專利名稱：用于大腸桿菌染色體重組的質(zhì)粒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于向大腸桿菌(Escherichia coli)K-12株以外的埃希氏桿菌屬(Escherichia)微生物整合基因的質(zhì)粒、將基因整合該染色體的方法、用該整合方法得到的重組菌株、以及利用該重組菌株制造有用物質(zhì)的方法。
而眾所周知的是，利用P1噬菌體進(jìn)行的P1轉(zhuǎn)化是一種有計(jì)劃性和有針對(duì)性的大腸桿菌染色體操作方法，也是最常用的技術(shù)[Zinder，N.D.and Lederberg J.，J.Bacteriol.，64，679(1952)]。
P1轉(zhuǎn)導(dǎo)變異以外的染色體操作技術(shù)大體可分為2種。
一種方法是，在大腸桿菌以外的微生物內(nèi)能自主復(fù)制但在大腸桿菌內(nèi)不能自主復(fù)制的質(zhì)粒中整合目標(biāo)基因、用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的、利用同源重組的原理獲得染色體中整合了目標(biāo)基因的菌株[A.Chen et al.，J.Bacteriol.，176，1542(1994)]。但是，使用這種方法時(shí)，由于以大腸桿菌以外的微生物為宿主合成的質(zhì)粒會(huì)被大腸桿菌內(nèi)的限制酶分解，所以有獲得目標(biāo)染色體重組菌株的有效率非常低的缺點(diǎn)。
另一種方法是，利用在大腸桿菌K-12株中、一般的生長(zhǎng)條件下能自主復(fù)制而高溫等一定條件下不能自主復(fù)制的質(zhì)粒，通過(guò)同源重組將目標(biāo)基因整合染色體中[T.Hashimoto，and M.Sekiguchi，J.Bacteriol.，127，1561(1976)]。
在研究和生產(chǎn)領(lǐng)域被廣泛使用的大腸桿菌包括K-12、B、W株等若干個(gè)體系，而多數(shù)基因重組技術(shù)是采用K-12株開(kāi)發(fā)而成的。
大腸桿菌W株適用于氨基酸等有用物質(zhì)的生產(chǎn)[S.Furukawa et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，29，253(1988)]，也有蔗糖的代謝性，而且實(shí)際上已成功地應(yīng)用于菌體的高密度培養(yǎng)[I.E.Gleiser and S.Bauer，Biotechnol.Bioeng.，23，1015(1981)]，在發(fā)酵生產(chǎn)上有很高的應(yīng)用價(jià)值。
以上這些基因重組技術(shù)都是與K-12株有關(guān)的，而未見(jiàn)有適用于K-12株以外體系的埃希桿菌屬微生物的報(bào)道。
本發(fā)明涉及以下(1)～(14)條內(nèi)容。
(1)在大腸桿菌K-12株中10-30℃條件下可自主復(fù)制，但在33℃以上時(shí)在該菌體內(nèi)不能自主復(fù)制、或該菌株細(xì)胞分裂時(shí)不能均勻分配、該條件下該菌體內(nèi)無(wú)法穩(wěn)定保持的溫度敏感性質(zhì)粒，以及在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中任何溫度下均無(wú)法在該菌體內(nèi)自主復(fù)制、或是該菌株細(xì)胞分裂時(shí)不能均勻分配、該條件下該菌體內(nèi)無(wú)法穩(wěn)定保持的質(zhì)粒。
(2)如以上(1)所述的質(zhì)粒，其中大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物，是指大腸桿菌W株或大腸桿菌B株。
(3)如以上(1)和(2)所述的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒是含有與大腸桿菌的染色體可以同源重組的DNA片段的質(zhì)粒。
(4)如以上(1)～(3)中任何一項(xiàng)所述的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒是具有大腸桿菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、或大腸桿菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)的質(zhì)粒。
(5)在以上(1)～(4)中任何一項(xiàng)所述的質(zhì)粒中整合任何基因而獲得的基因整合用質(zhì)粒。
(6)基因整合方法，其特征在于，將以上(1)～(5)中任何一項(xiàng)所述的質(zhì)粒引入到大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中。
(7)如以上(6)所述的基因整合方法，其中大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物，是指大腸桿菌W株或大腸桿菌B株。
