測定值判定培養(yǎng)物中含有約5g/L干重的生物質時，基于最初培養(yǎng)基的體積以1.25g/L/小時的速率開始葡萄糖進料。指數(shù)生長持續(xù)了約9小時，此時葡萄糖使生長達到極限而同時在該期限內指數(shù)生長率僅輕度降低。
在該快速生長期限結束時，將pH控制試劑改變成6N氫氧化鉀溶液并在接下來的110小時中使葡萄糖進料保持恒定。在該期限過程中，在整個指數(shù)生長過程中濃度保持恒定的銨從培養(yǎng)基中耗盡且磷酸鹽的濃度下降至低水平。盡管消耗了這些關鍵營養(yǎng)物，但是生物質以恒定的線性速率持續(xù)在培養(yǎng)基中累積。存活細胞計數(shù)也以線性方式增加至銨從培養(yǎng)基中耗盡為止。此后它們保持恒定。最終該發(fā)酵過程產生了71.5g/L干重的生物質。對比例1生產培養(yǎng)基成分 濃度(g/L)葡萄糖40.0硫酸銨8.0玉米漿9.0磷酸二氫鉀2.0磷酸氫二鉀1.0硫酸鎂0.5NaCl 0.5氯化鈣0.1微量金屬硼酸 0.00075硫酸銅0.00006
碘化鉀 0.00015氯化鐵 0.0003硫酸錳 0.0006鉬酸鈉 0.0003硫酸鋅 0.0006SAG471(E)消泡劑 2滴以合適的方式對對比例1中的培養(yǎng)基成分進行加熱滅菌以避免任何沉淀反應并將它們混入無菌發(fā)酵罐容器。發(fā)現(xiàn)完整的未接種培養(yǎng)基顏色極暗且?guī)в袕娏业挠衩诐{的氣味特征。使熱帶假絲酵母H5343(ATCC20962)在無菌條件下的攪拌、充氣發(fā)酵罐內在表4中所列培養(yǎng)基上生長，該發(fā)酵罐中最初的液體體積為10L。給該無菌培養(yǎng)基接種6％的熱帶假絲酵母H5343(ATCC 20962)接種液并使其在35℃下生長約9.5小時，同時攪拌并通氣，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在生長過程中向發(fā)酵罐中添加5ml的SAG471消泡劑以控制培養(yǎng)物中的發(fā)泡現(xiàn)象。在生長階段中通過添加6N NH4OH將pH維持在5.8-5.9。當培養(yǎng)物停止以指數(shù)方式生長且溶解的氧開始增加時，通過以2.0g/L/小時的速率開始通入Emersol267(含有71.8％油酸、8.3％亞油酸、6.3％棕櫚酸、4.6％棕櫚油酸、2.8％硬脂酸、2.7％肉豆蔻酸、0.93％C17∶0酸、0.86％肉豆蔻腦酸、0.58％亞麻酸和0.42％月桂酸的商品級油酸)的連續(xù)進料流而啟動轉化階段。同時發(fā)酵罐中的溫度從35℃降低至30℃、通風率降低至1.2vvm并將pH控制試劑由NH4OH切換成KOH。在轉化階段用6N KOH將pH維持在5.8或5.8以上。在即刻開始轉化階段的指數(shù)生長結束時以1.8g/L/小時葡萄糖的速率開始使葡萄糖進料流連續(xù)進入發(fā)酵罐。在整個轉化階段對發(fā)酵罐維持這種相同的葡萄糖進料速率。在轉化階段的前3小時過程中向發(fā)酵罐中添加17ml的SAG471消泡劑以控制極為明顯的發(fā)泡現(xiàn)象。在50小時的轉化階段后，發(fā)酵罐中的全部肉湯含有64g/Kg總二羧酸類。實施例4十二烷二酸含水混懸液的改變首先通過使用過量KOH將12.5克的Dupont產品(AldrichChemical Company)十二烷二酸(99％)溶于水而形成水-可溶性二羧酸鹽來制備25g/l長鏈二羧酸的細粒含水混懸液。然后使用H2SO4將該溶液快速滴定至pH6以便沉淀所述的二酸。
將20毫升該混懸液分散入各8只安裝了攪棒的平底螺絲帽小瓶中。因此，各小瓶中含有懸浮于水中的0.5克的細粒十二烷二酸。在30℃下將它們置于磁攪拌器上的水浴中并通過攪拌過夜使該混懸液達到平衡。
通過在平衡小瓶中分批加入不同濃度的測試物質來測試不同添加劑對混懸液特性的影響。商品測試物質的組成如表1中所示。
各小瓶中的純凈制品如表5中所示。
表5
在加入測試添加劑后4小時、24小時或24小時以上觀察該混懸液的外觀和特性并與對照品(小瓶7)進行比較。正如在相襯顯微鏡下觀察到的，作為混懸液的對照品中出現(xiàn)一定程度的各個顆粒的結合。
兩種甲酯添加劑在兩種濃度下使得DDDA更好地與相似大小的分散顆粒結合(小瓶3-6)。這種情況在將它們從攪拌的小瓶中取出并使之沉降時是明顯的。含有甲酯添加劑的混懸液的沉降遠比對照品迅速。剩余的水相比對照品澄清，而對照品保持了渾濁，因為在混懸液中保留了較小的DDDA顆粒。
使用含有4小時后顆粒開始結合成大團塊的油酸添加劑的混懸液獲得了最令人意外的結果。在20小時時，小瓶1在接近底部有較大的DDDA密集團塊且在小瓶上部有一些較小的團塊。在20小時時，小瓶2中含有約1cm直徑的單個DDDA球且水相澄清。
當將小瓶1和2持續(xù)保溫超過20小時時，數(shù)塊較大團塊已經破碎。然后這些團塊粘附在攪拌棒自身上。最終所有的DDDA在攪拌棒上生長，使得小瓶中的澄清水中含有渦動的DDDA大團塊。
本實施例表明了如何將脂肪酸類和脂肪酸衍生物的添加用于使二羧酸類的含水混懸液更適合于通過使用過濾、沉降或大小分級的方法的分離。
為了進行比較，接著將樣品加熱至70℃并快速冷卻至室溫以破壞在原始肉湯中形成的盤形結構。然后也如表6中所示進行類似分析。
在不同濃度水平的二羧酸混懸液下進行的一系列相似實驗證實了上述結果，因為它們表現(xiàn)出基本上相似形式的特性。就熱殺樣品而言，這類濃度如下27.6g/kg、57.3g/kg、83.2g/kg、95.8g/kg、100.9g/kg、117.0g/kg和117.0g/kg。
這些結果表明脂肪酸衍生物對發(fā)酵肉湯中二羧酸形態(tài)和粘度具有驚人的影響。
權利要求
1.一種含有至少一種二羧酸的含水混懸液，它包括水、至少一種二羧酸和有效導致基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸顆粒形成的用量的脂肪物質。
2.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的二羧酸顆粒的直徑大于約15μm。
