專利名稱：從大腸桿菌中提取的脂多糖的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從大腸桿菌中提取的新的脂多糖。
所謂的內(nèi)毒素是指細(xì)菌的結(jié)構(gòu)成分，其不同于外毒素，不是由活細(xì)菌排泄出的，而是特別在自體消化作用后釋放出來(lái)的。所謂的典型的內(nèi)毒素涉及熱穩(wěn)定的脂多糖，下面稱為L(zhǎng)PS，從革蘭氏陰性細(xì)菌的外細(xì)胞膜中提取。LPS由所謂的脂質(zhì)A，核低聚糖以及特定的O-鏈構(gòu)成，其中脂質(zhì)A是LPS的毒素作用的主要貢獻(xiàn)成分。
內(nèi)毒素刺激宏觀生物中免疫系統(tǒng)的介質(zhì)，如白介素1，簡(jiǎn)稱IL-1和腫瘤-壞死因子，簡(jiǎn)稱TNFα的產(chǎn)生。
對(duì)腸細(xì)菌的內(nèi)毒素，特別是大腸桿菌內(nèi)毒素的組成，已經(jīng)進(jìn)行了一系列的研究，其中已經(jīng)確定，S/R突變株一般只含有其O-鏈的一個(gè)重復(fù)單元(參見(jiàn)

圖1)。出發(fā)點(diǎn)是，在這些情況下編碼O-鏈的聚合酶的基因有缺陷，因此只將一個(gè)重復(fù)單元轉(zhuǎn)移到核低聚糖。與LPS結(jié)構(gòu)相似，但是為其它結(jié)構(gòu)的類型，經(jīng)常也在人體病原菌，如奈瑟氏菌，弧菌，彎曲桿菌，螺桿菌等中發(fā)現(xiàn)。這些細(xì)菌擁有一種LPS，使它們可能通過(guò)一種特殊的分子模擬，此外像哺乳動(dòng)物的糖蛋白和糖脂質(zhì)的唾液酸和含有唾液酸的低聚糖的存在，避開宿主的免疫防護(hù)。大腸桿菌DSM 6601(分類號(hào)為大腸桿菌(E.Coli)NISSLE 1917 SK22/1，于1991年7月11日保藏于德意志微生物保藏中心，該保藏單位的地址為德國(guó)(D-38124)不倫瑞克馬歇爾奧德路1b號(hào))確定為O6-血清型。這種結(jié)構(gòu)由P.E.Jansson等在Carbohydr.Res.131(1984)277-283中研究并發(fā)表。這種結(jié)構(gòu)相應(yīng)于圖2中描述的結(jié)構(gòu)式。
也有不同的研究組研究了大腸桿菌的脂質(zhì)A，其中確定，脂質(zhì)A的結(jié)構(gòu)在一般情況下以六?；问酱嬖?，對(duì)于大腸桿菌的所有血清型是一致的(圖3)。此六酰基化合物的結(jié)構(gòu)在1984年由Th.Rietschel等的脂多糖的脂質(zhì)A組分的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象(Structure and conformationof the lipid A component of lipopolysaccharides)；內(nèi)毒素手冊(cè)(Handbook of Endotoxins)(Proctor，R.編輯)，第一卷，內(nèi)毒素化學(xué)(E.Th.Rietschel編寫)，Elsevier，阿姆斯特丹(1984)，187-220頁(yè)中公開，相應(yīng)于圖3中的描述。
特定的O-鏈和脂質(zhì)A通過(guò)核低聚糖互相連接。目前已知大腸桿菌有五種不同的核低聚糖，這方面參閱O.Holst等的脂多糖的核心區(qū)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌的內(nèi)毒素的脂多糖(Bacterial EndotoxicLipopolysacehariides)，第一卷，Morrison D.C.和Ryan，J.L.(編輯)，Boca Raton，F(xiàn)L，美國(guó)(1992)第135-170頁(yè)(參見(jiàn)圖4)。
