專利名稱：用于監(jiān)測(cè)hiv藥物抗性的病毒載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組載體和細(xì)胞系，以及檢測(cè)和監(jiān)測(cè)病毒感染的方法。更具體的，本發(fā)明涉及重組載體和細(xì)胞系，和檢測(cè)HIV感染，監(jiān)測(cè)HIV藥物抗性和篩選抗HIV藥的方法。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)是免疫系統(tǒng)的緩慢變性疾病，稱為獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的主要原因。HIV 1型病毒(HIV-1)感染T-淋巴細(xì)胞的CD4+亞類導(dǎo)致該主要淋巴細(xì)胞亞類的耗竭，不可避免的導(dǎo)致機(jī)會(huì)感染、神經(jīng)性疾病、腫瘤生長和最終死亡。被人免疫缺陷病毒(HIV)感染是一個(gè)緩慢過程，伴有持續(xù)高速率的病毒復(fù)制。HIV-1感染的發(fā)病機(jī)理的特征是可變但通常是長期的無癥狀時(shí)期，然后是急性病毒血癥期。先前的工作確定了HIV疾病進(jìn)程和感染性病毒、病毒抗原和病毒特異性核酸數(shù)量的增加之間的相關(guān)性(Ho等，New England J.Med.3211621-1625(1989)；Schnittman等，AIDS Res.Hum.Retrovirus 7361-367(1991)；Pantalco等，Nature 362355-358(1993))。
開發(fā)了各種試劑和試驗(yàn)用于檢測(cè)HIV的感染和監(jiān)測(cè)HIV在體內(nèi)的進(jìn)程。例如，使用了計(jì)算CD4+細(xì)胞的耗竭來指示AIDS的預(yù)后。在世界范圍內(nèi)還利用了血清學(xué)篩選技術(shù)來檢測(cè)HIV，其中檢測(cè)針對(duì)HIV抗原，例如HIV p24抗原的存在。
目前大多數(shù)醫(yī)院和篩選實(shí)驗(yàn)室采用ELISA試驗(yàn)測(cè)定血清樣品。然而，目前使用的ELISA試驗(yàn)可能不敏感，不足以檢測(cè)所有感染HIV的個(gè)體。這是由于一些感染了HIV的個(gè)體沒有可檢測(cè)水平的針對(duì)HIV的血清抗體。在檢測(cè)HIV感染和血清轉(zhuǎn)化之間有顯著的時(shí)間延遲。另外，一些感染了HIV但是血清陰性的個(gè)體可能永不轉(zhuǎn)化，但將在其一生中保持被感染狀態(tài)。因此，這種篩選方法可產(chǎn)生假陰性，它反過來可增加由這些個(gè)體使健康人感染HIV的可能性。
描述了另一種在血清陰性個(gè)體中檢測(cè)HIV感染的方法(Jehuda-Cohen，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873972-3076(1990))，其中從血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)，然后與促分裂原，例如商陸促分裂原接觸。分離的PBMC與商陸促分裂原一起培養(yǎng)，導(dǎo)致PBMC分泌對(duì)HIV特異性的免疫球蛋白。ELISA試驗(yàn)不能檢測(cè)所有感染HIV的個(gè)體，通過誤導(dǎo)感染了HIV的個(gè)體他們沒有被感染，使公眾受到威脅，因此使得感染HIV的個(gè)體將更有可能不知不覺的感染其它人。
還用反轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增血漿HIV RNA(美國專利號(hào)5,674,680)，確定HIV的存在。用該方法檢測(cè)外周血中的三種HIV mRNAAIDS病人、感染HIV但無癥狀的個(gè)人和接受AIDS治療的個(gè)人的未剪接的、多重剪接的、和單剪接的mRNA。然而，需要確定HIV mRNA水平和AIDS預(yù)后中的差異之間的相關(guān)性。
已開發(fā)了許多抗病毒藥，通過靶向HIV反轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶來抑制HIV感染和復(fù)制。在長期用一種藥物治療后獲得有限的成功，病毒負(fù)荷下落相當(dāng)小，然后血液中可檢測(cè)的病毒量上升，推測(cè)是由于產(chǎn)生HIV藥物抗性株。HIV對(duì)藥物的抗性不僅與HIV的高突變率有關(guān)，還由于長期抗-HIV藥物治療的選擇性壓力。從原始描述HIV-1的分離物對(duì)齊多夫定(AZT)的易感性減低(Larder等，Science(1989)2431731-1734)開始，文獻(xiàn)描述了在不同臨床狀態(tài)下，用不同的試驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)AZT的易感性降低，和負(fù)責(zé)易感性變化的基因突變。