專利名稱：新型單子葉植物基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物中的廣譜病害抗性、包括系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的現(xiàn)象。更具體地說，本發(fā)明涉及與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的NIM1基因單子葉同源物的鑒定、分離和表征。
植物經(jīng)常受到包括病毒、細菌、真菌和線蟲在內(nèi)的各種致病生物體的攻擊。農(nóng)作物植物特別脆弱，因為它們通常生長成遺傳上一致的單種栽培物；當病害發(fā)作時，損失可能是嚴重的。然而，大部分植物具有其抵抗致病生物體的先天機制。植物培育者和病理學(xué)家已經(jīng)鑒定了對植物病原體具有抗性的天然變化形式并將其培育成許多農(nóng)作物植物。這些天然病害抗性基因通常提供了抵抗病原體的高水平抗性或免疫性。
系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)是一種用于自身抵抗病原體的復(fù)合系統(tǒng)植物的組成部分(Hunt和Ryals，1996；Ryals等，1996)。另外參見美國專利號5,614,395。SAR是植物病原體反應(yīng)的一個特別重要的方面，因為它是病原體誘導(dǎo)的對包括病毒、細菌和真菌在內(nèi)的廣譜感染性病原體的系統(tǒng)抗性。當SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被阻斷時，植物變得對通常導(dǎo)致病害的病原體更為敏感，且它們對不經(jīng)常導(dǎo)致病害的某些感染性病原體也變得敏感(Gaffney等，1997；Delaney等，1994；Delaney等，1997；Bi等，1995；Mauch-Mani和Slusarenko，1996)。這些觀察結(jié)果表明SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對維持植物健康是關(guān)鍵的。
在理論上，SAR反應(yīng)可以被分成兩個階段。在初始階段中，識別病原體感染且釋放通過韌皮部傳輸?shù)竭h端組織的信號。這種系統(tǒng)性信號被因SAR基因和病害抗性的表達而起反應(yīng)的靶細胞覺察。SAR的維持期是指從數(shù)周到植物的整個生命期的時間期限，在此過程中該植物是準穩(wěn)態(tài)的且病害抗性得到控制(Ryals等，1996)。
水楊酸(SA)的累積看起來是SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的。不能因用特異性抑制劑處理，即，苯丙氨酸解氨酶的后生阻抑或特異性降解SA的水楊酸羥化酶的轉(zhuǎn)基因表達而累積SA的植物也不能誘導(dǎo)SAR基因表達或病害抗性(Gaffney等，1993；Delaney等，1994；Mauch-Mani和Slusaerenko，1996；Maher等，1994；Pallas等，1996)。盡管已經(jīng)建議SA可以用作系統(tǒng)性信號，但是目前這是有爭議的；且迄今為止，確切已知所有情況是如果SA不能累積，那么SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將被阻斷(Pallas等1996；Shulaev，1995；Vernooij等，1994)。
近來，擬南芥屬(Arabidopsis)已經(jīng)表現(xiàn)出可作為研究SAR的模型系統(tǒng)(Uknes等，1992；Uknes等，1993；Cameron等，1994；Mauch-Mani和Slusarenko，1994；Dempsey和Klessig，1995)。已經(jīng)證實擬南芥屬中的SAR可以被病原體和諸如SA、2，6-二氯異煙酸(INA)和苯并(1，2，3)噻二唑-7-硫代羧酸S-甲酯(BTH)這樣的化學(xué)藥品所激活(Uknes等，1992；Vernooij等，1995；Lawton等，1996)。在用INA或BTH進行處理或病原體感染后，至少三種與病理相關(guān)的(PR)蛋白質(zhì)基因即PR-1、PR-2和PR-5同時被誘導(dǎo)且伴隨抗性發(fā)作(Uknes等，1992，1993)。在煙草中，用病原體或免疫化合物處理的最佳特征化物種誘導(dǎo)至少9組基因的表達(Ward等，1991)。通過用不同的SAR基因轉(zhuǎn)化植物已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因病害抗性植物(美國專利號5,614,395)。
盡管對SAR的大量研究已經(jīng)在雙子葉植物中進行，也在單子葉植物中證實了SAR。例如，已在稻中證實了SAR，其中由P.s.pv syringae誘導(dǎo)的感染造成了針對葉胚病原體Pyricularia oryzae的系統(tǒng)性保護(Smith和Metranx，1991)；在大麥和小麥中，對由白粉病原體Erysiphe gramins的事先感染導(dǎo)致對E.graminis的保護增強(Schweizer等，1989；Hwang和Heitefuss，1992)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)的對INA之抗性已經(jīng)在大麥中證實(Kogel.等，1994；Wasterhack等1994)。近來，顯示BTH在小麥中誘導(dǎo)對E.graminis、Pucciniarecondita和Septoria sp.的獲得性抗性；以及對一些新植物基因轉(zhuǎn)錄的積累之誘導(dǎo)，所述基因在病原體感染期被誘導(dǎo)(Grlach，等1996)。
已經(jīng)分離出了具有改良的SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的大量擬南芥屬突變體(Delaney，1997)。這些突變體中最重要的是所謂的lsd(病變模擬病害)突變體和acd2(加速的細胞死亡)(Dietrich等，1994；Greenberg等，1994)。這些突變體均在其葉上具有一定程度的自發(fā)性壞死病變形成、SA水平升高、SAR基因的mRNA累積和病害抗性顯著提高。已經(jīng)分離并表征了至少7種不同的lsd突變體(Dietrich等；1994；Weymann等，1995)。另一種有意義類型的突變體是cim(組成型免疫)突變體(Lawton等，1993)。另外參見美國專利號5,792,904和國際PCT申請WO 94/16077。類似于lsd突變體和acd2，cim突變體具有升高的SA和SAR基因表達和抗性，不過，與lsd或acd2相反，在其葉上不會表現(xiàn)出可檢測到的病變。cpr1(PR基因的組成型表達子)可以是一類cim突變體；然而，因為尚未消除cpr1葉上存在的顯微病變，所以cpr1可能是一類lsd突變體(Bowling等，1994)。
已經(jīng)分離了在SAR信號傳輸中被阻斷的突變體。ndr1(非物種特異性病害抗性)是一種使含有不同無毒力基因的丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)和寄生霜霉(Peronospera parasitica)的一般無毒性分離物生長的突變體(Century等；1995)。顯然這種突變體在SAR信號傳輸中的早期被阻斷。npr1(PR基因的非表達子)是一種不能在INA處理后誘導(dǎo)SAR信號途徑表達的突變體(Cao等，1994)。已經(jīng)根據(jù)eds(增強的病害敏感性)突變體在接種低濃度細菌后維持細菌感染的能力分離了它們(Glazebrook等，1996；Parker等，1996)。某些eds突變體在表型上非常類似于npr1且近來已經(jīng)證實eds5和eds53是npr1的等位基因(Glazebrook等，1996)。nim1(非誘導(dǎo)型免疫)是一種在用INA處理后維持寄生霜霉(即霜霉病致病病原體)生長的突變體(Delaney等，1995；美國專利號5,792,904)。盡管nim1可以在病原體感染后累積SA，但是它不能誘導(dǎo)SAR基因表達或病害抗性，這提示這種突變阻斷了SA下游的途徑。nim1在其對INA或BTH反應(yīng)的能力上也受到了削弱，這提示在這些化學(xué)藥品作用的下游存在阻斷作用(Delaney等，1995；Lawton等，1996)。
已經(jīng)分離并表征了擬南芥屬的等位基因，它們的突變體分別對nim1和npr1表型負責(zé)(Ryals等，1997；Cao等，1997)。野生型NIM1基因產(chǎn)物與導(dǎo)致擬南芥屬中SAR和基因?qū)虿『剐缘男盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)(Ryals等，1997)。Ryals等，1997還報導(dǎo)了nim1的另外5種等位基因的分離方法，這些等位基因顯示出在化學(xué)誘導(dǎo)的PR-1基因表達和真菌抗性方面從每周削弱到被強力阻斷的一系列的表型。將野生型NPR1基因轉(zhuǎn)化成npr1突變體不僅補充了突變，從而恢復(fù)了SAR誘導(dǎo)作用對PR-基因表達和病害抗性的反應(yīng)性，而且在沒有SAR誘導(dǎo)作用存在的情況下賦予了所述的轉(zhuǎn)基因植物對丁香假單胞菌導(dǎo)致的感染更高的抗性(Cao等，1997)。WO 98/06748中描述了從擬南芥屬中分離NPR1和從Nicotiana glutinosa中分離同源物的方法。另外參見WO 97/49822、WO 98/26082和WO 98/29537。此外，美國專利申請09/265,149(Salmeron等人)描述了NIM1基因煙草(Nicotiana tabacum)、Lycopersicon esculentum(蕃茄)、Brassicanapus(油籽油菜)和擬南芥同源物的分離。
盡管作了大量研究且應(yīng)用了包括植物的遺傳轉(zhuǎn)化在內(nèi)的完善和深入細致的農(nóng)作物保護措施，但是每年因病害導(dǎo)致的損失仍保持在10億美元。因此，存在對開發(fā)基于植物中病害抗性的遺傳基礎(chǔ)不斷增加的了解的新的農(nóng)作物保護措施的持續(xù)需求。特別地，存在對鑒定、分離和表征來自其它植物物種特別是單子葉植物的NIM1基因同源物的需求。
本發(fā)明通過提供幾種來自單子葉植物物種的擬南芥屬NIM1基因同源物而滿足了上述需求。特別地，本發(fā)明涉及NIM1基因的小麥(Triticum aestivum)(小麥)和稻(Oryza sativa)(稻)的同源物的分離，這些同源物編碼認為與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)的蛋白質(zhì)，所述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)對可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的生物和化學(xué)誘導(dǎo)物敏感。
因此，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，它包括來自單子葉植物的NIM1基因同源物的核苷酸序列。
在一個特定實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，它包括編碼SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的分離的核酸分子。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，所述的核苷酸序列在序列中包括與SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的至少20、25、30、35、40、45或50個(優(yōu)選20個)連續(xù)堿基對部分相同的至少20、25、30、35、40、45或50個(優(yōu)選20個)連續(xù)的堿基對部分。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物對從單子葉植物DNA文庫擴增所述的核苷酸序列。
在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物對從稻DNA文庫擴增所述的核苷酸序列；在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物對從小麥DNA文庫擴增所述的核苷酸序列；在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包括核苷酸序列的分離的核酸分子，可以使用聚合酶鏈反應(yīng)，采用含有SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的編碼序列(CDS)之前20個核苷酸和最后20個核苷酸之反向互補物的引物對，從單子葉植物DNA文庫擴增所述的核苷酸序列。
在又一實施方案中，本發(fā)明涉及一種分離的核酸分子，其含有來自單子葉植物的核苷酸序列，其能在嚴格雜交和洗滌條件下與SEQ IDNO1、7、9、11、13、15、17或19的互補物雜交。
本發(fā)明還包括一種嵌合基因，它包括在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動子；本發(fā)明還包括含有這類嵌合基因的重組載體，其中所述的載體能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化入宿主且可以用這類載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化宿主。優(yōu)選所述的宿主是諸如下列農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物之一的植物水稻、小麥、大麥、黑麥、canola、甘蔗、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、洋李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和糖甘蔗。本發(fā)明還包括來自本發(fā)明植物的種子。
此外，本發(fā)明涉及一種增加植物中SAR基因表達的方法，該方法通過在所述植物中表達自身含有在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動子的嵌合基因來進行，其中在轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達所編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種提高植物中病害抗性的方法，該方法通過在所述植物中表達自身含有在植物中具有活性的與本發(fā)明NIM1同源物編碼序列可操作地連接的啟動子的嵌合基因來進行，其中在轉(zhuǎn)化的植物中以高于野生型植物的水平表達所編碼的蛋白質(zhì)。
此外，本發(fā)明涉及一種選自SEQ ID NO3或4的PCR引物。
本發(fā)明還包括一種用于分離與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的NIM1同源物的方法，該方法包括使用引物對的聚合酶鏈反應(yīng)從單子葉植物DNA文庫擴增DNA分子，其中所述的引物對相當于SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19編碼序列(CDS)的前20個核苷酸和最后20個核苷酸的反向互補物；或所述的引物對表示為SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述單子葉植物DNA文庫是稻和小麥的DNA文庫。
SEQ ID NO1-來自小麥的NIM1同源物的基因組DNA序列。
SEQ ID NO2-由SEQ ID NO1編碼的小麥NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO3-寡核苷酸引物KL1。
SEQ ID NO4-寡核苷酸引物KL2。
SEQ ID NO5-PCR引物NIM 2B。
SEQ ID NO6-PCR引物NIM 2D。
SEQ ID NO7-由稻A擴增的498bp NIM-樣DNA片段，它是13個序列的共有區(qū)且與擬南芥MIM1基因序列具有59％的序列同一性。
SEQ ID NO8-由SEQ ID NO7編碼的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO9-由稻B擴增的498bp NIM-樣DNA片段，它與擬南芥NIM1基因序列具有62％的序列同一性。
SEQ ID NO10-由SEQ ID NO9編碼的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO11-由小麥擴增的498bp NIM-樣DNA片段，它是3個序列的共有區(qū)且與擬南芥NIM1基因序列具有55％的序列同一性。
SEQ ID NO12-由SEQ ID NO11編碼的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO13-來自稻A的NIM1同源物的全長cDNA序列，它與SEQ ID NO7的PCR片段一致。
SEQ ID NO14-由SEQ ID NO13編碼的稻NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO15-來自稻B的MM1同源物的部分cDNA序列，它相應(yīng)于SEQ ID NO9的PCR片段。