在大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS的研究方面已經(jīng)確定，脂質(zhì)A在其組成上對(duì)應(yīng)于通常對(duì)大腸桿菌描述的脂質(zhì)A的六?；问健?br> 關(guān)于IL-1和TNFα的釋放方面的研究在人體的單核細(xì)胞中確認(rèn)，脂質(zhì)A具有相同的活性，因此很有可能對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的脂質(zhì)A的已知結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖5，圖6)。這種假設(shè)通過(guò)化學(xué)分析證實(shí)。
有關(guān)大腸桿菌DSM 6601的特定O-抗原的結(jié)構(gòu)令人驚奇的事實(shí)是，明顯地鏈中總是只存在唯一一個(gè)“重復(fù)單元”(參見(jiàn)圖1)，由此可以得出的結(jié)論是，菌株DSM 6601涉及S/R突變株，這對(duì)于一個(gè)人體分離物是極其特殊的。但是，這種“重復(fù)單元”的結(jié)構(gòu)，如血清學(xué)分析表明，對(duì)應(yīng)于大腸桿菌O6的O-鏈的基本模式。
盡管菌株DSM 6601的核心區(qū)相應(yīng)于已知的R1結(jié)構(gòu)。然而，結(jié)構(gòu)的特殊性在于，分析確定了每個(gè)LPS分子具有8個(gè)磷酸酯殘基，其中脂質(zhì)A一般分?jǐn)偟街挥?個(gè)磷酸酯殘基。此外還發(fā)現(xiàn)了非化學(xué)計(jì)量含量的焦磷酸乙醇胺。
因此概括地確定，菌株DSM 6601的LPS與目前已知的由大腸桿菌提取的LPS特別在核心的磷?；奶墙M分方面和在O-鏈的聚合度方面區(qū)別很大。脂質(zhì)A在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上相應(yīng)于對(duì)于大腸桿菌常規(guī)的類型，這強(qiáng)調(diào)了這種物質(zhì)在生物活性方面的作用。所述的LPS不只是適用于鑒別帶有它的大腸桿菌菌株，還在保持其免疫調(diào)制作用的情況下賦予其降低了的致病性。O-鏈?zhǔn)铅?糖苷而不是α-糖苷連接的事實(shí)，對(duì)于大腸桿菌可以用S/R突變株DSM 6601的例子首次明確地表明。
大腸桿菌DSM 6601的脂多糖(LPS)涉及一種新型的平滑-粗糙(S/R)結(jié)構(gòu)，其一方面由目前已知的部分結(jié)構(gòu)組成(O-特定鏈，核低聚糖和脂質(zhì)A)，另一方面以這里存在的復(fù)雜的形式表征為第一次且完整的結(jié)構(gòu)(參見(jiàn)圖7)。僅由血清型O6的一個(gè)唯一的重復(fù)單元構(gòu)成的O-特定鏈以β-糖苷連接到核低聚糖上，因此不同于O-鏈內(nèi)部(α-糖苷)的連接。核低聚糖具有R1結(jié)構(gòu)，一種通過(guò)用R1特異性抗體進(jìn)行血清學(xué)研究證實(shí)的化學(xué)判斷。脂質(zhì)A組分具有大腸桿菌脂質(zhì)A特征性的某種化學(xué)結(jié)構(gòu)。
大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS具有一個(gè)奇特的均一性。僅僅在磷酸酯取代基方面存在非均一性(PP和P-Etn對(duì)P和P)可以加以確定，其首次以這種形式被描述。借助復(fù)雜的NMR分析可以明確地確定在核低聚糖R1核低聚糖中的P-Etn-取代基在第二個(gè)庚糖(HepII)的2-位。
菌株DSM 6601的LPS的完整的結(jié)構(gòu)在圖7中描述。
下面借助實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述。
實(shí)施例1LPS的制備LPS由洗滌并干燥的細(xì)菌生物質(zhì)在改進(jìn)的苯酚/水萃取工藝后獲得；就此方面參閱O.Westphal等，細(xì)菌的脂多糖，用苯酚/水萃取和這種工藝的進(jìn)一步應(yīng)用，Meth.Carbohydr.Chem.，第V卷(1965)第83-91頁(yè)。
