專利名稱：在不同條件下利用多種測量方法對雙鏈體或三鏈體雜交進(jìn)行均相分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸的測序或分析方法，更具體地涉及精確分析三鏈和雙鏈核酸雜交復(fù)合體的方法。
相關(guān)領(lǐng)域說明很多年以來人們已經(jīng)知道，通過將電場施加于樣品上，可以分離和鑒定生物分子。
電泳可能是最熟知的分離和鑒定技術(shù)的例子，其是建立在電場對生物分子的影響的基礎(chǔ)上。在凝膠電泳中，其上施加電場的均一基質(zhì)或凝膠由例如聚丙烯酰胺構(gòu)成。施加到凝膠一端的混合物將依據(jù)其大小和與電場的相互作用通過凝膠。遷移率取決于物質(zhì)的獨(dú)特性質(zhì)，如構(gòu)象、大小和電荷。改變凝膠孔徑，例如通過形成一定的濃度或pH梯度，或者改變緩沖液的組成(pH、SDS、DOC、甘氨酸、鹽)，可影響遷移率。單向和雙向凝膠電泳是大多數(shù)研究實(shí)驗(yàn)室中采用的非常常規(guī)的方法。經(jīng)過凝膠電泳和/或從凝膠中物理提取可純化目標(biāo)物。
在Stanley的美國專利5,824,477中公開了最新開發(fā)出的方法，其中將電場施加到生物樣品上。Stanley的專利公開了檢測預(yù)定核酸序列在樣品中存在與否的方法。該方法包括(a)利用電極將電壓施加到溶液中的樣品上，從而使雙鏈核酸樣品變性；(b)使變性核酸與針對所述序列的寡核苷酸探針雜交；以及(c)確定雜交是否發(fā)生。Stanley的專利公開了為使靶序列變性的有限目的而將電場施加于待測樣品。
更為熟知的一種雜交分析是基于熒光標(biāo)記物的使用。最基本形式是基于熒光強(qiáng)度的分析一般包括使靶與含熒光團(tuán)的探針接觸，從結(jié)合探針中去除任何未結(jié)合的探針，以及檢測洗滌后樣品中的熒光。均相分析是對所述基本分析的改進(jìn)，即均相分析并不需要洗滌步驟或提供非液相載體。
基于某些熒光團(tuán)在雜交復(fù)合體中結(jié)合于核酸鏈之間的能力，一些分析也利用嵌入熒光團(tuán)檢測核酸雜交。
例如，Burke等的美國專利5,824,557公開了檢測并量化核酸分子的方法和試劑盒。優(yōu)選的實(shí)施方案取決于將染料嵌入雙鏈核酸的雙螺旋或單鏈核酸中。染料在嵌入之后發(fā)出熒光，其強(qiáng)度直接反映了樣品中存在的核酸量。盡管Burke等的方法聲稱可用于檢測樣品中的核酸量，但是這種方法基于嵌入染料與核酸之間非特異性的結(jié)合，使該方法對于檢測特異性結(jié)合，尤其是存在非靶核酸雙鏈的條件下不實(shí)用。
Ishiguro等的美國專利5,814,447公開的方法宣稱，對依賴于嵌入劑和核酸雙鏈間非特異性相互作用的方法作了改進(jìn)，這些方法如Burke等的方法以及由Ishiguro等早期在日本專利公開237000/1993中所描述的方法。早期的發(fā)展包括在靶核酸一個特定區(qū)域經(jīng)PCR擴(kuò)增之前，加入嵌入熒光素，該熒光素嵌入到樣品溶液后熒光強(qiáng)度有增加的趨勢，以及以給定時間間隔對反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測，從而檢測并量化擴(kuò)增前的靶核酸。該`447專利試圖通過提供提高了特異性的分析方法對前期的開發(fā)進(jìn)行改進(jìn)，該分析的特征在于探針是標(biāo)記了嵌入熒光素的單鏈寡核苷酸，該熒光素被嵌入到介于靶核酸與單鏈寡核苷酸探針之間互補(bǔ)的結(jié)合部分。
在正進(jìn)行的針對更靈敏、精確和快速的分析技術(shù)的研究中，一個研究組開發(fā)了一種分析，其包括分析電場對核酸雜交雙鏈體熒光強(qiáng)度的影響。參見分別于1997年2月27日和1997年6月6日提交的美國專利申請08/807,901和08/870,370。研究者們指出單堿基對錯配的雙鏈體的熒光強(qiáng)度與完全匹配的雙鏈體的熒光強(qiáng)度不同。因此，這些申請旨在公開一種檢測核酸序列的方法，其中在檢測步驟之前或在此同時將電場施加到液體介質(zhì)上，并且檢測作為電場函數(shù)的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化，指示探針是與完全互補(bǔ)核苷酸序列雜交還是與不完全互補(bǔ)核苷酸序列雜交。
盡管有以上的研究成果，本領(lǐng)域仍需要用于核酸之間和/或核酸類似物間相互作用的簡便、高靈敏度、有效并且快速的分析方法。
所有在此引用的參考文獻(xiàn)以其全文在此引作參考。
本發(fā)明還提供了另一種分析雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；測量所述檢測樣品在第一條件下的第一信號，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的初級測定值，其中所述第一信號與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；測量所述檢測樣品在第二條件下的第二信號，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的次級測定值，其中所述第二信號與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)，條件是當(dāng)所述第一條件和所述第二條件相似時，在測量所述第一信號后和測量所述第二信號前將刺激物施加到所述檢測樣品上，其中所述刺激物顯著影響所述探針和所述靶間的不完全互補(bǔ)雜交，卻不顯著影響所述探針和所述靶間的完全互補(bǔ)雜交；以及比較所述初級測定值和次級測定值，以評價(jià)二者間任何的不一致是否表明需要重新測試。
此外，本發(fā)明還提供了另一種雜交分析方法，其包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；測量所述檢測樣品通電前的熒光強(qiáng)度，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的初級測定值，其中所述通電前熒光強(qiáng)度與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；將電壓施加到所述檢測樣品上；在施加所述電壓過程中或之后，測量所述檢測樣品通電后熒光強(qiáng)度，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的次級測定值，其中所述通電后熒光強(qiáng)度與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；以及比較所述初級測定值和所述次級測定值，以評價(jià)二者間任何的不一致是否表明需要重新測試。
本發(fā)明還提供了一種分析序列特異性雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；將電壓施加到所述檢測樣品上；在施加所述電壓過程中或之后，檢測所述檢測樣品的信號，其中所述信號與所述探針和所述靶間的結(jié)合親和力相關(guān)；根據(jù)參照樣品所顯示的參照信號校準(zhǔn)所述信號，所述參照樣品包括與所述靶結(jié)合的至少一種參照探針，其中相對于所述靶，各所述探針和所述至少一種參照探針是選自如下組的不同成員完全匹配、單堿基錯配、二堿基錯配、三堿基錯配、單堿基缺失、二堿基缺失和三堿基缺失；以及由所述校準(zhǔn)來確定所述探針與所述靶之間的匹配程度。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說明本發(fā)明提供了一種分析靶與探針結(jié)合的快速、靈敏、環(huán)保而且安全的方法，其中該靶包含核酸序列或核酸類似物序列，該探針包含核酸序列或核酸類似物序列。
與某些先前的分析方法不同，本發(fā)明不僅檢測雜交是否存在，還提供有關(guān)探針和靶之間雜交性質(zhì)的定量和定性信息。因此，本發(fā)明使操作者可以區(qū)分是完全匹配、單堿基對錯配、兩個堿基對錯配、三個堿基對錯配、單堿基對缺失、兩個堿基對缺失還是三個堿基對缺失。
本發(fā)明的實(shí)施方案包括根據(jù)與相同靶結(jié)合的其他探針發(fā)出的同類信號，校準(zhǔn)第一個探針-靶混合物中所測定的信號(如電流和/或熒光強(qiáng)度)，其中其他探針每一個與第一個探針有至少一個堿基的差異。