例如，未用AZT治療的個(gè)體的分離物顯示對(duì)AZT的易感性范圍狹窄，50％抑制濃度(IC50)范圍是0.001-0.04μM(Larder等，(1989)，見上；Rooke等，AIDS(1989)3411-415；Land等，J.Infect Dis(1990)161326-329；Richman等，J.AIDS(1990)3743-746；Tudor-Williams等，Lancet(1992)33915-19)。該易感性的狹窄范圍對(duì)于所有年齡和所有HIV感染階段的個(gè)體的HIV分離物是典型的。然而，接受AZT的病人的HIV分離物在幾個(gè)月到幾年緩慢地顯示對(duì)AZT的易感性進(jìn)行性降低。還報(bào)道了長期治療中的一個(gè)病人的HIV-2分離物對(duì)AZT易感性的降低(Pepin等，第八屆國際AIDS會(huì)議，Amsterdam，The Netherlands，July 19-24，1992 Abstract PoA 24401)。除了AZT，對(duì)于其它核苷和非核苷抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物也可見HIV抗性。例如對(duì)AZT抗性的分離物顯示對(duì)其它含有3’-疊氮基團(tuán)，包括3’-疊氮-2’，3’-雙脫氧尿苷、3’-疊氮-2’，3’-雙脫氧鳥苷和3’-疊氮-2’，3’-雙脫氧腺苷的易感性下降(Larder等(1989)，見上；Larder等，Antimicrob Agents Chemother(1990)34436-441)。另外，報(bào)道了AZT-分離物顯示對(duì)雙脫氫雙脫氧胸苷的交叉抗性(Rooke等，Antimicrob.Agents Chemother.(1991)35988-991)。
對(duì)HIV分離物的藥物抗性不限于反轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，實(shí)際上所有抗HIV治療的藥物靶標(biāo)都容易產(chǎn)生抗性。例如，分離了對(duì)蛋白酶抑制劑具有抗性的突變體，它顯示對(duì)蛋白酶抑制劑的易感性降低8倍(Patterson等，第八屆國際AIDS會(huì)議，Amsterdam，The Netherlands，July 19-24，1992 Abstract ThA 1506)。
在最近5年來，隨著抗HIV藥物的開發(fā)和組合治療的利用，用多種抗病毒藥物(“混合物(cocktail)”)治療HIV感染導(dǎo)致了用常規(guī)檢測(cè)方法血液中病毒RNA量和可檢測(cè)的病毒減少。已顯示用3種或多種抗病毒藥物，例如印地那韋、齊多夫定和拉米夫定，或者，用奈韋拉平、齊多夫定和地丹諾辛組合治療先前未治療的病人，導(dǎo)致病毒負(fù)荷顯著下降(Wainberg，M.A.和Friendland，G.JAMA(1998)2791977-1983)。據(jù)信，所用的組合抗病毒方案必須阻止病毒復(fù)制達(dá)到不發(fā)生編碼藥物抗性的突變的程度。然而，目前的研究顯示，越來越多的病人用組合藥物方案失敗(Deek，S.等，5屆反轉(zhuǎn)錄病毒和機(jī)會(huì)感染會(huì)議，Chicago，F(xiàn)eb.1-5，1998，Abstract #419)。尋找對(duì)其有效的拯救治療是困難的。
在臨床環(huán)境中，常常檢測(cè)不到藥物抗性，直到病人顯示疾病進(jìn)展的癥狀，一般觀察不到直到在產(chǎn)生了病毒的藥物抗性株后才直到變得明顯。因此，很清楚需要一種檢測(cè)法，它能夠表明病毒株的藥物抗性，因此可以改變病人的藥物治療，并優(yōu)選立即檢測(cè)到抗性而不是拖延到觀察到臨床癥狀。
目前，對(duì)于HIV對(duì)抗病毒藥物易感性的最常用檢測(cè)法是檢測(cè)HIV的實(shí)驗(yàn)室株在類淋巴母細(xì)胞系中的細(xì)胞病理學(xué)、p24產(chǎn)生或反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的抑制。這些檢測(cè)法不容易用于HIV的臨床分離物。常用的臨床分離物的藥物易感性試驗(yàn)的例子是CD4-HeLa細(xì)胞中的多核體聚焦試驗(yàn)(Chesebro，B.和Wehrly，K.，J.Virol.(1988)623779-3788)，原代外周血單核細(xì)胞中p24產(chǎn)生的抑制，和用來自病人血液的培養(yǎng)的原代T-細(xì)胞進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶(RT)試驗(yàn)(Richman等，于Current Protocols inImmunology，Coligan等編，(1993)Brooklyn，J.Wiley)。
與多核體聚焦試驗(yàn)有關(guān)的缺點(diǎn)之一是它可能僅檢測(cè)顯示多核體誘導(dǎo)表型的HIV病毒，在實(shí)踐中這僅可能從少數(shù)血清陽性個(gè)體的標(biāo)本中獲得。而且多核體聚焦試驗(yàn)不能用于篩選影響翻譯后加工的藥物，例如糖苷酶和蛋白酶抑制劑。在另一方面，p24和RT試驗(yàn)還受到難以定量、低靈敏度和不確證的臨床效力的限制。