47g事先用蒸餾水洗滌兩次的凍干的細(xì)菌按照Westphal和Jann相應(yīng)的改進(jìn)的規(guī)程提取。這種改進(jìn)在于，隨后進(jìn)行的對(duì)含水提取物的酶處理(DNA酶，RNA酶，蛋白質(zhì)酶K)，其用于除去可能出現(xiàn)的雜質(zhì)蛋白質(zhì)和DNA/RNA組分。為此室溫下向這種水相中加入各20mgRNA酶(核糖核酸酶A，牛胰，Sigma)和20mg DNA酶(DNA酶1，牛胰，II級(jí)，Sigma)，混合物在室溫下攪拌30h。然后，加入20mg蛋白質(zhì)酶K(Tritirachium album，Boehringer，Mannheim)，再攪拌12h。然后，懸浮液在4℃下對(duì)15L蒸餾水滲析24小時(shí)三次，再凍干。酶處理的提取物重新吸收在蒸餾水中，以致于最后濃度達(dá)到50mg/mL。這種懸浮液在冷狀態(tài)下超速離心分離(155，000×g，4℃，4h)三次。沉淀物(LPS)用150mL蒸餾水吸收，再相對(duì)于水滲析三天一次，然后凍干(產(chǎn)量LPS1.45g，3.1％m/m)。
實(shí)施例2來(lái)自大腸桿菌菌株DSM 6601的LPS的分析己糖胺(HexN)(這里指葡糖胺+半乳糖胺，GlcN+GalN)按照改進(jìn)的Morgan-Elson試驗(yàn)來(lái)測(cè)定(Strominger，J.L.，Park，J.T.Thompson，R.E.J.Biol.Chem.234，3263-3268(1959))，但是也可選擇利用HPLC(PICO-TAG，Waters)來(lái)測(cè)定。不同于Morgan-Elson試驗(yàn)，這種分析方法不僅可以分開測(cè)定和量化GlcN和GalN，而且還可以平行查出經(jīng)常在LPS中出現(xiàn)的GlcN磷酸酯，2-乙醇胺(Etn)和2-乙醇胺磷酸酯(Etn-P)的存在。氣液色譜(GC)利用Varian 3700GC或Hewlett Packard(HP 5890系列II)色譜通過(guò)毛細(xì)管柱(熔融硅膠SPB-5，30m，Supelco)進(jìn)行。聯(lián)合的氣液色譜/質(zhì)譜(GC-MS)利用裝有HP-1毛細(xì)管柱(30m，Hewlett Packard)的質(zhì)譜儀(HP Modell5989)完成。GC或GC-MS分析用于測(cè)定糖醇乙酸酯形式的中性糖(Glc，Gal，Hep，Man)(Sawardeker，J.S.，Slonerker，J.H.Jeanes，A.Anal.Chem.37，1602-1604(1967))，以及在強(qiáng)烈的甲醇醇解(2MHCl/MeOH，120℃，16h)(Wollenweber，H.W.和Rietschel，E.Th.，脂多糖(脂質(zhì)A)脂肪酸的分析，J.Microbiol.Meth.11，(1990)195-211)和氯仿提取后進(jìn)行測(cè)定和量化脂肪酸甲酯衍生物形式的脂肪酸。兩種GC分析方法都在150℃(恒溫3min)開始，借助5℃/min的線性溫度梯度升溫至320℃。磷酸酯根據(jù)Lowry等(Lowry，O.H.，Roberts，N.R.，Leiner，K.Y.，Wu，M.KL.Farr，A.L.，J.Biol.Chem.207，1-17(1954))，2-氧代-3-脫氧-D-甘露辛酮糖酸(Kdo)借助硫代巴比妥酸試驗(yàn)測(cè)定(Waravdekar，V.C.& Saslaw，L.D.，J.Biol.Chem.234，1945-1950(1959))。