在某些實(shí)施方案中，在測量所述信號之前或在此同時，將低電壓施加到樣品上。通常，以如下方式選擇電壓使其高得足以使不完全匹配的雜交配偶體去穩(wěn)定，但又不高到使完全匹配的雜交配偶體去穩(wěn)定。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，電壓是約1V-約20V。
可產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中所測信號大小(例如，電流和/或熒光強(qiáng)度)是靶和探針之間結(jié)合親和力的函數(shù)。因?yàn)榘信c多種不同探針間的結(jié)合親和力因錯配堿基數(shù)不同、錯配的性質(zhì)不同(A-G對A-C對T-G對T-C等)、錯配堿基在雜交復(fù)合體中的位置等因素各有差異，因此，本發(fā)明分析可用于對靶測序。
所測信號可以是例如電導(dǎo)。在這類實(shí)施方案中，探針和靶間結(jié)合親和力與信號的大小正相關(guān)。也就是說，電導(dǎo)隨探針和靶間匹配程度而增加，優(yōu)選在包括0-2個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在包括0-3個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)。
在其它實(shí)施方案中，所測信號可以是檢測樣品中所含熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度。在這類實(shí)施方案中，根據(jù)熒光團(tuán)是否經(jīng)信號淬滅或信號放大來顯示雜交，可以使探針與靶之間的結(jié)合親和力與所述強(qiáng)度正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。因此，由嵌入劑產(chǎn)生熒光強(qiáng)度與探針-靶的結(jié)合親和力正相關(guān)，而實(shí)施方案中采用與探針共價(jià)結(jié)合的非嵌入熒光團(tuán)所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與探針-靶的結(jié)合親和力負(fù)相關(guān)。熒光強(qiáng)度隨探針和靶間的匹配程度的增加而增加(或者對于非嵌入劑則為減小)，優(yōu)選在包括0-2個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在包括0-3個錯配和/或缺失的范圍內(nèi)。
盡管發(fā)明人先前已公開了熒光強(qiáng)度分析雜交的優(yōu)點(diǎn)(參見于1999年12月21日提交的美國專利申請09/468,679)，但如下面實(shí)施例6所示，將電場施加到樣品上可增加分析的分辨率。
此外，在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述分析包括測量樣品的至少兩種信號。第一種信號優(yōu)選為熒光強(qiáng)度，第二種信號優(yōu)選選自若干電導(dǎo)測量值(或反之)。
在優(yōu)選的多重測量實(shí)施方案中，第一信號可以與第二信號相同或不同。當(dāng)測量的第一信號與第二信號相同時，第二信號可以根據(jù)第一信號和/或用于校準(zhǔn)第一信號的相同基準(zhǔn)信號進(jìn)行校準(zhǔn)。另外，在測量第一信號之后并且在測量第二信號之前，最好向測試樣品施加改變條件的刺激物。該刺激物優(yōu)選足以顯著影響探針與靶之間的不完全互補(bǔ)雜交，但不足以顯著影響探針與靶之間的完全互補(bǔ)雜交。
例如，在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，測量的第一信號為通電前的熒光強(qiáng)度(即在向測試樣品施加條件改變電壓之前測量的強(qiáng)度)，測量的第二信號為通電后的熒光強(qiáng)度(即在已向測試樣品施加條件改變電壓過程中或之后測量的強(qiáng)度)。
在前述實(shí)施方案中的附加測量值提高了分析的可靠性，并且使得對可疑結(jié)果能夠立即重新測試。如果至少兩個測量值結(jié)果不一致，一般表明需要重新測試。
本發(fā)明可以量化探針與靶之間的結(jié)合親和力。這樣的信息在許多方面非常有用，包括設(shè)計(jì)具有最佳結(jié)合特性的反義藥物。
與先前的方法不同，本發(fā)明的分析優(yōu)選是均相的。該分析在檢測所測信號的大小之前，無需將探針-靶復(fù)合體與游離探針和靶分離。該分析無需凝膠分離步驟，因此檢測通量有很大提高。定量分析簡便準(zhǔn)確。因此，這種結(jié)合分析可節(jié)省大量的時間和花費(fèi)，而且容易自動化完成。進(jìn)一步，這種分析使結(jié)合中的一些變量，如緩沖液、pH、離子濃度、溫度、溫育時間、探針和靶序列的相對濃度、嵌入劑濃度、靶序列長度、探針序列的長度以及可能的輔助因子的要求被快速確定。
所述分析可在例如孔內(nèi)、不透性表面上或生物芯片上的溶液中進(jìn)行。
此外，本發(fā)明的分析在進(jìn)行時優(yōu)選無需給靶或探針提供信號淬滅劑。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案特異地檢測探針與雙鏈靶之間的三鏈體雜交，因此無須將靶變性。當(dāng)PNA探針已知可與某些類型的靶形成三鏈體時(參見，如Egholm等，365 Nature 566(1993)，和Tomac等，118J.Am.Chem.Soc.5544(1996))，本發(fā)明人驚訝地發(fā)現(xiàn)，這些PNA探針能夠特異地分析單鏈核酸(如ssDNA和RNA)探針與雙鏈核酸(如dsDNA)靶之間形成的三鏈體。當(dāng)檢測樣品中存在嵌入劑時，三鏈體的形成和/或穩(wěn)定性增強(qiáng)。
本發(fā)明分析中使用的合適的探針包括，如ssDNA、RNA、PNA以及其它不帶電荷或帶部分電荷主鏈的核酸類似物。盡管在某些實(shí)施方案中優(yōu)選反平行探針，但PNA探針也可以是平行的。優(yōu)選長度為8到20個堿基的探針序列，因?yàn)樵摲秶窃撕驼婧松镆寻l(fā)現(xiàn)的最小的獨(dú)特DNA序列范圍。特別優(yōu)選12到18個堿基的探針，因?yàn)檫@是人基因組中最小的獨(dú)特序列的長度。實(shí)施方案中，最優(yōu)選6-30個堿基的探針。不過，多個更短的探針可用于檢測具有多個非獨(dú)特靶序列的核酸序列，這些探針組合用來獨(dú)特地識別核苷酸序列?？蓪μ结橀L度進(jìn)行選擇，以與靶的長度相匹配。
本發(fā)明無須使用危險(xiǎn)、操作煩瑣、耗時，而且需要經(jīng)常再生的放射性探針。本發(fā)明的探針優(yōu)選的是數(shù)年都安全穩(wěn)定的探針。相應(yīng)的，探針可大量地制備或訂購和儲存。
優(yōu)選未標(biāo)記的探針和靶，但在另一些實(shí)施方案中，嵌入劑與探針共價(jià)結(jié)合。在這樣一些實(shí)施方案中，該嵌入劑優(yōu)選地結(jié)合于探針的任一端。
其它實(shí)施方案中，嵌入劑盡管可在分析中插入探針與靶之間，但并不與探針共價(jià)結(jié)合，而是以非共價(jià)形式與探針有義鍵合。
本發(fā)明使用的優(yōu)選嵌入劑包括，如YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚體-1、乙啶同型二聚體-2和吖啶。通常，嵌入劑是能夠嵌入雙鏈和/或三鏈核酸復(fù)合體鏈間的成分。優(yōu)選的實(shí)施方案中，嵌入劑(或其一個組分)在核酸不存在時基本上是無熒光的，只有在嵌入雙鏈或三鏈核酸復(fù)合體時，被合適波長輻射激發(fā)和嵌入的熒光才顯示100倍到10000倍的增強(qiáng)。
其它實(shí)施方案中，嵌入劑在嵌入和被適當(dāng)波長的輻射激發(fā)后，可能表現(xiàn)熒光波長移位。確切的熒光波長可依賴于被嵌入核酸的結(jié)構(gòu)，如DNA對RNA，雙鏈體對三鏈體等。
選擇相當(dāng)于所用熒光團(tuán)最大激發(fā)的激發(fā)波長(通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)和/或常識)，優(yōu)選200到1000nm。優(yōu)選發(fā)射波長為200到1000nm的嵌入劑。優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用氬離子激光器，用波長范圍在400nm到540nm之間的光輻射熒光團(tuán)，在500到750nm之間檢測到熒光發(fā)射。