SEQ ID NO16-由SEQ ID NO15編碼的稻NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO17-來自小麥的NIM1同源物的全長cDNA序列，它相應(yīng)于SEQ ID NO11的PCR片段。
SEQ ID NO18-由SEQ ID NO17編碼的小麥NIM1同源物的蛋白質(zhì)序列。
SEQ ID NO19-來自相應(yīng)于小麥的NIM1樣基因組序列pHW01(SEQ ID NO1)的全長cDNA序列。
SEQ ID NO20-由SEQ ID NO19編碼的蛋白質(zhì)序列。
在描述本發(fā)明的過程中，使用下列術(shù)語且這些術(shù)語的定義如下所示。
相關(guān)/可操作地連接指的是物理或功能相關(guān)的兩個DNA序列。例如，認為啟動子或調(diào)節(jié)DNA序列與編碼RNA或蛋白質(zhì)的DNA序列“相關(guān)”，條件是這兩個序列可操作地連接或定位以使調(diào)節(jié)DNA序列影響編碼或結(jié)構(gòu)DNA序列的表達水平。
嵌合基因一種重組DNA序列，其中啟動子或調(diào)節(jié)DNA序列可操作地與編碼mRNA或表達為蛋白質(zhì)的DNA序列連接或相關(guān)，使得調(diào)節(jié)DNA序列能夠調(diào)節(jié)相關(guān)DNA序列的轉(zhuǎn)錄或表達。嵌合基因的調(diào)節(jié)DNA序列通常不與在自然界中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)的DNA序列可操作地連接。
編碼序列轉(zhuǎn)錄成諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、有義RNA或反義RNA這樣的RNA的核酸序列。優(yōu)選隨后在生物體中翻譯所述的RNA以便產(chǎn)生蛋白質(zhì)。
互補指的是包括反平行核苷酸序列的兩個核苷酸序列，所述的反平行核苷酸序列能夠在反平行核苷酸序列中的互補堿基對殘基之間形成氫鍵時彼此配對。
表達指的是植物中內(nèi)源性基因或轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，就反義構(gòu)建體而言，表達可能指的僅是反義DNA的轉(zhuǎn)錄。
表達盒能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在合適的宿主細胞中的表達的核酸序列，它包括與感興趣的核苷酸序列可操作地連接的啟動子，所述的感興趣的核苷酸序列與終止信號可操作地連接。它一般還包括適當翻譯所述核苷酸序列所需的序列。包括感興趣的核苷酸序列的表達盒可以是嵌合的，即其成分中的至少一種相對于其其它成分中的至少一種而言是異源的。該表達盒還可以是一種天然存在但已經(jīng)以用于異源表達的重組形式獲得的表達盒。然而，一般來說，該表達盒相對于宿主而言是異源的，即所述表達盒的特定核酸序列不會在宿主細胞中天然存在且必須通過轉(zhuǎn)化事件將其引入宿主細胞或宿主細胞的祖先。表達盒中核苷酸序列的表達可以在組成型啟動子或僅當宿主細胞接觸某些特定的外部刺激物時啟動轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動子的控制下進行。就諸如植物這樣的多細胞生物體而言，所述的啟動子對特定的組織或器官或發(fā)育階段也具有特異性。
基因位于基因組內(nèi)且除上述編碼核酸序列外還包括對控制編碼部分的表達、即轉(zhuǎn)錄和翻譯來說是必不可少的其它主要調(diào)節(jié)核酸序列的確定區(qū)?；蜻€可以包括其它的5’和3’未翻譯序列和終止序列。可以存在的其它元件例如是內(nèi)含子。
異源DNA序列本文所用的術(shù)語“異源DNA序列”、“外源DNA片段”或“異源核酸”各自指的是來源于對特定宿主細胞而言是外來的來源的序列或如果來自相同來源那么是根據(jù)其原始形式修飾的序列。因此，宿主細胞中的異源基因包括對特定宿主細胞而言是內(nèi)源性的但例如已經(jīng)通過應(yīng)用DNA改組修飾的基因。該術(shù)語還包括天然存在的DNA序列的非天然存在的多拷貝。因此，該術(shù)語指的是一種DNA片段，它對所述細胞而言是外源的或異源的或與所述細胞同源但位于通常未發(fā)現(xiàn)所述元件的所述宿主細胞核酸內(nèi)的某一位置上。表達外源DNA片段以便產(chǎn)生外源性多肽類。
同源DNA序列天然與引入其中的宿主細胞相關(guān)的DNA序列。
同類編碼當核酸序列編碼與由參比核酸序列編碼的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽時，該核酸序列與參比核酸序列為同類編碼。
分離的在本發(fā)明的上下文中，分離的核酸分子或分離的酶是一種脫離其天然環(huán)境存在且因此不是天然產(chǎn)物的受人控制的核酸分子或酶。分離的核酸分子或酶可以以純化形式存在或可以存在于諸如例如重組宿主細胞這樣的非天然環(huán)境中。
最小啟動子啟動子元件、特別是TATA元件，它們是無活性的或在沒有上游激活的情況下具有顯著降低的啟動子活性。在有合適的轉(zhuǎn)錄因子存在的情況下，最小啟動子的功能是啟動轉(zhuǎn)錄。
天然的指的是存在于未轉(zhuǎn)化細胞基因組中的基因。
天然存在的術(shù)語“天然存在的”用于描述與由人通過人工方式生產(chǎn)不同的能在自然界中發(fā)現(xiàn)的物體。例如，存在于生物體(包括病毒)中的蛋白質(zhì)或核苷酸序列是天然存在的，它們可以分離自天然來源且沒有被人在實驗室中進行過人為修飾。
NIM1Ryals等，1997中描述的基因，它與SAR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)有關(guān)。
NIM1由NIM1基因編碼的蛋白質(zhì)。
核酸術(shù)語“核酸”指的是脫氧核苷酸或核糖核苷酸及其單或雙鏈形式的聚合物。除非另有限定，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的已知類似物的核酸，它們與參比核酸具有相似的結(jié)合特性且以與天然出現(xiàn)的核苷酸相似的方式被代謝。除非另有說明，特定的核酸序列無疑還包括其保守修飾的變化形式(例如簡并密碼子取代)和互補序列以及明確指定的序列。具體地，可以通過生成其中一種或多種選擇的(或全部)密碼子的第三位被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)簡并密碼子取代(Batzer等，《核酸研究》(Nucleic Acid Res.)195081(1991)；Ohtsuka等，《生化雜志》(J.Biol.Chem.)2602605-2608(1985)；Rossolini等，《分子細胞探針》(Mol.Cell.Probes)891-98(1994))。也可以將術(shù)語“核酸”或“核酸序列”與基因、cDNA和由基因編碼的mRNA互換使用。在本發(fā)明的上下文中，核酸分子優(yōu)選是DNA片段。核苷酸由下列標準縮寫的其堿基來表示腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G)。
ORF可讀框。
植物任何完整的植物。
植物細胞植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，它包括原生質(zhì)體和細胞壁。植物細胞可以是分離的單細胞或培養(yǎng)的細胞形式，或作為諸如例如植物組織、植物器官或完整植物這樣的較高組織化單位的一部分。
植物細胞培養(yǎng)物植物單位培養(yǎng)物，諸如例如原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)物細胞、植物組織中的細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚囊、合子和不同發(fā)育階段的胚。
植物材料指的是葉、莖、根、花或花的部分、果實、花粉、卵細胞、合子、種子、插條、細胞或組織培養(yǎng)物、或植物的任何其它部分或產(chǎn)物。
植物器官植物明顯的和可見的結(jié)構(gòu)和分化部分，諸如根、莖、葉、花芽或胚。
植物組織組織成結(jié)構(gòu)和功能單位的一組植物細胞。包括植物或培養(yǎng)物中的植物的任何組織。本術(shù)語包括但不限于完整植物、植物器官、植物種子、組織培養(yǎng)物和組織成結(jié)構(gòu)和/或功能單位的任何組的植物細胞。該術(shù)語連同如上所述的或由本定義包括的任何特殊類型的植物組織一起使用或在沒有如上所述的或由本定義包括的任何特殊類型的植物組織的情況下使用并不排除任何其它類型的植物組織。
啟動子含有RNA聚合酶II的結(jié)合位點并啟動DNA轉(zhuǎn)錄的編碼區(qū)上游的未翻譯的DNA序列。啟動子區(qū)還可以包括起基因表達調(diào)節(jié)物作用的其它元件。
原生質(zhì)體不含細胞壁或僅含部分細胞壁的分離的植物細胞。
純化的術(shù)語“純化的”在用于核酸或蛋白質(zhì)時指的是基本上不含其它在天然狀態(tài)下與其相關(guān)的細胞成分的核酸或蛋白質(zhì)。優(yōu)選它是在同源狀態(tài)下，不過，它可以處于無水的或含水的溶液中。一般使用諸如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相層析這樣的分析型化學(xué)技術(shù)來測定純度和均勻性。屬于存在于制品中的主要物質(zhì)的蛋白質(zhì)基本上是純化的。術(shù)語“純化的”指的是核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中主要產(chǎn)生一條帶。特別地，它指的是核酸或蛋白質(zhì)的純度至少約為50％、更優(yōu)選純度至少約為85％且最優(yōu)選純度至少約為99％。
重組DNA分子使用重組DNA技術(shù)彼此連接的DNA分子的組合。
調(diào)節(jié)元件在控制核苷酸序列表達中所涉及的序列。調(diào)節(jié)元件包括可操縱地與感興趣的核苷酸序列和終止信號連接的啟動子。它們一般還包括正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。
選擇性標記基因其在植物細胞中的表達使細胞產(chǎn)生選擇優(yōu)勢的基因。用選擇性標記基因轉(zhuǎn)化的細胞所具有的選擇優(yōu)勢可能是由于與未轉(zhuǎn)化細胞的生長相比它們在有諸如抗生素或除草劑這樣的負選擇劑存在情況下的生長能力所造成的。與未轉(zhuǎn)化的細胞相比，轉(zhuǎn)化細胞所具有的選擇優(yōu)勢也可能是由于它們將添加的化合物用作營養(yǎng)物、生長因子或能源的增強的或新的能力所造成的。選擇性標記基因還指其在植物細胞中的表達使細胞產(chǎn)生負的和正的選擇優(yōu)勢的基因或基因組合。
顯著提高大于測定技術(shù)中固有的誤差限度的酶活性的提高，優(yōu)選在有抑制劑存在的情況下使野生型酶的活性提高約2倍或2倍以上、更優(yōu)選提高約5倍或5倍以上且最優(yōu)選提高約10倍或10倍以上。
就兩種或多種核酸或蛋白質(zhì)序列而言所用的術(shù)語“相同”或“同一性”百分比指的是當進行最大相應(yīng)性比較和序列對比時相同或具有規(guī)定的氨基酸殘基或核苷酸百分比的兩種或多種序列或亞序列，正如使用下列序列對比算法或通過目測檢查所測得。
基本上相同就兩種核酸或蛋白質(zhì)序列而言所用的術(shù)語“基本上相同”指的是當進行最大相應(yīng)性比較和序列對比時具有至少60％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選90-95％且最優(yōu)選99％的核苷酸或氨基酸殘基同一性的兩種或多種序列或亞序列，正如使用下列序列對比算法或通過目測檢查所測得的。在至少約50個殘基長的序列區(qū)內(nèi)、更優(yōu)選在約100個殘基區(qū)內(nèi)存在基本的同一性且最優(yōu)選在約150個殘基內(nèi)序列基本上相同。在一個最優(yōu)選的實施方案中，序列在全長編碼區(qū)內(nèi)基本上相同。此外，基本上相同的核酸或蛋白質(zhì)序列具有基本上相同的功能。
為了進行序列比較，一般一個序列起參比序列的作用，將測試序列與其進行比較。當使用序列比較算法時，將測試和參比序列輸入計算機，如果需要指定亞序列等同物并指定序列算法程序參數(shù)。然后序列比較算法以指定的程序參數(shù)為基準計算出測試序列與參比序列相比較的序列同一性百分比。
例如，可以通過下列方法進行用于比較的序列最佳排列Smith &waterman的局部同源性算法《數(shù)學(xué)應(yīng)用發(fā)展》(Adv.Appl.Math.)2482(1981)；Needleman & Wunsch的同源性序列對比算法《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)443(1970)；Pearson & Lipman的相似性方法檢索《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA)852444(1988)；這些算法的計算機化應(yīng)用(Wisconsin GeneticsSofware Package中的GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目測檢查(通常參見Ausubel等，參見下文)。
適合于確定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一個實例是BLAST算法，它描述在Altschul等的《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol.)215403-410(1990)中。公眾可以通過國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST分析的軟件。該算法包括首先通過確定查詢序列中長度W的短詞來確定主要劃線的序列對(HSPs)，當用數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的詞進行序列對比時，它們與某些正值閾值得分T相適應(yīng)或滿足它們。T指的是鄰近詞得分閾值(Altschul等，1990)。命中這些起始的鄰近詞為啟動檢索程序打下基礎(chǔ)以便找到含有它們的更長的HSPs。然后沿各序列的兩個方向擴展命中的詞，直到累積的序列對比得分得到增加為止。就核苷酸序列而言，使用參數(shù)M(配對殘基對的有利結(jié)果得分；總＞0)和N(錯配殘基的不利結(jié)果得分；總＜0)來計算累積得分。就氨基酸序列而言，將得分矩陣用于計算累積得分。當累積序列對比得分從其獲得的最大值下降到X量時停止在各方向上擴展命中詞，累積得分達到0或0以下，這是因為累積了一種或多種負得分的殘基序列對比或達到各序列的末端所導(dǎo)致的。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了序列對比的敏感性和速度。BLATN程序(就核苷酸序列而言)使用詞長度(W)為11、期望值(E)為10、截止值為100、M＝5、N＝4和兩鏈比較作為默認值。就氨基酸序列而言，BLASTP程序使用詞長度(W)為3、期望值(E)為10和BLOSUM62得分矩陣作為默認值(參見Henikoff& Henikoff《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)8910915(1989)。
除計算序列同一性百分比外，BLAST算法還進行了兩種序列之間相似性的統(tǒng)計分析(參見，例如Karlin & Altschul《美國國家科學(xué)院院報》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)905873-5787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一個測定值是最小的和數(shù)概率(P(N))，它產(chǎn)生了一個概率的示數(shù)，通過該示數(shù)也許會出現(xiàn)兩個核苷酸或氨基酸序列之間的配對。例如，如果在測試核酸序列與參比核酸序列進行比較過程中的最小和數(shù)概率約小于0.1、更優(yōu)選約小于0.01且最優(yōu)選約小于0.001，那么認為測試核酸序列與參比序列相似。
兩個核酸序列基本上相同的另一種表示方式是兩個分子在嚴格條件下彼此雜交。術(shù)語“特異性地與…雜交”指的是分子僅與特定的核苷酸序列在嚴格條件下的結(jié)合、雙重組合或雜交，此時所述的序列存在于復(fù)合的混合物(例如總細胞)DNA或RNA中?！盎旧辖Y(jié)合”指的是探針核酸與靶核酸之間的互補雜交且包括可以通過降低雜交培養(yǎng)基的嚴格性而容納的最小錯配以便實現(xiàn)對靶核酸序列進行所需檢測。
就諸如DNA雜交和Northern雜交這樣的核酸雜交實驗而言所用的“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”具有序列依賴性且在不同的環(huán)境參數(shù)下是不同的。較長的序列特別在較高的溫度下雜交。關(guān)于核酸雜交的廣泛指導(dǎo)原則可以在下列文獻中找到Tijssen(1993)《生化實驗室技術(shù)和分子生物學(xué)-使用核酸探針的雜交》(LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridizationwith Nucleic Acid Probes)第1部分第2章“雜交原理和核酸探針測定策略的綜述”(Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays)，Elsevier，New York。一般來說，就在規(guī)定的離子強度和pH下的特定序列而言，將高度嚴格雜交和洗滌條件選擇為低于熱熔點(Tm)約5℃。一般來說，在“嚴格條件”下探針與其靶亞序列雜交而不與其它序列雜交。
