專利名稱：用于鑒定生物樣本中原種事件gat－z m1的方法和試劑盒的制作方法
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因在植物中的表型表達(dá)由該基因自身的結(jié)構(gòu)及其在植物基因組中的位置決定。同時(shí)轉(zhuǎn)基因(為外源DNA)在基因組的不同位置存在時(shí)，可以不同方式影響植物的總體表型。通過(guò)遺傳操作在植物中從農(nóng)業(yè)上或工業(yè)上成功導(dǎo)入商業(yè)感興趣的性狀是一個(gè)漫長(zhǎng)的、受不同因素影響的過(guò)程。經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化的植物的實(shí)際轉(zhuǎn)化和再生只是一系列選擇步驟的第一步，其中所述選擇步驟包括廣泛的遺傳鑒定、育種及野外試驗(yàn)的評(píng)估，最終導(dǎo)致原種事件的選擇。
鑒于有關(guān)Novel Food/Feed的討論、GMO和非GMO產(chǎn)物的分離以及對(duì)專利物質(zhì)的鑒定，對(duì)原種事件的明確鑒定顯得愈發(fā)重要。理想的情況是此類鑒定方法既快速又簡(jiǎn)單，且不用多方面的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備。進(jìn)一步地，該方法應(yīng)提供使原種事件得以明確鑒定且不用專家解釋的結(jié)果，但如果需要的話可在專家的監(jiān)視下進(jìn)行。
在開(kāi)發(fā)玉米對(duì)除草劑Liberty的抗性時(shí)，GAT-ZM1被選作原種事件，其中所述GAT-ZM1原種事件是通過(guò)用質(zhì)粒pUC/Ac轉(zhuǎn)化玉米而產(chǎn)生的，所述pUC/Ac包含編碼對(duì)膦絲菌素耐受的pat基因。市場(chǎng)上以Liberty Link玉米為商標(biāo)出售，例如AgriGold/Akin Seed Company出售的Liberty LinkA6460LL。此處描述了用于以簡(jiǎn)單明確的方法鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的手段。
更具體地，本發(fā)明涉及這樣的方法，其包含用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增在生物樣本中存在的核酸，以得到一條在100至350bp之間的DNA片段，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)使用至少兩條引物，一條識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)，另一條識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。引物分別優(yōu)選地識(shí)別位于GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，最優(yōu)選地識(shí)別位于SEQ ID No.6的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，以及識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。尤其優(yōu)選地，識(shí)別5’側(cè)翼區(qū)的引物包含此處所述的SEQ ID No.11核苷酸序列以及識(shí)別外源DNA內(nèi)的序列的引物包含此處所述的SEQ ID No.12核苷酸序列。
本發(fā)明尤其涉及用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的方法，該方法包含用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增在生物樣本中存在的核酸，以得到一條在180至220bp之間的DNA片段，優(yōu)選地約200bp，其中所述聚合酶鏈反應(yīng)使用的兩條引物分別具有SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的核苷酸序列本發(fā)明還涉及此處描述的GAT-ZM1特異的側(cè)翼序列，其可用于開(kāi)發(fā)特異的鑒定方法來(lái)鑒定生物樣本中的GAT-ZM1。更具體地，本發(fā)明涉及GAT-ZM1 5’和/或3’側(cè)翼區(qū)，其可用于產(chǎn)生特異的引物和探針。本發(fā)明還涉及基于此類特異引物或探針的使用而對(duì)生物樣本中GAT-ZM1的存在進(jìn)行鑒定的方法。
本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的試劑盒，所述試劑盒包含至少一條特異識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)的引物或探針。
優(yōu)選地本發(fā)明的試劑盒除了包含一條特異識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)的引物外，還包含第二條特異識(shí)別位于GAT-ZM1的外源DNA內(nèi)序列的引物，以用于PCR鑒定方法。優(yōu)選地，本發(fā)明的試劑盒包含兩條特異引物，其中一條識(shí)別位于GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，最優(yōu)選地識(shí)別位于SEQ IDNo.6的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，且另一條識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。尤其優(yōu)選地，識(shí)別5’側(cè)翼區(qū)的引物包含此處所述的SEQ ID No.11核苷酸序列以及識(shí)別轉(zhuǎn)基因的引物包含此處所述的SEQ ID No.12核苷酸序列。
本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的試劑盒，所述試劑盒包含具有SEQ ID No.11和SEQ ID No.12核苷酸序列的PCR引物，以用于此處描述的GAT-ZM1 PCR鑒定方法。
本發(fā)明還涉及用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的試劑盒，所述試劑盒包含特異探針，其序列對(duì)應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與GAT-ZM1特異區(qū)具有80％至100％序列同一性的序列。優(yōu)選地探針序列對(duì)應(yīng)于一個(gè)特異區(qū)，所述特異區(qū)包含部分GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)。最優(yōu)選地該特異探針具有(或互補(bǔ)于)與SEQ ID No.6的第286位至第466位核苷酸之間的序列具有80％至100％序列同一性的序列。
本發(fā)明所包括的方法和試劑盒可用于不同的目的，例如但不限于以下目的鑒定植物、植物材料或產(chǎn)品(例如但不限于包含或來(lái)自植物材料的食品或飼料產(chǎn)品(新鮮或經(jīng)加工的))中的GAT-ZM1；另外，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，以分離轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因材料；另外，本發(fā)明的方法和試劑盒可用于確定包含GAT-ZM1的植物材料的質(zhì)量(即材料百分純)。