本發(fā)明的分析可在極廣的溫度范圍下進(jìn)行，如5℃到85℃之間。某些現(xiàn)有技術(shù)分析要求提高溫度，使花費(fèi)增加并延遲分析。另一方面，本發(fā)明可在室溫或以下的溫度進(jìn)行(如低于25℃的溫度)。
本發(fā)明的分析是極其靈敏的，因此無需對靶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。例如，至少在熒光強(qiáng)度實(shí)施方案中，可以對含有約10fmol靶和約10fmol探針的體積為約20微升的檢測樣品進(jìn)行分析。本發(fā)明實(shí)施方案的靈敏度足以分析5×10-9M濃度的靶，優(yōu)選濃度不高于5×10-10M。本發(fā)明實(shí)施方案的靈敏度足以分析5×10-9M濃度的探針，優(yōu)選濃度不高于5×10-10M。
測量電導(dǎo)可以區(qū)別40微升中僅含約1pmol探針和1pmol靶的樣品。當(dāng)減少樣品體積時，將可使用甚至更少量的探針和靶。
毫無疑問，上述數(shù)值并不意味著本方法不能檢測更高的濃度。
對于每一濃度的被測探針和靶，可以容許一個寬范圍的嵌入劑濃度。例如，當(dāng)對5×10-10M的探針和5×10-10M的靶進(jìn)行雜交時，嵌入劑YOYO-1的最佳濃度在25nM至2.5nM的范圍。在探針和靶都是5×10-8M的濃度時，優(yōu)選的YOYO-1濃度范圍為1000nM至100nM。
所述分析的靈敏度足以將單堿基對錯配探針-靶復(fù)合體與二堿基對錯配探針-靶復(fù)合體區(qū)別開來，并且優(yōu)選足以將二堿基對錯配探針-靶復(fù)合體與三堿基對錯配探針-靶復(fù)合體區(qū)別開來。當(dāng)然，所述分析的靈敏度足以將完全匹配探針-靶復(fù)合體與任何一種上述錯配復(fù)合體區(qū)別開來。
雜交介質(zhì)可以是任何已知的適宜于保存核酸的常規(guī)介質(zhì)。參見如Sambrook等“分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊”第2卷(1989)。例如，液相介質(zhì)可包括核苷酸、水、緩沖液以及標(biāo)準(zhǔn)鹽濃度。
互補(bǔ)堿基間的雜交在多種情況下進(jìn)行，各情況在溫度、鹽濃度、靜電強(qiáng)度和緩沖液組成方面有所不同。這些條件和使用方法的例子是本領(lǐng)域所已知的。
優(yōu)選的，雜交復(fù)合體在約15℃到約25℃的溫度下形成約1到約5分鐘。不需要更長的反應(yīng)時間，但溫育幾個小時對雜交復(fù)合體也沒有副作用。
可以(盡管不是必要，特別是對于含有嵌入劑的實(shí)施方案)使用某些試劑促進(jìn)溶液中的雜交。這些試劑優(yōu)選的例子包括單鏈結(jié)合蛋白，如RecA蛋白、T4基因32蛋白、大腸桿菌單鏈結(jié)合蛋白、大或小的核酸溝結(jié)合蛋白、二價(jià)離子、多價(jià)離子、viologen以及嵌入劑如溴化乙啶、放線菌素D、補(bǔ)骨脂素及當(dāng)歸素。這些助劑可被證明在極端操作條件下是有用的，例如在異常pH值或極端高溫下。
本發(fā)明分析可被用于，如識別折疊核酸序列中可及區(qū)域，以確定雜交復(fù)合體中錯配的堿基對數(shù)目以及基因組制圖。
在用嵌入劑探測熒光強(qiáng)度的實(shí)施方案中，強(qiáng)度隨探針與靶之間結(jié)合親和力的增大而增加。在用非嵌入熒光團(tuán)探測熒光強(qiáng)度的實(shí)施方案中，強(qiáng)度隨探針與靶之間結(jié)合親和力的增大而減小。不管熒光團(tuán)是否嵌入，本發(fā)明方法都不需要測量熒光極性，與熒光各向異性方法不同。
本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不只限于以下實(shí)施例。
野生型靶DNA(SEQ ID NO1)的有義鏈的序列為5’-TGG CACCAT TAA AGA AAA TAT CAT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGAATA TA-3’。
野生型靶DNA(SEQ ID NO1)的反義鏈的序列為5’-TAT ATTCAT CAT AGG AAA CAC CAA AGA TGA TAT TTT CTT TAA TGGTGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO1)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為65.2℃。
SEQ ID NO2是與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)類似的50聚體的突變dsDNA靶序列，只是在氨基酸位置第507處有一個堿基對的突變(下劃線)，其中將野生型序列CAT變?yōu)镃GT。
SEQ ID NO2的有義鏈序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TAT CGT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO2的反義鏈序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGGAAA CAC CAA AGACGA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO2)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為66.0℃。
SEQ ID NO3是與野生型靶DNA(SEQ ID NO1)類似的50聚體的突變dsDNA靶序列，只是在氨基酸位置第506和507處有連續(xù)的兩個堿基對的突變(下劃線)，其中將野生型序列CAT突變?yōu)锳CT。
SEQ ID NO3的有義鏈的序列為5’-TGG CAC CAT TAA AGAAAA TATACT CTT TGG TGT TTC CTA TGA TGA ATA TA-3’。
SEQ ID NO3的反義鏈的序列為5’-TAT ATT CAT CAT AGGAAA CAC CAA AGAGTA TAT TTT CTT TAA TGG TGC CA-3’。
dsDNA(SEQ ID NO3)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為65.2℃。
本實(shí)施例中使用的PNA探針由Commonwealth Biotechnologies公司(Richmond，VA，USA)合成、HPLC純化并通過質(zhì)譜分析確認(rèn)。PNA探針首先被溶解在0.1％的TFA(三氟乙酸)到濃度為10mg/ml，加入雙蒸水使其稀釋至1mg/ml。最終PNA的儲藏溶液制成水溶液濃度1pmole/μl。
1號探針是15聚體反平行PNA探針，其設(shè)計(jì)成與50聚體野生型靶DNA有義鏈(SEQ ID NO1)的一個15核苷酸區(qū)段完全互補(bǔ)，從氨基酸位置505到510序列是完全重疊的(Nature380，207(1996))。該探針結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO8)為5’-H-CAC CAA AGA TGA TAT-Lys-CONH2-3’。
雜交反應(yīng)混合物(80μl)含有以下成分2pmole的靶dsDNA、2pmole的PNA探針、0.5×TBE和250nM的DNA嵌入劑YOYO-1(分子探針，Eugene，OR，USA)。將樣品放置在3mm石英杯中，1或5伏DC(V)通電15秒。電流分析包括在將電壓施加到溶液上的同時檢測電流。將溫度傳感器置于各溶液中，以測量進(jìn)行電流分析時的溫度。在1伏時，在通電的最初2秒觀察到電流峰。在以后的13秒，電流迅速降低。在采用5伏的實(shí)驗(yàn)中，電流在整個通電過程(15秒)中保持相對穩(wěn)定。
進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，其中在DNA或PNA不存在時(對照)，或當(dāng)野生型SEQ ID NO1、突變體SEQ ID NO2或突變體SEQ ID NO3與1號反平行PNA探針反應(yīng)時，觀察到了電導(dǎo)值。