Tm是50％的靶序列與完好配對探針雜交的溫度(在指定的離子強度和pH下)。將非常嚴格的條件選擇為等于特定探針的Tm。用于在DNA或RNA印跡中的濾膜上雜交具有100個以上互補殘基的互補核酸的嚴格雜交條件的一個實例是在42℃下50％甲酰胺與1mg肝素雜交，其中將雜交過程進行過夜。高度嚴格的洗滌條件的一個實例是在72℃下用0.15M NaCl洗滌約15分鐘。一個洗滌條件的一個實例是在65℃下用0.2×SSC洗滌15分鐘(參見下文Sambrook對SSC緩沖液的描述)。通常在高度嚴格性洗滌前是低度嚴格性洗滌以便除去背景探針信號。就雙鏈體、例如100個以上核苷酸而言，中度嚴格性洗滌的一個實例是在45℃下用1×SSC洗滌15分鐘。就雙鏈體、例如100個以上核苷酸而言，低度嚴格性洗滌的一個實例是在40℃下用4-6×SSC洗滌15分鐘。就短探針(例如約10-50個核苷酸)而言，嚴格條件一般包括在pH 7.0-8.3下鹽濃度低于約1.0 M Na離子、一般約為0.01-1.0M Na離子濃度(或其它鹽)且溫度一般至少約為30℃。還可以通過添加諸如甲酰胺這樣的去穩(wěn)定劑來實現(xiàn)嚴格條件。一般來說，在特定雜交測定試驗中對不相關(guān)探針所觀察到的2倍(或2倍以上)的信噪比表明了檢測特異性雜交。如果核酸編碼的蛋白質(zhì)基本上相同，那么在嚴格條件下無法彼此雜交的核酸仍基本上相同。例如，這種情況在使用遺傳密碼所允許的最大密碼簡并產(chǎn)生核酸拷貝時發(fā)生。
下面是可以用于克隆基本上與本發(fā)明參比核苷酸序列相同的同源核苷酸序列的雜交/洗滌條件組的實例參比核苷酸序列與參比核苷酸序列優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mMEDTA中雜交、其中在50℃下用2×SSC洗滌；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用1×SSC、0.1％ SDS洗滌；更理想的是在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用0.5×SSC、0.1％ SDS洗滌；優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在50℃下用0.1×SSC、0.1％ SDS洗滌；更優(yōu)選在50℃下的7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaPO4、1mM EDTA中雜交、其中在65℃下用0.1×SSC、0.1％ SDS洗滌。
兩種核酸序列或蛋白質(zhì)基本上相同的進一步證明方式是由第一種核酸編碼的蛋白質(zhì)與由第二種核酸編碼的蛋白質(zhì)發(fā)生交叉免疫反應(yīng)或特異性地與之結(jié)合。因此，一種蛋白質(zhì)通常與第二種蛋白質(zhì)基本上相同，例如，其中兩種蛋白質(zhì)的區(qū)別僅在于保守取代。
術(shù)語“特異性地(或選擇性地)與抗體結(jié)合”或“特異性地(或選擇性地)與…發(fā)生免疫反應(yīng)”在涉及蛋白質(zhì)或肽時指的是結(jié)合反應(yīng)是在有蛋白質(zhì)和其它生物制品的異源群體存在的情況下蛋白質(zhì)存在的決定因素。因此，在指定的免疫測定條件下，特異性抗體結(jié)合特定的蛋白質(zhì)而不以顯著量結(jié)合存在于樣品中的其它蛋白質(zhì)。在這類條件下與抗體的特異性結(jié)合可能需要根據(jù)其對特定蛋白質(zhì)的特異性來選擇的抗體。例如，可以選擇針對具有由本發(fā)明任何核酸序列編碼的氨基酸序列的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的抗體以便獲得與該蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)而不與除多態(tài)變體外的其它蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的抗體?？梢詫⒍喾N免疫測定方式用于選擇與特定蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，通常將固相ELISA免疫測定法、蛋白質(zhì)印跡或免疫組織化學(xué)法用于選擇與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。參見Harlow和Lane((1988)《抗體-實驗室手冊》(Antibodies，A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Publications，New York“Harlow和Lane”)對可以用于測定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測定方式和條件的描述。一般來說，特異性或選擇性反應(yīng)將是背景信號或噪聲的至少2倍且更常見的是背景的10-100倍以上。
特定核酸序列的“保守修飾的變化形式”指的是編碼相同或基本上相同的氨基酸序列或其中核酸序列不編碼氨基酸序列的那些核酸序列。由于遺傳密碼的簡并性，所以大量功能相同的核酸編碼任何給定的多肽。例如，密碼子CGT、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG均編碼氨基酸精氨酸。因此，在用密碼子表示的精氨酸的每一位上，可以將密碼子改變成任何相應(yīng)的所述密碼子而不會改變所編碼的蛋白質(zhì)。這類核酸變化形式是“沉默變化形式”，它們是“保守修飾變化形式”的一個種類。除非另有說明，編碼蛋白質(zhì)的本文所述的每個核酸序列也描述了每一種可能的沉默變化形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員認為可以修飾核酸中的各密碼子(ATG除外，它通常僅是甲硫氨酸的密碼子)以便通過標準技術(shù)得到功能相同的分子。因此，編碼蛋白質(zhì)的核酸的各“沉默變化形式”在各所述序列中是隱含的。
此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到在所編碼的序列中改變、添加或缺失單個氨基酸或較小百分比的氨基酸(一般低于5％、更常見的是低于1％)的各個取代、缺失或添加是“保守修飾的變化形式”，其中這種改變導(dǎo)致氨基酸被化學(xué)上相似的氨基酸所取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表在本領(lǐng)域中是眾所周知的。下列5組中各包含屬于相互保守取代的氨基酸脂族甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)；芳香族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫的甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；堿性的精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸(H)；酸性的天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外參見Creighton(1984)《蛋白質(zhì)》(Proteins)，W.H.Freeman和Company。此外，在所編碼的序列中改變、添加或缺失單個氨基酸或較小百分比的氨基酸的各個取代、缺失或添加也是“保守修飾的變化形式”。
“亞序列”指的是分別包括核酸或氨基酸的較長序列(例如蛋白質(zhì))的一部分的核酸或氨基酸序列。
當將其它核苷酸(或其它類似分子)引入核酸時核酸是“延長的”。最常見的是使用聚合酶(例如DNA聚合酶)、例如在核酸3’末端添加序列的聚合酶進行該過程。
當將來自兩種核酸中每一種的序列在子代核酸中組合時兩種核酸被“重組”。當這兩種核酸是用于重組的底物時可“直接”重組兩條序列。當使用諸如交換寡核苷酸這樣的中間體重組所述序列時可“間接重組”兩條序列。就間接重組而言，僅僅一條序列是用于重組的真正底物且在某些情況下兩條序列都不是用于重組的底物。
例如配體和受體這樣的兩種分子之間的“特異性結(jié)合親和力”指的是在分子混合物中一種分子對另一種分子的優(yōu)先結(jié)合。如果結(jié)合親和力約為1×104M-1-約1×106M-1或1×106M-1以上，那么可以將該分子的結(jié)合看作是特異性的。
轉(zhuǎn)化一種用于將異源DNA引入宿主細胞或生物體的過程。
“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組的”指的是諸如細菌或植物這樣已經(jīng)引入了異源核酸分子的宿主生物體。核酸分子可以被穩(wěn)定地整合入宿主的基因組或也可以作為染色體外分子存在。這類染色體外分子可以是自體復(fù)制的。認為轉(zhuǎn)化的細胞、組織或植物不僅包括轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物而且包括其轉(zhuǎn)基因子代?！胺寝D(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的”宿主指的是例如細菌或植物這樣不含異源核酸分子的野生型生物體。
根據(jù)有關(guān)國際公認的用于專利程序目的的微生物保藏布達佩斯條約，已經(jīng)將下列材料保藏在Agricultural Research Service，PatentCulture Collection(NRRL)，1815 North University Street，Peoria，Illinois 61604，USA。對所保藏材料的可得到性的所有限制在專利授權(quán)后最終將被取消。
克隆保藏號保藏日pHW01NRRL B-301521999年7月1日本發(fā)明涉及單子葉NIM1同源物，諸如那些從小麥和稻中分離的。如下面實施例中更詳細的描述，本發(fā)明的單子葉NIM1同源物可從cDNA和/或基因組DNA文庫中分離，方法是利用WO 00/53762中所述的煙草NIM1cDNA片段探查，此處引入該文獻作為參考。
此外，可從單子葉植物cDNA和/或基因組DNA文庫中分離，方法是通過PCR擴增，利用基于擬南芥、煙草和蕃茄的NIM1以及來自擬南芥的NML序列構(gòu)建的引物(見，實施例5“簡并性引物的設(shè)計”，WO 00/53762)。
此外，本發(fā)明的單子葉NIM1同源物可通過PCR方法分離，其中利用基于所附序列表中的序列之小麥和稻序列構(gòu)建的PCR引物。例如，可以將具有SEQ ID NO19(例如SEQ ID NO10的核苷酸1-20和1649-1668)的大約前和最后20-25個連續(xù)核苷酸的用作構(gòu)建PCR引物的基礎(chǔ)，以便從來自植物來源(小麥)的cDNA文庫直接擴增cDNA序列(SEQ ID NO19)。同樣可以使用序列表中所示的DNA序列末端作為PCR引物基礎(chǔ)，通過PCR從單子葉植物的cDNA或基因組DNA文庫中擴增本發(fā)明的其它DNA序列。
據(jù)推定本文所述的NIM1基因同源物編碼對生物和化學(xué)誘導(dǎo)物敏感的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中所涉及的蛋白質(zhì)，所述的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)可在植物中產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。本發(fā)明還涉及單子葉植物中這類NIM1同源物的轉(zhuǎn)基因表達以便增加SAR基因表達并增強病害抗性。
據(jù)推定在植物中轉(zhuǎn)基因表達本發(fā)明的NIM1同源物可使一系列廣泛的植物病原體產(chǎn)生免疫性，所述的植物病原體包括但不限于病毒或類病毒，例如煙草或黃瓜花葉病毒、環(huán)斑病毒或壞死病毒、天竺葵葉卷曲病毒、紅色三葉草環(huán)斑病毒、番茄叢矮病毒等病毒；真菌，例如卵菌諸如寄生疫霉和煙草霜霉；細菌，例如丁香假單胞菌和煙草野火病假單胞菌(Psendomonas tabacina)；昆蟲、諸如蚜蟲，例如桃短尾蚜；和鱗翅目，例如Heliothus的種類；以及線蟲，例如南方根結(jié)線蟲。本發(fā)明的載體和方法對大量玉米病害生物體來說是有用的、包括但不限于霜霉諸如；大孢指疫霉、Sclerophthora rayissiae、禾生指梗霉、Pernosclerospora sorghi、Peronosclerospora philippinensis、Peronosclerospora sacchari和Peronosclerospora maydis；銹菌諸如高粱柄銹菌、多堆柄銹菌和Physopella zeae；其它真菌諸如Cercosporazeae-maydis、禾生刺盤孢、串珠鐮孢、玉蜀黍赤霉、Exerohilumturcicum、玉蜀黍球梗孢、禾白粉菌、殼針孢屬和Bipolaris maydis；和細菌諸如斯獲氏歐文氏桿菌。
本發(fā)明的方法可以用于將病害抗性賦予各種植物，包括裸子植物、單子葉植物和雙子葉植物。盡管可以使屬于這些寬類別的任何植物產(chǎn)生病害抗性，但是它特別適用于農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物植物，諸如水稻、小麥、大麥、黑麥、油菜、玉米、馬鈴薯、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、胡蘿卜、南瓜、南瓜、綠皮密生西葫蘆、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、芒果、李子、櫻桃、桃、蜜桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和甘蔗。
可以將本發(fā)明的單子葉NIM1同源物編碼序列插入為植物設(shè)計的表達盒以便使用標準遺傳工程技術(shù)構(gòu)建本發(fā)明的嵌合基因。對適合于實現(xiàn)所選植物宿主中所需模式和水平的表達的諸如啟動子、信號序列、5，和3’未翻譯序列和增強子這樣的特異性調(diào)節(jié)序列的選擇屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范圍內(nèi)?？梢詫⒑性诤线m讀框中連接的各個元件的所得分子插入能夠轉(zhuǎn)化至宿主植物細胞的載體中。
能夠在植物或植物細胞中起作用的啟動子的實例(即那些能夠啟動相關(guān)編碼序列表達的啟動子、諸如那些編碼植物細胞中NIM1同源物的啟動子)包括擬南芥屬和玉米遍在蛋白質(zhì)啟動子；花椰菜花葉病毒(CaMV)19S或35S啟動子和CaMV雙啟動子；水稻肌動蛋白啟動子；來自煙草、擬南芥屬或玉米的PR-1啟動子；胭脂氨酸合酶啟動子；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞單位(ssuRUBISCO)啟動子等。特別優(yōu)選的是擬南芥屬遍在蛋白質(zhì)啟動子?？梢孕揎梿幼幼陨硪员憧刂茊幼訌姸?，從而按照本領(lǐng)域已知的方法提高相關(guān)編碼序列的表達。優(yōu)選用于本發(fā)明的啟動子是那些產(chǎn)生高水平組成型表達的啟動子。
可以使信號或轉(zhuǎn)運肽類與本發(fā)明的嵌合DNA構(gòu)建體中的單子葉NIM1同源物編碼序列融合以便使所表達的蛋白質(zhì)定向轉(zhuǎn)運至所需的作用部位。信號肽類的實例包括那些與植物發(fā)病機理相關(guān)蛋白質(zhì)天然連接的信號肽，例如PR-1、PR-2等。參見，例如Payne等，1988。轉(zhuǎn)運肽類的實例包括諸如那些在Von Heijne等(1991)、Mazur等(1987)和Vorst等(1988)中所述的葉綠體轉(zhuǎn)運肽類；以及諸如那些在Boutry等(1987)中所述的線粒體轉(zhuǎn)運肽類。另外還包括使所編碼的蛋白質(zhì)集中于諸如液泡這樣的各種細胞區(qū)室中的序列。例如，參見NeuhauS等(1991)和Chrispeels(1991)。
本發(fā)明的嵌合DNA構(gòu)建體可以含有本發(fā)明的多拷貝的啟動子或多拷貝的NIM1同源物編碼序列。此外，該構(gòu)建體可以包括標記物的編碼序列和諸如信號或轉(zhuǎn)運肽類這樣的其它肽類的編碼序列，它們各自在帶有DNA分子中的其它功能元件的合適的讀框中。這類構(gòu)建體的制備方法屬于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平范圍內(nèi)。
有用的標記物包括提供除草劑、抗生素或藥物抗性的肽類，諸如例如耐原卟啉原氧化酶抑制劑、潮霉素、卡那霉素、G418、慶大霉素、潔霉素、氨甲蝶呤、草甘膦、膦絲菌素等?？梢詫⑦@些標記物用于從未轉(zhuǎn)化的細胞中篩選用本發(fā)明嵌合DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細胞。其它有用的標記物是可以通過例如顏色反應(yīng)這樣的可肉眼觀察的反應(yīng)方便檢測的肽酶，例如熒光素酶、β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。