3.一種權利要求2的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的二羧酸顆粒的直徑在約15μm-約1cm的范圍。
4.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的基本上盤形或基本上部分球形二羧酸顆粒的厚度在約1μm-約5μm的范圍。
5.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中將該混懸液的溫度維持在約50℃以下。
6.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質是脂肪酸。
7.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質是脂肪酸酯。
8.一種權利要求7的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
9.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質量為基準，所述脂肪物質的含有量大于約10ppm。
10.一種權利要求9的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質量為基準，所述脂肪物質的含有量在約10ppm-約5％的范圍。
11.一種權利要求10的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中以二羧酸的質量為基準，所述脂肪物質的含有量在約50ppm-約1％的范圍。
12.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪物質包括脂肪酸與脂肪酸酯的組合。
13.一種權利要求12的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
14.一種權利要求1的含有至少一種二羧酸的含水混懸液，其中該含水混懸液是包括下列組成的發(fā)酵培養(yǎng)基(a)可代謝的碳源和能源；(b)無機氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素源。
15.一種用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，該方法包括下列步驟向所述混懸液中添加使二羧酸顆粒有效成形的用量的脂肪物質以便使具備某種形狀的二羧酸顆粒形成，其中所述的形狀選自基本上盤形、基本上部分球形或基本上球形組成的組。
16.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的顆粒具有約大于15μm的直徑。
17.一種權利要求16的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的二羧酸顆粒的直徑在約15μm-約1cm的范圍。
18.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的基本上盤形或基本上部分球形二羧酸顆粒的厚度在約1μm-約5μm的范圍。
19.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，進一步包括將該混懸液的溫度維持在約50℃以下的步驟。
20.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的脂肪物質是脂肪酸。
21.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的脂肪物質是脂肪酸酯。
22.一種權利要求21的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
23.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中加入的脂肪物質占二羧酸質量的約10ppm以上。
24.一種權利要求23的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的用量占二羧酸質量的約10ppm-約5％。
25.一種權利要求24的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的用量占二羧酸質量的約50ppm-約1％。
26.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的脂肪物質是脂肪酸與脂肪酸酯的組合。
27.一種權利要求26的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
28.一種權利要求15的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中該含水混懸液包括發(fā)酵培養(yǎng)基。
29.一種權利要求28的用于改變含有二羧酸的含水混懸液的流變學特性的方法，其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包括(a)可代謝的碳源和能源；(b)無機氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素源。
全文摘要
一種發(fā)酵培養(yǎng)基，它含有(a)可代謝的碳源和能源；(b)無機氮源；(c)磷酸鹽源；(d)至少一種選自堿金屬、堿土金屬、過渡金屬及其混合物組成的組的金屬；和(e)基本上不含顆粒物質和細菌的生物素。可以將脂肪物質加入到含有至少一種二羧酸的含水混懸液中以便改變該混懸液的流變學特性。
文檔編號C12N1/16GK1394232SQ01803479
公開日2003年1月29日 申請日期2001年1月5日 優(yōu)先權日2000年1月7日
發(fā)明者K·W·安德森, J·D·溫澤爾 申請人:科金斯公司