圖1A和1B繪出了在各個實(shí)驗(yàn)中得到的電導(dǎo)數(shù)據(jù)。圖1A顯示了施加1V電的結(jié)果，圖1B顯示了施加5V電的結(jié)果。由完全互補(bǔ)序列(SEQ ID NO1+1號探針)組成的dsDNAPNA雜合三鏈體使得YOYO-1最大嵌入，在整個15秒的1V施加過程中產(chǎn)生最大的電導(dǎo)值(圖上顯示為負(fù)的電流值)。反平行PNA探針與單堿基對錯配的dsDNA(SEQ ID NO2+1號探針)和與兩個堿基對錯配的dsDNA(SEQ ID NO3+1號探針)的三鏈體雜交在施加電壓的最初1秒期間，其標(biāo)準(zhǔn)化電導(dǎo)峰分別比完全匹配的dsDNAPNA三鏈雜合體(SEQ ID NO1+1號探針)所觀察到的值低79％和96％(圖1A)。當(dāng)把整個15秒施加電壓期間的電導(dǎo)值平均時，在完全互補(bǔ)三鏈體和含堿基對錯配的三鏈體之間，得到了類似的百分比降低。在圖1A中，與完全匹配的dsDNAPNA雜合體相比，單堿基對和兩個堿基對錯配的dsDNAPNA雜合體的平均電導(dǎo)值分別降低65％和91％。圖1A中表示的所有實(shí)驗(yàn)在室溫(23℃)下進(jìn)行。隨著探針與雙鏈靶之間的錯配程度增加，YOYO-1嵌入的水平降低，電導(dǎo)水平也降低。當(dāng)重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)并施加更高電壓(5V)時，也觀察到這些關(guān)系。與完全匹配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO3+1號探針)相比，在施加5V電壓的過程中，單堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ IDNO2+1號探針)和兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ IDNO3+1號探針)的標(biāo)準(zhǔn)化平均電導(dǎo)值分別低52％和67％(圖1B)。圖1B中表示的所有實(shí)驗(yàn)在室溫(23℃)下進(jìn)行。
當(dāng)在增至50℃和65℃的溫度下重復(fù)實(shí)驗(yàn)時，觀察到類似的電流分析值。在50℃，在對完全匹配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO1+1號探針)施加1V 15秒時，產(chǎn)生-0.25μA平均電流，相比之下，單堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO2+1號探針)和兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO3+1號探針)分別產(chǎn)生-0.15μA平均電流(低40％)和-0.06μA平均電流(低76％)(圖1C)。在65℃，當(dāng)施加1V電15秒時觀察到類似的結(jié)果。完全匹配的核酸雜合體產(chǎn)生-0.37μA平均電流，相比之下，單堿基對和兩個堿基對錯配的雜合體分別產(chǎn)生-0.16μA平均電流(低57％)和-0.01μA平均電流(低97％)(圖1C)。在高溫下施加5伏電壓產(chǎn)生類似結(jié)果。對于完全匹配的雜合體、單堿基對錯配的雜合體和兩個堿基對錯配的雜合體，在50℃進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)分別產(chǎn)生-0.27mA、-0.13mA(低52％)和-0.08mA(低70％)的平均電流，對于相同的三組，在65℃進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)分別產(chǎn)生-0.31mA、-0.14mA(低55％)和-0.10mA(低68％)的平均電流(圖1D)。對所有前述實(shí)驗(yàn)，dsDNA在與1號反平行PNA探針進(jìn)行三鏈雜交前沒有變性。
在雜交混合物加熱至65℃并立即冷卻之后，在不同溫度下進(jìn)行類似的實(shí)驗(yàn)。在冷卻至室溫(23℃)之后，向完全匹配的樣品(SEQ IDNO1+1號探針)施加1V電壓15秒，產(chǎn)生-0.18μA的平均電流。通過比較，對于單堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈雜合體(SEQ ID NO2+1號探針)和兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈雜合體(SEQ ID NO3+1號探針)，可以分別觀測到-0.06μA的電流值(低67％)和-0.05μA的電流值(低72％)(數(shù)據(jù)沒有列出)。在將樣品從65℃冷卻至50℃時，若繼之施加1V電壓15秒，可以觀測到類似的結(jié)果。完全匹配的樣品(SEQ ID NO1+1號探針)產(chǎn)生-0.23μA的平均電流，相比之下，單堿基對和兩個堿基對錯配的樣品分別觀測到-0.11μA的平均電流(低52％)和-0.01μA平均電流(低96％)(數(shù)據(jù)沒有列出)。當(dāng)冷卻至23℃或50℃之后施加5V電壓時，在完全匹配的三鏈雜合體(SEQ IDNO1+1號探針)、單堿基對錯配的三鏈雜合體(SEQ ID NO2+1號探針)和兩個堿基對錯配的三鏈雜合體(SEQ ID NO3+1號探針)中產(chǎn)生的平均電流在23℃時分別為-0.15mA、-0.09mA(低40％)和-0.07mA(低53％)，而在50℃時分別為-0.23mA、-0.09mA(低61％)和-0.09mA(低61％)(數(shù)據(jù)沒有列出)。
當(dāng)使用反平行PNA探針時，在65℃(50聚體dsDNA序列的Tm)對雜交混合物進(jìn)行預(yù)處理然后冷卻不會顯著影響在23℃或50℃(沒有在65℃預(yù)熱)直接測量的完全互補(bǔ)的dsDNAPNA三鏈雜合體與那些含有1或2bp錯配的三鏈雜合體之間觀測到的電導(dǎo)差別。顯然，在DNA嵌入劑YOYO-1存在下反平行PNA探針能夠形成具有dsDNA靶的三鏈雜合體結(jié)構(gòu)。施加低電壓電流(例如1V或5V)可以使完全匹配的dsDNAPNA三鏈雜合體序列與那些含有1或2bp突變的三鏈雜合體區(qū)別開來，而無需進(jìn)行序列的預(yù)變性。實(shí)施例2圖2表明，當(dāng)所用的PNA探針與靶DNA序列方向平行時，本發(fā)明的電流分析也可區(qū)分完全匹配的dsDNAPNA三鏈雜合體與那些含有1或2堿基對錯配的雜合體。2號探針是與1號探針序列上相同的15聚體PNA探針，不過合成為符合靶DNA的平行方向，而非常規(guī)的反平行方向。2號探針的結(jié)構(gòu)(SEQ ID NO9)為5’-H-TAT AGTAGA AAC CAC-Lys-CONH2-3’。
除了用2號探針代替1號探針外，以與實(shí)施例1中所述相同的分析條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在施加1伏電壓時，與在匹配溫度下對完全匹配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO1+2號探針)所觀察到的平均電流相比，在23℃時，單堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO2+2號探針)和連續(xù)兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO3+2號探針)的平均電流分別低25％和32％，在50℃時分別低30％和23％，在65℃時分別低28％和53％(圖2A)。
在施加5V電壓(代替1V)15秒時得到類似的結(jié)果。完全匹配的dsDNAPNA雜合體在23℃、50℃和65℃分別產(chǎn)生-0.15mA、-0.24mA和-0.17mA的平均電流(圖2B)。與完全匹配的雜合體樣品所得結(jié)果相比，單堿基對錯配和兩個堿基對錯配的不完全互補(bǔ)三鏈體在23℃分別產(chǎn)生低27％(-0.11mA)和低53％(-0.07mA)的平均電流，在50℃分別產(chǎn)生低21％(-0.19mA)和低46％(-0.13mA)的平均電流，在65℃分別產(chǎn)生無差別(-0.17mA)和低18％(-0.14mA)的平均電流(圖2B)。
圖2A和2B中所示結(jié)果表明，相比于使用1號反平行PNA探針時得到的結(jié)果，在使用2號平行PNA探針時，完全匹配的dsDNAPNA三鏈體和含單堿基對或兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體之間電導(dǎo)差異的顯著性較小(圖1)。
