專利名稱：細(xì)胞分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離存在于樣品中的微生物的方法，特別是一種分離存在于樣品中的細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
大部分旨在定性和定量分析樣品中微生物存在的現(xiàn)有技術(shù)針對鑒定一種特定的微生物，例如病原體。對用免疫磁性法從食物和臨床樣品中分離利斯特氏菌和沙門氏菌已有描述(見例如Skjerve等，Appl.Environ.Microbiol.1990，3478-3481)。這些技術(shù)依賴于配體的使用，通常是抗體，對所關(guān)心的微生物具有特異性。由于它依賴于使用特異性配體，免疫磁性分離法僅能用于要尋找特定的微生物，而不能用于需要通用篩選可能存在的微生物的情況。免疫磁性分離不容易檢出未知的微生物。
在一些情況下，例如當(dāng)分析環(huán)境樣品，例如水樣時(shí)，需要獲得所存在的不同種類微生物的總體情況，或估測微生物的總濃度。對于供水中可能存在的細(xì)菌總量可設(shè)定限制，這不需要于對特定微生物存在的關(guān)注。鑒定廣泛種類的微生物，例如在河或湖中，可提供關(guān)于該水體的狀態(tài)、營養(yǎng)物水平、農(nóng)用化學(xué)物質(zhì)的排放等的有用信息。
如果可提供一種從樣品中分離微生物的通用方法，就可以在一個(gè)后續(xù)步驟中方便地鑒定特定微生物?；诤怂岬臏y試可方便地用來鑒定特定微生物。
目前用于獲得對存在于樣品中的微生物總量的估計(jì)，或從樣品中分離微生物用于進(jìn)一步分析的方法依賴于粗分離技術(shù)，涉及過濾和/或濃縮，并在瓊脂平板上培養(yǎng)。確定總細(xì)菌濃度可用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)或過濾并在培養(yǎng)皿的通用培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這些方法可需數(shù)天，而且復(fù)雜而不精確。用于分析食物樣品的常規(guī)方法已觀察到特定的問題，因?yàn)檫@些含有大量固態(tài)物質(zhì)(碎屑和脂肪顆粒)，它們將堵塞濾器，隨后的濃縮產(chǎn)生細(xì)菌堆積的團(tuán)塊，不能裂解或與抗體結(jié)合。
因此需要一種能從一種樣品中分離許多不同種類的微生物，優(yōu)選是一個(gè)步驟的方法，它快速并便于進(jìn)行。
發(fā)明簡述本發(fā)明針對這些要求，因此根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面提供了一種從樣品中分離微生物的方法，該方法包括將所述微生物與固相載體通過固定在所述固相載體上的非特異性配體結(jié)合。
本發(fā)明因此通過利用與固相載體結(jié)合的非特異性配體與微生物表面發(fā)現(xiàn)的所述配體的結(jié)合配對(受體)之間的相互作用，提供了一種通用的分離方法，它能捕獲廣泛種類的微生物。由于本發(fā)明的主旨是固定化配體和微生物之間的相互作用，當(dāng)本文提到“分離微生物”時(shí)是指描述以非種和非屬特異性方式分離微生物。換言之，固定化的配體能與幾個(gè)屬的微生物結(jié)合，至少2個(gè)不同屬，優(yōu)選3或以上，更優(yōu)選至少5或7個(gè)不同屬，最優(yōu)選至少10或甚至14個(gè)或以上不同屬。
本發(fā)明因此提供了一種從樣品中的其它成分中分離微生物，尤其是細(xì)菌的通用方法。該方法的“通用”在于不針對一種細(xì)菌而是實(shí)現(xiàn)一個(gè)總體的分離系統(tǒng)來獲得對于所有微生物群的信息，或進(jìn)行第二步，例如用種特異性探針在核酸水平上獲得種特異性信息。
“分離”微生物，因?yàn)樗鼈兣c固相載體結(jié)合，然后可通過取出與其結(jié)合的固相載體，或通過除去，例如排出樣品的剩余物，從樣品的剩余物質(zhì)中分離。在固態(tài)載體是磁性的情況下，操作載體/微生物復(fù)合物是尤其方便的。
本發(fā)明的方法可用于分離各種各樣的微生物，包括所有可與真核細(xì)胞結(jié)合的微生物，包括原生生物、藻類、原生動物和真菌，以及支原體和所有病菌和病毒。本發(fā)明的方法可用于分離真核寄生蟲，特別是那些能與在人細(xì)胞(或其它宿主生物)上發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜多糖相結(jié)合。這些真核寄生蟲包括隱孢子蟲、痢疾內(nèi)變形蟲(Enamoeba histolytica)和瘧原蟲。因此，本文所用的“微生物”應(yīng)包括這些寄生蟲。
本發(fā)明的方法特別適用于分離細(xì)菌。細(xì)菌分類是一種復(fù)雜和時(shí)常變化的科學(xué)，但“真實(shí)的”細(xì)菌(真細(xì)菌)可分成許多，門(Bergey的Manual of DeterminativeBiology)，例如光能利用菌、滑行細(xì)菌、有鞘細(xì)菌和革蘭氏陽性菌。各門還可分為一個(gè)或多個(gè)目，在目中有科和屬。來自一個(gè)以上的屬、科或目或甚至門的細(xì)菌可用本發(fā)明的方法分離?？捎帽景l(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)對樣品中來自下列一些或所有科和屬的細(xì)菌的有效分離氣單胞菌、桿菌、彎曲桿菌、檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、腸桿菌、埃希氏桿菌(病原性或非病原性)、哈夫尼菌、克雷伯氏菌、利斯特氏菌、變形桿菌、沙門氏菌、希瓦氏菌、沙雷氏菌、志賀氏菌、弧菌、耶爾森氏菌、摩根氏菌、發(fā)光桿菌、鏈球菌。乳球菌、葡萄球菌、腸球菌、明串珠菌、片球菌、乳桿菌、索絲菌。
方法可用于同時(shí)分離細(xì)菌和其它類型的微生物，例如藻類、原生動物、真菌或病毒。
在某些情況下，樣品中可能僅含有數(shù)量有限的細(xì)菌種類，該方法可僅有幾種細(xì)菌或甚至僅有一或兩種，通過結(jié)合并從樣品中分離出來。這樣的方法仍然不是特異性分離方法，因?yàn)楣潭ɑ呐潴w能與各種各樣的細(xì)菌結(jié)合，即使可得到的細(xì)菌群非常有限。
事實(shí)上不需要為了進(jìn)行特定的分離方法選擇固相載體特異性-配體復(fù)合物，這提供了靈活性和成本上的顯著優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭稍诟鞣N各樣的分離方法中使用結(jié)合有配體的一種固相載體。因此固相載體的普遍結(jié)合能力是特別有利的。
優(yōu)選本發(fā)明的方法將得到存在于要分離的樣品中的很大部分的微生物(例如細(xì)菌)，不僅在于存在的所有細(xì)菌的比例，還在于細(xì)菌種類的比例。因此，優(yōu)選至少30％，更優(yōu)選至少50％，最優(yōu)選至少70％或80％樣品中的微生物將與固相載體結(jié)合。當(dāng)然，樣品中的微生物百分?jǐn)?shù)將由加到樣品中的固相載體量和配體對微生物的比例決定。針對上述百分?jǐn)?shù)的假定是在混合物中存在過量的固相載體和配體。
從另一方面看，優(yōu)選將分離至少20％存在的不同(例如細(xì)菌)物種，更優(yōu)選至少30-40％的樣品，最優(yōu)選至少50％，特別是至少60或70％或甚至至少80％存在的不同(例如細(xì)菌)物種將與固相載體結(jié)合。
“非特異性”配體將是如上所述的能與一種以上微生物和/或細(xì)菌屬，優(yōu)選大于2或3，更優(yōu)選大于5或7，甚至多于10或14個(gè)不同屬結(jié)合。在配體及其負(fù)責(zé)結(jié)合的微生物表面上的結(jié)合配對之間有相互作用，并不是簡單的細(xì)胞和固相載體之間的一般吸引或結(jié)合，例如當(dāng)細(xì)胞通過沉淀結(jié)合的情況。配體的非特異性特征不是指它是不可分辨的與微生物表面上的分子結(jié)合或聯(lián)系，而是其結(jié)合配對對于某一類或一種微生物不是特異性的。因此配體可視為普遍結(jié)合配體。
由于合適的結(jié)合配對可在不同的微生物，具體是細(xì)菌的不同屬中相對廣泛的找到，提供了一種普遍而非特異性的分離方法。因此雖然配體具有一種或多種特異性結(jié)合配對，但它由于能與各種全部攜帶合適的結(jié)合配對的細(xì)菌結(jié)合仍是“非特異性”的。雖然不希望被理論所限，似乎各種不同的結(jié)合配對本身通常是物種特異性的，但能夠與相同配體結(jié)合，從而提供了不是物種特異性的分離方法。物種特異性的植物凝血素與基于糖的配體能提供一種非物種特異性的分離系統(tǒng)。
結(jié)合配對通常是微生物表面的蛋白質(zhì)，在物種和物種之間可能是不同的。關(guān)于結(jié)合配對知道的不多，但發(fā)明人卻已能鑒定出合適的配體，用于本發(fā)明的方法。
配體是非蛋白質(zhì)的，這樣可排除抗體及其衍生物和片段。與本發(fā)明的非特異性配體相反，這些蛋白配體可以與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)非常特異性地(即屬，特別是物種特異性)相互作用。
優(yōu)選的配體是糖類，包括單糖、寡糖(包括二糖和三糖)和多糖。合適的單糖包括己糖和戊糖，其形式是吡喃糖和呋喃糖形式(如果合適)，以及糖類衍生物例如醛糖糖酸和糖醛酸、脫氧或氨基糖、磺化的糖和糖醇。合適的單糖的例子是甘露糖(例如D-甘露糖)、葡萄糖(例如D-葡萄糖)、果糖、巖藻糖(例如L-巖藻糖)、N-乙酰-葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甲基D-甘露吡喃糖苷(甘露糖苷)、α-甲基-葡糖苷、半乳糖苷、核糖、木糖、阿拉伯糖、糖質(zhì)酸鹽、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、甘油和這些單體的衍生物。其中甘露糖、半乳糖和果糖是優(yōu)選的。
特別優(yōu)選的是寡糖和多糖，它們是單糖單體的聚合物，例如由上述單糖單體組成的聚合物。
寡糖中含有2-12，優(yōu)選4-8個(gè)共價(jià)連接的單糖單元，它們可以是相同或不同的，并且可以是線性或分枝的，優(yōu)選分枝的，例如具有2-6個(gè)單元的寡甘露糖?；溠刻?、蔗糖、海藻糖、纖維二糖和水楊苷，尤其是麥芽糖。產(chǎn)生寡糖的方法在Pan等，Infection and Immunity(1997)，4199-4206中有描述。
多糖中含有13個(gè)或更多共價(jià)連接的單糖單元，它們可以是相同或不同的，可以是線性或分枝的，優(yōu)選分枝的。合適的多糖將富含甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖或糖醛酸，例如半乳糖甘露糖多糖(本文中稱為GUM或GUM1)(Sigma G-0753)，據(jù)信它們是甘露糖的直鏈聚合物，在每隔四個(gè)甘露糖上有一個(gè)半乳糖苷分枝。由甘露糖和半乳糖苷亞基組成的多糖是優(yōu)選的配體類型，另一個(gè)例子是瓜耳膠，它具有β-1，4連接的線性甘露糖骨架鏈，在約每隔1個(gè)單元上有1，6-α連接的半乳糖苷側(cè)鏈。甘露糖與半乳糖的比例是約1.8∶1-約2∶1；在本文所述的實(shí)驗(yàn)中使用的瓜耳膠來自Sigma，目錄參考號G1429。