(8)如以上(6)和(7)所述的基因整合方法，其中基因整合是將質(zhì)粒整合到染色體中。
(9)如以上(6)～(8)中任何一項(xiàng)所述的基因整合方法，其中基因整合時(shí)，質(zhì)粒上的DNA片段通過(guò)同源重組與染色體上的DNA片段發(fā)生取代。
(10)由以上(6)～(9)中任何一項(xiàng)所述的方法而得到的轉(zhuǎn)化體。
(11)如以上(10)中所述的轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)化體是指大腸桿菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、大腸桿菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)、大腸桿菌WLA-131(FERM BP-6902)以及大腸桿菌WL-1133(FERM BP-6903)等轉(zhuǎn)化體。
(12)有用物質(zhì)制造方法，其特征在于將以上(10)和(11)所述的轉(zhuǎn)化體放在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使培養(yǎng)物中有用物質(zhì)生長(zhǎng)積聚，再?gòu)脑撆囵B(yǎng)物中提取出有用物質(zhì)。
(13)如以上(12)所述的有用物質(zhì)制造方法，其中有用物質(zhì)選自氨基酸、有機(jī)酸、核酸、核酸相關(guān)物質(zhì)、糖、脂類、維生素、色素、以及這些物質(zhì)的衍生物之類的有用物質(zhì)。
(14)如(12)一項(xiàng)所述的有用物質(zhì)制造方法，其中有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
質(zhì)粒的變異處理質(zhì)粒是采用pMW119(日本基因公司銷售)或含有與pMW119相同的ori區(qū)域、rep基因的質(zhì)粒。ori域就是含有復(fù)制起始點(diǎn)的區(qū)域，rep基因就是對(duì)復(fù)制酶進(jìn)行編碼的基因。
質(zhì)粒的變異處理方法有采用羥胺這種眾所周知的方法[G.O.Humphreys et al.，Mol，Gen Gennet.，145，101(1976)]等。
例如，如果是采用羥胺，則將質(zhì)粒約10μg溶解到含有0.4mol/l鹽酸羥胺的磷酸緩沖液[50mmol/l NaH2PO4，1mmol/l EDTA2Na，pH6.0(NaOH)]中，75℃條件下加熱30-60分鐘，就可使質(zhì)粒變異。
獲得溫度敏感性質(zhì)粒在大腸桿菌K-12株中表現(xiàn)出溫度敏感性的質(zhì)?？梢杂帽娝苤姆椒╗T.Hashimoto，and M.Sekiguchi，J.Bacteriol.，127，1561(1976)]獲得。
具體來(lái)說(shuō)，采用經(jīng)過(guò)變異處理的質(zhì)粒，對(duì)大腸桿菌K-12株進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得在10-32℃范圍內(nèi)對(duì)氨芐青霉素等藥物有耐受性的菌株。其中轉(zhuǎn)化只要是能讓大腸桿菌K-12株轉(zhuǎn)化的方法即可，但是優(yōu)選轉(zhuǎn)化效率高的電穿孔法[W.J.Dower et al.，Nucleic Acids Res.，16，6127(1988)]。
含有標(biāo)記藥物的LB瓊脂培養(yǎng)基[Bacto胰蛋白胨(Difco公司制造)1.0％、酵母提取物(Difco公司生產(chǎn))0.5％、NaCl 1.0％]上涂抹經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化處理的大腸桿菌K-12株，在10-32℃溫度條件下培養(yǎng)6-24小時(shí)。
選出轉(zhuǎn)型變異株，就是確因培養(yǎng)而生長(zhǎng)的菌株。在33℃以上該轉(zhuǎn)化株能夠生長(zhǎng)的溫度條件下，將此轉(zhuǎn)化株在未添加藥物的瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
培養(yǎng)后，將生長(zhǎng)了的菌株涂抹在含有氨芐青霉素等藥物的瓊脂培養(yǎng)基上，在33℃以上該菌株能夠生長(zhǎng)的溫度條件下培養(yǎng)6-24小時(shí)。從上述未添加藥物的瓊脂培養(yǎng)基上分離出與該條件下不能生育的菌株相對(duì)應(yīng)的菌株，將其放在未添加藥物的培養(yǎng)基上再次培養(yǎng)。此次培養(yǎng)后，從菌株中按常規(guī)方法分離出質(zhì)粒。得到的質(zhì)粒就是溫度敏感性質(zhì)粒。