但是，通過使用2號平行探針以及在將樣品加熱至65℃并立即冷卻之后施加5V電壓的實(shí)驗(yàn)，公開了電流測量值，顯示了完全匹配的dsDNAPNA三鏈體和單堿基對或兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體間的信號差別增大(圖2C)。完全匹配的雜合體(SEQ ID NO1+2號探針)、單堿基對錯配的雜合體(SEQ ID NO2+2號探針)和兩個堿基對錯配的雜合體(SEQ ID NO3+2號探針)產(chǎn)生的平均電導(dǎo)值在23℃時分別為-0.19mA、-0.08mA和-0.06mA，在50℃時分別為-0.17mA、-0.09mA和-0.07mA，在65℃時分別為-0.23mA、-0.13mA和-0.08mA。這意味著在與完全互補(bǔ)樣品所得的值相比，單堿基對和兩個堿基對錯配的樣品產(chǎn)生的電導(dǎo)在23℃時分別低58％和68％，在50℃時分別低47％和59％，在65℃時分別低43％和65％(圖2C)。
因此，在電流分析中，反平行和平行PNA探針均能區(qū)分完全互補(bǔ)dsDNA靶和那些含有1個或2個堿基對突變的不完全互補(bǔ)dsDNA靶。實(shí)施例33號探針是15聚體的ssDNA，在序列和方向上均與15聚體的1號反平行探針(SEQ ID NO8)相同。3號探針結(jié)構(gòu)如下5’-CAC CAAAGA TGA TAT-3’。
將3號ssDNA探針與50聚體野生型和突變型dsDNA靶序列在未經(jīng)預(yù)變性條件下反應(yīng)，以進(jìn)一步驗(yàn)證電流分析的特異性。該分析條件與實(shí)施例1中所述條件等同。
由于DNA嵌入劑YOYO-1的增強(qiáng)作用，在30℃到65℃之間形成了dsDNAssDNA三鏈體。在用1伏電壓處理后，由SEQ ID NO1和3號探針組成的完全匹配DNA三鏈體產(chǎn)生最高的電導(dǎo)值(圖3A)。相反，當(dāng)不完全互補(bǔ)探針與靶組合生成單堿基對錯配(SEQ ID NO2+3號探針)和連續(xù)的兩個堿基對錯配(SEQ ID NO3+3號探針)時，導(dǎo)致平均電導(dǎo)值分別比匹配溫度下完全匹配序列所觀察到的平均電導(dǎo)值在23℃時分別低14％和64％，在50℃時分別低30％和70％，在65℃時分別低25％和72％(圖3A)。向這些樣品施加更高電壓(5V)，與在1V，特別是在更低溫度下得到的結(jié)果相比，導(dǎo)致完全匹配和錯配樣品間的電流差別更大。在用5V處理15秒后，與匹配溫度下完全匹配DNA三鏈體所觀察到的平均電流相比，單堿基對錯配和兩個堿基對錯配的DNA三鏈體的平均電流在23℃時分別低54％和78％，在50℃時分別低68％和70％，在65℃時分別低33％和61％(圖3B)。
在類似的電學(xué)實(shí)驗(yàn)中，在施加1V或5V電壓前，雜交混合物加熱至65℃，并維持在該溫度或立即冷卻至50℃或23℃。在23℃、50℃和65℃，對完全匹配的DNA三鏈體序列(SEQ ID NO1+3號探針)用1V處理15秒產(chǎn)生最高電導(dǎo)值(圖3A)。含單堿基對錯配的DNA三鏈體(SEQ ID NO2+3號探針)或含兩個堿基對錯配的DNA三鏈體(SEQ ID NO3+3號探針)的電導(dǎo)在23℃分別低21％和63％，在50℃分別低18％和74％，在65℃分別低12％和106％(圖3A)。類似地，當(dāng)向預(yù)熱樣品施加5V電壓時，與完全匹配的DNA三鏈體所產(chǎn)生的平均電導(dǎo)值相比，單堿基對錯配的DNA三鏈體和兩個堿基對錯配的DNA三鏈體的平均電導(dǎo)值在23℃時分別低24％和104％，在50℃時分別低42％和44％，在65℃時分別低38％和102％(圖3B)。
在電流分析中，反平行PNA探針(圖1)和ssDNA探針(圖3)表現(xiàn)出相似的行為，這表明用作探針的核酸整體的主鏈不是特別重要。YOYO-1的存在使dsDNA靶和ssDNA探針形成三鏈螺旋構(gòu)象，根據(jù)溶液中靶和探針間序列互補(bǔ)的程度，能產(chǎn)生不同的電荷。隨探針和靶間錯配程度增加，電導(dǎo)降低，從而證明電流分析在不進(jìn)行預(yù)變性情況下使用天然DNA探針時具有可靠性。實(shí)施例4在實(shí)施例1-3中所述的電流分析中，將DNA嵌入劑YOYO-1加入含雜交混合物的溶液中。YOYO-1嵌入促進(jìn)了dsDNAPNA三鏈體和dsDNAssDNA三鏈體的形成。實(shí)施例4評估了電流分析中利用與ssDNA探針共價(jià)連接的嵌入劑部分的可能性。
吖啶也是一種dsDNA嵌入劑，其也具有嵌入核酸三鏈體結(jié)構(gòu)的能力，由此穩(wěn)定三螺旋結(jié)構(gòu)。參見，例如Kukreti等，“Extension of therange of DNA sequences available for triple helix formationstabilizationof mismatched tripliexes by acridine-containing oligonucleotides.”25Nucleic Acids Research 4264-4270(1977)。用DNA合成儀(Expedite 8909，PerSeptive Biosystems)合成了在3’端共價(jià)連接了吖啶分子(GlenResearch，Sterling，VA，USA)的ssDNA探針，并經(jīng)HPLC純化。
4號探針是15聚體ssDNA，序列和方向與3號15聚體探針相同(因此其序列和取向也與1號15聚體反平行PNA探針(SEQ ID NO8)相同)，只是在3’端添加了一個吖啶部分。該探針結(jié)構(gòu)為5’-CAC CAAAGA TGA TAT-吖啶-3’。
雜交反應(yīng)混合物(80μl)含有以下成分2pmole的靶dsDNA、2pmole的4號ssDNA探針和0.5×TBE。將樣品放置在3mm石英杯中，并在23℃以5伏DC通電11秒。如實(shí)施例1所述檢測電流和溫度。
如圖4所示，由于穩(wěn)定嵌入了共價(jià)連接的吖啶部分，4號ssDNA探針能與完全匹配的50聚體dsDNA靶(SEQ ID NO1)雜交，產(chǎn)生-0.53mA的平均電流。相比之下，當(dāng)根據(jù)對照(無靶DNA的4號探針)校準(zhǔn)后，與完全匹配的DNA三鏈體所得結(jié)果相比，含1個堿基對錯配的較不穩(wěn)定DNA三鏈體(SEQ ID NO2+4號探針)或含2個堿基對錯配的較不穩(wěn)定DNA三鏈體(SEQ ID NO3+4號探針)產(chǎn)生的平均電流分別低52％和66％(圖4)。
因此，在電流分析中，對于形成DNA三螺旋，連接到ssDNA探針上的吖啶與未連接的YOYO-1同等有效，根據(jù)靶和探針的序列互補(bǔ)程度，所述DNA三螺旋產(chǎn)生不同的電流。
SEQ ID NO4是來源于SEQ ID NO1的15聚體dsDNA靶序列，其設(shè)計(jì)成與1號探針完全互補(bǔ)。
野生型靶DNA(SEQ ID NO4)的有義鏈的序列為5’-ATA TCATCT TTG GTG-3’。
野生型靶DNA(SEQ ID NO4)的反義鏈的序列為5’-CAC CAAAGA TGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO4)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為40.0℃。
SEQ ID NO5是與野生型靶DNA(SEQ ID NO4)相類似的15聚體的突變dsDNA靶序列，只是有一個堿基對的突變(下劃線)，其中將序列TTT變?yōu)門AT。
突變體靶DNA(SEQ ID NO5)的有義鏈序列為5’-ATA TCA TCTATG GTG-3’。
突變體靶DNA(SEQ ID NO5)的反義鏈序列為5’-CAC CATAGATGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO5)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為40.0℃。
SEQ ID NO6是與野生型靶DNA(SEQ ID NO4)相類似的15聚體的突變dsDNA靶序列，只是有連續(xù)兩個堿基對的突變(下劃線)，其中序列ATC變?yōu)镚GC。
突變體靶DNA(SEQ ID NO6)的有義鏈序列為5’-ATA TCGGCTTTG GTG-3’。