可以用多種已知方法將諸如本文所述的那些用于植物表達的嵌合基因引入植物細胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解對方法的選擇可能取決于為轉(zhuǎn)化而靶向的植物(即單子葉植物或雙子葉植物)和/或細胞器(即細胞核、葉綠體、線粒體)的類型。轉(zhuǎn)化植物細胞的適宜方法包括微量注射(Crossway等，1986)、電穿孔(Riggs等，1986)、農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等，1988；Ishida，1996)、定向基因轉(zhuǎn)移(Paszkowski等，1984；Hayashimoto等，1990)和使用獲自Agracetus，Inc.，Madison，Wisconsin and Dupont，Inc.，Wilmington，Delaware的裝置進行的沖擊粒子加速(參見，例如美國專利4,945,050和McCabe等，1988)。另外參見Weissinger等(1988)；Sanford等(1987)(洋蔥)；Christou等(1988)(大豆)；McCabe等(1988)(大豆)；Datta等(1990)(水稻)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Klein等(1988)(玉米)；Fromm等(1990)；和Gordon-Kamm等(1990)(玉米)；Svab等(1990)(煙草葉綠體)；Gordon-Kamm等(1993)(玉米)；Shimamoto等(1989)(水稻)；Christou等(1991)(水稻)；Datta等(1990)(水稻)；歐洲專利申請EP 0 332 581(鴨茅屬和其它Pooideae)；Vasil(1993)(小麥)；Weeks等(1993)(小麥)；Wan等(1994)(大麥)；Jahne等(1994)(大麥)；Umbeck等(1987)(棉花)；Casas等(1993)(高粱)；Somers等(1992)(燕麥)；Torbert等(1995)(燕麥)；Weeks等(1993)(小麥)；WO 94/13822(小麥)；和Nehra等(1994)(小麥)。在Koziel等(1993)、Hill等(1995)和Koziel等(1996)中可以找到通過微粒轟擊將重組DNA分子引入玉米的一組特別優(yōu)選的實施方案。另一個優(yōu)選的實施方案是公開在EP0 292 435中的玉米的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法。
一旦將包括單子葉NIM1同源物編碼序列的嵌合基因轉(zhuǎn)化入特定的植物物種，則可以使用傳統(tǒng)的育種技術(shù)使之在該物種中繁殖或?qū)⑵湟迫胂嗤锓N的其它的變種、特別包括商品變種中。本發(fā)明特別優(yōu)選的植物包括上面所列的農(nóng)學(xué)上重要的農(nóng)作物。通過有性繁殖來傳遞上述基因工程的轉(zhuǎn)基因種子和植物的遺傳特性且這些特性由此可以在子代植物中得到維持和傳播。
根據(jù)Zabarovsky和Turina，1988從K802裂解物中分離λ噬菌體DNA。9個陽性候選物中，6個與3’NIM1和5’NIM1探針均雜交，方法是限制性消化的λDNA Southern印跡。然后將雜交DNA片段克隆入pUC19載體(NEB)。
通過引物步行(primer walking)利用在ABI 3948 DNA合成儀上設(shè)計的18mer確定克隆HW01的DNA序列。用Big Dye Terminator序列測定反應(yīng)測定HW01模板的序列，每次反應(yīng)采用400ng模板。根據(jù)DT50-30程序確定循環(huán)條件95℃-10秒，50℃-5秒，60℃4分鐘，共29個循環(huán)。熱循環(huán)條件程序后，用異丙醇沉淀反應(yīng)。將樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠并在ABI377自動序列測定儀上分析。
也將模板HW01經(jīng)歷Primer Island程序，籍此將模板在Qiagen機器人(Robot)中制備，并在96孔Marsh孔板塊形式(Marsh plateblock format)中測序。用于孔板測序的引物為來自Primer Island試劑盒的正向和反向引物。分析測序數(shù)據(jù)，并利用Phred/Phrap和Consed程序裝配。
來自部分λ克隆#8的亞克隆DNA序列之一稱為pHW01，其帶有4270bp SacI插入片段，并鑒定為擬南芥NIM1基因的小麥同源物(Ryals等，1997)。小麥NIM1同源物的翻譯氨基酸序列是基于HW01的反向序列(i-HW01)，其中NIM1同源物的方向與擬南芥NIM1序列相同。小麥NIM1氨基酸序列與WO 00/53762的SEQ ID NO1煙草NIM1同源物有77/68％氨基酸相似性/相同性，與WO 00/53762的SEQ ID NO3番茄NIM1同源物有78/68％氨基酸相似性/相同性，與擬南芥NIM1同源物有65/61％氨基酸相似性/相同性(Ryals等，1997)，且分別與煙草、番茄和擬南芥NIM1基因有69％、69％和59％的核苷酸相似性(參見下面的表1和表2)。
表1 NIM1同源物的氨基酸比較(相似性/同一性)
表2 NIMI同源物的核苷酸比較
小麥NIM1同源物的基因組序列示于SEQ ID NO1，且其編碼的蛋白質(zhì)示于SEQ ID NO2。含有SEQ ID NO1的小麥NIM1同源物作為pHW01于1999年7月1日保藏NRRL(1815 North UniversityStreet，Peoria，Illinois 61604，美國)的大腸桿菌DH5α中，保藏號NRRLB-30152。實施例2小麥NIM1同源物的PCR擴增使用PCR證實小麥NIM1同源物來自小麥基因組。分別相應(yīng)于來自pHW01亞克隆序列的核苷酸1871-1890和核苷酸2360-2340的引物KL1(19nt5’-CCATTGCTACTCTTGCCTC-3’)(SEQ ID NO3)和KL2(21nt，5’-ATCGTTGTCTCCCTTTTAACC-3’)(SEQ ID NO4)用于引發(fā)PCR反應(yīng)，利用小麥UC703基因組DNA作為模板。循環(huán)條件為94℃30秒，50℃30秒，72℃30秒，總共35個循環(huán)。得到約500bp條帶并克隆。具有正確插入片段大小的克隆經(jīng)測序顯示從小麥基因組中擴增了3種不同的序列。所有三種不同的序列彼此高度相似，且其中一個序列與相應(yīng)的HW01區(qū)域之排比非常相似，顯示HW01事實上來自小麥基因組。本發(fā)明的小麥NIM1同源物因此可通過PCR從小麥基因組文庫中利用上述PCR引物KL1和KL2通過PCR分離。實施例3通過Southern印跡分離單子葉NIM1同源物利用Dellaporta等(1983)的微型制備方法從單子葉植物中分離DNA。根據(jù)標準方法(Amersharm)進行Southern印跡。相應(yīng)于NIM1特異性的“NIM環(huán)”之小麥NIM1同源物的DNA序列(I-HW01的核苷酸2180-3251，從pHW01分離的1.1kb NdeI/BglII片段)與小麥(c.v.UC703)基因組DNA和其他單子葉作物(如稻、大麥和玉米)雜交。優(yōu)選的雜交在65℃于雜交緩沖液中(5X SSPE，5XDenhards，0.5％SDS，100μg stDNA/ml)進行，洗滌優(yōu)選在如下條件進行(i)2X SSPE，0.1％SDS，室溫下10分鐘；(ii)0.2X SSPE，0.1％SDS，65℃15分鐘；和(iii)0.1X SSPE，0.1％SDS，65℃15分鐘，每次洗滌進行兩次。測試的單子葉作物顯示與小麥NIM1序列的強雜交信號，表明這些作物中存在NIM1同源物。在小麥基因組DNA中的雜交信號表明至少在小麥基因組中存在4中NIM1同源物。
用PCR引物KL1和KL2(分別為SEQ ID NO3和4)獲得的來自小麥基因組DNA的PCR產(chǎn)物用于探查小麥RNA的凝膠印跡。與總RNA雜交顯示一種弱轉(zhuǎn)錄。但是，與polyA+RNA雜交顯示存在兩種轉(zhuǎn)錄物一種較小，更為豐富的mRNA轉(zhuǎn)錄物，和一種較大，不甚豐富的mRNA。較小的轉(zhuǎn)錄物相應(yīng)于總RNA中檢測到的大小。兩種轉(zhuǎn)錄物顯示以相同的豐度存在與從葉片組織中分離的RNA中，所述葉片未用BTH處理或用BTH處理了24小時。上述小麥“NIM環(huán)”也用作探針。實施例4利用PCR從單子葉作物基因組DNA文庫中分離NIM1同源物引物KL1和KL2(分別為SEQ ID NO3和4)用于克隆來自其他單子葉作物的NIM1同源物。利用小麥基因組DNA擴增(實施例2)的相同循環(huán)條件，從稻、玉米和大麥基因組DNA中分別擴增了大小約為500bp的條帶?？寺〔y序了來自稻DNA的PCR產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)所以測序的克隆含有相同的插入片段，且插入片段序列顯示與擬南芥NIM1和其作物同源物具有強相似性，表明克隆了稻NIM1同源物。實施例5從單子葉作物之cDNA文庫中通過PCR分離NIM1同源物基于利用GCG seqweb多重序列排比程序(Pretty，WisconsinGenetics Computer Group)發(fā)現(xiàn)的保守性區(qū)域設(shè)計簡并性PCR引物，用于和如下序列比對擬南芥NIM1基因(Ryals等，1997)；擬南芥NIM樣(NML)基因組序列AtNMLc5，AtNMLc2，AtNMLc4-1，和AtNMLc4-2；來自煙草(Nicotiana tabacum)和蕃茄(Lycopersiconesculentum)的NIM1序列(見WO 0053762)。基于上述排比，設(shè)計簡并性PCR引物，用于從包括小麥和稻的其他作物種類中擴增NIM1同源物。由這些保守性區(qū)域設(shè)計的引物中的兩種列在如下表3。引物優(yōu)選用Genosys Biotechnologies，Inc.(The woodlands，Texas)合成。簡并性位置示于表3中，方法是在寡核苷酸的一個位點上注明多于一個的堿基?！叭∠颉北硎疽锸浅騝DNA的3’端(下游)或是5’端(上游。
表3簡并性引物
從小麥和稻中利用cDNA作為模板擴增NIM1同源物DNA片段。簡并性引物PCR優(yōu)選用Ready-To-G0 PCR珠(Amersham，Piscataway，NJ)在GeneAmp PCR系統(tǒng)9700(PE AppliedBiosystems，F(xiàn)oster City，CA)中進行。每次反應(yīng)中使用5-10ngcDNA，每一引物的終濃度為0.8μM。優(yōu)選的循環(huán)參數(shù)如下94℃1分鐘；3個循環(huán)[94℃30秒；37℃30秒；72℃2分鐘]；35個循環(huán)[94℃30秒，60℃30秒；72℃2分鐘]；72℃7分鐘；保持在4℃。反應(yīng)產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上分析，切割具有適當大小的DNA片段。從瓊脂糖條帶利用例如Geneclean III試劑盒(Bio101，Inc.，Carsbad，CA)將DNA片段分離，并利用例如TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)克隆。利用例如CONCERT Rapid Plasmid MiniPrepSystem(Life technologies，Inc.，Rockville，MD)分離質(zhì)粒，用標準方法測定序列。
利用引物2B和2D，將兩個特有的NIM1同源物DNA片段從稻cDNA文庫中擴增(SEQ ID NO7和9)，一個特有的NIM 1同源物DNA片段從小麥cDNA文庫中擴增(SEQ ID NO11)實施例6全長單子葉NIM1同源物cDNA優(yōu)選通過使用SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech，PaloAlto，CA)的RACE PCR從NIM1同源物PCR片段中獲得相應(yīng)的cDNA序列上游和下游。優(yōu)選對至少三種獨立的RACE產(chǎn)物的每個5，-或3’-末端測序，以便消除PCR誤差。分別將相應(yīng)于SEQ ID NO7的PCR片段之全長稻NIM 1同源物cDNA序列表示為SEQ ID NO13；將相應(yīng)于SEQ ID NO9的PCR片段之NIM 1同源物稻cDNA序列表示為SEQ ID NO15；將相應(yīng)于SEQ ID NO11的PCR片段之全長小麥NIM 1同源物cDNA序列表示為SEQ ID NO17；。
優(yōu)選通過RACE PCR獲得全長小麥NIM1同源物cDNA序列(SEQ ID NO1)，且如SEQ ID NO19所示(SEQ ID NO19的3’端來自cDNA預(yù)測程序)II.植物中本發(fā)明基因序列的表達可以使用常規(guī)的重組DNA技術(shù)將本發(fā)明的NIM1同源物引入植物細胞。一般來說，這一過程包括使用本領(lǐng)域中公知的標準克隆步驟將本發(fā)明的編碼序列插入與該編碼序列是異源的(即正常情況下不存在的)表達系統(tǒng)。所述載體含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所插入編碼蛋白質(zhì)的序列所必不可少的元件?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中公知的大量載體系統(tǒng)，諸如質(zhì)粒、噬菌體病毒和其它修飾的病毒。合適的載體包括但不限于病毒載體，諸如λ載體系統(tǒng)λgtl1、λgtl0和卡隆4；質(zhì)粒載體，諸如pBI121、pBR322、pACYC177、pACYC184、pAR系列、pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、pCDNAII和其它相似系統(tǒng)。還可以修飾所述表達系統(tǒng)的成分以便增加表達。例如，可以使用截短的序列、核苷酸取代或其它修飾方法。在合適的條件下可以采用本文所述的表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)化實際上任何的農(nóng)作物植物細胞?？梢允罐D(zhuǎn)化的細胞再生成完整植物，使得單子葉NIM1同源物增加SAR基因表達并提高轉(zhuǎn)基因植物中的病害抗性。實施例7植物表達盒的構(gòu)建首先在表達盒中將用于轉(zhuǎn)基因植物中表達的編碼序列裝配在植物中可表達的合適啟動子之后。該表達盒還可以包括表達轉(zhuǎn)基因所需或篩選的任何其它序列。這類序列包括但不限于轉(zhuǎn)錄終止子；諸如內(nèi)含子這樣促進表達的外部序列；活性序列和用于將基因產(chǎn)物靶向至特定細胞器和細胞區(qū)室的序列。然后便利地將這些表達盒轉(zhuǎn)入下述植物轉(zhuǎn)化載體。下面是典型表達盒中各種成分的描述。
1.啟動子對表達盒中所用啟動子的選擇決定轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因的空間和時間分布型。所選擇的啟動子表達特殊細胞類型(諸如葉表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞)或特殊組織或器官(例如，根、葉或花)中的轉(zhuǎn)基因，并且這種選擇反映出累積基因產(chǎn)物所需的位置。另一方面，所選擇的啟動子可以在不同誘導(dǎo)條件下啟動基因的表達。啟動子在其強度即促進轉(zhuǎn)錄的能力上是可變的。根據(jù)所用宿主細胞系統(tǒng)的不同，可以使用包括基因的天然啟動子在內(nèi)的許多合適啟動子中的任何一種。下面是可以用于表達盒中的啟動子的非限制性實例。
a.組成型表達、遍在蛋白質(zhì)啟動子遍在蛋白質(zhì)是一種已知累積在許多細胞類型中的基因產(chǎn)物且已經(jīng)從用于轉(zhuǎn)基因植物的幾個物種中克隆了其啟動子(例如向日葵-Binet等人，1991；玉米-Christensen等人，1989；和擬南芥屬-Norris等人，1993)。已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因單子葉植物系統(tǒng)中研發(fā)了玉米遍在蛋白質(zhì)啟動子且為單子葉植物轉(zhuǎn)化而構(gòu)建的其序列和載體公開在專利申請EP 0342 926(Lubrizol)中。Taylor等人(1993)描述了包括玉米遍在蛋白質(zhì)啟動子和第一種內(nèi)含子的載體(pAHC25)及其在通過微射轟擊引入時大量單子葉植物的細胞混懸液中的高活性。特別優(yōu)選將擬南芥屬遍在蛋白質(zhì)啟動子用于本發(fā)明的NIM1同源物中。這種遍在蛋白質(zhì)啟動子適合于包括單子葉植物和雙子葉植物在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因植物中的基因表達。合適的載體是pAHC25的衍生物或在該申請中記載的通過引入合適的遍在蛋白質(zhì)啟動子和/或內(nèi)含子序列而修飾的任何轉(zhuǎn)化載體。