本發(fā)明還涉及GAT-ZM1 5’和/或3’側(cè)翼區(qū)以及從GAT-ZM1 5’和/或3’側(cè)翼序列產(chǎn)生的特異引物和探針。詳細(xì)描述重組DNA分子摻入植物基因組一般是細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化的結(jié)果(或其它遺傳操作的結(jié)果)。摻入的具體位點(diǎn)或源自“隨機(jī)”整合，或?yàn)轭A(yù)定位置(如果使用的是定向整合方法)。
作為用重組DNA或“轉(zhuǎn)化DNA”轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織的結(jié)果而導(dǎo)入植物基因組的DNA此后稱為“外源DNA”，其包含一個(gè)或多個(gè)“轉(zhuǎn)基因”。這樣，外源DNA可包含重組DNA及植物的新導(dǎo)入的重排DNA。但在本發(fā)明的上下文中術(shù)語(yǔ)“植物DNA”指可在對(duì)應(yīng)的野生型植物的相同遺傳位置找到的植物DNA?？赏ㄟ^(guò)重組DNA分子在植物基因組中摻入位點(diǎn)處的位置和構(gòu)型來(lái)表示外源DNA的特征。重組DNA在植物基因組中的插入位點(diǎn)也稱為“插入位點(diǎn)”或“目標(biāo)位點(diǎn)”。植物基因組中重組DNA的插入可與植物DNA的缺失相關(guān)，稱為“目標(biāo)位點(diǎn)缺失”。此處所用的“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”指的是這樣的序列，其為植物基因組的至少20bp序列，優(yōu)選地至少50bp序列，以及高達(dá)5000bp的序列，其位于緊挨著外源DNA的上游且鄰近于外源DNA，或位于緊挨著外源DNA的下游且鄰近于外源DNA。導(dǎo)致外源DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化步驟會(huì)產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化子，對(duì)每一個(gè)轉(zhuǎn)化子而言它們是特征性的和唯一的。當(dāng)重組DNA通過(guò)常規(guī)的雜交導(dǎo)入植物時(shí)，其在植物基因組中的插入位點(diǎn)或其側(cè)翼區(qū)一般不改變。此處所用的“插入?yún)^(qū)”指的是對(duì)應(yīng)于至少40bp，優(yōu)選地至少100bp，以及高達(dá)超過(guò)10000bp的區(qū)域，其被植物基因組中包含外源DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列包圍?？紤]到由于種內(nèi)突變引起的小差異，插入?yún)^(qū)在雜交入同一種類的植物后，可保留與包含最初從轉(zhuǎn)化獲得的植物中外源DNA上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列至少85％，優(yōu)選地90％，更優(yōu)選地95％，且最優(yōu)選地100％的序列同一性。
“事件”定義為作為遺傳操作結(jié)果的(人工)基因座，其攜帶包含至少一拷貝目的基因的外源DNA。一個(gè)事件的一般等位基因狀態(tài)為外源DNA的存在或缺失。事件的表型特征在于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在基因水平上，事件是植物基因組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于轉(zhuǎn)基因的限制性酶切圖譜(例如通過(guò)Southern印跡確定)、轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼序列、分子標(biāo)志物的位置和/或轉(zhuǎn)基因的分子構(gòu)型。通常用包含至少一種目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物，導(dǎo)致多個(gè)事件，其中每一個(gè)均為唯一的。
此處所用的“原種事件”為基于轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性以及與含有它的植物之最佳農(nóng)藝學(xué)特性的相容性而從一組事件選擇的事件，其通過(guò)用同一轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化或通過(guò)與此類轉(zhuǎn)化所獲得的植物回交而獲得。因此原種事件選擇的標(biāo)準(zhǔn)為一種或多種，優(yōu)選地兩種或多種，有利地為所有下列標(biāo)準(zhǔn)a)外源DNA的存在不降低其它所期望有的植物特性，例如那些與農(nóng)學(xué)特性或商業(yè)價(jià)值相關(guān)的特性；b)事件的特征在于充分定義的穩(wěn)定遺傳之分子構(gòu)型，且可開(kāi)發(fā)用于鑒定對(duì)照的合適診斷手段；c)在事件的雜合(或半合子)和純合子的情況下，目標(biāo)基因在一系列的環(huán)境條件下以商業(yè)可接受水平顯示正確、合適且穩(wěn)定的空間和時(shí)間表型表達(dá)，其中攜帶事件的植物可能處于常規(guī)的農(nóng)業(yè)用途。
優(yōu)選外源DNA與植物基因組的某個(gè)位置有關(guān)，其中所述位置允許基因易于滲入所期望的商業(yè)遺傳背景。
事件作為原種事件的情形通過(guò)將原種事件滲入不同的相關(guān)遺傳背景并且觀察例如上述a)，b)和c)中的一個(gè)、兩個(gè)或所有標(biāo)準(zhǔn)而證實(shí)。
因此“原種事件”指的是包含外源DNA的基因座，其滿足上述標(biāo)準(zhǔn)。植物、植物材料或子代例如種子可在其基因組中包含一個(gè)或多個(gè)原種事件。
開(kāi)發(fā)用于鑒定原種事件或鑒定包含原種事件的植物或植物材料，或鑒定包含含有原種事件的植物材料之產(chǎn)品的手段是基于原種事件的特定基因組特性而進(jìn)行的，其中所述特定基因組特性例如包含外源DNA的基因組區(qū)域之特定的限制性圖譜、分子標(biāo)志物或外源DNA側(cè)翼區(qū)的序列。
一旦已對(duì)外源DNA的一個(gè)或兩個(gè)側(cè)翼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序，可用分子生物學(xué)技術(shù)產(chǎn)生特異性識(shí)別樣本核酸(DNA或RNA)中這種(這些)序列的引物和探針。例如可通過(guò)PCR法來(lái)鑒定生物樣本(如植物、植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品樣本)中的原種事件。此類PCR基于至少兩條特異“引物”，一條識(shí)別位于原種事件5’或3’側(cè)翼區(qū)中的序列，另一條識(shí)別位于外源DNA中的序列。引物優(yōu)選地為具有15至35個(gè)核苷酸的序列，其在優(yōu)化的PCR條件下分別“特異性識(shí)別”位于原種事件5’或3’側(cè)翼區(qū)中的序列和原種事件的外源DNA中的序列，這樣可從包含原種事件的核酸樣本中擴(kuò)增出特異片段(“整合片段”)。這意味著在優(yōu)化的PCR條件下植物基因組或外源DNA中只有目標(biāo)整合片段而沒(méi)有其它序列被擴(kuò)增。