游離脂質(zhì)A和核低聚糖的制備和純化LPS(258.8mg)懸浮在25mL 0.1M NaOAc/HOAc(pH4.4)中，在100℃進(jìn)行溫和的酸水解1h。然后用25mL氯仿從水解產(chǎn)物中萃取親油組分(脂質(zhì)A)三次(產(chǎn)量23.2mg)。有機(jī)相中的脂質(zhì)A借助制備的薄層色譜(PSC)進(jìn)一步提純(2mmPSC Kieselgel 60板，E.Merck，Darmstadt)，其用氯仿-甲醇-水100∶75∶15(v/v/v)進(jìn)行色譜提純，通過(guò)浸入在蒸餾水中展開。用這種方法得到6個(gè)級(jí)分，其中主要的級(jí)分(Rf≈0.4)是純化的二磷?；牧；|(zhì)A(DPHLA-Ec6601)。提純的DPHLA-Ec6601(產(chǎn)量2.06mg)溶解在氯仿-甲醇8∶2(v/v)中，在進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析前用離子交換劑(Amberlite IRA 120，H+型)處理。純化的DPHLA-Ec6601的等分試樣(250μg)用于生物學(xué)試驗(yàn)。
對(duì)氯仿抽提物的含水相進(jìn)行凍干(產(chǎn)量272mg)，低聚糖借助TSK-柱[3.5×90cm，TSK HW-40(S)，E.Merck]用吡啶-醋酸-水8∶20∶2000，(v/v/v)進(jìn)一步純化。各個(gè)低聚糖級(jí)分(Pool A，B，C和D)借助GC-MS和NMR-譜分析。含有O-鏈的糖組分(Man，GalNac)和核低聚糖的糖組分(Hep，Kdo)的主要級(jí)分(Pool A，#28-41；49.05mg)，進(jìn)行進(jìn)一步純化。其它級(jí)分含有單糖，沒(méi)有詳細(xì)研究的Kdo的人造物(Artefakte)(酐和內(nèi)酯)和最終鹽。TSK分離的主要級(jí)分不僅在GC-MS分析中而且在NMR-分析中都表現(xiàn)出核低聚糖(Kdo，Gal，Hep)和O-鏈(Man，GalNac)的所有組分，因此進(jìn)一步處理。
為此首先檢測(cè)是否分析用的高壓-陰離子交換色譜(HPAEC)適合將低聚糖純化為均相。這里應(yīng)用帶有分析用的CarboPac PA1柱；(4.6mm×250mm)和線性的鹽梯度(5min在0值，然后50min內(nèi)升至0.5M NaOAc)，流速為1mL/min的用于分析復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)的特殊的HPLC方法(DIONEX體系)。洗脫液借助脈沖電流檢測(cè)器(PAD)檢測(cè)還原當(dāng)量(糖分子)。用這種方法可以得到四種低聚糖級(jí)分，其借助半制備的HPAEC，按類似的方法進(jìn)一步提純。
半制備的HPAEC借助CarboPac PA1柱；[(9mm×250mm)Dionex體系]用與如在分析用的HPAEC(5min在0值，然后50min內(nèi)升為0.5M NaOAc)中一樣的鹽梯度和4mL/min的流速完成。低聚糖(42mg；從TSK-柱得到的pool A)在半制備的HPAEC上的裝載是在兩個(gè)類似的HPAEC進(jìn)程中進(jìn)行。洗脫液每分鐘收集一個(gè)級(jí)分，各個(gè)級(jí)分利用分析用的HPAEC分別進(jìn)行研究。按照這種方法利用半制備的HPAEC得到兩個(gè)主要的級(jí)分(級(jí)分I，保留時(shí)間tR～12min和組分II，tR～15min)。兩種HPAEC級(jí)分必須在MALDI-TOF-MS和NMR分析之前借助G-10柱(2.5×120cm)脫鹽(產(chǎn)量級(jí)分I 4.68mg；級(jí)分II 4.39mg)。
基體輔助的激光解吸/離子化時(shí)間飛行(MALDI-TOF)質(zhì)譜分析基體輔助的激光解吸/離子化時(shí)間飛行質(zhì)譜分析(MALDI-TOF-MS)在Bruker-ReflexII飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Bruker-Franzen Analytik，Bremen)中只以線性的組態(tài)和負(fù)模式，在加速電壓為20kV和“延遲的離子萃取”的狀態(tài)下進(jìn)行。試樣首先以10μg/μL的濃度溶解在氯仿(脂質(zhì)A)或蒸餾水(低聚糖級(jí)分)中，其中2μL的等分試樣用2μL于甲醇含有0.5M 2，4，6-三羥基乙酰苯(Aldrich，Steinheim)的基體溶液溶解。這種混合物的等分試樣(0.5μL)涂敷在金屬桿上，用電吹風(fēng)機(jī)干燥。