獲得在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物的菌體中無(wú)法復(fù)制的質(zhì)粒。
本發(fā)明涉及的、在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物的菌體中無(wú)法復(fù)制的質(zhì)粒，可以從上述(1)中所記載的方法獲得的、在大腸桿菌K-12株中顯示溫度敏感性的質(zhì)粒中選出。
其中，大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物就是任何K-12株體系以外的屬于埃希氏桿菌屬的微生物。比如，大腸桿菌W株、大腸桿菌B株、大腸桿菌C株、大腸桿菌15株等體系的屬于大腸桿菌的微生物，其中優(yōu)選大腸桿菌W株和B株。
具體而言，采用在大腸桿菌K-12株中顯示溫度敏感性的質(zhì)粒，對(duì)大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，得到轉(zhuǎn)化體。將此轉(zhuǎn)化體用含有藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，如果在任何溫度下該轉(zhuǎn)化體體都無(wú)法生長(zhǎng)，那么該溫度敏感性質(zhì)粒就是具有本發(fā)明特性的質(zhì)粒。
染色體的基因整合由上述方法獲得的、在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物的菌體中任何溫度下都無(wú)法復(fù)制的質(zhì)粒(以下稱本發(fā)明質(zhì)粒)整合到染色體中。
首先，將基因在本發(fā)明質(zhì)粒中克隆。該基因只要是與目標(biāo)有用物質(zhì)的制造有關(guān)，具有與大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物染色體的目標(biāo)基因有相同序列者即可。有用物質(zhì)就是該基因與其制造相關(guān)的所有有用物質(zhì)。比如，有亮氨酸等氨基酸、異檸檬酸等有機(jī)酸、黃素腺嘌呤二核苷酸等核酸或核酸相關(guān)物質(zhì)、果糖等糖類、磷脂或糖脂等脂類、生物素等維生素、胡蘿卜素等色素、還有這些物質(zhì)的衍生物、該基因編碼的酶等蛋白質(zhì)，等等。但也不僅限于這些物質(zhì)。
基因的克隆可由大腸桿菌K-12株開(kāi)始用常規(guī)方法進(jìn)行[《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)》，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)(以下簡(jiǎn)稱MolecularCloning第二版)]。還可以用常規(guī)的方法人為地改變克隆后的基因的堿基序列(Molecular Cloning第二版)。而基因的克隆或是克隆后的基因改變，是以大腸桿菌K-12株為宿主、在32℃以下進(jìn)行培養(yǎng)。
采用以上構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒，對(duì)大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將該菌株用含有氨芐青霉素等藥物的培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到耐藥性菌株，從而就可以得到含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒整合到染色體中形成的染色體重組菌株。其中轉(zhuǎn)化的方法可以采用電穿孔法或氯化鈣法等常規(guī)的方法(Molecular Cloning第二版)。
也可以把質(zhì)粒上克隆后的基因和大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物原染色體上具有的基因發(fā)生取代，從而獲得菌株。
具體而言，采用本發(fā)明質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的菌株在不含氨芐青霉素等藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。只要是該變形株可以生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，則可以用瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，也可以用不含瓊脂的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