發(fā)明簡述提供了一種重組細(xì)胞，它含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；重組細(xì)胞能細(xì)胞分裂，并表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，它們促使HIV病毒生產(chǎn)性感染重組細(xì)胞；和重組細(xì)胞使感染該重組細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制并感染重組細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
本文所用的將報(bào)道序列引入重組細(xì)胞指用任一種不同的重組方法，包括但不限于轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)導(dǎo)將序列引入細(xì)胞。
重組細(xì)胞可優(yōu)先地表達(dá)足夠數(shù)量的細(xì)胞表面受體，使重組細(xì)胞接受基本上所有的HIV株。另外，重組細(xì)胞可以表達(dá)所選的一組細(xì)胞表面受體，以致重組細(xì)胞接受所選的一組HIV株。重組細(xì)胞能表達(dá)的細(xì)胞表面受體的例子包括但不限于CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)移的報(bào)道序列可任選的含有啟動(dòng)子序列，包括HIV特異性增強(qiáng)子序列，和報(bào)道基因，通過HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列的結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)。根據(jù)該改變，HIV特異性反式激活蛋白優(yōu)選是Tat，HIV特異性增強(qiáng)子序列優(yōu)選含有至少一個(gè)TAR序列的拷貝。另外，HIV特異性蛋白質(zhì)可任選的通過HIV特異性蛋白質(zhì)和存在于重組細(xì)胞中的反式激活蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來，調(diào)控報(bào)道序列的表達(dá)。
HIV特異性蛋白質(zhì)的例子包括但不限于HIV蛋白質(zhì)Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。HIV特異性蛋白質(zhì)可任選的是HIV反式激活蛋白，例如Tat。
重組細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)可以是由HIV特異性蛋白質(zhì)上調(diào)或下調(diào)。
提供了一種檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法，包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中HIV病毒存在的樣品接觸；和檢測(cè)重組細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變。
還提供了一種方法，用于檢測(cè)不同HIV病毒株在樣品中的存在，包括取第一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體能使第一種細(xì)胞培養(yǎng)物接受第一組HIV株，但不能使第一組細(xì)胞培養(yǎng)物接受第二組不同的HIV細(xì)胞株，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；取第二種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體能使第二種細(xì)胞培養(yǎng)物接受第二組HIV株，但不能使第二組細(xì)胞培養(yǎng)物接受第一組不同的HIV細(xì)胞株，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；使第一和第二種細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中HIV病毒存在的樣品接觸；檢測(cè)第一細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變；檢測(cè)第二細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變；根據(jù)第一或第二中細(xì)胞培養(yǎng)物中是否產(chǎn)生報(bào)道基因表達(dá)水平的改變，把第一和第二組病毒株區(qū)別開。
根據(jù)上述方法，重組細(xì)胞的第一和第二種培養(yǎng)物可任選的彼此混合。第一和第二種重組細(xì)胞培養(yǎng)物中的報(bào)道基因還可任選的彼此不同，從而第一種細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞可以與第二種細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞區(qū)別開來。這使得可以在含有兩種培養(yǎng)物的細(xì)胞的一個(gè)孔中檢測(cè)不同的HIV病毒株。