其它多糖包括據(jù)信是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡糖醛酸的分枝聚合物的Gum Arabic(Sigma G9752)和據(jù)信是半乳糖、鼠李糖和葡糖醛酸的部分乙?；木酆衔锏目ɡz(Sigma G 0503)，以及由甘露糖單元組成的同多糖甘露聚糖。
合適的配體糖衍生物包括肝素、硫酸肝素、硫酸葡聚糖和角叉菜膠(各種形式)。硫酸化的糖是優(yōu)選類型的糖衍生物。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了基于作為微生物營養(yǎng)物，例如糖類的分子的配體提供了合適分離方法。本方法的一個(gè)目標(biāo)是提供一種分離系統(tǒng)，它利用受體/配體相互作用，利用細(xì)菌對于介質(zhì)中營養(yǎng)物存在的激活前反應(yīng)，來增強(qiáng)對微生物的捕獲。也可用作本發(fā)明方法的非特異性配體的其它微生物的營養(yǎng)物包括維生素，例如煙酸、維生素B、硫胺素、吡哆醇、泛酸、葉酸、生物素和鈷胺素，以及鐵螯合分子/化合物，例如高鐵紅血素、乳鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅蛋白和含鐵基團(tuán)，例如產(chǎn)氣菌素(aerobactin)、鐵色素(Sigma F8014)、鐵腸螯合素(ferrienterochelin)、腸菌素和ferrixanine。
在其上固定有能與細(xì)胞(例如微生物)以非特異性方式結(jié)合的配體的固相載體?！胺翘禺愋缘摹比缟隙x(即不是細(xì)胞類型或物種特異性，但仍然依靠與結(jié)合配對的相互作用)，本文根據(jù)方法描述了合適的配體。
在本文中在調(diào)查霍亂弧菌(Vibrio cholerae)的海藻糖敏感性和甘露糖敏感性的凝血作用中，L-海藻糖和D-甘露糖與瓊脂糖珠(Sanchez等，APMIS(1990)98353-357)共價(jià)結(jié)合，因此這些固相載體-配體復(fù)合物不包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。該先前的工作是調(diào)查與僅一種細(xì)菌有關(guān)的非常特異性的相互作用，不是通用的細(xì)菌分離方法。因此在本文的方法中使用這些珠-配體復(fù)合物是本發(fā)明的一個(gè)方面。
固定化的配體優(yōu)選是寡糖或多糖、維生素(例如微生物營養(yǎng)物必需的)或鐵螯合化合物，多糖是特別優(yōu)選的。特別優(yōu)選的配體的例子先前在與方法有關(guān)的討論中有所描述。
雖然本文中提供了一種通用的分離方法，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)摻入一些糖的配體特別適用于分離一些非常廣泛的微生物類型。因此例如，當(dāng)使用含有甘露糖的配體時(shí)，能非常有效的分離存在于腸道中的微生物菌種(配體可以是甘露糖單體或摻入甘露糖的聚合物)，通過肺進(jìn)入的細(xì)菌能用硫酸化的糖作為配體非常有效的分離，感染尿道的細(xì)菌與固定化的葡萄糖(再次，作為單體或摻入聚合物)結(jié)合。在從取自腸或肺的樣品分離細(xì)菌的方法中使用這些配體因此構(gòu)成了本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方面。
可從中分離微生物的樣品包括環(huán)境學(xué)樣品，例如水樣，例如來自湖、河、污水處理站和其它水處理中心的或土壤樣品。方法特別適用于分析食物樣品，一般在健康和衛(wèi)生應(yīng)用中，其中它用于在食品制備的地方監(jiān)測細(xì)菌水平?？煞治隼缛橹破分械睦固厥暇Ｓ霉潭ɑ贵w分離細(xì)菌的常規(guī)技術(shù)已被證明比我們的用非特異性配體分離利斯特氏菌的效果差，可能是由于固定化抗體的疏水性質(zhì)。當(dāng)樣品是水樣時(shí)，配體優(yōu)選是感興趣的微生物的營養(yǎng)物。
可通過首先如需要(如果是固體樣品)勻漿，然后與合適的培養(yǎng)培養(yǎng)基(例如蛋白胨水)在37℃培養(yǎng)過夜分析食物樣品?？捎迷摲椒ǚ治瞿汤?、冰淇淋、雞蛋、人造黃油、魚、蝦、雞肉、牛肉、豬肋排、小麥面粉、麥片、米飯、辣椒、植物如西紅柿、硬花甘藍(lán)、菜豆、花生等和杏仁軟糖等食品。本發(fā)明的方法對于分析食品樣品提供了特別的益處，因?yàn)檫@些含有大量固態(tài)物質(zhì)(碎屑和脂肪顆粒)，它們會堵塞濾器，隨后的濃縮將產(chǎn)生沉淀，其中的細(xì)菌堆積，不能裂解或與抗體結(jié)合。
可根據(jù)本發(fā)明分離出微生物的樣品可以是來自人或動物體的臨床樣品。合適的樣品包括全血和衍生自血液產(chǎn)品、尿、糞便、腦脊液或任何其它體液，以及組織樣品和從例如拭刮腔體獲得的樣品。
樣品還可以包括較純或特別純化的起始物質(zhì)，例如從其它細(xì)胞分離過程獲得的半純化的制備物。
還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的固相載體和方法可用于從樣品非選擇性分離真核細(xì)胞。方法的“非選擇性”在于分離不針對一種細(xì)胞類型。根據(jù)這些方法可分離至少2種，優(yōu)選3或多種，4或多種，甚至6或多種不同的真核細(xì)胞類型。
因此在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種從樣品分離真核細(xì)胞的方法，該方法包括使所述真核細(xì)胞通過固定在所述固相載體上的非特異性配體與固相載體結(jié)合。合適的可分離的真核細(xì)胞是在其表面具有植物凝血素，與多糖結(jié)合的那些細(xì)胞。當(dāng)用于從血液或血液衍生的樣品，從骨髓或事實(shí)上含有白血細(xì)胞的任何組織或體液捕獲所有類型的白血細(xì)胞時(shí)，這些方法可以具有特別的實(shí)用性。為了該應(yīng)用，特別適合的配體包括角叉菜膠及其衍生物、硫酸化的多糖(糖胺聚糖)例如硫酸葡聚糖、肝素和硫酸肝素。
根據(jù)本發(fā)明的方法，至少B-細(xì)胞和單核細(xì)胞，優(yōu)選大部分(如果不是所有的)類型的白血細(xì)胞可通過相同的珠分離。紅血細(xì)胞優(yōu)選不被捕獲。該方法通常是從樣品分離DNA的預(yù)備步驟。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的方法，從血液中分離DNA是通過直接裂解樣品和捕獲DNA實(shí)現(xiàn)的。這種技術(shù)將裂解存在的全部細(xì)胞，而根據(jù)本發(fā)明的方法，白細(xì)胞的結(jié)合使得感興趣的細(xì)胞被初步濃縮?；诳贵w的分離系統(tǒng)不能普遍的捕獲白血細(xì)胞。以類似方式，其它類型的細(xì)胞可從真核樣品中分離。
本發(fā)明因此提供了細(xì)胞分離方法，其中“細(xì)胞”可以是真核或原核的，術(shù)語“細(xì)胞”包括所有之前限定的微生物。
用于本發(fā)明的合適固相載體可以是任何熟知的載體或基質(zhì)，它們目前被廣泛使用或用于固定化、分離等。這些可以采用顆粒、片層、凝膠、濾膜、膜、纖維、毛細(xì)管或微量滴定條、管、平板或孔等形式。
載體可方便的地使用玻璃、二氧化硅、乳膠或聚合材料制造。優(yōu)選是提供細(xì)胞，然后是核酸結(jié)合的高表面積的材料。這些載體通常具有不規(guī)則的表面，可以是例如多孔或顆粒狀的，例如顆粒、纖維、網(wǎng)、燒結(jié)體或篩。顆粒材料例如珠是通常優(yōu)選的，因?yàn)槠漭^大的結(jié)合能力，特別是聚合物的珠。
為了方便，本發(fā)明所用的顆粒狀固相載體是球狀珠。珠的大小不是關(guān)鍵的，但它們可以是例如直徑至少是1，優(yōu)選至少2微米數(shù)量級的，具有最大直徑優(yōu)選不超過10和更優(yōu)選不超過6微米。例如，2.8微米和4.5微米直徑的珠已顯示起到良好的作用。
適用于本發(fā)明的方法的非磁性聚合物珠購自Dyno ParticlesAS(lillestrom，Norway)以及來自Qiagen、Pharmacia和Serotec。
然而，為了幫助操作和分離，磁珠是優(yōu)選的。本文所用的術(shù)語“磁珠”意味著當(dāng)置于磁場中時(shí)，載體能具有磁矩，因此能在該場的作用下去除。換言之，作為磁性顆粒的載體不難通過磁力聚集取出，提供了一種在細(xì)胞和核酸結(jié)合步驟后快速、簡單和有效的分離顆粒的方法，而且比常規(guī)技術(shù)例如離心等方法溫和的多，后者產(chǎn)生剪切力，可破壞細(xì)胞或降解核酸。
因此用本發(fā)明的方法，結(jié)合有細(xì)胞的磁性顆?？赏ㄟ^施加磁場(例如用永磁鐵)移動到合適的表面上。通常在含有樣品混合物的一側(cè)施加磁性足夠使顆粒聚集在容器壁上，倒掉樣品的剩余物。
尤其優(yōu)選的是超順磁性顆粒，例如那些Sintef在EP-A-106873中描述的，因?yàn)樵诜磻?yīng)過程中可避免磁力聚集和顆粒聚叢，從而確保均勻和核酸抽提。熟知的Dynal AS(Oslo，Norway)出售的磁性顆粒，稱為DYNABEADS適用于本發(fā)明。
用于本發(fā)明的官能化包裹的顆?？赏ㄟ^根據(jù)美國專利4,336,173、4,459,378和4,654,267修飾制備。因此，可制備具有不同類型的官能化表面，例如帶正電或負(fù)電，親水或疏水的珠或其它載體。
顆粒優(yōu)選提供結(jié)合的大表面積，因此可以是小而不光滑的。固相載體的表面優(yōu)選(在配體固定化之前或之后)不是疏水的。
在本發(fā)明的方法中用作固相載體的特別優(yōu)選的顆粒是球形聚合物顆粒(珠)，基于PVA(聚乙烯醇)，其中包裹了磁性膠體。這些珠可通過將含有磁性膠體的聚合物相懸浮在含有乳化劑的植物油相中制備，如CA 2,227,608所述。尺寸可在1-8微米之間變化的顆粒優(yōu)選購自Chemagen AG，Germany。
可用合適的緩沖液等作為分離的介質(zhì)，來獲得適合結(jié)合的條件。為了方便，可在樣品中在與固相載體接觸前，同時(shí)或后加入具有合適的電荷、滲透壓等的緩沖液。PBS是合適的細(xì)胞結(jié)合緩沖液。
配體與固相載體結(jié)合的方法是本領(lǐng)域熟知的。通常固相載體首先被活化，然后與配體反應(yīng)，配體本身可稍微修飾，用于與固相載體共價(jià)結(jié)合。就上述Chemagen的超順磁性珠而言，可通過8原子間隔臂引入異氰酸酯官能團(tuán)，活化聚乙烯醇基質(zhì)。這些活化的珠(M-PVA A k2x)然后可用于直接偶聯(lián)含有氨基或羥基官能團(tuán)的分子。典型的偶聯(lián)反應(yīng)如下珠-NCO + R- OH→ 活化的珠 具有羥基的糖類糖類的氨基甲酸酯
Chemagen擁有關(guān)于通過偶聯(lián)修飾其珠的專利。
為了調(diào)查細(xì)胞的結(jié)合和需要特定微生物的定性或定量信息的情況下，可進(jìn)行另一個(gè)鑒定步驟。如上所述的通用細(xì)胞分離法與物種特異性檢測法的聯(lián)合代表了一種特別優(yōu)選的本發(fā)明的實(shí)施例。