培養(yǎng)后的菌體用適量滅菌生理鹽水稀釋，涂抹在不含氨芐青霉素等藥物的LB瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。發(fā)生生長(zhǎng)的各菌落涂抹在含有氨芐青霉素等藥物的瓊脂培養(yǎng)基上，從原來(lái)的未添加藥物的培養(yǎng)基上分離出與未發(fā)生生長(zhǎng)的菌株相對(duì)應(yīng)的菌株。從分離后的菌株中，可以選出本發(fā)明質(zhì)粒上的基因與大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物染色體上原有基因通過(guò)同源重組發(fā)生取代后的菌株。
含有目標(biāo)基因的質(zhì)粒整合到染色體上得到的染色體重組株，或是質(zhì)粒上經(jīng)過(guò)了克隆的基因與大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物原染色體上具有的基因發(fā)生取代而得的菌株，以下稱為本發(fā)明微生物。
用本發(fā)明微生物可以制造有用物質(zhì)。
還有，上述方法中，如果質(zhì)粒整合到染色體上的位置設(shè)計(jì)在目標(biāo)基因的堿基序列中，那么在目標(biāo)基因上整合新的序列就可以破壞該基因。用這種方法破壞基因，其優(yōu)點(diǎn)是比通過(guò)變異使基因失活的方法準(zhǔn)確率要高。
培養(yǎng)本發(fā)明微生物的培養(yǎng)基，只要含有本發(fā)明微生物可以用于代謝的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽類等、可有效地培養(yǎng)本發(fā)明微生物，不管是天然培養(yǎng)基，還是合成培養(yǎng)基均可。
碳源，只要是本發(fā)明微生物可以用于代謝者即可，如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有這些糖的糖蜜、淀粉或淀粉水解產(chǎn)物等碳水化合物、醋酸、丙酸等有機(jī)酸、乙醇、丙醇等醇類，等等。
氮源，可以用氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸的銨鹽、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、玉米浸漬液、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物、各種發(fā)酵菌體及其消化產(chǎn)物等。
無(wú)機(jī)鹽，可以用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養(yǎng)時(shí)，用振蕩培養(yǎng)或深部通風(fēng)攪拌培養(yǎng)等好氧條件下進(jìn)行。
培養(yǎng)溫度是15-40℃即可，培養(yǎng)時(shí)間一般為16小時(shí)～7天。培養(yǎng)中的pH值最好保持3.0～9.0。使用無(wú)機(jī)或有機(jī)酸、堿性溶液、尿素、碳酸鈣、氨等來(lái)調(diào)節(jié)pH值。
還有，培養(yǎng)中必要時(shí)也可以在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素或四環(huán)素等抗生素。
通過(guò)上述培養(yǎng)，可以在培養(yǎng)液中積聚有用物質(zhì)。
培養(yǎng)結(jié)束后，除去培養(yǎng)液中的菌體等沉淀物，同時(shí)使用離子交換處理法、濃縮法、鹽析法等就可以從培養(yǎng)液中回收該有用物質(zhì)。
有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)時(shí)，可以用常規(guī)的蛋白質(zhì)分離精制法對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行分離精制。比如，如果該蛋白質(zhì)表現(xiàn)為溶解于細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，那么培養(yǎng)結(jié)束后，通過(guò)離心分離回收細(xì)胞，用水系緩沖液懸濁，然后通過(guò)超聲波粉碎機(jī)、法式壓力機(jī)、Manton Gaulin勻漿器、Dyno磨等粉碎細(xì)胞，得到無(wú)細(xì)胞提取液。該無(wú)細(xì)胞提取液離心分離得到的上層清液，單獨(dú)或合并使用以下各種常用的蛋白質(zhì)分離精制法，即可得精制蛋白質(zhì)。精制法有溶劑提取法、硫銨等鹽析法、去鹽法、有機(jī)溶劑沉淀法、二乙氨基乙基(DEAE)纖維素、使用DIAION HPA-75(三菱化成公司制造)等樹(shù)脂的陰離子交換色譜法、用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制造)等樹(shù)脂的陽(yáng)離子交換色譜法、使用丁基纖維素、苯基纖維素等樹(shù)脂的疏水性色譜法、使用分子篩的凝膠過(guò)濾法、親和色譜法、色譜聚焦法、等電點(diǎn)電泳等電泳法，等等。