突變體靶DNA(SEQ ID NO6)的反義鏈序列為5’-CAC CAAAGCCGA TAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO6)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為44.0℃。
SEQ ID NO7是與野生型靶DNA(SEQ ID NO4)相類似的15聚體的突變dsDNA靶序列，只是有分開的三個堿基對的突變(下劃線)，其中三個單堿基對突變各為三個堿基對所分開，序列ATC、TCT和TGG分別變?yōu)锳CC、TAT和TAG。
突變體靶DNA(SEQ ID NO7)的有義鏈序列為5’-ATACCA TATTTAGTG-3’。
突變體靶DNA(SEQ ID NO7)的反義鏈序列為5’-CACTAA ATATGGTAT-3’。
dsDNA(SEQ ID NO7)的熔點(diǎn)(Tm)預(yù)計(jì)為38.0℃。
雜交反應(yīng)混合物(80μl)含有以下成分2pmole的靶dsDNA、2pmole的2號平行PNA探針、0.5×TBE和250nM的DNA嵌入劑YOYO-1。反應(yīng)混合物在95℃溫育5到10分鐘使其變性，接著保存于65℃直到分析。樣品放于石英杯中，用波長為488nm的氬離子激光束照射，在65℃監(jiān)測熒光發(fā)射情況。通過一個由軟件控制的直接放置在各樣品中的溫度傳感器，同時實(shí)現(xiàn)溫度檢測。最大熒光強(qiáng)度產(chǎn)生于536nm波長，表明YOYO-1嵌入了PNADNA雜合體。作為第二分析，在對各樣品進(jìn)行初始激光照射后，對相同樣品進(jìn)行1V DC通電4秒。在通電的最后1秒，這些樣品用氬離子激光束再一次照射，并在65℃監(jiān)測熒光發(fā)射情況。各分析樣品的熒光強(qiáng)度作為波長的函數(shù)進(jìn)行繪圖。
由完全互補(bǔ)序列組成的ssDNAPNA雜合體(SEQ ID NO4+2號探針)使得YOYO-1最大嵌入，產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(圖5A)。單堿基對錯配的ssDNAPNA雜合體(SEQ ID NO5+2號探針)、連續(xù)兩個堿基對錯配的ssDNAPNA雜合體(SEQ ID NO6+2號探針)和分開的三個堿基對錯配的ssDNAPNA雜合體(SEQ ID NO7+2號探針)在65℃時熒光強(qiáng)度都比完全匹配的ssDNAPNA雜合體所得的熒光強(qiáng)度低(圖5，數(shù)據(jù)沒有列出)。隨著探針與靶之間的錯配程度增加，YOYO-1嵌入的水平降低，因而熒光強(qiáng)度也降低。當(dāng)不存在任何DNA和PNA時(僅YOYO-1)，只觀察到背景熒光(圖5A)。
當(dāng)在65℃對完全匹配的ssDNAPNA雜合體以1V通電4秒，熒光強(qiáng)度保持相對恒定，只降低2％(圖5A)。相反，與在不加電壓情況下照射相同樣品所得到的結(jié)果相比，向含單堿基對錯配(圖5B)、兩個堿基對錯配(圖5C)和三個堿基對錯配(數(shù)據(jù)沒有列出)的不完全互補(bǔ)雙鏈體施加1V電壓產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別低18％、39％和71％。用低電壓電流(例如1V)處理會進(jìn)一步減小含堿基對錯配的ssDNAPNA雜合體的穩(wěn)定性。當(dāng)在通電情況下，隨探針和靶間序列互補(bǔ)程度降低，熒光強(qiáng)度顯著降低，從而提供了高度可靠且精確的第二分析，用于區(qū)分完全匹配序列和含單堿基對、兩個堿基對或三個堿基對突變的序列。
雜交反應(yīng)混合物(80μl)含有以下成分4pmole的靶dsDNA、4pmole的1號反平行PNA探針、0.5×TBE和250nM的DNA嵌入劑YOYO-1。樣品放于石英杯中，用波長為488nm的氬離子激光束照射80毫秒，并在23℃監(jiān)測熒光發(fā)射情況。通過一個由軟件控制的直接放置在各樣品中的溫度傳感器，同時實(shí)現(xiàn)溫度檢測。最大熒光強(qiáng)度產(chǎn)生于536nm波長，表明YOYO-1嵌入了PNADNA雜合體。作為第二分析，在對各樣品進(jìn)行初始激光照射后，對相同樣品進(jìn)行20V DC通電4秒。在通電3秒后，這些樣品立即用氬離子激光束再一次照射80毫秒，并在23℃監(jiān)測熒光發(fā)射情況。各分析樣品的熒光強(qiáng)度作為波長的函數(shù)進(jìn)行繪圖。
為嵌入劑YOYO-1所增強(qiáng)，在23℃形成了dsDNAPNA三鏈體。當(dāng)野生型50聚體dsDNA靶序列(SEQ ID NO1)與1號15聚體反平行PNA探針雜交時，產(chǎn)生最強(qiáng)的熒光強(qiáng)度(圖6)。相比之下，單堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO2+1號探針)和連續(xù)兩個堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體(SEQ ID NO3+1號探針)在23℃時熒光強(qiáng)度分別比完全匹配的dsDNAPNA三鏈體的熒光強(qiáng)度低60％和91％(圖6)。當(dāng)含YOYO-1的反應(yīng)混合物中不存在任何DNA和PNA時，只觀察到背景熒光。
由完全互補(bǔ)的三鏈體和含單堿基對錯配或兩個堿基對錯配的三鏈體得到的熒光強(qiáng)度差別明顯比完全匹配的雙鏈體和不完全互補(bǔ)的雙鏈體間熒光強(qiáng)度差別大(比較圖5和圖6)。顯然，對于檢測堿基對錯配，形成三鏈體的熒光強(qiáng)度分析具有較強(qiáng)的區(qū)分能力。
此外，二次施加電壓甚至可進(jìn)一步區(qū)分野生型和突變序列。完全匹配的dsDNAPNA三鏈體以20V處理3秒所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度光譜基本上與未施加電壓的相同樣品所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度光譜相同(圖6)。但對含單堿基對錯配和兩個堿基對錯配的不完全互補(bǔ)三鏈體施加20V電壓3秒所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度分別比不通電下照射的相同樣品所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度低23％和71％(圖6)。20V電處理不影響完全互補(bǔ)三鏈體的穩(wěn)定性，但降低含堿基對錯配的dsDNAPNA三鏈體的穩(wěn)定性，其影響程度取決于探針和靶間的序列互補(bǔ)程度。因此，在熒光強(qiáng)度分析中施加電壓，提供了更可靠的分析，用以在不需要序列預(yù)變性的情況下區(qū)分野生型序列和含單堿基對或兩個堿基對突變的序列。
盡管本發(fā)明在此做了詳細(xì)說明，并列舉特定的范例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的情況下，還可有多種改變和修飾。
序列表序列表<110>皮埃爾·皮卡德(Picard，Pierre)亞斯曼·I·戴克斯(Daksis，Jasmine)格倫·H·埃里克森(Erikson，Glen)<120>在不同條件下利用多種測量方法對雙鏈體或三鏈體雜交進(jìn)行均相分析(HOMOGENEOUSASSAY OF DUPLEX 0R TRIPLEX HYBRIDIZATION BY MEANS OF MULTIPLE MEASUREMENTS UNDERVARIED CONDITIONS)<130>E1047/20031<140><141><160>9<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>1tggcaccatt aaagaaaata tcatctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>2tggcaccatt aaagaaaata tcgtctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>3<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>3tggcaccatt aaagaaaata tactctttgg tgtttcctat gatgaatata 50<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>4atatcatctt tggtg 15<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>5atatcatcta tggtg 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>6atatcggctt tggtg 15<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述來自人囊性纖維化基因的外顯子10<400>7ataccatatt tagtg 15<210>8<211>15<212>PNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述ssPNA探針<400>8caccaaagat gatat 15<210>9<211>15<212>PNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述ssPNA探針<400>9tatagtagaa accac