還提供了在樣品中檢測(cè)HIV藥物抗性的方法，包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂。(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中HIV病毒存在的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸前后加入一種或多種抗HIV藥；和檢測(cè)重組細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變。
還提供了一種取一個(gè)已知被一種或多種HIV株感染的病人，并確定一種或多種抗HIV藥的組合是否對(duì)治療該病人有效的方法，該方法包括取多種細(xì)胞培養(yǎng)物，各種培養(yǎng)物含有重組細(xì)胞，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與含有HIV病毒的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸前后，在各細(xì)胞培養(yǎng)物中加入不同組的一種或多種抗HIV藥；和比較多種細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因的表達(dá)。
一種篩選抗HIV活性的組合物的方法，包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是由HIV病毒基因組在HIV病毒感染重組細(xì)胞后表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與含有HIV病毒的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸前后，加入一種或多種對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)物的抗HIV活性未知的藥物；和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變。
根據(jù)上述任一種方法，用于這些方法的細(xì)胞培養(yǎng)物中的重組細(xì)胞可任選的含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；重組細(xì)胞能細(xì)胞分裂，并表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，它們促使HIV病毒生產(chǎn)性感染重組細(xì)胞；和重組細(xì)胞使感染該重組細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制并感染重組細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
還根據(jù)上述任一方法，HIV特異性蛋白質(zhì)可以是任一HIV蛋白質(zhì)Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。HIV特異性蛋白質(zhì)可任選的是HIV反式激活蛋白，例如Tat。
還根據(jù)上述任一方法，報(bào)道序列可含有啟動(dòng)子序列，其含有HIV特異性增強(qiáng)子序列，和報(bào)道基因，通過HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列的結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)。在一個(gè)改變中，HIV特異性反式激活蛋白是Tat，HIV特異性增強(qiáng)子序列含有至少一個(gè)TAR序列的拷貝。
還根據(jù)上述任一方法，由重組細(xì)胞表達(dá)的一種或多種額外細(xì)胞表面受體可包括但不限于CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
還根據(jù)上述任一方法，檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變可包括檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變。
還根據(jù)上述任一方法，檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變可包括在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)水平的改變。
還根據(jù)上述任一方法，檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變可包括檢測(cè)是否在細(xì)胞培養(yǎng)物中存在病毒復(fù)制。
還根據(jù)上述任一方法，檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變可包括將與樣品接觸的細(xì)胞表達(dá)水平和與一種或多種對(duì)照樣品接觸的表達(dá)細(xì)胞水平比較。