優(yōu)選地，整合片段的長(zhǎng)度在50至500個(gè)核苷酸之間，最優(yōu)選地在100至350個(gè)核苷酸之間。優(yōu)選地特異引物的序列分別與原種事件5’或3’側(cè)翼區(qū)中的序列和原種事件的外源DNA中的序列具有80％至100％的同一性，只要錯(cuò)配仍允許用這些引物在優(yōu)化的PCR條件下特異性鑒定原種事件。但允許的錯(cuò)配范圍易于實(shí)驗(yàn)確定且為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。
由于引物序列和它們?cè)诨蚪M中的相對(duì)位置對(duì)原種事件是獨(dú)特的，因此只在包含原種事件(的核酸)的生物樣本中存在整合片段的擴(kuò)增。優(yōu)選地當(dāng)用PCR鑒定未知樣本中GAT-ZM1的存在時(shí)，可包括一組引物對(duì)照，其中用該引物對(duì)照可擴(kuò)增出在該事件的植物種類的“管家基因”中的片段。管家基因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)細(xì)胞類型中表達(dá)且為與所有細(xì)胞共有的基本代謝活性相關(guān)的基因。優(yōu)選地，從管家基因擴(kuò)增的片段較擴(kuò)增的整合片段大。根據(jù)待分析樣本，可包括其它對(duì)照。
本領(lǐng)域?qū)?biāo)準(zhǔn)的PCR方法進(jìn)行了描述，例如在“PCR應(yīng)用手冊(cè)”(“PCRApplications Manual”)(Roche Molecular Biochemicals，第二版，1999)一書中的描述。優(yōu)化的PCR條件(包括特異的引物序列)在用于每個(gè)原種事件的“PCR鑒定方法”(“PCR identification protocol”)中進(jìn)行了說(shuō)明。但應(yīng)該清楚需要針對(duì)具體的實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)節(jié)PCR鑒定方法中的一些參數(shù)，并且可作些許修改以獲得類似結(jié)果。例如使用不同的方法制備DNA時(shí)，可能需要調(diào)節(jié)例如所用引物量、聚合酶和退火條件。同樣地，選擇其它引物則需要其它用于PCR鑒定方法的優(yōu)化條件。但這些調(diào)節(jié)顯然為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，且在如上所引用的最新PCR應(yīng)用手冊(cè)中進(jìn)行了進(jìn)一步的詳述。
另外，特異引物可用于擴(kuò)增整合片段，后者可用作鑒定生物樣本中GAT-ZM1的“特異探針”。在允許探針與其在核酸中的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行雜交的條件下，將生物樣本的核酸與探針接觸，導(dǎo)致核酸/探針雜交體的形成。可檢測(cè)該雜交體的形成(例如標(biāo)記核酸或探針)，其中該雜交體的形成表明存在GAT-ZM1。本領(lǐng)域已描述了基于與(在固相載體上或在溶液中的)特異探針雜交的此類鑒定方法。特異探針優(yōu)選為這樣的序列，其在優(yōu)化的條件下，特異地與原種事件5’或3’側(cè)翼區(qū)且優(yōu)選地也包含與其鄰接的部分外源DNA中的區(qū)域(此后稱之為“特異區(qū)”)雜交。優(yōu)選地，特異探針包含在50至500bp之間，優(yōu)選在100至350bp之間的序列，其與特異區(qū)的核酸序列至少80％，優(yōu)選地80至85％，更優(yōu)選地85至90％，尤其優(yōu)選地90至95％，最優(yōu)選地95％至100％相同(或互補(bǔ))。優(yōu)選地，特異探針包含約15至約100個(gè)鄰接的與原種事件特異區(qū)相同(或互補(bǔ))的核苷酸序列。
此處所用的“試劑盒”指的是以本發(fā)明方法實(shí)施為目的的一套試劑，更具體地，指的是鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的一套試劑。更具體地，本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案包含如上所述的至少一條或兩條特異引物。任選地，試劑盒可進(jìn)一步包含此處在PCR鑒定方法中描述的任一其它試劑。另外，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，該試劑盒可包括如上所述的一條特異探針，其與生物樣本的核酸特異性雜交以鑒定其中GAT-ZM1的存在。任選地，該試劑盒可進(jìn)一步包含任一其它試劑(例如但不限于雜交緩沖液、標(biāo)記物)，用于用特異探針鑒定生物樣本中的GAT-ZM1。
可使用本發(fā)明的試劑盒，且試劑盒的組分可具體調(diào)節(jié)，以用于質(zhì)量控制(例如種子批次的純度)，檢測(cè)植物材料或包含或衍生于植物材料的材料中(例如但不限于食物或飼料產(chǎn)品)的原種事件。
此處所用關(guān)于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”指的是具有相同核苷酸的位置數(shù)除以兩個(gè)序列中的較短序列的核苷酸數(shù)目。兩個(gè)核苷酸序列的排列用Wilbur和Lipmann算法(Wilbur和Lipmann，1983，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院報(bào)(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)80726)進(jìn)行，所用窗口大小為20個(gè)核苷酸，字長(zhǎng)為4個(gè)核苷酸且缺口罰分為4。例如可用IntelligeneticsTM Suite程序(Intelligenetics Inc.，CA)或GeneticsComputer Group的序列分析軟件包(GCG，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心)方便地進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助分析并解釋序列數(shù)據(jù)，包括上述的序列排列。當(dāng)此類序列的序列同一性為至少約75％，尤其是至少約80％，更尤其是至少約85％，更尤其是約90％，特別是約95％，更特別是約100％時(shí)，序列被表示為“基本相似”。這樣當(dāng)RNA序列被說(shuō)成是與DNA序列基本相似或具有某種程度的序列同一性時(shí)，應(yīng)清楚DNA序列中的胸腺嘧啶(T)認(rèn)為與RNA序列中的尿嘧啶(U)是相同的。此處所用的“互補(bǔ)于”是指核酸序列中核苷酸A和T(U)之間以及G和C之間的互補(bǔ)性。
此處所用術(shù)語(yǔ)“引物”包括在模板依賴的方法中(如PCR)可引導(dǎo)新生核酸合成的任一核酸。一般引物為10至30bp的寡核苷酸，但也可使用較長(zhǎng)的序列。引物可以雙鏈形式提供，但優(yōu)選以單鏈形式提供。雖然探針可被用作引物，但探針是設(shè)計(jì)為與靶DNA或RNA結(jié)合且不必用于擴(kuò)增步驟。
此處當(dāng)提到特異引物時(shí)所用術(shù)語(yǔ)“識(shí)別”是指這樣的事實(shí)在方法中所提的條件(例如PCR鑒定方法的條件)下，特異引物與原種事件中的核酸序列特異性雜交，其中的特異性通過(guò)存在的陽(yáng)性和陰性對(duì)照而確定。