權(quán)利要求
1.一種分析序列特異性雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；將第一刺激物施加到所述檢測樣品上，以提供第一受激檢測樣品；從所述第一受激檢測樣品中檢測第一信號，其中所述第一信號與所述探針和所述靶間的結(jié)合親和力相關(guān)；根據(jù)參照樣品所顯示的參照信號校準(zhǔn)所述第一信號，所述參照樣品包括與所述靶結(jié)合的至少一種參照探針，其中相對于所述靶，各所述探針和所述至少一種參照探針是選自如下組的不同成員完全匹配、單堿基錯配、二堿基錯配、三堿基錯配、單堿基缺失、二堿基缺失和三堿基缺失；以及由所述校準(zhǔn)來確定所述探針與所述靶之間匹配程度的第一測定值；將第二刺激物施加到所述第一受激檢測樣品上，以提供第二受激檢測樣品；從所述第二受激檢測樣品中檢測第二信號，其中所述第二信號與所述探針和所述靶間的結(jié)合親和力相關(guān)；由所述第二信號的所述檢測來確定所述探針與所述靶之間所述匹配程度的第二測定值；以及比較所述第一測定值和所述第二測定值。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括量化所述結(jié)合親和力。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是在所述靶無需預(yù)變性的情況下進(jìn)行的均相分析。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述方法是在所述靶無需PCR擴(kuò)增的情況下進(jìn)行的均相分析。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測樣品進(jìn)一步包括嵌入劑，所述靶是dsDNA，所述探針特異性地與所述靶雜交形成三鏈體。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針是ssDNA或RNA。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針具有帶部分電荷的主鏈。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針具有不帶電荷的主鏈。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述探針包括ssPNA序列。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針是經(jīng)反平行合成而制備的ssPNA。
11.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針和所述靶長度相同。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針長度為6-30個核苷酸。
13.權(quán)利要求1的方法，其是在孔內(nèi)或不透性表面上的溶液中進(jìn)行的。
14.權(quán)利要求1的方法，其是在生物芯片上進(jìn)行的。
15.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所述施加所述第二刺激物之前改變所述第一受激檢測樣品的條件，其中所述改變足以顯著影響所述探針與所述靶之間的不完全互補(bǔ)雜交，且不足以顯著影響所述探針與所述靶之間的完全互補(bǔ)雜交。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述改變包括向所述第一受激檢測樣品施加電壓，并且所述結(jié)合親和力與所述第一信號和所述第二信號間的差別正相關(guān)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述電壓是約1V-約20V。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述電壓是直流或交流電壓。
19.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一信號或第二信號是電導(dǎo)。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述電導(dǎo)指示所述探針和所述靶間的匹配程度。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述電導(dǎo)是相對于加入所述探針和所述靶前的所述雜交介質(zhì)的參照電導(dǎo)而言的。
22.權(quán)利要求20的方法，其中測量了所得到的最大初始安培數(shù)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中測量了安培數(shù)由所述最大初始安培數(shù)峰值下降的比率。
24.權(quán)利要求20的方法，其中測量了在所述施加所述電壓期間的安培數(shù)。
25.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法的靈敏度足以將單堿基對錯配探針-靶復(fù)合體與兩個堿基對錯配探針-靶復(fù)合體區(qū)別開來。
26.權(quán)利要求20的方法，其中所述方法的靈敏度足以將完全互補(bǔ)的探針-靶復(fù)合體與單堿基對錯配探針-靶復(fù)合體和兩個堿基對錯配探針-靶復(fù)合體區(qū)別開來。
27.權(quán)利要求20的方法，其中所述檢測樣品進(jìn)一步包括嵌入劑，所述靶是dsDNA，所述探針特異性地與所述靶雜交形成三鏈體。
28.權(quán)利要求20的方法，其中所述探針是ssDNA。
29.權(quán)利要求20的方法，其中所述探針是PNA。
30.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括在所述檢測樣品中提供一熒光團(tuán)；以及根據(jù)第二參照信號校準(zhǔn)所述第二信號，其中(a)所述第一刺激物是電壓，所述第一信號是電導(dǎo)，所述第二刺激物是激發(fā)輻射以及所述第二信號是熒光強(qiáng)度；或者(b)所述第一刺激物是激發(fā)輻射，所述第一信號是熒光強(qiáng)度，所述第二刺激物是電壓以及所述第二信號是電導(dǎo)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述熒光團(tuán)與所述探針共價(jià)連接，其連接方式使得所述熒光團(tuán)不嵌入相鄰堿基之間，所述強(qiáng)度隨所述探針和所述靶間的匹配程度的增加而降低。
32.權(quán)利要求30的方法，其中所述熒光團(tuán)是嵌入劑，所述強(qiáng)度隨所述探針和所述靶間的匹配程度的增加而增加。
33.權(quán)利要求30的方法，其中所述熒光團(tuán)是與所述探針共價(jià)連接的嵌入劑。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述熒光團(tuán)是嵌入劑，其被加入到不含所述探針和不含所述靶的所述雜交介質(zhì)中。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述檢測樣品進(jìn)一步包括嵌入劑，所述靶是dsDNA，所述探針特異性地與所述靶雜交形成三鏈體。