NMR譜圖分析一維(1D)1H和31P-NMR-譜圖與二維(2D)NMR譜圖用Bruker AvanceDRX-600譜圖儀(Bruker，Rheinstetten)進(jìn)行，13C NMR譜圖用BrukerAMX-360譜圖儀在300K用2H2O進(jìn)行。每次測(cè)量前，樣品用氘代水2H2O凍干兩次。作為外標(biāo)使用丙酮(δH2.225ppm，δC31.45ppm)或85％H3PO4(δPOppm)。標(biāo)準(zhǔn)的Bruker軟件(XWINNMR 1.3)用于采集NMR數(shù)據(jù)。用于TOCSY(整體相關(guān)譜圖)或NOESY(核奧佛好塞增強(qiáng)譜圖)的混合時(shí)間是100或500ms。
血清學(xué)分析血清學(xué)分析作為用三種不同的抗體顯現(xiàn)的Western-Blots進(jìn)行。
1.多克隆抗-O6-抗血清(家兔)用大腸桿菌菌株DSM 6601(血清型O6∶K5∶H1)在漢堡的衛(wèi)生研究院制備(Bockemühl教授)。
2.多克隆抗-大腸桿菌R1-抗血清(家兔，內(nèi)部記號(hào)K299/d58)通過(guò)用粗糙型突變株的免疫得到，其具有R1-核心(抗-R1)。
3.應(yīng)用一種單克隆抗體(WN1-222-5，內(nèi)部記號(hào)F167)，其對(duì)從最小結(jié)構(gòu)(＞Rd)起的所有的大腸桿菌核低聚糖廣泛地交叉反應(yīng)。
表由菌株DSM 6601提取的大腸桿菌LPS的成分分析成分 成分含量nmol/mg(mol/LPS)a糖 1.分析 2.分析GlcNb283(1.8)n.b.GalN 139(0.9)n.b.HexNc591(3.8)589(2.9)Kdo248(1.6)242(1.2)Man321(2.1)383(1.9)Gal474(3.0)557(2.8)Glc1069(6.9) 1291(6.4)L，D-Hep 566(3.6)442(2.2)極性端基P 1188(7.6) 1146(5.7)Etn-P 85(0.5) n.b.脂肪酸12∶0 130(0.8)162(0.8)14∶0 156(1.0)201(1.0)14∶0(3-OH)460(3.0)504(2.5)16∶0 痕量痕量a各組分的摩爾比(在括號(hào)中)因?yàn)镺-鏈中GalNAc和GlcNAc的存在而標(biāo)化到肉豆蔻酸的值(14∶0)(1.0mol 14∶0/mol LPS)。
bGlcN借助氨基酸分析儀測(cè)定。數(shù)值由GlcN和GlcN-6P的總和得到。
cHexN根據(jù)Morgan-Elson光度測(cè)定。
n.b.未確定。
按上述方法得到的LPS-制品與比較的LPS一起進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(參見(jiàn)圖1)。對(duì)于LPS的SDS-PAGE-分析用16％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行(英國(guó)，Laemmli，噬菌體T4的頭部的組裝過(guò)程中結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的斷裂，Nature，227，680-685(1970))。LPS-帶借助靈敏的堿性銀染方法著色(C.M.Tsai和Frasch，C.F.，一種用于檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠中的脂多糖的敏感的銀染方法Anal.Biochem.，119，1982，115-119)。
研究結(jié)果在圖1中說(shuō)明。