此處當(dāng)提到特異探針時(shí)所用術(shù)語(yǔ)“雜交”是指這樣的事實(shí)在標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件下，探針可與原種事件核酸序列中的特異區(qū)結(jié)合。此處所用標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊條件是指此處所述的用于雜交的條件或由Sambrook等人(1989)(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約(MolecularCloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarbourLaboratory Press，NY))描述的常規(guī)雜交條件，其例如包括以下步驟1)將植物基因組DNA片段固定在濾膜上，2)將濾膜用50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt’s試劑和0.1％SDS，42℃預(yù)雜交1至2小時(shí)，或用6×SSC，2×Denhardt’s試劑和0.1％SDS，68℃預(yù)雜交1至2小時(shí)，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)孵育16至24小時(shí)，5)用1×SSC，0.1％SDS室溫洗濾膜20分鐘，6)洗濾膜三次，20分鐘，每次在68℃于0.2×SSC，0.1％SDS，以及7)用增感屏將濾膜于-70℃暴露于X-射線膠片24至48小時(shí)。
如此處所用生物樣本為植物、植物材料或含有植物材料的產(chǎn)品之樣本。術(shù)語(yǔ)“植物”指包含在任一成熟階段的玉米(玉蜀黍(Zea mays))植物組織以及取自或衍生于任一此類植物的任一細(xì)胞、組織或器官，包括(但不限于)任一種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。此處所用的“植物材料”指的是來(lái)自或衍生于植物的材料。包含植物材料的產(chǎn)品涉及到食物、飼料或其它用植物材料產(chǎn)生的或可被植物材料污染的產(chǎn)品。應(yīng)該明白在本發(fā)明的上下文中，此類生物材料優(yōu)選地用于測(cè)試GAT-ZM1特異核酸的存在，暗示樣本中存在核酸。因此此處所指的用于鑒定生物樣本中的原種事件GAT-ZM1的方法優(yōu)選地涉及鑒定包含原種事件生物樣本中的核酸。
此處所用的“包含”可解釋為使所述特征、整數(shù)、步驟或組成的存在如所指的具體化，但不排除另外的一個(gè)或多個(gè)特征、整數(shù)、步驟、組成或組的存在。這樣例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白質(zhì)可包含較實(shí)際所引用的要多的核苷酸或氨基酸，即包括在較大的核酸或蛋白質(zhì)中。包含功能上或結(jié)構(gòu)上確定的DNA序列之嵌合基因可包含額外的DNA序列等。
下列實(shí)施例描述了開(kāi)發(fā)用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的手段。
除非另外指出，所有的重組DNA技術(shù)均按照描述的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，描述見(jiàn)Sambrook等人(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，紐約以及Ausubel等人，(1994)分子生物學(xué)最新方法(CurrentProtocols in Molecular Biology)，美國(guó)。植物分子研究的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法的描述見(jiàn)BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和BlackwellScientific Publications，UK R.D.D.Croy出版的植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳真(Plant Molecular Biology Labfax)(1993)。
在描述和實(shí)施例中，參照以下序列SEQ ID No.1 載體pUC/Ac的遺傳成分序列SEQ ID No.2 引物MDB286SEQ ID No.3 引物MDB391SEQ ID No.4 引物MDB411SEQ ID No.5 引物MDB420SEQ ID No.6 包含GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列SEQ ID No.7 引物MDB439SEQ ID No.8 引物VDS44SEQ ID No.9 引物MDB522SEQ ID No.10包含GAT-ZM1 3’側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列SEQ ID No.11引物COR17SEQ ID No.12引物COR18SEQ ID No.13引物COR15SEQ ID No.14引物COR16
表1載體pUC/Ac的遺傳成分
對(duì)原種事件GAT-ZM1的選擇是在基于除草劑抗性基因的表達(dá)和穩(wěn)定性好且與最佳農(nóng)業(yè)性能具相容性的廣泛選擇方法基礎(chǔ)上進(jìn)行的。
用Liu等人(1995，植物雜志(Plant J.)8(3)457-463)描述的溫度非對(duì)稱交互(TAIL-)PCR法確定GAT-ZM1事件中外源DNA側(cè)翼區(qū)的序列。該方法將三條巢式引物與一條較短的隨機(jī)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)，這樣可熱控制特異和非特異產(chǎn)物的相對(duì)擴(kuò)增效率。所選擇的特異引物與外源DNA的邊界在它們的退火條件下退火。用1％瓊脂糖凝膠分析小量(5μl)未純化的二級(jí)和三級(jí)PCR產(chǎn)物。三級(jí)PCR產(chǎn)物用于制備性擴(kuò)增、純化并用DyeDeoxyTerminator循環(huán)試劑盒于自動(dòng)測(cè)序儀上測(cè)序。
1.1.右(5’)側(cè)翼區(qū)所用引物為
其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T用MDB286-MDB420擴(kuò)增的片段約1100bp，測(cè)定其全序列(SEQ ID No.6)。在第1至第341位核苷酸之間的序列對(duì)應(yīng)于植物DNA，而在第342至第1041位核苷酸之間的序列對(duì)應(yīng)于T-DNA。
1.2.左(3’)側(cè)翼區(qū)所用引物為
其中N＝A，C，T或g；S＝C或g；W＝A或T用MDB286-MDB522擴(kuò)增的片段約450bp，測(cè)定其全序列(SEQ ID No.10)。在第1至第342位核苷酸之間的序列對(duì)應(yīng)于T-DNA，而在第343至第484位核苷酸之間的序列對(duì)應(yīng)于植物DNA。