可通過分析微生物的核酸或用其它本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)，例如用對于一些類型的微生物特異性的標(biāo)記的抗體，調(diào)查結(jié)合的微生物的身份。為了方便，細(xì)胞與固相載體結(jié)合后，可通過PCR等分離和分析微生物-珠復(fù)合物的核酸。因此，在微生物與所述固相載體結(jié)合后，將有一個(gè)細(xì)胞裂解步驟，從微生物中釋放出核酸，然后分析?？稍谌芤褐蟹治鲠尫诺暮怂?，但在它與固相載體結(jié)合后更便于分析，該固相載體可以是相同或不同的，但優(yōu)選與微生物本身結(jié)合的固相載體相同。因此，在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分析含微生物的樣品的方法，所述方法包括(a)使所述微生物通過固定在所述固相載體上的非特異性配體與固相載體結(jié)合；和(b)鑒定與所述固相載體結(jié)合的微生物。
用(c)裂解微生物；和可任選的(d)使所述裂解的微生物釋放的核酸與固相載體結(jié)合方便的進(jìn)行步驟(b)。
從另一方面看，本發(fā)明提供了一種檢測樣品中一種細(xì)胞類型或微生物的方法，所述方法包括上述步驟(a)和(b)。
裂解微生物，結(jié)合因此釋放的核酸和分析核酸的合適方法在WO98/51693中提供，在此引入以供參考。因此本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種從細(xì)胞樣品分離核酸的方法，所述方法包括(a)使所述樣品中的細(xì)胞與固相載體通過固定在所述固相載體上的非特異性配體結(jié)合；(b)裂解結(jié)合的細(xì)胞；和(c)使從所述裂解的細(xì)胞釋放的核酸與固相載體結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是一種檢測樣品中靶細(xì)胞存在或不存在的方法，所述方法包括(a)使所述樣品中的細(xì)胞通過固定在所述固相載體上的非特異性配體與固相載體結(jié)合；(b)裂解結(jié)合的細(xì)胞；(c)使所述裂解的細(xì)胞釋放的核酸與固相載體結(jié)合；和(d)在所述結(jié)合的核酸中檢測所述靶細(xì)胞的特征性核酸的存在與否。優(yōu)選細(xì)胞、配體和固相載體如上所述。
核酸可以是DNA、RNA或任何天然存在或其合成的修飾物，及其組合。然而優(yōu)選核酸是DNA，它可以是單鏈或雙鏈或任何其它形式，例如線性或環(huán)形的。
結(jié)合后，裂解分離的或載體結(jié)合的微生物，釋放其核酸。細(xì)胞裂解的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且在文獻(xiàn)中廣泛描述，可使用任何已知的方法。不同的方法可對于不同的微生物更適用，但是可使用任何下列的方法用SDS、LiDS或十二烷基肌氨酸鈉在合適的緩沖液中去污劑裂解；用擾動試劑，例如鹽酸胍(GHCl)、硫氰酸胍GTC)、碘化鈉(NaI)、過氯酸鹽等；機(jī)械破壞，例如用弗式壓碎器、超聲、用玻璃珠、氧化鋁或在液氮中研磨；酶裂解，例如用溶菌酶、蛋白酶、鏈霉蛋白酶或纖維素酶或任何其它市售的裂解酶；用噬菌體或病毒感染裂解細(xì)胞；凍干；滲透壓休克；微波處理；溫度處理；如用熱或煮沸，或在干冰中或液氮中冷凍等，和融化；堿裂解。如上所述，所有這些方法是標(biāo)準(zhǔn)裂解技術(shù)和本領(lǐng)域熟知的，可使用任何這些方法和方法的組合。
為了方便，可根據(jù)本發(fā)明通過使用擾動試劑和/或去污劑實(shí)現(xiàn)裂解。例如，在細(xì)菌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)用去污劑和擾動試劑的組合特別有效。因此示范性合適的裂解劑包括GTC或GHCl等擾動試劑和SDS或十二烷基肌氨酸鈉等去污劑。裂解劑可以簡單的水溶液提供，或它們可包含在緩沖溶液中形成所謂的“裂解緩沖液”?？墒褂萌魏魏线m的緩沖液，包括例如Tris、Bicine、Tricine和磷酸緩沖液。還可分別加入裂解劑。裂解劑的合適濃度和量將根據(jù)精確的系統(tǒng)、要求的性質(zhì)變化，可以合適的測定，但可使用例如2-7M的擾動試劑，例如GTC、GHCl、NaI或過氯酸鹽，和0.1M-1M堿性劑例如NaOH，和0.1-50％(w/v)，例如0.5-15％去污劑。因此，合適的代表性裂解緩沖液的例子包括4M GTC，1％(w/v)的十二烷基肌氨酸鈉的水溶液。
分離的，載體結(jié)合的微生物，可以方便地從樣品的剩余部分中取出或分離，從而濃縮或富集細(xì)胞。因此細(xì)胞結(jié)合步驟用于富集細(xì)胞或濃縮成比最初樣品小的體積。然后加入含有所需裂解劑的合適裂解緩沖液或?qū)⒎蛛x的細(xì)胞置于所需的裂解條件下，方便的實(shí)現(xiàn)裂解。例如，就簡單加入含有合適裂解劑的裂解緩沖液而言，分離的細(xì)胞可簡單的在裂解緩沖液存在下保溫合適的時(shí)間，使得裂解發(fā)生。不同的保溫條件適合不同的裂解系統(tǒng)，是本領(lǐng)域已知的。例如對于含去污劑和/或擾動試劑的裂解緩沖液，可在室溫或在更高的溫度下，例如37℃-65℃進(jìn)行保溫。類似的，保溫時(shí)間可從幾分鐘，例如5或10分鐘到幾小時(shí)，例如1-2小時(shí)變化。就GTC/十二烷基肌氨酸鈉裂解緩沖液和細(xì)菌細(xì)胞而言，在例如65℃培養(yǎng)10-20分鐘被發(fā)現(xiàn)是適合的，但這當(dāng)然可以根據(jù)需要變化。對于酶裂解，例如用蛋白酶K等，需要更長的處理時(shí)間，例如過夜。
裂解后，方便地將釋放的核酸與固相載體結(jié)合，優(yōu)選結(jié)合了裂解的微生物的載體。雖然可提供例如混合的珠群，其中一些具有與微生物非特異性結(jié)合的配體，其它適合結(jié)合核酸。
可用本領(lǐng)域已知的用于將核酸與固相載體結(jié)合的任何方法實(shí)現(xiàn)對該核酸的結(jié)合。為了方便，核酸非特異性的結(jié)合于載體，即不依賴于序列。因此，例如釋放的核酸可用任何已知的核酸沉淀劑，例如醇、醇/鹽組合、聚乙二醇(PEG)等沉淀在載體上。核酸以該方式在珠上的沉淀在WO91/12079上有所描述。因此，可在載體上加入鹽，在溶液中釋放核酸，然后加入醇，它導(dǎo)致核酸沉淀。另外，可一起加入鹽和醇，或省略鹽。如上所述關(guān)于細(xì)胞結(jié)合步驟，可使用任何合適的醇或鹽，不難確定合適的量或濃度。
其它非特異性核酸結(jié)合技術(shù)包括使用Dynal AS的WO96/18731所述的去污劑(所謂的“DNA針對性”方法)和用擾動試劑和核酸結(jié)合固相，例如二氧化硅顆粒，如Akzo，N.V.在EP-A-0389063中所述。
核酸與載體的離子結(jié)合可通過使用具有帶電表面的固相載體實(shí)現(xiàn)，例如用聚胺包裹的載體。
用于本發(fā)明的方法的載體還可以攜帶官能團(tuán)，它幫助核酸的特異性或非特異性結(jié)合，例如DNA結(jié)合蛋白，如亮氨酸拉鏈或組蛋白或插入染料(如溴乙錠或Hoechst 42945)它們能包裹在載體上。
類似的，可提供具有結(jié)合配對的載體，來幫助選擇性捕獲核酸。例如，可使用互補(bǔ)的DNA或RNA序列，或DNA結(jié)合蛋白，或與病毒核酸結(jié)合的病毒蛋白。這些蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合可以用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的沉淀核酸的簡便方法是通過在含有載體和裂解細(xì)胞的混合物中加入沉淀劑，例如醇。因此可簡單的將合適體積的醇，例如100％或96％乙醇加到混合物中，保溫足夠的時(shí)間，使釋放的核酸與載體結(jié)合。該步驟的保溫條件不是關(guān)鍵的，可簡單的在室溫下保溫5-10分鐘。然而時(shí)間的長短可以變化，溫度根據(jù)選擇提高。
雖然不必要，可方便地在本發(fā)明的分離方法中，例如在核酸結(jié)合步驟后引入一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。可使用任何常規(guī)的洗滌緩沖液或其它基質(zhì)。一般說，優(yōu)選低至溫和離子強(qiáng)度的緩沖液，例如pH8.0的10mM Tris-HCl/10mM NaCl。可使用其它標(biāo)準(zhǔn)洗滌介質(zhì)，例如含醇的，如需要例如用70％乙醇洗滌。
使用磁性顆?？珊喕礈觳襟E，簡單地通過聚集顆粒，取出結(jié)合核酸的介質(zhì)，加入洗滌介質(zhì)，重新聚集顆粒如需要的許多次數(shù)。
在核酸分離步驟和任何可能需要的任選洗滌步驟后，將攜帶結(jié)合的核酸的載體轉(zhuǎn)移，例如重懸浮或浸入任何合適的介質(zhì)，例如水或低離子強(qiáng)度緩沖液中。由載體和任何所需的隨后加工的性質(zhì)決定，可能或不可能需要從載體上釋放核酸。
在顆粒狀固相載體例如磁性或非磁性珠的情況下，這可以在許多情況下直接使用，例如在PCR或其它擴(kuò)增中，不用從載體洗脫核酸。另外對于許多DNA檢測或鑒定方法，洗脫不是必需的，雖然DNA可能隨機(jī)與珠表面接觸，并在許多點(diǎn)通過氫鍵或離子或其它力鍵合，但是通常足夠長度的DNA能與寡核苷酸雜交和擴(kuò)增。
然而如需要，可用已知方法，例如加熱到例如70-90℃5-10分鐘，然后可從介質(zhì)中取出載體，核酸留在溶液中。該加熱可自動在PCR中通過循環(huán)程序前的DNA變性步驟獲得的。
如果需要從DNA中除去RNA，這可以通過在DNA分離步驟前破壞RNA，例如通過加入RNAase或堿，例如NaOH實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是它能快速和簡單地進(jìn)行，該方法的簡便實(shí)現(xiàn)樣品的高通量。
本發(fā)明有利的適合自動化，特別是如果顆粒尤其是磁性顆粒用作載體。
如上所述，本發(fā)明的方法作為制備核酸，用于基于核酸的檢測方法的預(yù)先第一步有特別的實(shí)用性。
如上所述，在進(jìn)行檢測步驟前，有利結(jié)合的核酸不需要被洗脫或從載體上除去，雖然如需要這可以進(jìn)行。核酸是否被洗脫還可以由在核酸結(jié)合步驟中使用的特定方法決定。因此某些核酸結(jié)合的步驟將與核酸的結(jié)合比其它更緊密。在使用例如去污劑(例如DNA Direct)的DNA結(jié)合情況下，當(dāng)引入洗脫緩沖液或其它合適的介質(zhì)時(shí)，從固相載體上洗脫核酸。通過沉淀劑，例如醇或擾動試劑結(jié)合的核酸將維持更緊密的結(jié)合，當(dāng)置于緩沖介質(zhì)中時(shí)，可不洗脫，也可需要加熱洗脫。
因此，可直接在基于核酸的檢測過程中使用載體結(jié)合的核酸，尤其是如果載體是顆粒狀的，簡單的通過將載體懸浮在，或加入到適合檢測步驟的介質(zhì)中。不論核酸是洗脫入介質(zhì)或如上所述，它都不是必需洗脫的。當(dāng)用硫酸化的糖作為配體時(shí)，洗脫是優(yōu)選的。
檢測核酸的許多不同技術(shù)是已知的，在文獻(xiàn)中有所描述，可根據(jù)本發(fā)明使用任何這些方法。在最簡單的情況下可通過與探針雜交檢測核酸，已描述了許多這樣的雜交方案(見例如Sambrook等，1989，Molecular Cloning，A LaboratoryMannual，第二版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)。最常用的，檢測涉及原位雜交步驟，和/或用任何文獻(xiàn)所述的方法體外擴(kuò)增的步驟。因此如提到的，可使用LAR、3SR和Q-β-復(fù)制酶系統(tǒng)等技術(shù)。然而，PCR及其各種變化，例如用嵌套引物，一般是選擇的方法(見例如Abramon和Myers，1993，CurrentOpinion in Biotechnology，441-47，對于核酸擴(kuò)增技術(shù)的綜述)。