36.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括在所述檢測樣品中提供一熒光團(tuán)，其中所述改變包括向所述第一受激檢測樣品施加電壓，所述第一刺激物和所述第二刺激物是激發(fā)輻射，以及所述第一信號和所述第二信號是熒光強(qiáng)度。
37.權(quán)利要求36的方法，進(jìn)一步包括根據(jù)所述第一信號校準(zhǔn)所述第二信號，以確定所述靶和所述探針間的匹配程度。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)與所述探針共價(jià)連接，其連接方式使得所述熒光團(tuán)不嵌入相鄰堿基之間，并且所述強(qiáng)度隨所述探針和所述靶間的所述匹配程度的增加而降低。
39.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)是嵌入劑，所述強(qiáng)度隨所述探針和所述靶間的匹配程度的增加而增加。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)是與所述探針共價(jià)連接的嵌入劑。
41.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)是嵌入劑，其被加入不含所述探針和不含所述靶的所述雜交介質(zhì)中。
42.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)是選自如下組的嵌入劑YOYO-1、TOTO-1、溴化乙啶、乙啶同型二聚體-1、乙啶同型二聚體-2和吖啶。
43.權(quán)利要求36的方法，其中所述檢測樣品進(jìn)一步包括嵌入劑，所述靶是dsDNA，所述探針特異性地與所述靶雜交形成三鏈體。
44.權(quán)利要求36的方法，其中所述方法是一種均相分析，其在無需給所述靶或所述探針提供信號淬滅劑的情況下進(jìn)行。
45.權(quán)利要求36的方法，其中所述激發(fā)輻射是由波長為約200nm到約1000nm的氬離子激光器發(fā)射出的。
46.權(quán)利要求36的方法，其在溫度為5到85℃時進(jìn)行。
47.權(quán)利要求36的方法，其在溫度低于25℃時進(jìn)行。
48.權(quán)利要求36的方法，其中所述方法的可靠性不依賴于探針或靶堿基序列，并且不依賴于探針或靶的鳥嘌呤和胞嘧啶的含量。
49.權(quán)利要求36的方法，其中所述檢測樣品體積約為20μl，含有約10fmole的靶和約10fmole的探針。
50.權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測樣品體積約為40μl，含有約1pmole的靶和約1pmole的探針。
51.權(quán)利要求36的方法，其中所述樣品中所述靶的濃度不高于5×10-10M。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述樣品中所述探針的濃度不高于5×10-10M。
53.權(quán)利要求36的方法，其中所述熒光團(tuán)是嵌入劑，在嵌入后所述嵌入劑發(fā)出熒光時所處的波長轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙ㄩL，所述波長與所述第二波長之間的差異表明所述探針與所述靶間形成的復(fù)合體是否是雙鏈體或三鏈體，以及所述靶是否是DNA或RNA。
54.一種分析雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；測量所述檢測樣品在第一條件下的第一信號，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的初級測定值，其中所述第一信號與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；測量所述檢測樣品在第二條件下的第二信號，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的次級測定值，其中所述第二信號與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)，條件是當(dāng)所述第一條件和所述第二條件相似時，在測量所述第一信號后和測量所述第二信號前將刺激物施加到所述檢測樣品上，其中所述刺激物顯著影響所述探針和所述靶間的不完全互補(bǔ)雜交，卻不顯著影響所述探針和所述靶間的完全互補(bǔ)雜交；以及比較所述初級測定值和次級測定值，以評價(jià)二者間任何的不一致是否表明需要重新測試。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述第一信號是熒光發(fā)射，所述第二信號是電導(dǎo)。
56.權(quán)利要求54的方法，進(jìn)一步包括在所述測量所述第一信號之前或過程中向所述檢測樣品施加電壓。
57.權(quán)利要求54的方法，進(jìn)一步包括在所述初級測定值和所述次級測定值不同時重新測試所述檢測樣品。
58.一種分析雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；測量通電前所述檢測樣品的熒光強(qiáng)度，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的初級測定值，其中所述通電前熒光強(qiáng)度與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；將電壓施加到所述檢測樣品上；在施加所述電壓過程中或之后，測量通電后所述檢測樣品的熒光強(qiáng)度，以提供關(guān)于所述探針和所述靶間雜交的次級測定值，其中所述通電后熒光強(qiáng)度與所述探針和所述靶間的雜交相關(guān)；以及比較所述初級測定值和次級測定值，以評價(jià)二者間任何的不一致是否表明需要重新測試。
59.權(quán)利要求58的方法，其中改變施加到所述檢測樣品上的所述電壓，以便在分析完全互補(bǔ)的探針-靶復(fù)合體時使得所述通電前熒光強(qiáng)度和所述通電后熒光強(qiáng)度相對不變，在分析不完全互補(bǔ)的探針-靶復(fù)合體時所述通電前熒光強(qiáng)度和通電后熒光強(qiáng)度不同，以及所述通電前熒光強(qiáng)度和通電后熒光強(qiáng)度的差別表示所述探針和所述靶間的錯配程度。
60.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括檢測所述探針是否含有純合或雜合等位基因。
61.一種分析序列特異性雜交的方法，所述方法包括提供包含至少一種核酸序列的靶；提供包含核酸或核酸類似物序列的探針；將所述探針和所述靶加入雜交介質(zhì)，以提供檢測樣品；將電壓施加到所述檢測樣品上；在所述施加所述電壓過程中或之后，檢測所述檢測樣品的信號，其中所述信號與所述探針和所述靶間的結(jié)合親和力相關(guān)；根據(jù)參照樣品所顯示的參照信號校準(zhǔn)所述信號，所述參照樣品包括與所述靶結(jié)合的至少一種參照探針，其中相對于所述靶，各所述探針和所述至少一種參照探針是選自如下組的不同成員完全匹配、單堿基錯配、二堿基錯配、三堿基錯配、單堿基缺失、二堿基缺失和三堿基缺失；以及由所述校準(zhǔn)來確定所述探針與所述靶之間的匹配程度。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于核酸雜交、檢測和評價(jià)的均相分析方法。所述分析包括在將電壓施加于測試樣品之前和過程中從測試樣品中得到信號，以及使信號相互關(guān)聯(lián)，每一所述信號都是探針與靶相互結(jié)合親和力的指征。由于可校準(zhǔn)電壓從而顯著地使除完全互補(bǔ)雜交以外的任何雜交去穩(wěn)定，所述分析能檢測探針與靶間的匹配程度。其大小與結(jié)合親和力相關(guān)的信號可以是電導(dǎo)和/或熒光強(qiáng)度。優(yōu)選對兩種信號對進(jìn)行測量和比較，從而增強(qiáng)分析的可靠性。所述分析可以檢測單鏈探針與非變性的雙鏈靶之間形成三鏈體的特異性雜交，因此無需使靶變性。該分析方法也可應(yīng)用于雙鏈雜交復(fù)合體。
文檔編號C12N15/09GK1447861SQ01804052
公開日2003年10月8日 申請日期2001年1月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月24日
發(fā)明者格倫·H·埃里克森, 皮埃爾·皮卡德, 亞斯曼·I·戴克斯 申請人:英詹尼斯公司