另外，如果該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)形成不溶物而表達(dá)的情況，那么同樣是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行回收、破碎、離心分離，該蛋白質(zhì)不溶物作為沉淀組分而加以回收?；厥盏脑摰鞍踪|(zhì)不溶物用蛋白質(zhì)改性劑使其變?yōu)榭扇?。?duì)該可溶性液體進(jìn)行稀釋或透析、降低該可溶液中蛋白質(zhì)改性劑的濃度，從而使該蛋白質(zhì)恢復(fù)到正常的立體結(jié)構(gòu)。然后，通過(guò)與上述相同的分離精制法就可以得到該蛋白質(zhì)的精制標(biāo)準(zhǔn)品。
本發(fā)明的實(shí)施例如下所述，但本發(fā)明并不僅限于實(shí)施例。
圖2表示含有亮氨酸操縱子的pTS14-LEUR122的限制酶地圖、以及各基因的配置圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方案如下所述的實(shí)施例中的操作，只要未作特別申明，均按MolecularCloning第二版記載的方法實(shí)施。實(shí)施例1獲得在大腸桿菌W株中無(wú)法保持的質(zhì)粒對(duì)大腸桿菌的代表性質(zhì)粒載體pMW119[日本基因公司制造]用體外培養(yǎng)進(jìn)行變異處理。變異處理采用[G.O.Humphreys et al.，Mol.Gen.Genet.，145，101(1976)]記載的如下所示的羥胺方法進(jìn)行。
首先，用超速離心法將配好的pMW119約10μg溶解到含有0.4mol/l鹽酸羥胺的磷酸緩沖液[50mol/lNaH2PO4，1mmol/l EDTA2Na，pH6.0(NaOH)]中。在75℃下對(duì)該溶液加熱40分鐘。然后，加入乙醇使處理DNA沉淀，溶解到TE溶液[10mol/l三羥甲基甲烷，1mol/l EDTAZNa，pH8.0(HCl)]中。
用該DNA溶液對(duì)大腸桿菌K-12株DH5α(Bethesda ReseachLaboratories)進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理。將該菌株在含有氨芐青霉素50mg/l的LB瓊脂培養(yǎng)基[Bacto胰蛋白胨(Difco公司制造)1％、酵母提取物0.5％、NaCl 0.5％、瓊脂2％]上30℃中培養(yǎng)，選出約1700株發(fā)生生長(zhǎng)的菌株。
將這些選擇菌株復(fù)制到不含氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，在42℃培養(yǎng)。發(fā)生生長(zhǎng)的菌落再次復(fù)制到含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，在42℃培養(yǎng)，從原來(lái)的平板上選出22株不能生長(zhǎng)的菌株。
采用從這些選擇菌株提取出的質(zhì)粒，通過(guò)電穿孔法[William J.Dower et al.，Nucleic Acids Research，16，6127(1988)]對(duì)大腸桿菌W株(ATCC-11105)和大腸桿菌B株(ATCC-11303)進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理。此時(shí)轉(zhuǎn)換變異效率為7×108細(xì)胞/μg pBR322。
W株和B株這兩株中，對(duì)氨芐青霉素顯示耐受性的轉(zhuǎn)換變異株獲得頻率為pMW119的107分之一以下的2種質(zhì)粒分別為pMTS11910、pMTS11914。用pMTS11910、pMTS11914對(duì)大腸桿菌DH5α進(jìn)行轉(zhuǎn)化。該轉(zhuǎn)化株大腸桿菌DH5α/pMTS11910和大腸桿菌DH5α/pMTS11914按照布達(dá)佩斯條約于平成11年9月30日分別以FERM BP-6904、FERM BP-6905保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(原工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))。實(shí)施例2構(gòu)建含有亮氨酸操縱子的溫度敏感性質(zhì)粒采用大腸桿菌L-亮氨酸產(chǎn)生菌(FERM BP-4704)(特開(kāi)平8-70879)的leu操縱子作為進(jìn)行染色體基因整合的基因。用齋藤等人的方法[H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)]提取FERM BP-4704株的染色體DNA，再用限制酶Sau3AI將該染色體DNA部分分解。另外，用限制酶BamHI分解pMW218[日本基因(株)]，再進(jìn)行堿性磷酸酯酶處理。處理后的各DNA溶液混合后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。