其它檢測方法可基于測序法，例如小測序法，如Syvnen和Sderlund，1990，Genomics，8684-692所述。
在擴(kuò)增技術(shù)例如PCR中，在第一步解開DNA雙鏈所需的加熱可從載體上釋放出所結(jié)合的DNA。因此就隨后的檢測步驟，例如PCR而言，可直接將載體結(jié)合的核酸加到反應(yīng)混合物中，核酸可在檢測步驟的第一步洗脫。根據(jù)本發(fā)明獲得的整個(gè)分離的載體結(jié)合的核酸樣品，可用于檢測步驟或等份。
可用許多本領(lǐng)域描述的方法檢測或可視化PCR或其它檢測步驟的結(jié)果。例如PCR或其它擴(kuò)增產(chǎn)物可用已知技術(shù)走電泳膠，如溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠。另外，可用DIANA系統(tǒng)，它是嵌套引物技術(shù)的修改。在DIANA(固定化的擴(kuò)增的核酸的檢測)系統(tǒng)(見Wahlberg等，Mol.Cell Probes 4285(1990))中，內(nèi)部的第二對引物分別攜帶固定化能捕獲擴(kuò)增的DNA的序列和一種標(biāo)記或結(jié)合標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)識別的分子。這提供了減少背景信號和迅速和方便的檢測擴(kuò)增DNA的雙重優(yōu)點(diǎn)。實(shí)時(shí)PCR分析可用于DNA檢測，例如5’核酸PCR法或使用熒光探針的技術(shù)。
還可用測序，用任意的許多不同的現(xiàn)有的測序技術(shù)，例如標(biāo)準(zhǔn)測序、固相測序、循環(huán)測序、自動測序和小測序檢測擴(kuò)增的核酸或確定結(jié)果。
進(jìn)行本發(fā)明的方法所需的各種反應(yīng)劑和成分可以方便的以試劑盒形式提供。該試劑盒代表了本發(fā)明的另一個(gè)方面。
以最簡單的形式，本發(fā)明的該方面提供了從樣品分離微生物的試劑盒，包括(a)具有在其上固定有配體的固相載體，所述配體能與微生物非特異性結(jié)合；(b)將微生物與所述固相載體結(jié)合的工具；可任選的(c)裂解所述細(xì)胞的工具；和可任選的(d)使從所述裂解的細(xì)胞上釋放的核酸與固相載體結(jié)合的工具。
各種方法(b)、(c)和(d)可以如所述和如上關(guān)于本發(fā)明的方法討論的。
典型的試劑盒可含有固相載體，例如用多糖，例如GUM1和緩沖劑，例如PBS和裂解緩沖液包裹的顆粒。
另一種可任選的成分是(e)，用于檢測靶微生物特征性核酸存在或不存在的工具。如上所述，這些工具可包括合適的探針或引物寡核苷酸序列，用于基于雜交和/或擴(kuò)增的檢測技術(shù)。
可任選的還包括在這些試劑盒中的有緩沖劑、鹽、聚合物、酶等。
本發(fā)明的試劑盒在抽提細(xì)菌和分離DNA用于PCR擴(kuò)增中具有很大是實(shí)際利用性。使用該試劑盒的合適方案如下，假定選擇磁性或可磁化的珠作為固相載體(a)-合并結(jié)合緩沖液(b)和珠，加入來自過夜培養(yǎng)物的樣品并在例如Eppendorf管中混合，-置于磁力的影響下，使細(xì)菌/珠混合物移動到管子一側(cè)，-吹干并丟棄上清液，-加入裂解緩沖液(c)并在乙醇中保溫，-用磁力從上清液中分離珠，吹干并丟棄上清液，-洗滌珠并除去上清液，
-重懸浮珠/DNA用于PCR。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了用本文所述的固相載體從樣品中粗分離細(xì)胞。分離是“粗的”，因?yàn)樗皇羌?xì)胞特異性分離方法，而是一種從樣品中的其它組分中分離細(xì)胞的通用方法。先前用過濾或沉淀實(shí)現(xiàn)了這些方法。相反，本文所述的固相載體可用于合并配體-受體結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，但不是以物種或細(xì)胞類型特異性方式。如本文所述，與固相載體結(jié)合的配體能與樣品中的顯著部分，如果不是全部的微生物類型(例如不同的細(xì)菌物種)或真核細(xì)胞類型結(jié)合，以實(shí)現(xiàn)從總樣品中粗分離。
附圖簡述本發(fā)明現(xiàn)在將以下列非限制性實(shí)施例參考附圖作更詳細(xì)描述，其中

圖1是凝膠照片，顯示與包裹有甘露糖、麥芽糖和GUM1的珠結(jié)合的細(xì)菌(大腸桿菌)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖2是凝膠照片，顯示與包裹和未包裹的珠結(jié)合的細(xì)菌(蠟狀芽孢桿菌(B.cereus))的核酸的PCR產(chǎn)物；圖3是凝膠照片，表明各種各樣細(xì)菌與GUM1包裹的珠的結(jié)合；圖4是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的霍亂弧菌的核酸的PCR產(chǎn)物；圖5是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的弗式志賀氏菌(Shigellaflexneri)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖6是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的大腸桿菌的核酸的PCR產(chǎn)物；圖7是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖8是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖9是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖10是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrheae)的核酸的PCR產(chǎn)物；圖11是凝膠照片，顯示與各種包裹的珠結(jié)合的人白血細(xì)胞的核酸的PCR產(chǎn)物；
圖12是凝膠照片，顯示與各種包裹或未包裹的Dynabeads結(jié)合的大腸桿菌的核酸的PCR產(chǎn)物；圖13是凝膠照片，顯示與各種GUM1包裹的Dynabeads結(jié)合的各種細(xì)菌的核酸的PCR產(chǎn)物；實(shí)施例實(shí)施例1糖類包裹的顆粒的制備和細(xì)胞結(jié)合性質(zhì)的測試將化合物偶聯(lián)在M-PVA OCN-活化的珠(Chemagen AG)上。反應(yīng)珠-NCO + R- OH→ 活化的珠 具有羥基的糖類 糖類的氨基甲酸酯(urethar)修飾的珠與不同細(xì)菌培養(yǎng)物，與純的未稀釋培養(yǎng)物(o.n.)或稀釋在水中或緩沖液(PBS)中的培養(yǎng)物一起保溫。為了調(diào)查細(xì)胞結(jié)合，從細(xì)菌-珠復(fù)合物中分離出DNA，然后進(jìn)行PCR分析。參考WO98/51693。用Chemagen進(jìn)行該偶聯(lián)反應(yīng)，得到的修飾的珠用于本文所述的本發(fā)明的分離方法。
實(shí)施例2在珠上分離細(xì)菌和鑒定特定細(xì)菌的方法在100毫升胰蛋白胨大豆肉湯中30℃不攪拌培養(yǎng)細(xì)菌過夜?；旌?00微升PBS(結(jié)合緩沖液)和10微升本發(fā)明的珠(10毫克/毫升)，然后加入100毫升過夜培養(yǎng)物，用滴管吹打，溫和攪拌。用磁性分離器除去上清液，將珠-細(xì)菌復(fù)合物重新懸浮在50微升裂解緩沖液(4M硫氰酸胍-1％十二烷基肌氨酸鈉)中。樣品開蓋在65℃保溫5分鐘。
然后加入100微升96％乙醇，繼續(xù)閉蓋保溫5分鐘。用磁性分離器除去上清液，用1毫升70％乙醇洗滌DNA樣品兩次。
將珠-DNA樣品重懸浮在45微升水中，在65℃開蓋保溫15分鐘，除去所有痕量乙醇(或者加入5微升水來濕潤珠，然后在65℃保溫5分鐘)。用50微升PCR純化20微升純化的物質(zhì)。
為了鑒定分離的細(xì)菌，進(jìn)行具有物種或組特異性引物(X和Y)PCR擴(kuò)增。
下文的表1提供了用于不同細(xì)菌的合適的引物。
表1
在50微升體積中進(jìn)行PCR擴(kuò)增水-17.5微升；dNTP2mM-5微升；10x緩沖液DynaZyme-5微升；引物x(10pmol/微升)-1微升；引物y10pmol/微升-1微升；酶Dynazyme 2U/微升-0.5微升；模板-20微升。溫度程序是94℃-4分鐘，然后35個(gè)循環(huán)，溫度為96℃-15秒；56℃-30秒；72℃-1分鐘；然后72℃-7分鐘。
通過瓊脂糖凝膠電泳可視化PCR產(chǎn)物。
實(shí)施例3用其上偶聯(lián)有D-甘露糖的M-PVA珠進(jìn)行實(shí)施例2的方案。
顯示珠與桿菌、大腸桿菌(病原體和非病原體)、利斯特氏菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌結(jié)合。
實(shí)施例4用其上偶聯(lián)有麥芽糖的M-PVA珠進(jìn)行實(shí)施例2的方案。
顯示珠與桿菌、大腸桿菌(病原體和非病原體)、利斯特氏菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌結(jié)合。
實(shí)施例5用其上偶聯(lián)有半乳糖甘露聚糖多糖(GUM1)的M-PVA珠進(jìn)行實(shí)施例2的方案。
顯示珠特別與氣單胞菌、桿菌、彎曲桿菌、檸檬酸桿菌、芽孢桿菌、腸桿菌、大腸桿菌(病原體和非病原體)、哈夫尼菌、克雷伯氏菌、利斯特氏菌、變形桿菌、沙門氏菌、希瓦氏菌、沙雷氏菌、志賀氏菌、弧菌、耶爾森氏菌結(jié)合。
這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可在圖3的凝膠照片中可見。顯示了PCR產(chǎn)物的條帶，表明根據(jù)下列圖表特定細(xì)菌與珠結(jié)合。
泳道1，DNA標(biāo)記(GeneRulerTM 100bp DNA序列梯，F(xiàn)ermetas)；泳道2-3，分別是肺炎克雷伯氏菌(Klebesiella pneumoniae)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌(K.oxytoca)；泳道4-6，分別是弗式志賀氏菌、索氏志賀氏菌(S.sonnei)和鮑氏志賀氏菌(S.boydii)；泳道7-8和12-13，霍亂弧菌(泳道7和12)、創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)(泳道8)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)；泳道9，蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)；泳道10-11，分別是溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)；