2.聚合酶鏈反應(yīng)鑒定方法的進(jìn)行2.1.引物設(shè)計(jì)識(shí)別原種事件中序列的特異引物。更具體地，設(shè)計(jì)的一條引物識(shí)別GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)序列。然后所選擇的第二條引物位于外源DNA的序列中，這樣引物所跨序列長(zhǎng)約200bp。對(duì)GAT-ZM1 DNA進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)下列引物可給出特別清晰且可重復(fù)的結(jié)果COR175’-ggg.TgA.gCT.CgA.ATg.TTg.TTC.T-3’(SEQ ID 11)(靶植物DNA)COR185’-TCT.TAg.ACg.TCA.ggT.ggC.ACT.T-3’(SEQ ID 12)(靶T-DNA)在PCR混合物中，優(yōu)選地包括靶向內(nèi)源序列的引物。在未知樣本和在DNA陽(yáng)性對(duì)照中，這些引物作為內(nèi)部控制。用內(nèi)源引物對(duì)所得的陽(yáng)性結(jié)果表明在基因組DNA制備物中有充分的足夠質(zhì)量DNA可用于產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。所選擇的內(nèi)源引物識(shí)別玉蜀黍的管家基因COR155’-AgC.gTC.AAg.gAT.CAT.Tgg.TgT.C-3’(SEQ ID 13)(位于玉蜀黍乙醇脫氫酶1基因(X04050)中)COR165’-ggC.CAA.gTT.CAg.CAT.AAg.CTg.T-3’(SEQ ID 14)(位于玉蜀黍乙醇脫氫酶1基因(X04050)中)2.2.擴(kuò)增片段在PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段為
對(duì)于COR15-COR16引物對(duì)513bp(內(nèi)源對(duì)照)對(duì)于COR17-COR18引物對(duì)202bp(GAT-ZM1原種事件)2.3.模板DNA按Edwards等人，(核酸研究，19，1349頁(yè)，1991)用葉鉆孔制備模板DNA。當(dāng)使用用其它方法制備的DNA時(shí)，需要用不同量的模板進(jìn)行測(cè)試。通常50ng的基因組模板DNA產(chǎn)生最佳結(jié)果。
2.4.設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照為避免假陽(yáng)性或假陰性，在PCR運(yùn)行中堅(jiān)決應(yīng)包括下列陽(yáng)性和陰性對(duì)照-基本的混合物對(duì)照(DNA陰性對(duì)照)。此為反應(yīng)中未加入DNA的PCR。當(dāng)觀察到預(yù)期結(jié)果即無(wú)PCR產(chǎn)物時(shí)，表明該P(yáng)CR混合物未污染靶DNA。
-DNA陽(yáng)性對(duì)照(已知含有轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣本)。該陽(yáng)性對(duì)照的成功擴(kuò)增表明PCR是在允許靶序列擴(kuò)增的條件下運(yùn)行的。
-野生型DNA對(duì)照。此為所提供的模板DNA為制備自非轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA的PCR。當(dāng)觀察到預(yù)期結(jié)果，即轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物未被擴(kuò)增而內(nèi)源PCR產(chǎn)物被擴(kuò)增時(shí)，表明在基因組DNA樣本中無(wú)可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。
2.5.PCR條件在下列條件下可獲得最佳結(jié)果-用于25μl反應(yīng)的PCR混合物中含有2.5μl模板DNA2.5μl 10x擴(kuò)增緩沖液(與Taq聚合酶同時(shí)提供)0.5μl 10mM dNTP’s0.5μl COR17(10pmoles/μl)0.5μl COR18(10pmoles/μl)0.25μl COR15(10pmoles/μl)0.25μl COR16(10pmoles/μl)0.1μl Taq DNA聚合酶(5個(gè)單位/μl)
加水至25μl-為得到最佳結(jié)果，應(yīng)遵循下列熱循環(huán)參數(shù)95℃ 4分鐘然后95℃ 1分鐘57℃ 1分鐘72℃ 2分鐘進(jìn)行5個(gè)循環(huán)然后92℃ 30秒57℃ 30秒72℃ 1分鐘進(jìn)行25個(gè)循環(huán)然后72℃ 5分鐘2.6.瓊脂糖凝膠分析為顯示最佳PCR結(jié)果，將10至20μl的PCR樣本及合適的分子量標(biāo)志物(例如100bp梯度PHARMACIA)上樣于1.5％瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)。
2.7.結(jié)果驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植物DNA樣本的單一PCR循環(huán)和單一PCR混合物的數(shù)據(jù)不可采用，除非1)DNA陽(yáng)性對(duì)照顯示預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源片段)，2)PCR擴(kuò)增的DNA陰性對(duì)照為陰性(沒(méi)有片段)以及3)野生型DNA對(duì)照顯示預(yù)期結(jié)果(內(nèi)源片段擴(kuò)增)。
當(dāng)遵循上述GAT-ZM1的PCR鑒定方法時(shí)，顯示可見(jiàn)量的如預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明其對(duì)應(yīng)的植物(由其制備的基因組模板DNA)已遺傳了GAT-ZM1原種事件。未顯示可見(jiàn)量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物但顯示可見(jiàn)量的內(nèi)源PCR產(chǎn)物的泳道表明其對(duì)應(yīng)的植物(由其制備的基因組模板DNA)不包含原種事件。未顯示可見(jiàn)量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的泳道表明基因組DNA的質(zhì)和/或量不能產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。這些植物不予以評(píng)價(jià)。應(yīng)重復(fù)基因組DNA的制備，且必須進(jìn)行具備合適對(duì)照的新一輪PCR循環(huán)。
2.8.使用識(shí)別PCR法鑒定GAT-ZM1在嘗試篩選未知對(duì)象前，需進(jìn)行具有所有適當(dāng)對(duì)照的試驗(yàn)。對(duì)已有的方法，可能需要優(yōu)化在不同的實(shí)驗(yàn)室間可能不同的組分(模板DNA制備物，Taq DNA聚合酶，引物性質(zhì)，dNTP’s，熱循環(huán)儀等)。
在方法中對(duì)內(nèi)源序列的擴(kuò)增起著關(guān)鍵作用。必須達(dá)到的PCR和熱循環(huán)條件為對(duì)已知的轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板，可擴(kuò)增等摩爾量的內(nèi)源序列和轉(zhuǎn)基因序列。在同樣的溴化乙錠染色強(qiáng)度下用瓊脂糖凝膠電泳判斷時(shí)，當(dāng)目標(biāo)內(nèi)源片段未被擴(kuò)增或目標(biāo)序列未被擴(kuò)增時(shí)，需要優(yōu)化PCR條件。
按照上述方法對(duì)來(lái)自一系列植物(其中一些包含GAT-ZM1)的玉蜀黍葉材料進(jìn)行試驗(yàn)。來(lái)自原種事件GAT-ZM1的樣本和來(lái)自玉蜀黍野生型的樣本分別用作陽(yáng)性和陰性對(duì)照。