還根據(jù)上述任一方法，樣品可以是任何可能含有HIV的樣品，包括但不限于全血、血清、分離的外周血細(xì)胞、T細(xì)胞和骨髓。
還提供了試劑盒，用于進(jìn)行各種本發(fā)明的方法。這些試劑盒可包括本發(fā)明的細(xì)胞系和用于進(jìn)行這些方法的任何兩種或多種成分。
在一個(gè)變化中，提供了一種試劑盒，它含有第一和第二種重組細(xì)胞系，各重組細(xì)胞系含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的，重組細(xì)胞能細(xì)胞分裂，并表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，它們促使HIV病毒生產(chǎn)性感染重組細(xì)胞；和重組細(xì)胞使感染該重組細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制并感染重組細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；其中第一種重組細(xì)胞系表達(dá)的一種或多種額外細(xì)胞表面受體使得第一種重組細(xì)胞系接受第一組HIV株，第二種重組細(xì)胞系表達(dá)的一種或多種額外細(xì)胞表面受體使得第二種重組細(xì)胞系接受第二組不同的HIV株。
根據(jù)該變化，第一和第二種重組細(xì)胞系可任選的在試劑盒中一起混合。還根據(jù)該變化，第一種重組細(xì)胞系可任選的含有第一個(gè)報(bào)道基因，第二個(gè)重組細(xì)胞系可任選的含有第二種不同的報(bào)道基因，其使得第一和第二種重組細(xì)胞系分別被識(shí)別。
本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生上述重組細(xì)胞的重組病毒載體。重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞感染后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
在一個(gè)優(yōu)選例中，重組病毒載體是重組腺病毒載體。重組腺病毒載體可能是不能復(fù)制的，但攜帶腺病毒包裝信號(hào)。載體攜帶編碼HIV受體的基因，例如CD4、CXCR4和CCR5，和報(bào)道基因，例如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、β-葡糖醛酸酶、熒光蛋白(例如GFP和BFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、分泌的胚胎堿性磷酸酶(SEAP)、激素和細(xì)胞因子。載體還可以攜帶編碼白細(xì)胞介素(例如IL-2和IL-12)的基因，它使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞更容易受到HIV感染。載體還可以攜帶真核聚腺苷酸化序列，例如SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)或BGH聚腺苷酸化位點(diǎn)。
編碼HIV受體的基因可置于位于腺病毒載體靠近左側(cè)末端重復(fù)(L-TR)的E1區(qū)組成型(例如CMV和SV40)或可誘導(dǎo)(例如四環(huán)素誘導(dǎo))啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。報(bào)道基因可置于重組腺病毒載體的右側(cè)末端，例如在重組腺病毒載體靠近右側(cè)末端重復(fù)(R-TR)的E4區(qū)中。
各種HIV受體可以用一個(gè)攜帶所有HIV受體的重組病毒載體，或多個(gè)重組病毒載體，各攜帶一個(gè)或多個(gè)HIV受體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，賦予細(xì)胞不同的向性。
另外，可用重組質(zhì)粒將受體序列和報(bào)道序列引入細(xì)胞。重組質(zhì)粒含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染感染細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生上述重組細(xì)胞的試劑盒。該試劑盒含有重組病毒載體和能被載體感染的細(xì)胞系，重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系中的細(xì)胞感染后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法。該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞感染后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
另外，本發(fā)明的重組細(xì)胞可以通過用含有報(bào)道序列的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已表達(dá)CD4和一種或多種HIV共同受體，例如CXCR4和CCR5的細(xì)胞產(chǎn)生。