采用該連接處理后的DNA，對(duì)大腸桿菌L-亮氨酸必需株CV437[M.G.Davis and J.M.Calvo，J.Bacteriol.，129，1078(1977)]通過(guò)電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果得到66株具有卡那霉素耐受性和L-亮氨酸非必需性的菌株。其中，將菌株在不含L-亮氨酸的M9最少培養(yǎng)基上培養(yǎng)，選出可以生長(zhǎng)的菌株，就得到了L-亮氨酸非必需性菌株。
由該菌株中任選12株，提取質(zhì)粒DNA。用該質(zhì)粒DNA，對(duì)L-亮氨酸必需株CV524[M.G.Davis and J.M.Calvo，J.Bacteriol.，129，1078(1977)]通過(guò)電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，L-亮氨酸非必需株的質(zhì)粒為pLEUR12。因?yàn)镃V437缺少leu A，而CV524缺少leu D，所以推斷往pLEUR12中至少整合了含有l(wèi)eu A和leu D的leu操縱子。再進(jìn)一步繪制出pLEUR12的整合DNA片段的限制酶地圖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和已經(jīng)確定堿基序列的大腸桿菌K-12株leu ABCD基因[T.Ura et al.，Nucleic Acids Research，20，3305(1992)]的限制酶地圖一致。
推斷的pLEUR12的結(jié)構(gòu)如

圖1所示。
將克隆后的leu操縱子按以下操作步驟整合pMTS11914。
首先，用限制酶EcoRI、XbaI切斷pLEUR12，對(duì)該切斷DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠中提取出含有l(wèi)eu操縱子的約9Kb的片段。
另外，用限制酶EcoRI、XbaI切斷pMTS11914，再用堿性磷酸酯酶處理。處理后的DNA溶液混合后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。用該連接處理后的DNA，對(duì)大腸桿菌L-亮氨酸必需株C600[Brenner S.，and J.R.Beckwith，J.Mol.Biol.，13，629(1965)]通過(guò)電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果得到約500株具有氨芐青霉素耐受性的菌株。由該氨芐青霉素耐受性菌株中，按上述方法選出L-亮氨酸非要求性菌株，再將選出的菌株在42℃進(jìn)行培養(yǎng)，選出具有氨芐青霉素敏感性的菌株。由選出的菌株中提取出質(zhì)粒，檢查該質(zhì)粒的限制酶切斷方式，將整合了目標(biāo)leu操縱子的質(zhì)粒作為pTS14-LEUR122(圖2)。實(shí)施例3將pTS14-LEUR122整合入大腸桿菌W株染色體中采用pTS14-LEU R122，對(duì)大腸桿菌W 113-3株[ATCC-11105，J，Bacteriol.，60，17(1950)]通過(guò)電穿孔法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)化而得的氨芐青霉素耐受性菌株，用生物測(cè)定法檢查其是否具有L-亮氨酸生產(chǎn)能力。
具體而言，就是在如前所述的L-亮氨酸必需株CV524濃度約為1×107cells/ml、含M9最少瓊脂培養(yǎng)基(葡萄糖5g/l，Na2HPO46g/l，KH2PO43g/l，NaCl 0.5g/l，NH4Cl 1g/l，MgSO41mol/l，CaCl20.1mol/l，DL-蛋氨酸20mg/l，瓊脂2％)上，涂抹獲得的氨芐青霉素耐受性菌株，37℃中培養(yǎng)12小時(shí)。
在具有L-亮氨酸生產(chǎn)能力的菌株的周圍，CV524菌株生長(zhǎng)并形成白色混濁的環(huán)形(以下稱為暈圈)。分離出暈圈形成比平均大小要大的菌株，在含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上42℃培養(yǎng)。從該菌株中選出具有氨芐青霉素耐受性的菌株，這就是染色體上整合了pTS14-LEUR122的菌株。將該菌株的其中一個(gè)命名為大腸桿菌WLA-131株。
通過(guò)Southern雜交確定了pTS14-LEUR122經(jīng)同源重組整合入了大腸桿菌WLA-131株染色體上。