b.組成型表達，CaMV35S啟動子質(zhì)粒pCGN1761的構(gòu)建記載在公開的專利申請EP 0392 225(實施例23)中。pCGN1761含有“雙”CaMV35S啟動子和tml轉(zhuǎn)錄終止子(在該啟動子和該終止子之間具有單一EcoRI位點)并帶有pUC-型主鏈。構(gòu)建帶有修飾的多接頭的pCGN1761衍生物，所述的多接頭除包括存在的EcoRI位點外還包括Notl和Xhol位點。將這種衍生物命名為pCGN1761ENX。pCGN1761ENX用于克隆其多接頭內(nèi)的cDNA序列或編碼序列(包括微生物ORF序列)以便在轉(zhuǎn)基因植物中在35S啟動子控制下表達所述的序列?？梢杂门c啟動子5’連接的Hindlll、Sphl、Sall和Xbal位點和與終止子3’連接的Xbal、BamHl和Bgll位點切割如此構(gòu)建的完整35S啟動子-編碼序列-tml終止盒以便轉(zhuǎn)入諸如下述的轉(zhuǎn)化載體。此外，可以通過用Hindlll、Sphl、Sall、Xbal或Pstl進行5’切割并用任何的多接頭限制位點(EcoRI、Notl或Xhol)進行3’切割來除去雙35S啟動子片段，以便用另一啟動子進行取代。如果需要，通過引入可以促進翻譯的序列來進行克隆位點周圍的修飾。這在需要超表達時特別有用。例如，可以如美國專利號5,639,949的實施例37中所述通過使翻譯起始位點最佳化來修飾pCGN1761ENX。
c.組成型表達，肌動蛋白啟動子已知在大多數(shù)細胞類型中表達了幾種肌動蛋白的同種型且由此肌動蛋白啟動子對組成型啟動子來說是一種良好的選擇。特別地，已經(jīng)克隆和表征了來自稻Actl基因的啟動子(McElroy等人，1990)。發(fā)現(xiàn)1.3kb的該啟動子片段含有水稻原生質(zhì)體中表達所需的全部調(diào)節(jié)元件。此外，已經(jīng)特異性構(gòu)建了用于單子葉植物的基于Actl啟動子的大量表達載體(McElroy等人，1991)。它們結(jié)合了Actl-內(nèi)含子1、Adhl5’側(cè)翼序列和Adhl-內(nèi)含子1(來自玉米醇脫氫酶基因)和來自CaMV35S啟動子的序列。顯示出最高程度表達的載體是35S和Actl內(nèi)含子或Actl5’側(cè)翼序列和Actl內(nèi)含子的融合體。使起始ATG(GUS報道基因的)周圍的序列最佳化也會促進表達?？梢苑奖愕匦揎椨蒑cElroy等人(1991)所述的啟動子表達盒以用于基因表達，并且這些啟動子表達盒特別適用于單子葉植物宿主。例如，可以從McElroy構(gòu)建體中除去含啟動子的片段并將其用于取代pCGN1761ENX中的雙35S啟動子，然后將它用于插入特異性基因序列。接著可以將由此構(gòu)建的融合基因轉(zhuǎn)入合適的轉(zhuǎn)化載體。在一個獨立的報導(dǎo)中，還發(fā)現(xiàn)帶有第一種內(nèi)含子的稻Actl啟動子指導(dǎo)經(jīng)培養(yǎng)的大麥細胞中的高度表達(Chibbar等人，1993)。
d.誘導(dǎo)型表達，PR-1啟動子可以用產(chǎn)生適宜的高度表達水平的所選擇的任何其它啟動子來取代pCGN1761ENX中的雙35S啟動子。根據(jù)實例，美國專利號5,614,395中所述的化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子之一可以取代雙35S啟動子。優(yōu)選用限制酶從所選擇的啟動子來源中切割選擇的啟動子，不過，可以另外選擇使用攜帶合適終止限制位點的引物來對所選擇的啟動子進行PCR擴增。應(yīng)進行PCR擴增，然后應(yīng)對所述啟動子重新進行測序以便檢查在靶載體中克隆擴增的啟動子后的擴增誤差。從質(zhì)粒pCIB1004中切割化學(xué)/病原體調(diào)節(jié)煙草PR-1a啟動子(用于構(gòu)建，參見例如EP 0332 104中的實施例21)并將其轉(zhuǎn)入質(zhì)粒pCGN1761ENX(Uknes等人，1992)。用Ncol切割pCIB1004并通過用T4 DNA聚合酶處理使所得線性化片段的3’突出端鈍端化。然后用Hindlll切割該片段并將所得的含PR-1a的啟動子片段進行凝膠純化，并克隆入已經(jīng)除去了雙35S啟動子的pCGN1761ENX中。該過程通過下列步驟來進行用Xhol切割和用T4聚合酶鈍端化處理；隨后用Hindlll切割并分離含有pCIB1004啟動子片段被克隆入的片段的較大載體-終止子。這一過程產(chǎn)生一種pCGN1761ENX衍生物，它帶有PR-1a啟動子和tml終止子以及帶有單一EcoRI和Notl位點的間插多接頭?？梢詫⑺x擇的編碼序列插入該載體，隨后可以將融合產(chǎn)物(即啟動子-基因-終止子)轉(zhuǎn)入包括下文所述的那些載體在內(nèi)的任何選擇的轉(zhuǎn)化載體?？梢圆捎酶鞣N化學(xué)調(diào)節(jié)物來誘導(dǎo)所選擇的編碼序列在按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物中的表達，這些化學(xué)調(diào)節(jié)物包括美國專利號5,523,311和5,614,395中公開的苯并噻二唑、異煙酸和水楊酸化合物。
e.誘導(dǎo)型表達，一種乙醇-誘導(dǎo)型啟動子還可以將諸如乙醇這樣的某些醇類或酮類誘導(dǎo)的啟動子用于使本發(fā)明的編碼序列產(chǎn)生誘導(dǎo)型表達。這類啟動子例如是來自構(gòu)巢曲霉的alcA基因啟動子(Caddick等人，1998)。在構(gòu)巢曲霉中，alcA基因編碼醇脫氫酶I，其表達在有化學(xué)誘導(dǎo)物存在的情況下由AlcR轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)。為了本發(fā)明的目的，用本發(fā)明的編碼序列來取代包括與最小35S啟動子(Caddick等人，1998)融合的alcA基因啟動子序列的質(zhì)粒palcACAT中的CAT編碼序列以便形成帶有在alcA基因啟動子控制下的編碼序列的表達盒?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中眾所周知的方法來進行該過程。
f.誘導(dǎo)型表達、一種糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子使用基于類固醇激素的系統(tǒng)誘導(dǎo)本發(fā)明NIM1同源物的表達也是所關(guān)注的。例如，可以使用糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的誘導(dǎo)系統(tǒng)(Aoyama和Chua，1997)并且通過應(yīng)用糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)基因表達，例如一種合成的糖皮質(zhì)激素，優(yōu)選地塞米松，優(yōu)選的濃度范圍在0.1mM-1mM、更優(yōu)選10mM-100mM。為了本發(fā)明的目的，用編碼NIM1同源物的基因序列取代熒光素酶基因序列以便在與35S最小啟動子融合的GAL4上游活化序列6個拷貝的控制下形成帶有編碼NIM1同源物的基因序列的表達盒。使用本領(lǐng)域中眾所周知的方法來進行該過程。反式作用因子包括GAL4 DNA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Keegan等人，1986)，該結(jié)構(gòu)域與皰疹病毒蛋白VP16(Triezenberg等人，1988)的反式激活域融合，這種反式激活域與大鼠糖皮質(zhì)激素受體(Picard等人，1988)的激素結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合。融合蛋白的表達由適合于本領(lǐng)域中公知或本文所述植物中的表達的任何啟動子來控制。這種表達盒還包括在含有編碼與6xGAL4/最小啟動子融合的NIM1同源物的基因序列的植物中。因此，獲得融合蛋白的組織或器官特異性可導(dǎo)致NIM1同源物的誘導(dǎo)型組織或器官特異性。
g.根特異性表達基因表達的另一種模式是根表達。合適的根啟動子由de Framond(1991)描述并且也記載于公開的專利申請EP 0452 269中。將這種啟動子轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761ENX這樣合適的載體以便插入所選擇的基因，隨后將完整的啟動子-基因-終止盒轉(zhuǎn)入目的轉(zhuǎn)化載體中。
h.創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子也適合于基因表達。已經(jīng)描述了大量這類啟動子(例如Xu等人，1993)；Logemann等人，1989；Rohrmeier & Lehle，1993；Firek等人，1993；Warner等人，1993)，它們均適用于本發(fā)明。Logemann等人描述了雙子葉植物馬鈴薯wunl基因的5’上游序列。Xu等人證實來自雙子葉植物馬鈴薯的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子(pin2)在單子葉植物水稻中具有活性。此外，Rohrmeier & Lehle描述了玉米WiplcDNA的克隆，它是創(chuàng)傷誘導(dǎo)型的且可以將其用于使用標準技術(shù)分離關(guān)連啟動子。類似地，F(xiàn)irek等人和Warner等人已經(jīng)描述了來自單子葉植物石刁柏的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型基因，將它在局部創(chuàng)傷和病原體侵害部位表達。使用本領(lǐng)域中眾所周知的克隆技術(shù)可以將這些啟動子轉(zhuǎn)入與涉及本發(fā)明基因融合的合適載體，并用于在植物創(chuàng)傷部位上表達這些基因。
i.髓優(yōu)選的表達專利申請WO 93/07278中描述了優(yōu)選在髓細胞中表達的玉米trpA基因的分離。列出了從轉(zhuǎn)錄起點擴展至-1726bp的基因序列和啟動子。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)可以將這種啟動子或其部分轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761這樣的載體，其中它可以取代35S啟動子，并可用于以髓優(yōu)選方式啟動外源基因的表達。實際上，可以將含有髓優(yōu)選的啟動子或其部分的片段轉(zhuǎn)入任何載體并修飾以便在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
j.葉特異性表達Hudspeth & Grula(1989)已經(jīng)描述了編碼磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)可以將用于該基因的啟動子用于以葉特異性方式啟動轉(zhuǎn)基因植物中任何基因的表達。
k.花粉特異性表達WO 93/07278中描述了在花粉細胞中表達的玉米鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)的分離。基因序列和啟動子從轉(zhuǎn)錄起點擴展至1400bp。使用標準分子生物學(xué)技術(shù)可以將這種啟動子或其部分轉(zhuǎn)入諸如pCGN1761這樣的載體，其中它可以取代35S啟動子，并可用于以花粉特異性方式啟動本發(fā)明NIM1同源物的表達。
2.轉(zhuǎn)錄終止子各種轉(zhuǎn)錄終止子可以應(yīng)用于表達盒。它們負責(zé)轉(zhuǎn)基因及其正確聚腺苷酸化后的轉(zhuǎn)錄終止。合適的轉(zhuǎn)錄終止子是那些已知在植物中起作用的終止子且包括CaMV 35S終止子、tml終止子、胭脂氨酸合酶終止子和豌豆rbcS E9終止子。它們可用于單子葉植物和雙子葉植物。此外，可以使用一種基因的天然轉(zhuǎn)錄終止子。
3.用于表達的增強或調(diào)節(jié)的序列已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量來自轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的可促進基因表達的序列，并且可以將這些序列與本發(fā)明的基因聯(lián)合使用以便增加其在轉(zhuǎn)基因植物中的表達。
已經(jīng)證實不同的內(nèi)含子序列可促進表達、特別是在單子葉植物細胞中。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)玉米Adhl基因的內(nèi)含子可顯著促進野生型基因在引入玉米細胞時在其關(guān)連啟動子控制下的表達。發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子1特別有效且在與氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶基因的融合構(gòu)建體中的表達得到提高(Callis等，1987)。在相同的實驗系統(tǒng)中，來自玉米bronze1基因的內(nèi)含子在促進表達方面具有相似的作用。通常將內(nèi)含子序列引入植物轉(zhuǎn)化載體、一般是未翻譯的前導(dǎo)區(qū)內(nèi)。
已知許多來源于病毒的未翻譯前導(dǎo)序列也可促進表達，并且它們在雙子葉植物細胞中特別有效。特別地，已經(jīng)證實來自煙草花葉病毒(TMV，“W-序列”)、玉米褪綠斑駁病(MCMV)和苜?；ㄈ~病毒(AMV)的前導(dǎo)序列可有效促進表達(例如Gallie等人，1987；Skuzeski等人，1990)。
4.細胞內(nèi)基因產(chǎn)物的靶向已知在植物中存在靶向基因產(chǎn)物的不同機理，并且已經(jīng)以一定的具體方式表征了控制這些機理起作用的序列。例如，由在進入葉綠體以產(chǎn)生成熟蛋白質(zhì)的過程中被切割的不同蛋白質(zhì)氨基酸末端發(fā)現(xiàn)的信號序列控制將基因產(chǎn)物靶向至葉綠體(例如Comao等人，1988)。這些信號序列可以與異源基因產(chǎn)物融合以便影響異源產(chǎn)物引入葉綠體(van den Broeck等人，1985)。編碼合適的信號序列的DNA可以分離自編碼RUBISCO蛋白質(zhì)、CAB蛋白質(zhì)、EPSP合酶、GS2蛋白質(zhì)和已知是葉綠體定位的許多其它蛋白質(zhì)的5’末端。另外參見美國專利號5,639,949的實施例37中的小標題“使用葉綠體靶向的表達”。
其它基因產(chǎn)物定位于其它諸如線粒體和過氧化物酶體這樣的細胞器(例如Unger等人，1989)。還可以操縱編碼這些產(chǎn)物的cDNAs以便使異源基因產(chǎn)物靶向至這些細胞器。這類序列的實例是核編碼的腺苷三磷酸酶和特異性線粒體用的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶同種型。Rogers等人(1985)已經(jīng)描述了靶向細胞蛋白質(zhì)體。
此外，已經(jīng)表征了可使基因產(chǎn)物靶向至其它細胞區(qū)室的序列。氨基末端序列負責(zé)靶向至ER、質(zhì)外體和從糊粉細胞進行胞外分泌(Koehler & Ho，1990)。另外，氨基末端序列與羧基末端序列負責(zé)基因產(chǎn)物的液泡靶向(Shinshi等人，1990)。
通過將上述合適的靶向序列與目的轉(zhuǎn)基因序列融合，有可能使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物定向于任何細胞器或細胞區(qū)室。例如，為了進行葉綠體靶向，使來自RUBISCO基因、CAB基因、EPSP合酶基因或GS2基因的葉綠體信號序列與轉(zhuǎn)基因的氨基末端ATG進行框內(nèi)融合。所選擇的信號序列應(yīng)包括已知的切割位點，并且所構(gòu)建的融合體應(yīng)考慮到切割所需的切割位點后的任何氨基酸。在某些情況中，通過在切割位點與轉(zhuǎn)基因ATG之間添加少量氨基酸或在轉(zhuǎn)基因序列中取代某些氨基酸可以滿足這種要求。通過體外翻譯體外轉(zhuǎn)錄的構(gòu)建體、隨后使用由Bartlett等人(1982)和Wasmann等人(1986)所述的技術(shù)，通過葉綠體體外攝取來測試為引入葉綠體所構(gòu)建的融合體的葉綠體攝入功效。這些構(gòu)建技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且同樣可用于線粒體和過氧化物酶體。
上述細胞靶向機理不僅可以與其關(guān)連啟動子共同使用，而且可以與異源啟動子一起使用，從而在與靶向信號來源的啟動子不同的表達模式的啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)下實現(xiàn)特異性靶向細胞的目的。實施例8植物轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建大量可以應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化載體對于植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是公知的，并且可以將涉及本發(fā)明的基因與任何這類載體一起使用。對載體的選擇將取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的靶物種。就某些靶物種而言，可以優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標記。在轉(zhuǎn)化中通常使用的選擇標記包括產(chǎn)生卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptll基因(Messing & Vierra，1982；Bevan等人，1983)、產(chǎn)生除草劑膦絲菌素抗性的bar基因(White等人，1990；Spencer等人，1990)、產(chǎn)生抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger & Diggelmann)和產(chǎn)生氨甲蝶呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，1983)以及產(chǎn)生草甘膦抗性的EPSPS基因(美國專利號4,940,935和5,188,642)。