實(shí)施例3生物活性a)IL-1-活性IL-1-活性借助MNC-增殖試驗(yàn)在培養(yǎng)液的上清液中測(cè)定。人體單核細(xì)胞(MNC)由志愿捐獻(xiàn)者的外周血液分離(8×105MNC/200mL)，轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中，同時(shí)摻入試驗(yàn)物質(zhì)。對(duì)于體外生物活性的試驗(yàn)，首先用LPS刺激(10ng/mL)細(xì)胞。在8個(gè)小時(shí)的溫育時(shí)間后研究150mL培養(yǎng)液的上清液的細(xì)胞因子的釋放。IL-1-活性借助纖維細(xì)胞-增殖試驗(yàn)在培養(yǎng)液的上清液中測(cè)定。對(duì)此需要的成纖維細(xì)胞從人體的包皮取得。這種成纖維細(xì)胞的增殖通過(guò)IL-1提高。通過(guò)在概率分析中比較培養(yǎng)液的上清液的劑量作用曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定培養(yǎng)液的上清液中的生物活性。由已知內(nèi)毒素活性的細(xì)菌菌株(弗里德奧沙門氏菌)提取的LPS用作陽(yáng)性參照(陽(yáng)性對(duì)照)，因此在圖5中引用。
b)TNFα-活性培養(yǎng)液的上清液的TNFα-活性在細(xì)胞毒性試驗(yàn)中用TNF敏感的細(xì)胞系L929測(cè)定。在概率分析中比較培養(yǎng)液的上清液的劑量作用曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以測(cè)定TNF活性。這里也使用已知內(nèi)毒素活性的由弗里德奧沙門氏菌中提取的LPS作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果在圖6中圖解說(shuō)明。
結(jié)果表明，關(guān)于IL-1和TNFα-釋放(Ausschuettung)，可以確定在用作標(biāo)準(zhǔn)和陽(yáng)性對(duì)照的由弗里德奧沙門氏菌中提取的LPS與由菌株DSM 6601中提取的LPS之間沒(méi)有顯著的區(qū)別(圖5和6，下圖)。這也可以由菌株DSM 6601的脂質(zhì)A與大腸桿菌的高純化的脂質(zhì)A幾乎具有全等的活性來(lái)證明(圖5和6，上圖)。
權(quán)利要求
1.具有圖7描述的結(jié)構(gòu)的脂多糖(LPS)。
2.權(quán)利要求1的LPS，其特征為，每個(gè)LPS分子含有8個(gè)磷酸酯殘基。
3.權(quán)利要求1或2的LPS，其特征為，每個(gè)LPS分子含有0.5molP-Etn。
4.獲得按權(quán)利要求1至3的LPS的方法，其特征為，洗滌并干燥的大腸桿菌生物質(zhì)按已知方式進(jìn)行苯酚/水提取，這樣得到的提取物用RNA酶/DNA酶和蛋白酶K處理。
5.權(quán)利要求4的方法，其特征為，使用大腸桿菌菌株DSM 6601。
6.按權(quán)利要求1至3的由大腸桿菌菌株DSM 6601提取的脂多糖在微生物學(xué)，生物技術(shù)，分析，診斷和/或醫(yī)藥方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及由大腸桿菌DSM 6601提取的脂多糖。這種LPS與大腸桿菌提取的目前已知的LPS特別在核心的磷酰化的糖組分和O－鏈的聚合度方面不同。脂質(zhì)A在結(jié)構(gòu)和生物學(xué)上相應(yīng)于大腸桿菌的常規(guī)類型。所述的LPS不只適用于鑒定帶有它的大腸桿菌菌株，還在保持其免疫調(diào)制作用的同時(shí)賦予其降低了的致病性。
文檔編號(hào)C12P19/00GK1436245SQ01806916
公開日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月20日
發(fā)明者H·普羅珀特, J·馬林卡, J·舒爾澤, U·索南博恩, U·扎林格, A·厄爾默, E·T·里特徹爾 申請(qǐng)人:制藥中心有限公司