泳道12-13，弧菌，見上；泳道14，普通變形菌(Proteus vulgaris)；泳道15-16，分別是鼠傷寒沙門氏菌和豬霍亂沙門氏菌豬霍亂亞種(S.enterica ssp enteritidis)；泳道17-18和41-44，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolotica)(泳道17-18血清型未知)，血清型09(泳道42)、08(泳道43)、和03(泳道44)和假結(jié)核耶爾森氏菌(Y.pseudotuberculosis)泳道41；泳道19，大腸桿菌；泳道20-21，分別是無害利斯特氏菌(Listeria innocua)和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(L.monocytogenes)；泳道22-23和38-39，蠟狀芽孢桿菌(泳道22)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)(泳道23)和簡單芽孢桿菌(B.simplex)(泳道38-39)；泳道24，弗式檸檬酸桿菌(Citrobacter freudii)；泳道25-26，分別是產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)和索氏芽孢梭菌(C.sordelli)；泳道27-30，大腸桿菌，病原性；泳道31-37，空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)(泳道31)和紅嘴鷗彎曲桿菌(C.lari)(泳道32-37)；泳道38-39，桿菌，見上；泳道40，熱殺索絲菌(Bronchothrix thermosphacta)；泳道41-44，耶爾森氏菌，見上；泳道45-47，分別是阪崎腸桿菌(Enterobacter sakazakii)、產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)和陰溝腸桿菌(E.cloacae)；泳道48，摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)；泳道49，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)；泳道50-52，腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)；泳道53-54，分別是明亮發(fā)光桿菌(Photobacterium phosphoreum)和美人魚發(fā)光桿菌(P.damsela)；泳道55，嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)；
泳道56，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；泳道57，沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)；泳道58，糞腸球菌(Enterococcus faecalis)；泳道59-60，腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)；泳道61-64，乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)(泳道61-62)和有害片球菌(P.damnosus)(泳道63-64)；泳道65-69，嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)(泳道65、68和69)和植物乳桿菌(L.plantarum)(泳道66-67)。
實(shí)施例6用實(shí)施例3、4和5的珠和Dynabeads M-280(dynal，Norway)(未激活)從過夜培養(yǎng)物中分離大腸桿菌。在裂解釋放核酸后，用引物U59/L673(見表1)擴(kuò)增約600bp的大腸桿菌DNA序列。
圖1顯示了結(jié)果，其中泳道2-5，使用15微升模板，在泳道7-10中，用5微升模板；泳道1和6，DNA標(biāo)記φx174/HaeIII；泳道2和7，甘露糖包裹的珠；泳道3和8，麥芽糖包裹的珠；泳道4和9，GUM1包裹的珠；泳道5和10，DynabeadsM-280已活化。
實(shí)施例7用實(shí)施例5的珠和未包裹的珠(稱為UNC)分離來自2毫升過夜培養(yǎng)物(100微升TSB，30℃)分離蠟狀芽孢桿菌ATCC14579，根據(jù)下列稀釋泳道1，DNA標(biāo)記φx174/HaeIII；泳道2，100微克UNC，未稀釋的培養(yǎng)物；泳道3，50微克GUM1，101稀釋的培養(yǎng)物；泳道4，100微克GUM1，101稀釋的培養(yǎng)物；泳道5，200微克GUM1，101稀釋的培養(yǎng)物；
泳道6，100微克UNC，101稀釋的培養(yǎng)物；泳道7，50微克GUM1，102稀釋的培養(yǎng)物；泳道8，100微克GUM1，102稀釋的培養(yǎng)物；泳道9，200微克GUM1，102稀釋的培養(yǎng)物；泳道10，100微克UNC，103稀釋的培養(yǎng)物；泳道11，50微克GUM1，103稀釋的培養(yǎng)物；泳道12，100微克GUM1，103稀釋的培養(yǎng)物；泳道13，DNA標(biāo)記φx174/HaeIII；泳道14，200微克GUM1，103稀釋的培養(yǎng)物；泳道15，100微克UNC，103稀釋的培養(yǎng)物；泳道16，50微克GUM1，104稀釋的培養(yǎng)物；泳道17，100微克GUM1，104稀釋的培養(yǎng)物；泳道18，200微克GUM1，104稀釋的培養(yǎng)物；泳道19，100微克UNC，104稀釋的培養(yǎng)物；泳道20，50微克GUM1，105稀釋的培養(yǎng)物；泳道21，100微克GUM1，105稀釋的培養(yǎng)物；泳道22，200微克GUM1，105稀釋的培養(yǎng)物；泳道23，100微克UNC，105稀釋的培養(yǎng)物。
裂解釋放核酸后，用引物U552/L1254(見表1)擴(kuò)增約600bp的蠟狀芽孢桿菌序列。結(jié)果如圖2所示。101稀釋的結(jié)果將作為錯(cuò)誤出現(xiàn)，因?yàn)?0微克GUM1和200微克GUM1在檢測核酸中都得到了陽性的結(jié)果，表明細(xì)胞結(jié)合?？偟恼f，結(jié)果顯示GUM1的結(jié)合比未包裹的珠高100-1000倍。
實(shí)施例8已用其它珠說明了本發(fā)明的原理，特別合適的珠類型是Dynabeads M-270Epoxy，Prod.No.143.02(購自Dynal AS，Norway)。
珠的制備將2毫升除菌過濾的0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4加到30毫克干珠中，得到濃度約109個(gè)珠/毫升。攪拌重懸浮珠30秒，然后緩慢傾斜旋轉(zhuǎn)保溫10分鐘。將管置于磁鐵上4分鐘，小心的用吸管吸去上清液。
在管中再次加入2毫升0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4，通過攪拌充分混合珠。將管置于磁鐵上4分鐘，除去上清液。
將洗過的珠重懸浮在600微升0.1M磷酸鈉緩沖液，pH7.4中，得到推薦的珠濃度，加入配體溶液后得到硫酸銨濃度。該珠溶液用于包裹過程。
包裹過程將配體溶于PBS至1mg/ml的濃度，并除菌過濾。將600微升配體與600微升珠溶液和600微升無菌過濾的3M硫酸銨按Dynal的推薦混合。管在室溫下緩慢旋轉(zhuǎn)保溫過夜。
在保溫后，將管置于磁鐵上4分鐘，除去上清液。用2毫升洗滌包裹的珠總共4次。最終將珠懸浮在1毫升PBS中，濃度為30mg/ml，儲藏在4℃。
實(shí)施例9細(xì)菌在珠上的分離方案和特定細(xì)菌的鑒定細(xì)菌在37℃100毫升胰蛋白胨大豆肉湯中培養(yǎng)過夜。根據(jù)本發(fā)明混合800微升(結(jié)合緩沖液)和20微升珠，然后加入100微升過夜培養(yǎng)物并用滴管溫和混合。管在室溫下放置5分鐘。用磁性分離器除去上清液，將珠-細(xì)菌復(fù)合物重懸浮在50微升裂解緩沖液(4M異氰酸胍-1％十二烷基肌氨酸鈉)。樣品在80℃閉蓋培養(yǎng)5分鐘。
然后加入150微升96％乙醇，繼續(xù)培養(yǎng)5分鐘。用磁性分離器除去上清液，珠-DNA樣品用1毫升70％洗滌兩次。
珠-DNA樣品重懸浮30微升H20，80℃開蓋10分鐘除去所有痕量的乙醇。在1次50微升PCR中使用所有30微升純化材料。
實(shí)施例10用實(shí)施例9的方案分離細(xì)菌，并鑒定分離的細(xì)菌，用下列引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)A-E如表1實(shí)驗(yàn)F
上游5’TGCTTTACACATGCAAGTCG3’下游5’CAT CTC TAC GCA TTT CAT TG 3’在下列實(shí)驗(yàn)中使用的是來自Dynal的M-270 Dynabeads或Chemagen AG的經(jīng)M-PVA OCN-活化的珠。
下面的實(shí)驗(yàn)A-G中所用的細(xì)菌如下
在下列實(shí)驗(yàn)中，通常直接在DNA-珠復(fù)合物上進(jìn)行擴(kuò)增。然而用擴(kuò)增技術(shù)鑒定細(xì)菌物種可在上清液中進(jìn)行。對于某些結(jié)合配體例如肝素、硫酸葡聚糖和角叉菜膠，這可能是優(yōu)選的，因?yàn)榱蛩峄鶊F(tuán)可抑制PCR反應(yīng)。在下列實(shí)驗(yàn)中，除非另外說明，當(dāng)用角叉菜膠包裹時(shí)，PCR在80℃保溫珠，從珠上釋放所有DNA后在上清液中進(jìn)行。
在該實(shí)施例中“角叉菜膠”指ι角叉菜膠(Sigma C-3889)。從sigma獲得了肝素和硫酸葡聚糖，分別具有目錄參考號H3149和D6924。
A.從霍亂弧菌用Gum、甘露糖和角叉菜膠分離基因組DNA。
擴(kuò)增的結(jié)果在圖4的凝膠照片中顯示。
從凝膠頂端左側(cè)開始閱讀第1列1號孔＝HaeIII標(biāo)記(弱)。
2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的霍亂弧菌稀釋液。
3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的霍亂弧菌稀釋液。
4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的霍亂弧菌稀釋液。
5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的霍亂弧菌稀釋液。
6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的霍亂弧菌稀釋液。
7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的霍亂弧菌稀釋液。
8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的霍亂弧菌稀釋液。
9號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的霍亂弧菌稀釋液。
10號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍亂弧菌稀釋液。
11號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍亂弧菌稀釋液。