1.適合于農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的載體許多載體可以應(yīng)用于使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。它們一般攜帶至少一種T-DNA邊緣序列且包括諸如pBIN19(Bevan，《核酸研究》(Nucl.Acids Res.)(1984))和pXYZ這樣的載體。下面描述了適合于農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的兩種典型載體的構(gòu)建。
a.pCIB200和pCIB2001二元載體pCIB200和pCIB2001用于構(gòu)建適用于農(nóng)桿菌屬的重組載體，且以下列方式構(gòu)建它們。通過Narl消化pTJS75而生成pTJS75kan(Schmidhauser & Helinski，1985)，從而切下四環(huán)素抗性基因，隨后插入來自攜帶NPTII的pUC4K的Accl片段(Messing &Vierra，1982；Bevan等人，1983；McBride等人，1990)。將Xhol接頭與含有左和右T-DNA邊緣、植物選擇性nos/nptll嵌合基因和pUC多接頭的PCIB7的EcoRV片段連接(Rothstein等人，1987)，并將Xhol-消化的片段克隆入Sall-消化的pTJS75kan中，以便生成pCIB200(還可參見EP 0 332 104，實施例19)。pCIB200含有下列單一多接頭限制位點EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal和Sall。pCIB2001是通過插入其它限制位點的多接頭而生成的pCIB200的衍生物。在pCIB2001的多接頭中的單一限制位點有EcoRI、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal、Sall、Mlul、Bcll、Avrll、Apal、Hpal和Stul。pCIB2001除含有這些單一限制位點外還具有植物和細菌卡那霉素選擇性、用于農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的左和右T-DNA邊緣、用于大腸桿菌與其它宿主之間轉(zhuǎn)移的RK2-衍生的trfA功能和同樣來自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接頭適合于克隆含有其自身調(diào)節(jié)信號的植物表達盒。
b.pCIB10及其潮霉素選擇衍生物二元載體pCIB10含有編碼植物中篩選用的卡那霉素抗性的基因和T-DNA右和左邊緣序列并引入來自廣泛宿主范圍質(zhì)粒pRK252的序列，使它在大腸桿菌和農(nóng)桿菌屬中復(fù)制。Rothstein等人(1987)描述了其構(gòu)建。構(gòu)建了引入潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因(Gritz等人，1983)的pCIB10的各種衍生物。這些衍生物能夠選擇僅針對潮霉素(pCIB743)或針對潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)的轉(zhuǎn)基因植物細胞。
2.適合于非農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的載體不使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化避開了在選擇的轉(zhuǎn)化載體中對T-DNA序列的需求，結(jié)果除了諸如上述含有T-DNA序列的載體之外，還可以使用缺乏這些序列的載體。不依賴于農(nóng)桿菌屬的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體吸收(例如PEG和電穿孔)和微注射的轉(zhuǎn)化。對載體的選擇主要取決于對所轉(zhuǎn)化物種的優(yōu)先選擇。下面描述了適合于非農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化的典型載體的構(gòu)建。
a.pCIB3064pCIB3064是一種適合于與通過除草劑basta(或膦絲菌素)選擇聯(lián)用的定向基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的pUC-衍生的載體。質(zhì)粒pCIB246包括可操作地與大腸桿菌GUS基因融合的CaMV 35S啟動子和CaMV 35S轉(zhuǎn)錄終止子，在PCT公開申請WO 93/07278中有描述。這種載體的35S啟動子含有兩個起始位點的ATG序列5’。使用標準PCR技術(shù)使這些位點發(fā)生突變，以這樣一種方式以便除去ATGs并生成限制位點Sspl和Pvull。新的限制位點是離單一Sall位點96和37 bp和離實際起始位點101和42 bp。將所得的pCIB246衍生物命名為pCIB3025。然后通過用Sall和Sacl消化從pCIB3025上切下GUS基因，使末端鈍端化并重新連接而生成質(zhì)粒pCIB3060。質(zhì)粒pJIT82獲自John InnesCentre，Norwich，切下含有來自產(chǎn)綠色鏈霉菌的bar基因的400bpSaml片段并將其插入pCIB3060的Hpal位點(Thompson等人，1987)。該過程生成pCIB3064，它包括在除草劑篩選用的CaMV 35S啟動子和終止子控制下的bar基因、氨芐青霉素抗性基因(用于大腸桿菌中的篩選)和帶有單一位點Sphl、Pstl、Hindlll和BamHl的多接頭。這種載體適合于克隆含有其自身調(diào)節(jié)信號的植物表達盒。
b.pSOG19和pSOG35pSOG35是一種使用大腸桿菌基因二氫葉酸還原酶(DFR)作為產(chǎn)生氨甲蝶呤抗性的選擇標記的轉(zhuǎn)化載體。將PCR用于擴增35S啟動子(-800bp)、來自玉米Adh1基因的內(nèi)含子6(-550bp)和18bp來自pSOG10的GUS未翻譯前導(dǎo)序列。另外通過PCR擴增編碼大腸桿菌二氫葉酸還原酶II型基因的250-bp片段，并給這兩種PCR片段裝配來自包括pUC19載體主鏈和胭脂氨酸合酶終止子的pB1221(Clontech)的Sacl-Pstl片段。裝配這些片段產(chǎn)生含有與內(nèi)含子6序列融合的35S啟動子、GUS前導(dǎo)區(qū)、DHFR基因和胭脂氨酸合酶終止子的pSOG19。來自玉米褪綠斑駁病毒(MCMV)的前導(dǎo)序列對pSOG19中的GUS前導(dǎo)區(qū)取代的產(chǎn)生了pSOG35載體。pSOG19和pSOG35攜帶用于氨芐青霉素抗性的pUC基因并具有用于克隆外來物質(zhì)的Hindlll、Sphl、Pstl和EcoRl位點。
1.雙子葉植物的轉(zhuǎn)化用于雙子葉植物的轉(zhuǎn)化技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的且包括基于農(nóng)桿菌屬的技術(shù)和不需要農(nóng)桿菌屬的技術(shù)。非農(nóng)桿菌屬技術(shù)包括由原生質(zhì)體或細胞直接攝入外源性遺傳物質(zhì)。該過程可以通過PEG或電穿孔介導(dǎo)的吸收、粒子轟擊介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運或微注射來完成。這些技術(shù)的實例由Paszkowski等人，1984；Potrykus等人，1985；Reich等人，1986和Klein等人，1987描述。在每種情況中，使用本領(lǐng)域中公知的標準技術(shù)使轉(zhuǎn)化的細胞再生成完整植物。
農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是一種用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選技術(shù)，這是由于其高轉(zhuǎn)化效率及其在許多不同物種的廣泛應(yīng)用所導(dǎo)致的。農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化一般包括將攜帶有意義的外源DNA的二元載體(例如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)入合適的農(nóng)桿菌屬菌株的步驟，這種合適的農(nóng)桿菌屬菌株可以依賴于共存Ti質(zhì)粒上由宿主農(nóng)桿菌屬菌株攜帶的Vir基因補體或染色體的存在方式(例如pCIB200和pCIB2001所用的菌株CIB542)(Uknes等人，1993)。將重組二元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌屬的過程通過使用攜帶重組二元載體的大腸桿菌進行的三親交配步驟來完成，所述的大腸桿菌是一種攜帶諸如pRK2013且能夠使重組二元載體達到靶農(nóng)桿菌屬菌株的質(zhì)粒的輔助大腸桿菌菌株。另一方面，可以通過DNA轉(zhuǎn)化將重組二元載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌屬(Hfgen & Willmitzer，1988)。
通過重組農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化靶植物物種通常包括農(nóng)桿菌屬與來自植物的外植體的共培養(yǎng)，并按照本領(lǐng)域中眾所周知的方案進行。在攜帶二元質(zhì)粒T-DNA邊緣之間存在的抗生素或除草劑抗性標記的選擇培養(yǎng)基上使轉(zhuǎn)化的組織再生。
另一種使用基因轉(zhuǎn)化植物細胞的手段包括使惰性或生物活性顆粒推進到植物組織和細胞上。這項技術(shù)公開在美國專利號4,945,050、5,036,006和5,100,792中。一般來說，該過程包括在有效透過細胞外表面并在其內(nèi)部產(chǎn)生結(jié)合的條件下將惰性或生物活性顆粒推進到細胞中。當使用惰性顆粒時，可以通過給顆粒包裹含有所需基因的載體而將所述載體引入細胞。另一方面，靶細胞可被載體包圍，使得該載體尾隨顆粒進入細胞。也可以將生物活性顆粒(例如各自含有試圖引入的DNA的干燥的酵母細胞、干燥的細菌或噬菌體)推進到植物細胞組織中。
2.單子葉植物的轉(zhuǎn)化目前大多數(shù)單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化已經(jīng)成為常規(guī)的。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔技術(shù)將基因直接轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體和粒子轟擊入愈傷組織?？梢允褂脝蜠NA物種或多DNA物種進行轉(zhuǎn)化(即共轉(zhuǎn)化)且這兩項技術(shù)均適用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化可以具有避免完全載體構(gòu)建和生成帶有感興趣基因的未連鎖的基因座和選擇性標記的轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)點，從而能夠在隨后的生產(chǎn)過程中除去所述的選擇性標記，應(yīng)將這一過程看作是理想的。然而，使用共轉(zhuǎn)化的缺點在于整合入基因組的單一DNA種類的頻率低于100％(Schocher等人，1986)。
專利申請EP 0292 435、EP 0392 225和WO 93/07278中描述了用于來自玉米原種近交系的愈傷組織和原生質(zhì)體的制備、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體和由轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)。Grodon-Kamm等人(1990)和Fromm等人(1990)已經(jīng)公開了使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生的玉米品系的技術(shù)。此外，WO 93/07278和Koziel等人(1993)中描述了通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米原種近交系的技術(shù)。這項技術(shù)使用傳粉后14-15天從玉米穗上切下的1.5-2.5mm長的未成熟胚和轟擊用PDS-1000He Biolstics裝置。
還可以通過使用原生質(zhì)體或粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)來進行稻的轉(zhuǎn)化。已經(jīng)描述了針對日本型和印度型的原生質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Zhang等人，1988；Shimamoto等人，1989；Datta等人，1990)。兩種類型也通常是使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化的(Christou等，1991)。此外，WO 93/21335中描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)。
專利申請EP 0 332 581中描述了Pooideae原生質(zhì)體的生成、轉(zhuǎn)化和再生。這些技術(shù)用于轉(zhuǎn)化鴨茅屬和小麥。此外，Vasil等人(1992)已經(jīng)描述了使用粒子轟擊入C型長期再生性愈傷組織的細胞進行小麥的轉(zhuǎn)化，Vasil等人(1993)和Weeks等人(1993)也描述了使用粒子轟擊未成熟胚和成熟胚衍生的愈傷組織來進行小麥的轉(zhuǎn)化。然而，優(yōu)選的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及通過粒子轟擊未成熟胚轉(zhuǎn)化小麥并包括在基因遞送之前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。在轟擊前，將任何數(shù)量的胚(0.75-1mm長)平板固定在含有3％蔗糖(Murashiga & Skoog，1962)和3mg/l2，4-D的MS培養(yǎng)基上以便誘導(dǎo)體細胞胚，使該步驟在黑暗中進行。在選擇進行轟擊的當天，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出胚并置于滲壓劑(即含有一般以15％的所需濃度添加的蔗糖或麥芽糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基)上。使胚進行質(zhì)壁分離2-3小時，然后進行轟擊。雖然并不關(guān)鍵，但通常是每個靶平板上有20個胚。應(yīng)用標準程序使一種合適的攜帶基因的質(zhì)粒(諸如pCIB3064或pSG35)沉淀在微米大小的金粒子上。用使用～1000psi的破裂壓力并使用標準80目篩的DuPont Biolistics氦裝置向各平板的胚發(fā)射。在轟擊后，將胚放回黑暗處以便恢復(fù)約24小時(仍然在滲壓劑上)。24小時后，從滲壓劑上取出胚并放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，在此它們在再生前穩(wěn)定約1個月。約1個月后，將帶有發(fā)育中的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基(MS+1mg/升NAA、5mg/升GA)，該培養(yǎng)基進一步含有合適的選擇劑(就pCIB3064而言是10mg/lbasta，就pSOG35而言是2mg/l氨甲蝶呤)。約1個月后，將發(fā)育的枝條轉(zhuǎn)入稱作“GA7”的含有半數(shù)濃度的MS、2％蔗糖和相同濃度的選擇劑的較大無菌容器中。
還描述了使用農(nóng)桿菌屬轉(zhuǎn)化單子葉植物的技術(shù)方案。參見，WO94/00977和美國專利號5,591,616。III.培育和種子生產(chǎn)通過有性繁殖或營養(yǎng)生長傳遞上述基因工程的轉(zhuǎn)基因種子和植物的遺傳特性，由此可以在子代植物中維持并傳播這些特性。通常所述的維持和傳播充分利用了為適合特殊目的發(fā)展的農(nóng)業(yè)方法，諸如耕種、播種或收獲。還可以應(yīng)用諸如水培或溫室技術(shù)這樣的特殊方法。當生長的農(nóng)作物易受到由昆蟲或感染以及雜草植物競爭所導(dǎo)致的損害和破壞時，實施某些措施以便控制雜草、植物病害、昆蟲、線蟲和其它不良條件以改善產(chǎn)量。它們包括耕作土壤或除去雜草和感染植物這樣的機械措施以及施用諸如除草劑、殺真菌劑、殺配子劑、殺線蟲劑、生長調(diào)節(jié)劑、催熟劑和殺蟲劑這樣的農(nóng)用化學(xué)品。