圖1闡述了用原種事件PCR鑒定法對(duì)一系列玉米植物樣本中GAT-ZM1的鑒定結(jié)果(泳道1至14)。發(fā)現(xiàn)在泳道1，2，5，6，7，8，11，13和14中的樣本含有原種事件，因?yàn)闄z測(cè)到了202bp的條帶，而在泳道4，9，10和12中的樣本不包含GAT-ZM1。泳道3表明PCR失敗，因?yàn)槲礄z測(cè)到對(duì)照條帶。泳道19和20代表GAT-ZM1陽(yáng)性對(duì)照樣本，泳道20和22代表非轉(zhuǎn)基因玉蜀黍?qū)φ?；泳?3代表陰性對(duì)照(水)樣本，以及泳道24為分子量標(biāo)志物(100bp)。
3.用特異整合片段作為探針，以檢測(cè)包含GAT-ZM1的材料用特異性引物COR17(SEQ ID No.11)和COR18(SEQ ID No.12)通過(guò)PCR擴(kuò)增或通過(guò)化學(xué)合成獲得GAT-ZM1的特異整合片段并標(biāo)記。該整合片段作為特異探針，以檢測(cè)在生物樣本中包含的GAT-ZM1。按照標(biāo)準(zhǔn)步驟從樣本中提取核酸。然后在雜交條件下將該核酸與特異探針接觸，其中所述雜交條件為優(yōu)化的，其允許雜交體形成。然后檢測(cè)雜交體的形成，以表明在樣本中存在GAT-ZM1核酸。任選地，樣本中的核酸在與特異探針接觸前，用特異引物擴(kuò)增。另外在與特異探針而非整合片段接觸前標(biāo)記該核酸。任選地，在與樣本接觸前，將該特異探針附著于固相載體(例如但不限于濾膜、條帶或珠)。
序列表序列表<110>阿溫提斯作物科學(xué)公司<120>用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的方法和試劑盒<130>EE-ZM1<140><141><150>US 09/481049<151>2000-01-11<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>3983<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述pUC/Ac的遺傳成分<220><221>終止子<222>(412)..(618)<223>來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S終止子<220><221>misc_feature<222>(619)..(636)<223>合成的多接頭序列<220><221>基因<222>(637)..(1188)<223>合成的pat-基因編碼序列<220><221>啟動(dòng)子<222>(1217)..(1746)<223>來(lái)自花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子<400>1tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgaattc gagctcggta 420cccactggat tttggtttta ggaattagaa attttattga tagaagtatt ttacaaatac 480aaatacatac 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cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg 1380ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat 1440cgcaatgatg gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac 1500agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct 1560caattgccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagcgtgt 1620cgtgctccac catgttgacg aagattttct tcttgtcatt gagtcgtaag agactctgta 1680tgaactgttc gccagtcttt acggcgagtt ctgttaggtc ctctatttga atctttgact 1740ccatgggaat tcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 1800aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 1860gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 1920gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 1980ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 2040atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 2100gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 2160gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 2220gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 2280gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 2340aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 2400ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 2460taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 2520tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 2580gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 2640taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 2700tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 2760tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 2820ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 2880taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 2940tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt 3000cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc 3060gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc 3120cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg 3180ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac 3240aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg 3300atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc 3360tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact 3420gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc 3480aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat 3540acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc 3600ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac 3660tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 3720aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 3780catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 3840atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 3900aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 3960gcgtatcacg aggccctttc gtc 3983<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB286<400>2ngtcgaswga nawgaa 16<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB391<400>3tggatacaag catggtggat gg 22<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB411<400>4aggcatgccg ctgaaatcac c 21<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB420<400>5ggtttcgctc atgtgttgag c 21<210>6<211>1073<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)的序列<220><221>misc feature<222>(1)..(341)<223>植物DNA<220><221>misc_feature<222>(342)..(1073)<223>pUC/Ac的T-DNA<220><221>引物_結(jié)合<222>(286)..(307)<223>引物COR17的結(jié)合位點(diǎn)<220><221>引物_結(jié)合<222>互補(bǔ)序列((466)..(487))<223>引物COR18的結(jié)合位點(diǎn)<400>6cgtcgagtga gatgaagtca cgacggggac tgactgcacc gtcgtctcag gtacgagggt 60gacgtccagc aagcgtttcg cgagcvtgcc ggcgtcgtcc gtttgctcgg gattggcgtg 120tcgcggggag acvgcvchcg tctttgtctc aaacvmgagg tcgatgcccg acgcgccccc 180cgttggggcg ctggcgccgt cgactcgatc gacagccgac gaggcgctgc ctcctgcttg 240accttggttg ccctgcctcc tcctccgtcg gcgggggaga ggacggggtg agctcgaatg 300ttgttcttcc accacgcggg gaagacgtcg tcgattccac cctcatactc ttcctttttc 360aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 420tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 480tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 540ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga 600cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag 660cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc atcagagcag attgtactga 720gagtgcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca 780ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt 840cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc 900cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag tgccaagctt gaattcgagc 960tcggtaccca ctggattttg gttttaggaa ttagaaattt tattgataga agtattttac 1020aaatacaaat acatactaag ggtttcttat atgctcaaca catgagcgaa acc1073<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB439<400>7ctcatggtta tggcagcact gc 22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物VDS44<400>8ctgtcatgcc atccgtaaga tgc 23<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物MDB522<400>9tgctttgaag acgtggttgg 20<210>10<211>484<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述包含GAT-ZM1 3’側(cè)翼區(qū)的序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(342)<223>pUC/Ac的T-DNA<220><221>misc_feature<222>(343)..(484)<223>植物DNA<400>10tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt 60ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttcaacga tggcctttcc tttatcgcaa 120tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt tctactatct tcataataaa gtgacagata 180gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatt 240gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atatttttgg agtagacaag cgtgtcgtgc 300tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc gttccgccat tgtcgctgtc 360gcacggcggt ggaaggagta tcatgtcgta gctgccgtca agctccagat gggcagtctc 420cagcaacctc tccggcccgg gacggtgctc cgtttcggga gtcttgagtt catctcactc 480gacc 484<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物COR17<400>11gggtgagctc gaatgttgtt ct 22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物COR18<400>12tcttagacgt caggtggcac tt 22<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物COR15<400>13agcgtcaagg atcattggtg tc 22<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物COR16<400>14ggccaagttc agcataagct gt 2權(quán)利要求