大腸桿菌WLA-131株按照布達(dá)佩斯條約于平成11年9月30日作為FERM BP-6902保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(原工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))。實(shí)施例4采用染色體整合株獲得取代株大腸桿菌WLA-131株接種到5ml LB培養(yǎng)基，33℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。得到的培養(yǎng)液100μL再接種到5mlLB培養(yǎng)基，33℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。
該培養(yǎng)液適度稀釋后涂抹到LB瓊脂培養(yǎng)基上。
發(fā)生生長(zhǎng)的菌落復(fù)制到含有和不含有氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，選出氨芐青霉素敏感性菌株。用如實(shí)施例3所述的生物測(cè)定法檢驗(yàn)該氨芐青霉素敏感性菌株的L-亮氨酸生產(chǎn)能力，形成暈圈的菌株的其中之一命名為大腸桿菌WL-1133株。
大腸桿菌WL-1133株按照布達(dá)佩斯條約于平成11年9月30日以FERMBP-6903保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番地1中央第6(原工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所日本國(guó)茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))。
為確定大腸桿菌WL-1133株染色體上的基因已按預(yù)定目標(biāo)重組，采用Southerin雜交方法進(jìn)行了解析。pLEUR12進(jìn)行HindIII和BamHI消化，獲得含有l(wèi)eu ABCD的4.4Kb片段。該片段用異羥基毛地黃毒苷元修飾，用作探針。從大腸桿菌W113-3株、大腸桿菌WLA-131株、大腸桿菌WL-1133株中提取染色體DNA，該染色體DNA用SacII、KpnI分解，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
電泳后，分離出來(lái)的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜，和探針雜交，接著進(jìn)行了顯色操作。親株大腸桿菌WLA-113-3株和大腸桿菌WL-1133株中只檢測(cè)出含有l(wèi)eu ABCD的約17Kb片段。而大腸桿菌W131株中檢測(cè)出11Kb和約19Kb這兩個(gè)片段。
用于染色體整合的pTS14-LEUR122在其多克隆位點(diǎn)具有一個(gè)KpnI位點(diǎn)。因此，如果象預(yù)先設(shè)定的那樣將質(zhì)粒上的亮氨酸操縱子經(jīng)同源重組整合到了染色體上，就應(yīng)該可以檢測(cè)出19Kb和11Kb這兩個(gè)片段。由以上可知，對(duì)大腸桿菌WLA-131株來(lái)說(shuō)，pTS14-LEUR122整合到了其染色體上的leu操縱子上；對(duì)大腸桿菌WL-1133株來(lái)說(shuō)，整合的質(zhì)粒由于再次同源重組而脫落了。
也就是說(shuō)，曾整合在染色體上的pTS14-LEUR122的來(lái)自于pMT11914的區(qū)域從染色體上脫落了，大腸桿菌WL-1133株的染色體上有1拷貝的leu操縱子。實(shí)施例5氨基酸生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)大腸桿菌W113-3株、大腸桿菌WLA-131株、大腸桿菌WL-1133株分別接種到250ml容量的燒瓶中的種培養(yǎng)基(葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母提取物1％、NaCl0.25％、pH7.0)20ml上，30℃中振蕩培養(yǎng)16小時(shí)。得到的種培養(yǎng)液2.5ml分別接種到250ml容量燒瓶中的生產(chǎn)培養(yǎng)基(葡萄糖3％、硫酸胺1.6％、磷酸二氫鉀0.1％、玉米浸漬液0.2％、DL-蛋氨酸150mg/l、磷酸鎂4％、碳酸鈣1％、pH7.0)25ml上，在30℃中振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液中的L-亮氨酸的積聚量用高效液相色譜法定量。
結(jié)果如表1所示。
表1

工業(yè)實(shí)用性采用在大腸桿菌K-12株中可以自主復(fù)制、在大腸桿菌K-12株以外的大腸桿菌(大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物)中不能自主復(fù)制的質(zhì)粒，就可以在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物的染色體上的任意區(qū)域整合任意基因，或有目的地改變?nèi)旧w上的任意基因。