在植物培育中可以進一步應(yīng)用本發(fā)明的有利遺傳特性的轉(zhuǎn)基因植物和種子，其目的在于開發(fā)具有改善特性的植物，所述的改善特性諸如害蟲、除草劑或應(yīng)激耐受性、改善的營養(yǎng)價、產(chǎn)量提高或使倒伏或脫落損失減小的改進結(jié)構(gòu)。不同培育步驟的特征在于充分確定的人的干預(yù)諸如選擇雜交品系、親本品系的定向傳粉或選擇合適的子代植物。根據(jù)所需特性的不同，制定不同的培育措施。相關(guān)技術(shù)在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而且包括但不限于雜交、近交、回交培育、多線培育、變種混合、種間雜交、非整倍體技術(shù)等。雜交技術(shù)還包括植物不育化以便通過機械、化學(xué)或生化方式產(chǎn)生雄性或雌性不育植物。帶有不同品系花粉的雄性不育植物的交叉?zhèn)鞣鄞_保了雄性不育的基因組，而雌性不育植物均勻地獲得了兩親本品系的特性。因此，可以將本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因種子和植物用于改善的植物品系的培育，例如，這種培育方法提高了諸如除草劑或殺蟲劑(pestidice)處理這樣的常規(guī)方法的有效性，或因其改進的遺傳特性而不再需要所述的方法。另一方面，可以獲得具有改善的應(yīng)激特性的新型農(nóng)作物，由于它們具有最佳化遺傳“設(shè)備”，從而使收獲產(chǎn)品的質(zhì)量優(yōu)于不能耐受類似的不良發(fā)育條件的產(chǎn)品。
本發(fā)明的再一個方面是提供諸如上述典型方法這樣的新型農(nóng)用方法，其特征在于使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因植物物質(zhì)或轉(zhuǎn)基因種子。
可以將種子裝入由合適的包裝材料構(gòu)成的包、容器或管中，所述的包、容器或管能夠密封以包含種子?？梢詫⑷萜骰蚬茉O(shè)計成種子的短期或長期包裝或兩者均有的包裝。合適的包裝材料的實例包括諸如牛皮紙這樣的紙、硬質(zhì)塑料或柔順塑料或其它聚合材料、玻璃或金屬。理想的情況是所述的包、容器或管由多層相同或不同類型的包裝材料構(gòu)成。在一個優(yōu)選的實施方案中，提供所述的包、容器或管以便防止或限制水和濕氣接觸種子。在一個實例中，將所述的包、容器或管密封、例如加熱密封以便防止水或濕氣進入。在另一個實施方案中，將吸水物質(zhì)置于包裝材料層之間或接近包裝材料層。在另一個實施方案中，將包、容器或管或構(gòu)成的包裝材料進行處理以便限制、抑制或防止種子儲存或運輸過程中的病害、污染或其它不利影響。這類處理方法的一個實例是例如通過化學(xué)方式或通過接觸射線進行不育化。本發(fā)明包括的是一種商品包，它裝有包含本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物的種子、合適的載體及其用于使植物產(chǎn)生廣譜病害抗性的標記說明書，其中所述轉(zhuǎn)基因植物種子中包含本發(fā)明基因，其在所述轉(zhuǎn)化植物中的表達水平高于在野生型植物中的表達水平。IV.病害抗性評價用本領(lǐng)域中公知的方法抗性病害抗性評價。參見Uknes等人(1993)；Grlach等人(1996)；Alexander等人(1993)。例如，幾種有代表性的病害抗性測定如下所述。實施例12寄生疫霉(黑脛病)抗性測定對如Alexander等人(1993)中所述生長的6周齡植物進行黑脛病致病生物體寄生疫霉抗性測定。給植物澆水、排干水且然后通過給土壤施用10ml孢子囊混懸液(300孢子囊/ml)進行接種。將接種的植物保存在維持在日溫度23-25℃和夜溫度20-22℃的溫室內(nèi)。本試驗用枯萎指數(shù)如下0＝無癥狀；1＝無癥狀；1＝有一定枯萎征兆、膨脹度下降；2＝明顯的枯萎癥狀、但無腐爛或矮化；3＝明顯的枯萎癥狀、伴有矮化，但無明顯的莖腐爛；4＝嚴重枯萎、肉眼可見莖腐爛和一定的對根系的損害；5＝如4所述，但植物接近死亡或已經(jīng)死亡并伴有根系的嚴重減少。在對以隨機設(shè)計方式排列的植物全盲的情況下取得全部測定得分。實施例13丁香假單胞菌抗性測定給幾種6-7周齡植物的兩個下部的葉子注入濃度為106或3×106/ml水溶液的丁香假單胞菌變種煙草野火病假單胞菌(Pseuodomonas syringae pv.tabaci)菌株#551。在各個時間點評價6株單獨的植物。給煙草野火病假單胞菌感染的植物定為5點病害嚴重等級5＝100％死亡的組織；0＝無癥狀。對每天的評價結(jié)果進行T-檢驗(LSD)并在平均病害等級值后顯示分型。在評價當天后面跟著相同字母的數(shù)值在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異。實施例14煙草尾孢抗性測定將煙草尾孢(ATCC#18366)的孢子混懸液(100,000-150,000個孢子/ml)噴灑在葉表面的緊急溢放口上。將植物維持在100％濕度下5天。此后給植物噴水霧、每天5-10次。在各時間點處評價6株單獨的植物。給煙草尾孢定級為顯示病害主要癥狀的葉面積百分比a％。對每天的評價結(jié)果進行T-檢驗(LSD)并在平均病害等級值后顯示分型。在評價當天后面跟著相同字母的數(shù)值在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異。實施例15寄生霜霉抗性測定對如Uknes等人(1993)中所述的植物進行寄生霜霉抗性測定。通過噴灑分生孢子混懸液(大約5×104個孢子/毫升)給植物接種寄生霜霉的相容分離物。在17℃下的生長室內(nèi)的濕度下通過14小時-日/10小時-夜循環(huán)培養(yǎng)接種植物。在有分生孢子梗存在的情況下接種后的3-14天、優(yōu)選7-12天時檢查植物。此外，隨機選擇經(jīng)各種處理的幾種植物并用乳酚-錐蟲藍染色(Keogh等人，1980)以便于鏡檢。
上述公開的實施方案是解釋性的。對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說本發(fā)明的該公開內(nèi)容僅是本發(fā)明許多變化形式的一部分。所有這類顯而易見和可預(yù)測的變化形式均包括在權(quán)利要求中。
序列表<110>Syngenta Participations AG<120>新型單子葉植物基因及其用途<130>A-31281A<140><141><150>US 09/519233<151>2000-03-06<160>20<170>PatentIn Ver.2.2<210>1<211>4270<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220><221>外顯子<222>(1396)..(2163)<220><221>內(nèi)含子<222>(2164)..(2337)<220><221>外顯子<222>(2338)..(2532)<220><221>內(nèi)含子<222>(2533)..(2933)<220><221>外顯子<222>(2934)..(3188)<400>1gagctcgcca acctcttcca ggtccgcctc tccctctccc cttctcctcc atgatgcttt 60cttggtttca gacatttatt gtgcttgctg ggaatgcata tttgcgcgca cgttcttgtg 120ctcagacagc aaggtttaat gctgtctttt ctttctgcac gcggggacgt tttctgtatg 180cggcaaaatg ggcttagatc cccttaccat ttctgctaaa tttaatcaat ttcagtactt 240ctgaaaaata gcgttaaaca ttggttagta ctagtacgtt ttgtcggtag caatgaggag 300cttgtgctta tcatgtggtg atcttgaaat tggtgaagtt gtcaatggaa attgtacagt 360tgggaccttg aggtgccgtg tcattttgat gctatctcaa ggattcttgt tctgatgttt 420tttttttctt ggggaaaaat ggtaattgtt cattgctcaa agaatgagtg gtgtcaatat 480ggtacatgcc cctacttata tttttcatca atgaaatgca gttcttatga aactgtacaa 540atctaggttg 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sativa)<220><221>CDS<222>(2)..(496)<400>7g gca ytg gat tct gat gat gtt gag ctt gtg aag ttg ctt ctt aac gaa 49Ala Xaa Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu1 5 10 15tct gag atc acc ttg gat gat gcc aat gca ttg cac tat gct gct gct 97Ser Glu Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala20 25 30tac tgt gat tcg aaa gtt gtt tcg gag ttg tta gac ttg aga ctt gcc 145Tyr Cys Asp Ser Lys Val Val Ser Glu Leu Leu Asp Leu Arg Leu Ala35 40 45aac ttg aat ttg aag aat tcg cgt gga tac acg gca ctc cat ctg gct 193Asn Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala50 55 60gct atg agg aga gag cca gct att atc atg tgt ctc cta aac aaa gga 241Ala Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Asn Lys Gly65 70 75 80gca gct gta tca caa ttg act gct gat ggc cag agt gca atg agt atc 289Ala Ala Val Ser Gln Leu Thr Ala Asp Gly Gln Ser Ala Met Ser Ile85 90 95tgc cgg agg tta aca agg atg aaa gac tac aat aca aag atg gag caa 337Cys Arg Arg Leu Thr Arg Met Lys Asp Tyr Asn Thr Lys Met Glu 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395 400 405aat gca aag atg gag cag ggc caa gag tca aat aaa gat agg atg tgc1422Asn Ala Lys Met Glu Gln Gly Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys410 415 420 425att gac atc cta gag agg gag atg atg agg aat cct atg aca gcg gaa1470Ile Asp Ile Leu Glu Arg Glu Met Met Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu430 435 440gat tca gtc acc tca cct tta ttg gct gat gat ctt cac atg aaa cta1518Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu445 450 455agc tac ctg gaa aat aga gtc gcg ttt gca aga cta ttc ttc cct gct1566Ser Tyr Leu Glu Asn Arg Val Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala460 465 470gaa gcg aag gtt gcg atg caa att gcg caa gca gac atc aca cca gaa1614Glu Ala Lys Val Ala Met Gln Ile Ala Gln Ala Asp Ile Thr Pro Glu475 480 485gtt ggt ggt ttt tct gca gca agt act tct ggt aaa ctg agg gaa gtc1662Val Gly Gly Phe Ser Ala Ala Ser Thr Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val490 495 500 505gat ctg aat gag acg cca gta aca aaa aac aaa agg cta cgt tcg agg1710Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val Thr Lys Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg510 515 520gtg gat gca cta gtg aaa aca gtg gaa ctg ggc cgt cgg tac ttc cca1758Val Asp Ala Leu Val Lys Thr Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro525 530 535aac tgc tcg cag gtg ctc gac aaa ttc ttg gaa gat ggc ctg cct gat1806Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp Lys Phe Leu Glu Asp Gly Leu Pro Asp540 545 550ggc ctt gat gca ttc cag cag caa agc ggc acc cct gat gag caa cag1854Gly Leu Asp Ala Phe Gln Gln Gln Ser Gly Thr Pro Asp Glu Gln Gln555 560 565gtg aag aag atg cgc ttc tgc gag gtg aag gag gac gtg cgc aaa gca1902Val Lys Lys Met Arg Phe Cys Glu Val Lys Glu Asp Val Arg Lys Ala570 575 580 585tac agc aaa gac acg gcc gat aac agc atg ttt tca gcc ctg tcg tca1950Tyr Ser Lys Asp Thr Ala Asp Asn Ser Met Phe Ser Ala Leu Ser Ser590 595 600aac tcc tca tcc tcg gcg atg aag tga aggtactgta acaggctgtt 1997Asn Ser Ser Ser Ser Ala Met Lys605 610ttctggagat gtcaggacta aagagggatc gctggtcatg cgcatgtata gtgctcmcca 2057tcgtgtaaaa ctgaatatga acatgaaaga aggccccaaa atagtagaag atgatatata 2117ctttgctgga cttggagttt gttggagaag gctgtgccat cccattccag attcccaata 2177tcaattttcc catgctggtt gtgaagacag agccgcggat catccagctc cgacgctatg 2237catgcgtgca gcctgctgta tttgtttcgc atagctgcaa tacttatatg tttaataata 2297gtactaggga gtagtaggtt attgaggctg tagcggaagt tggaacctmc cttaatgtaa 2357gtgaaagggg ncagttgccc wttgtcgaat tgttgttatc aatacatagt tgattttcgb 2417maaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2446<210>18<211>609<212>PRT<213>小麥(Triticum aestivum)<400>18Met Glu Pro Ser Ser Ser Ile Thr Phe Ala Ser Ser Ser Ser Tyr Leu1 5 10 15Ser Asn Gly Ser Ser Pro Cys Ser Val Ala Leu Ala Pro Leu Pro Ala20 25 30Ala Asp Gly Trp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser35 40 45Val Glu Ala Val Ser Leu Asn Arg Leu Ser Asn Asn Leu Glu Arg Leu50 55 60Leu Leu Asp Ser Glu Leu Asp Cys Ser Asp Ala Asp Val Asp Met Ala65 70 75 80Asp Gly Gly Pro Pro Ile Pro Val His Arg Cys Ile Leu Ala Ala Arg85 90 95Ser Pro Phe Phe His Asp Leu Phe Arg Ala Arg Gly Ser Arg Ser Asp100 105 110Gly Ala Val Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ser Ala Thr Ser Gly Gly Ala115 120 125Gly Gly Asp Val Thr Gly Arg Pro Gln Tyr Lys Met Glu Asp Leu Val130 135 140Pro Gly Gly Arg Val Gly Arg Glu Ala Phe Leu Ala Phe Met Gly Tyr145 150 155 160Leu Tyr Thr Gly Arg Leu Arg Pro Ala Pro Leu Asp Val Val Ser Cys165 170 175Ala Asp Leu Val Cys Pro His Asp Ser Cys Pro Pro Ala Ile Arg Phe180 185 190Ala Val Glu Leu Met Tyr Ala Ala Trp Thr Phe Arg Ile Pro Glu Leu195 200 205Met Ser Leu Phe Gln Arg Arg Leu Met Asn Phe Ile Asp Lys Thr Leu210 215 220Ala Glu Asp Val Leu Pro Ile Leu Gln Val Ala Phe His Ser Glu Leu225 230 235 240Thr Gln Val Arg Gly Lys Cys Val Gln Arg Ile Ala Arg Ser Asp Leu245 250 255Asp Ile Met Ser Leu Asp Lys Glu Leu Pro Pro Glu Ile Ala Asp Glu260 265 270Ile Lys Lys Ile Arg Gln Lys Ser Ser Pro Ile Asp Gly Asp Thr Ile