1.鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的方法，該方法包含用特異性識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測(cè)GAT-ZM1特異區(qū)。
2.權(quán)利要求1的方法，所述方法包含用至少兩條引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)從所述生物樣本中存在的核酸擴(kuò)增出一條在100和350bp之間的DNA片段，其中所述至少兩條引物之一識(shí)別GAT-ZM1的5’或3’側(cè)翼區(qū)，另一條識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述引物之一識(shí)別位于GAT-ZM1 5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，且所述另一條引物識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述引物之一識(shí)別位于SEQ ID No.65’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，且另一條引物識(shí)別位于外源DNA內(nèi)的序列。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述引物分別包含SEQ ID No.11和SEQID No.12的序列。
6.權(quán)利要求2的方法，該方法包含用GAT-ZM1鑒定方法擴(kuò)增出一條在150和220bp之間的片段，其中所述引物序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID No.11和SEQ ID No.12的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求6的方法，該方法包含用GAT-ZM1鑒定方法擴(kuò)增出一條約202bp的片段。
8.用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的試劑盒，所述試劑盒包含至少一條PCR引物，后者識(shí)別位于GAT-ZM1 3’或5’邊界側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列。
9.權(quán)利要求8的試劑盒，其進(jìn)一步包含至少一條第二條PCR引物，后者識(shí)別位于GAT-ZM1的外源DNA內(nèi)的序列。
10.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述至少一條PCR引物識(shí)別位于SEQ IDNo.6的5’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列。
11.權(quán)利要求8的試劑盒，其中所述至少兩條PCR引物分別包含SEQID No.11和SEQ ID No.12的序列。
12.用于GAT-ZM1 PCR鑒定方法的引物，其具有的序列在優(yōu)化的PCR條件下特異性識(shí)別位于GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列。
13.權(quán)利要求12的引物，其具有的序列與SEQ ID No.6或SEQ ID No.10內(nèi)的序列具有至少80％的序列同一性。
14.具有SEQ ID No.11序列的引物。
15.具有SEQ ID No.12序列的引物。
16.權(quán)利要求1的方法，該方法包含將生物樣本的核酸與GAT-ZM1特異探針雜交。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述特異探針的序列與包含部分GAT-ZM1 5’側(cè)翼序列和與其鄰接的外源DNA序列的序列具有至少80％的序列同一性。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述特異探針的序列與SEQ ID No.6從第286至第487位核苷酸具有至少80％的序列同一性。
19.用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的試劑盒，所述試劑盒包含可特異性與GAT-ZM1特異區(qū)雜交的特異探針。
20.權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述特異探針的序列與包含部分GAT-ZM1 5’側(cè)翼序列和與其鄰接的外源DNA序列的序列具有至少80％的序列同一性。
21.權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述特異探針的序列與SEQ ID No.6從第286至第487位核苷酸或其互補(bǔ)序列具有至少80％的序列同一性。
22.用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的特異探針。
23.權(quán)利要求22的探針，其與包含部分GAT-ZM1 5’側(cè)翼序列和與其鄰接的外源DNA序列的序列或所述序列的互補(bǔ)序列具有至少80％的序列同一性。
24.權(quán)利要求23的探針，其與SEQ ID No.6中從第286至第487位核苷酸或其互補(bǔ)序列具有至少80％的序列同一性。
25.用于鑒定生物樣本中原種事件GAT-ZM1的特異探針，其序列基本上類似于SEQ ID No.6中從第286至第487位核苷酸或其互補(bǔ)序列。
26.用于證實(shí)種子純度的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子樣本中的GAT-ZM1特異區(qū)，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)。
27.篩選種子中存在GAT-ZM1的方法，該方法包含用特異引物或探針檢測(cè)種子批次樣本中的GAT-ZM1特異區(qū)，其中所述特異引物或探針可特異識(shí)別GAT-ZM1 5’或3’側(cè)翼區(qū)。
全文摘要
提供了可快速且明確鑒定生物樣本中原種事件GAT－ZM1的手段。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1396957SQ01803610
公開(kāi)日2003年2月12日 申請(qǐng)日期2001年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月11日
發(fā)明者M·德博克勒爾 申請(qǐng)人:拜爾作物科學(xué)公司