12號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍亂弧菌稀釋液。
13號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍亂弧菌稀釋液。
泳道21號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍亂弧菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍亂弧菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍亂弧菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍亂弧菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的霍亂弧菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的霍亂弧菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的霍亂弧菌稀釋液9號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的霍亂弧菌稀釋液10號孔＝陰性對照B.用Gum、甘露糖、角叉菜膠從弗式志賀氏菌分離的基因組DNA在圖5的凝膠照片中顯示了擴(kuò)增結(jié)果。
從凝膠的左上角讀泳道11號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的弗式志賀氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的弗式志賀氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的弗式志賀氏菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的弗式志賀氏菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的弗式志賀氏菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的弗式志賀氏菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的弗式志賀氏菌稀釋液9號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的弗式志賀氏菌稀釋液10號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100 ul 10-2的弗式志賀氏菌稀釋液11號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志賀氏菌稀釋液12號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的弗式志賀氏菌稀釋液13號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志賀氏菌稀釋液泳道21號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的弗式志賀氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志賀氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100ul 10-4的弗式志賀氏菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志賀氏菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的弗式志賀氏菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的弗式志賀氏菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的弗式志賀氏菌稀釋液9號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的弗式志賀氏菌稀釋液C.用角叉菜膠、甘露糖、Gum、甘露聚糖從大腸桿菌分離的基因組DNA圖6的凝膠照片中顯示了擴(kuò)增結(jié)果。
凝膠上有6條代表大腸桿菌的泳道。
從凝膠的左上角讀1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100ul 10-4的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液
8號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液9號孔＝陰性對照泳道21號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液泳道31號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液
6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液泳道41號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液泳道51號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的l00μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液泳道61號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液D.用角叉菜膠、甘露糖、Gum、甘露聚糖從鼠傷寒沙門氏菌分離的基因組DNA圖7的凝膠照片上顯示了擴(kuò)增的結(jié)果。
從凝膠的左上角讀1號孔＝HaeIII標(biāo)記
2號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液9號孔＝陰性對照泳道21號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液
8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液泳道31號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液泳道41號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到甘露聚糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液泳道51號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液泳道61號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液鼠傷寒沙門氏菌的DNA分離物E.用瓜耳膠(Guar)、Gum、甘露糖和角叉菜膠從空腸彎曲桿菌分離的DNA圖8的凝膠照片顯示了擴(kuò)增結(jié)果。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空腸彎曲桿菌稀釋液3號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空腸彎曲桿菌稀釋液4號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空腸彎曲桿菌稀釋液5號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空腸彎曲桿菌稀釋液6號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空腸彎曲桿菌稀釋液7號孔＝添加到瓜耳膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空腸彎曲桿菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空腸彎曲桿菌稀釋液9號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空腸彎曲桿菌稀釋液
10號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空腸彎曲桿菌稀釋液11號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空腸彎曲桿菌稀釋液12號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空腸彎曲桿菌稀釋液13號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空腸彎曲桿菌稀釋液14號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的空腸彎曲桿菌稀釋液15號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的空腸彎曲桿菌稀釋液16號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的空腸彎曲桿菌稀釋液17號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的空腸彎曲桿菌稀釋液18號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的空腸彎曲桿菌稀釋液19號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的空腸彎曲桿菌稀釋液20號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-1的空腸彎曲桿菌稀釋液21號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-2的空腸彎曲桿菌稀釋液22號孔＝添加到甘露糖包裹的200μg Chemagen珠的100μl 10-3的空腸彎曲桿菌稀釋液F.用Gum、肝素、角叉菜膠和硫酸葡聚糖從釀膿鏈球菌中分離基因組DNA。
擴(kuò)增的結(jié)果在圖9的凝膠照片中顯示。
第1列
在上清液中進(jìn)行PCR，在90℃保溫5分鐘后用磁鐵從珠分離。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液9號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
10號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液11號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液12號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液13號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液14號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液