275 280 285Ile Ser Asp Pro Val His Glu Lys Arg Val Arg Arg Ile His Arg Ala290 295 300Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu Ser305 310 315 320Glu Ile Thr Leu Asp Asp Ala Asn Ala Leu His Tyr Ala Ala Ala Tyr325 330 335Cys Asp Ser Lys Val Leu Thr Glu Leu Leu Gly Leu Glu Leu Ala Asn340 345 350Leu Asn Leu Lys Asn Ser Arg Gly Tyr Thr Ala Leu His Leu Ala Ala355 360 365Met Arg Arg Glu Pro Ala Ile Ile Met Cys Leu Leu Ser Lys Gly Ala370 375 380Val Ala Ser Gln Leu Thr Asp Asp Gly Arg Leu Ala Ser Asn Ile Cys385 390 395 400Arg Arg Leu Thr Arg Leu Lys Asp Tyr Asn Ala Lys Met Glu Gln Gly405 410 415Gln Glu Ser Asn Lys Asp Arg Met Cys Ile Asp Ile Leu Glu Arg Glu420 425 430Met Met Arg Asn Pro Met Thr Ala Glu Asp Ser Val Thr Ser Pro Leu435 440 445Leu Ala Asp Asp Leu His Met Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Asn Arg Val450 455 460Ala Phe Ala Arg Leu Phe Phe Pro Ala Glu Ala Lys Val Ala Met Gln465 470 475 480Ile Ala Gln Ala Asp Ile Thr Pro Glu Val Gly Gly Phe Ser Ala Ala485 490 495Ser Thr Ser Gly Lys Leu Arg Glu Val Asp Leu Asn Glu Thr Pro Val500 505 510Thr Lys Asn Lys Arg Leu Arg Ser Arg Val Asp Ala Leu Val Lys Thr515 520 525Val Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Pro Asn Cys Ser Gln Val Leu Asp530 535 540Lys Phe Leu Glu Asp Gly Leu Pro Asp Gly Leu Asp Ala Phe Gln Gln545 550 555 560Gln Ser Gly Thr Pro Asp Glu Gln Gln Val Lys Lys Met Arg Phe Cys565 570 575Glu Val Lys Glu Asp Val Arg Lys Ala Tyr Ser Lys Asp Thr Ala Asp580 585 590Asn Ser Met Phe Ser Ala Leu Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ser Ala Met595 600 605Lys<210>19<211>1668<212>DNA<213>小麥(Triticum aestivum)<220><221>CDS<222>(451)..(1668)<400>19tgtacttgcg agcatttgaa acacataaaa ttacttttga taggttactt aaatatatgc 60aacttcgatg cagaggctgg ggtaataaaa tcttccattt tctatttttt gaaatacttg 120ttgacagggc tgtaatcaaa ttgggttaat caatgtatgt gtttgtattc ttaaaatatt 180acttatcaga ttagaccgtt tatgcgtcta tattcttatc aatccgtatg gctgtgtcga 240gacttcggat ttttatgtat tttttagtga tgatatgctt ttccttctta gctttgtcat 300actgagattt gtgttttaat aattctgact tcgctgcaga tgatttgccc 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Leu Glu Lys Ala Leu Pro Gln Asp50 55 60Val Ile Lys Gln Ile Thr Asp Leu Arg Ile Thr Leu Gly Leu Ala Ser65 70 75 80Pro Glu Asp Asn Gly Phe Pro Asn Lys His Val Arg Arg Ile Leu Arg85 90 95Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu Thr Glu100 105 110Gly Gln Thr Asn Leu Asp Asp Ala Phe Ala Leu His Tyr Ala Val Glu115 120 125His Cys Asp Ser Lys Ile Thr Thr Glu Leu Leu Asp Ile Ala Leu Ala130 135 140Asp Val Asn Leu Arg Asn Pro Arg Gly Tyr Thr Val Leu His Ile Ala145 150 155 160Ala Lys Arg Arg Asp Pro Lys Ile Val Val Ser Leu Leu Thr Lys Gly165 170 175Ala Arg Pro Ser Asp Phe Thr Phe Asp Gly Arg Lys Ala Val Gln Ile180 185 190Ser Lys Arg Leu Thr Lys His Gly Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Glu Glu195 200 205Gly Lys Pro Ser Pro Asn Asp Lys Leu Cys Ile Glu Ile Leu Glu Gln210 215 220Ala Glu Arg Arg Asp Pro Gln Leu Gly Glu Ala Ser Leu Ser Leu Ala225 230 235 240Leu Ala Gly Asp Cys Leu Arg Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg245 250 255Val Ala Leu Ala Arg Ile Met Phe Pro Ile Glu Ala Arg Val Ala Met260 265 270Asp Ile Ala Gln Val Asp Gly Thr Leu Glu Phe Thr Leu Gly Ser Ser275 280 285Thr Asn Pro Pro Leu Glu Ile Thr Thr Val Asp Leu Asn Asp Thr Ser290 295 300Phe Lys Met Lys Glu Glu His Leu Ala Arg Met Arg Ala Leu Ser Lys305 310 315 320Thr Val Glu Leu Gly Lys Arg Phe Phe Pro Arg Cys Ser Asn Val Leu325 330 335Asp Lys Ile Met Asp Asp Glu Pro Glu Leu Ala Ser Leu Gly Arg Asp340 345 350Ala Ser Ser Glu Arg Lys Arg Arg Phe His Asp Leu Gln Asp Thr Leu355 360 365Leu Lys Ala Phe Ser Glu Asp Lys Glu Glu Phe Asn Arg Thr Thr Thr370 375 380Leu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ser Thr Val Ala Arg Asn Leu Ala385 390 395 400Gly Arg Thr Arg Arg40權(quán)利要求
1.一種分離的核酸分子，它包括來自單子葉植物且為NIM1基因同源物的核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的分離的核酸分子，它包括(a)編碼SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19；(c)包括與SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的至少20個連續(xù)堿基對部分相同的至少20個連續(xù)的堿基對部分；(d)可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQ ID NO5和6的引物對從單子葉植物DNA文庫擴增的所述的核苷酸序列；(e)可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQID NO5和6的引物對從稻DNA文庫擴增的所述的核苷酸序列；(f)可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4、或SEQID NO5和6的引物對從小麥DNA文庫擴增的所述的核苷酸序列；(g)可以使用聚合酶鏈反應(yīng)，采用含有SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的編碼序列(CDS)之前20個核苷酸和最后20個核苷酸之反向互補物的引物對，從單子葉植物DNA文庫擴增的所述的核苷酸序列；(h)核苷酸序列，其能在嚴格雜交和洗滌條件下與SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19的互補物雜交。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括編碼SEQ ID NO2、8、10、12、14、16、18或20的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括SEQ ID NO1、7、9、11、13、17或19。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括一種核苷酸序列，該核苷酸序列包括在序列中與SEQ ID NO1、7、9、11、13、17或19中的至少20個連續(xù)堿基對部分相同的至少20個連續(xù)堿基對部分。
6.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物對從單子葉植物DNA文庫擴增的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物對從稻DNA文庫擴增的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用表示為SEQ ID NO3和4或SEQ ID NO5和6的引物對的從小麥DNA文庫擴增的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括可以使用聚合酶鏈反應(yīng)采用引物對從單子葉植物DNA文庫擴增的核苷酸序列，所述的引物對相應(yīng)于SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19編碼序列(CDS)的前20個核苷酸和最后20個核苷酸的反向互補物。
10.權(quán)利要求2的分離的核酸分子，包括在嚴格雜交和洗滌條件下可與SEQ ID NO1、7、9、11、13、15、17或19互補物雜交的核苷酸序列。
11.一種包含在植物中具有活性的與權(quán)利要求1的核酸分子可操作地連接的啟動子的嵌合基因。
12.一種包含權(quán)利要求11所述的嵌合基因的重組載體。
13.一種包含權(quán)利要求11所述的嵌合基因的宿主細胞。
14.一種包含權(quán)利要求11所述的嵌合基因的植物。
15.權(quán)利要求14的植物，其為單子葉植物。
16.權(quán)利要求14所述的植物，它選自下列植物稻、小麥、大麥、黑麥、玉米、馬鈴薯、canola、向日葵、胡蘿卜、甘薯、甜菜、菜豆、豌豆、菊苣、萵苣、甘藍、花椰菜、嫩莖花椰菜、蕪菁、蘿卜、菠菜、蘆筍、洋蔥、大蒜、茄子、胡椒、芹菜、南瓜、南瓜、黃瓜、蘋果、梨、溫柏、甜瓜、洋李、櫻桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、覆盆子、黑莓、鳳梨、鱷梨、番瓜、芒果、香蕉、大豆、煙草、番茄、高粱和糖甘蔗。
17.來自權(quán)利要求14的植物的種子。
18.一種增加植物中SAR基因表達的方法，該方法包括在所述植物中表達權(quán)利要求11所述的嵌合基因。
19.一種提高植物中病害抗性的方法，該方法包括在所述植物中表達權(quán)利要求11所述的嵌合基因。
20.一種PCR引物，它選自SEQ ID NO3或SEQ ID NO4。
21.一種用于分離與可導(dǎo)致植物中系統(tǒng)獲得性抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的NIM1同源物的方法，該方法包括使用聚合酶鏈反應(yīng)采用引物對從植物DNA文庫擴增DNA分子，所述的引物對相應(yīng)于SEQ IDNO1、7、9、11、13、15、17或19編碼序列(CDS)的前20個核苷酸和最后20個核苷酸的反向互補物；或所述的引物對表示為SEQ IDNO3和4或SEQ ID NO5和6。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的植物DNA文庫是稻或小麥的DNA文庫。
全文摘要
本發(fā)明涉及從單子葉作物諸如Triticumaestivum(小麥)和Oryza sativa(稻)中分離與可導(dǎo)致系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)相關(guān)的擬南芥屬NIM1基因同源物。本發(fā)明進一步涉及用于在轉(zhuǎn)基因植物中表達單子葉NIM1同源物以便增加SAR基因表達并提高廣譜病害抗性的轉(zhuǎn)化載體和方法。
文檔編號C12N1/21GK1411511SQ01806112
公開日2003年4月16日 申請日期2001年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月6日
發(fā)明者H·X·王, J·M·薩爾梅隆, M·G·維爾里茲, K·A·洛頓 申請人:辛根塔參與股份公司