權(quán)利要求
1.質(zhì)粒，是在大腸桿菌K-12株中、10-30℃范圍內(nèi)能夠自主復(fù)制、而在33℃以上在該菌體內(nèi)不能自主復(fù)制或是該菌株細(xì)胞分裂時(shí)不能均勻分配、該條件下在該菌體內(nèi)不能保持穩(wěn)定的溫度敏感性質(zhì)粒，而且在大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中、任何溫度下在該菌體內(nèi)都無(wú)法自主復(fù)制、或是該菌株細(xì)胞分裂時(shí)不均勻分配、該條件下在該菌體內(nèi)不能保持穩(wěn)定的質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所記載的質(zhì)粒，其中大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物為大腸桿菌W株和大腸桿菌B株。
3.如權(quán)利要求1和2所記載的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒為含有與大腸桿菌的染色體可以同源重組的DNA片段的質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所記載的質(zhì)粒，其中質(zhì)粒為具有大腸桿菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)和大腸桿菌DH5α/pMTS11914(FERM BP-6905)的質(zhì)粒。
5.在如權(quán)利要求1～3中任何一項(xiàng)所記載的質(zhì)粒中整合任意基因而得到的基因整合用質(zhì)粒。
6.基因整合方法，其特征在于將如權(quán)利要求1～5中任何一項(xiàng)所記載的質(zhì)粒引入到大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中。
7.如權(quán)利要求6所記載的基因整合方法，其中大腸桿菌K-12株以外的埃希氏桿菌屬微生物為大腸桿菌W株或大腸桿菌B株。
8.如權(quán)利要求6或7所記載的基因整合方法，其中基因整合是通過(guò)將質(zhì)粒整合到染色體中的方式進(jìn)行的。
9.如權(quán)利要求6～8任一項(xiàng)所記載的基因整合方法，其中基因整合是質(zhì)粒上的DNA片段通過(guò)同源重組與染色體上的DNA片段發(fā)生取代。
10.通過(guò)如權(quán)利要求6～9任一項(xiàng)所記載的方法獲得的轉(zhuǎn)化體。
11.如權(quán)利要求10所記載的轉(zhuǎn)化體，其中轉(zhuǎn)化體是選自大腸桿菌DH5α/pMTS11910(FERM BP-6904)、大腸桿菌DH5α/pMTS11914(FERMBP-6905)、大腸桿菌WLA-131(FERM BP-6902)、大腸桿菌WL-1133(FERMBP-6903)中的任何一種。
12.有用物質(zhì)制造方法，其特征在于將如權(quán)利要求10和11所記載的轉(zhuǎn)化體用培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)物中生成并積聚有用物質(zhì)，從該培養(yǎng)物中提取有用物質(zhì)。
13.如權(quán)利要求12所記載的有用物質(zhì)制造方法，其中有用物質(zhì)為氨基酸、有機(jī)酸、核酸、核酸相關(guān)物質(zhì)、糖、脂類、維生素、色素和這些物質(zhì)的衍生物中的任何一種。
14.如權(quán)利要求12所記載的有用物質(zhì)制造方法，其中有用物質(zhì)為蛋白質(zhì)。
全文摘要
埃希氏桿菌屬微生物作為各種有用物質(zhì)的產(chǎn)生菌具有很高的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明的目的在于提供對(duì)此種微生物染色體上之特定基因進(jìn)行有效人工重組的方法。構(gòu)建在大腸桿菌K－12株中可以復(fù)制、同時(shí)在大腸桿菌K－12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中不能復(fù)制的質(zhì)粒。向此質(zhì)粒中整合目標(biāo)基因，再將其引入至大腸桿菌K－12株以外的埃希氏桿菌屬微生物中，就可以有效地選出目標(biāo)基因被取代后的菌株。
文檔編號(hào)C12N15/70GK1422335SQ01807613
公開(kāi)日2003年6月4日 申請(qǐng)日期2001年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月6日
發(fā)明者高野純一, 木野邦器, 古川令 申請(qǐng)人:協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會(huì)社