15號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液第2列在90℃培養(yǎng)5分鐘后，在用磁鐵把珠分離的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液3號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液4號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液5號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液6號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液7號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液8號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液9號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
10號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液11號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液12號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液13號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液14號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液15號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液第3列在90℃培養(yǎng)5分鐘后，在用磁鐵與珠分開的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液3號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液4號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液5號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液6號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液7號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液8號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液9號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
10號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液11號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液
12號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液13號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液14號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液15號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液第4列在90℃培養(yǎng)5分鐘，在用磁鐵將珠分離的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液3號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液4號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液5號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液6號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液7號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液8號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液9號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
10號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的釀膿鏈球菌稀釋液11號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的釀膿鏈球菌稀釋液12號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的釀膿鏈球菌稀釋液13號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的釀膿鏈球菌稀釋液14號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的釀膿鏈球菌稀釋液15號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的釀膿鏈球菌稀釋液G.用Gum、肝素、角叉菜膠和硫酸葡聚糖從淋病奈瑟氏菌中分離基因組DNA。
擴(kuò)增的結(jié)果在圖10的凝膠照片中顯示。
第1列在上清液中進(jìn)行PCR，在90℃保溫5分鐘后用磁鐵將珠分離。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液
8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液9號孔＝添加到Gum包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液第2列在90℃培養(yǎng)5分鐘后，在用磁鐵將珠分離的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀釋液3號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀釋液4號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀釋液5號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
6號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀釋液7號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液8號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液9號孔＝添加到肝素包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液第3列在90℃培養(yǎng)5分鐘，在用磁鐵將珠分離的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀釋液
3號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀釋液4號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀釋液5號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
6號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀釋液7號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液8號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液9號孔＝添加到角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液第4列在90℃培養(yǎng)5分鐘后，在用磁鐵將珠分離的上清液中進(jìn)行PCR。
1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的淋病奈瑟氏菌稀釋液3號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的淋病奈瑟氏菌稀釋液4號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的淋病奈瑟氏菌稀釋液5號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-4的淋病奈瑟氏菌稀釋液在重新懸浮在水中后，在剩余的珠上進(jìn)行PCR。
6號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-5的淋病奈瑟氏菌稀釋液
7號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液8號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液9號孔＝添加到硫酸葡聚糖包裹的200μg Chemagen的100μl 10-6的淋病奈瑟氏菌稀釋液實(shí)施例11在稱為J558L的B-癌細(xì)胞系純的培養(yǎng)物上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用的引物是上游5’CCCGCCCCTTGCTCTC 3’下游5’TGGTCGCTCGCTCCTCTC 3’擴(kuò)增的結(jié)果如圖11的凝膠照片所示。在90℃保溫5分鐘后用磁鐵將珠分離的上清液上進(jìn)行PCR。
第1列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-細(xì)胞稀釋液3號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-細(xì)胞稀釋液4號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-細(xì)胞稀釋液5號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-細(xì)胞稀釋液第2列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到I型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-細(xì)胞稀釋液3號孔＝添加到I型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-細(xì)胞稀釋液
4號孔＝添加到I型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-細(xì)胞稀釋液5號孔＝添加到I型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-細(xì)胞稀釋液第3列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到II型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-0的B-細(xì)胞稀釋液3號孔＝添加到II型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-1的B-細(xì)胞稀釋液4號孔＝添加到II型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-2的B-細(xì)胞稀釋液5號孔＝添加到II型角叉菜膠包裹的200μg Chemagen的100μl 10-3的B-細(xì)胞稀釋液第4列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-0的B-細(xì)胞稀釋液3號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的B-細(xì)胞稀釋液4號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的B-細(xì)胞稀釋液5號孔＝添加到V型角叉菜膠包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的B-細(xì)胞稀釋液使用的各種類型的角叉菜膠(其在Sigma目錄中的產(chǎn)品號)I型角叉菜膠-大部分是κ角叉菜膠C1013II型角叉菜膠-大部分是ι角叉菜膠C1138V型角叉菜膠-ι角叉菜膠C-3889實(shí)施例12
根據(jù)實(shí)施例8的方案從包裹了GUM的珠上分離大腸桿菌。未包裹的珠與包裹的珠進(jìn)行相同的包裹過程，但不加入糖。根據(jù)下列稀釋度進(jìn)行實(shí)施例9的分離方案第1列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-1的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-2的大腸桿菌稀釋液6號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-3的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液9號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-4的大腸桿菌稀釋液第2列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-5的大腸桿菌稀釋液4號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-6的大腸桿菌稀釋液7號孔＝添加到未包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl 10-7的大腸桿菌稀釋液擴(kuò)增的結(jié)果如圖12的凝膠照片所示。
實(shí)施例13根據(jù)實(shí)施例8的方案從包裹了GUM的珠上分離各種細(xì)菌。根據(jù)實(shí)施例9的分離方案，擴(kuò)增結(jié)果如圖13的凝膠照片所示第1列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的弗式志賀氏菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的弗式志賀氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的嗜水氣單胞菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的肺炎鏈球菌稀釋液6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的釀膿鏈球菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌稀釋液第2列1號孔＝HaeIII標(biāo)記2號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的大腸桿菌稀釋液3號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌稀釋液4號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的產(chǎn)氣莢膜梭菌稀釋液5號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的蠟狀芽孢桿菌稀釋液
6號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的空腸彎曲桿菌稀釋液7號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的淋病奈瑟氏菌稀釋液8號孔＝添加到Gum包裹的200μg Dynabeads的100μl未稀釋的百日咳博德氏菌(Bordetella pertussis)稀釋液博德氏菌的引物與奈瑟氏菌的相同(見表1)。
權(quán)利要求
1.一種從樣品中分離細(xì)胞的方法，其特征在于，該方法包括將所述細(xì)胞通過固定在固相載體上的非特異性配體與所述固相載體結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是微生物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物是細(xì)菌。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，樣品中存在的不同細(xì)菌物種至少30％的代表與所述固相載體結(jié)合。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，樣品中存在的不同細(xì)菌物種至少60％的代表與所述固相載體結(jié)合。
6.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，配體是營養(yǎng)物。
7.如任一前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述配體是糖類或糖類衍生物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述配體選自單糖、寡糖、多糖或硫酸化的多糖。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述配體選自甘露糖、Gum、瓜耳膠、肝素、硫酸肝素、角叉菜膠、硫酸葡聚糖和甘露聚糖。
10.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述固相載體是顆粒狀的。
11.如前述任一權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，該方法還包括鑒定與所述固相載體結(jié)合的一種或多種細(xì)胞的步驟。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，用細(xì)胞類型特異性核酸探針鑒定細(xì)胞。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，裂解所述結(jié)合的細(xì)胞，釋放其核酸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述釋放的核酸與固相載體結(jié)合。
15.一種檢測樣品中的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述微生物通過固定在固相載體上的非特異性配體與所述固相載體結(jié)合；和(b)鑒定與所述固相載體結(jié)合的微生物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟(b)包括裂解微生物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，從所述裂解微生物中釋放的核酸與固相載體結(jié)合。
18.一種固相載體，其特征在于，該固相載體上固定有能與細(xì)胞以非特異方式結(jié)合的配體。
19.如權(quán)利要求18所述的固相載體，其特征在于，所述配體是糖類或糖類衍生物。
20.權(quán)利要求18或19所述的固相載體在從樣品中粗分離細(xì)胞的用途。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于，所述細(xì)胞是微生物。
22.一種從細(xì)胞樣品中分離核酸的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞通過固定在固相載體上的非特異性配體與所述固相載體結(jié)合；(b)裂解結(jié)合的細(xì)胞；和(c)將所述裂解的細(xì)胞釋放的核酸與固相載體結(jié)合。
23.一種檢測樣品中靶細(xì)胞存在與否的方法，其特征在于，所述方法包括(a)將所述樣品中的細(xì)胞通過固定在固相載體上的非特異性配體與所述固相載體結(jié)合；(b)裂解結(jié)合的細(xì)胞；(c)將所述裂解的細(xì)胞釋放的核酸與固相載體結(jié)合；和(d)在所述結(jié)合的核酸中檢測所述靶細(xì)胞特征性核酸的存在與否。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其特征在于，所述核酸與細(xì)胞結(jié)合于相同的固相載體。
25.如權(quán)利要求22-24任一所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是微生物。
26.一種用于從樣品中分離微生物的試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含(a)在其上固定有與微生物非特異性結(jié)合配體的固相載體；(b)將微生物與所述固相載體結(jié)合的裝置；可任選的(c)裂解所述細(xì)胞的裝置；和可任選的(d)使從所述裂解的細(xì)胞上釋放的核酸與固相載體結(jié)合的裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從樣品中分離細(xì)胞的方法，該方法包括將所述細(xì)胞與固相載體通過固定在所述固相載體上的非特異性配體進(jìn)行結(jié)合，具體是一種從樣品中分離微生物的方法。優(yōu)選用于該方法的配體包括糖類及其衍生物。還描述了用于從樣品中分離微生物的試劑盒，含有(a)一種固相載體，在其上面固定化一種配體，該配體能與微生物非特異性結(jié)合；(b)將所述微生物與所述固相載體結(jié)合的裝置；可任選的(c)裂解所述細(xì)胞的裝置；和可任選的(d)結(jié)合將從所述裂解細(xì)胞中釋放的核酸與固相載體結(jié)合的裝置。
文檔編號C12Q1/68GK1395620SQ0180390
公開日2003年2月5日 申請日期2001年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月21日
發(fā)明者U·H·雷夫塞思, T·科爾普斯 申請人:簡珀恩特聯(lián)合股份有限公司