可任選的，本發(fā)明的重組細(xì)胞還可以通過用表達(dá)CD4和一種或多種HIV共同受體的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已含有報(bào)道序列的細(xì)胞產(chǎn)生。
可任選的，本發(fā)明的重組細(xì)胞還可以通過用含有報(bào)道序列的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已以足夠促使HIV病毒在細(xì)胞中生產(chǎn)性感染的水平表達(dá)CD4和一種或多種HIV共同受體，例如CXCR4和CCR5的細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明的重組細(xì)胞還可以通過用多個(gè)重組病毒載體，各種多個(gè)重組病毒載體表達(dá)受體序列，例如編碼CD4、CXCR4和CCR5的基因，或報(bào)道序列，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生。
本發(fā)明的重組病毒載體還可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)天然表達(dá)CD4或共同受體(例如CXCR4和CCR5)，但以比人工表達(dá)系統(tǒng)的水平(例如本發(fā)明系統(tǒng)的重組表達(dá)載體)低的水平表達(dá)的細(xì)胞。通過在細(xì)胞內(nèi)引入攜帶HIV受體的載體，HIV受體的表達(dá)水平可用強(qiáng)啟動(dòng)子(例如CMV和SV40啟動(dòng)子)顯著增加，以超過表達(dá)受體。
本發(fā)明的重組病毒載體還可用于產(chǎn)生在受控的時(shí)間段內(nèi)，通過使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，或在較短的時(shí)間段內(nèi)，通過使用腺病毒載體表達(dá)受體的細(xì)胞。這使得多方面和有效產(chǎn)生各種各樣能用于檢測(cè)細(xì)胞中HIV感染、篩選抗HIV藥物和檢測(cè)細(xì)胞中的HIV藥物抗性的細(xì)胞。
附圖簡述

圖1A說明HIV受體和報(bào)道基因的表達(dá)質(zhì)粒。
圖1B說明HIV受體和報(bào)道基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
圖2A說明人CD4和CXCR4受體的表達(dá)質(zhì)粒。
圖2B說明lacZ報(bào)道基因的質(zhì)粒。
圖3A顯示在HIV病毒存在下培養(yǎng)的HeLaT4細(xì)胞，和隨后用X-Gal處理。
圖3B顯示在HIV病毒存在下培養(yǎng)的HeLa D4R4細(xì)胞，和在最初感染后1天用X-Gal處理。
圖3C顯示在HIV病毒存在下培養(yǎng)的HeLa D4R4細(xì)胞，和在最初感染后3天用X-Gal處理。
圖3D顯示在HIV病毒存在下培養(yǎng)的HeLa D4R4細(xì)胞，和在最初感染后4天用X-Gal處理。
圖3E顯示在HIV病毒存在下培養(yǎng)的HeLa D4R4細(xì)胞，和在最初感染后5天用X-Gal處理。
圖3F顯示在HIV病毒和AZT存在下培養(yǎng)的HeLa D4R4細(xì)胞，和隨后用X-Gal處理。
圖4A說明人CD4、CXCR4和CCR5受體的穿梭質(zhì)粒。
圖4B說明報(bào)道基因的穿梭質(zhì)粒。
圖5A說明人CXCR4和CCR5受體的穿梭質(zhì)粒。
圖5B說明人CD4受體的穿梭質(zhì)粒。
圖6說明構(gòu)建本發(fā)明重組腺病毒載體的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及新穎和有用的方法，包括檢測(cè)HIV的方法，檢測(cè)HIV藥物抗性的方法，設(shè)計(jì)為病人定制的抗HIV藥物混合物治療的方法，和篩選抗HIV活性的組合物的方法。還提供了可用于本發(fā)明的方法的新穎載體和細(xì)胞系。
本發(fā)明的方法使用重組細(xì)胞，它們(a)能細(xì)胞分裂；(b)允許HIV病毒；(c)表達(dá)一種報(bào)道基因，其表達(dá)受到HIV感染的選擇性調(diào)控；和(d)允許HIV在受感染的細(xì)胞中復(fù)制，這種感染使相同細(xì)胞培養(yǎng)物中最初未被感染的細(xì)胞被感染。重組細(xì)胞通過表達(dá)細(xì)胞表面受體，例如CD4、CXCR4和CXCR5能接受HIV病毒?？赏ㄟ^用幾種分別攜帶報(bào)道基因和受體基因的質(zhì)粒或載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生重組細(xì)胞。另外，可用同時(shí)攜帶HIV受體(CD4)和共同受體(例如CXCR4和CXCR5)的報(bào)道基因和基因的單個(gè)質(zhì)粒或不能復(fù)制的病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，產(chǎn)生重組細(xì)胞。
本發(fā)明提供的優(yōu)點(diǎn)之一是所用的重組細(xì)胞能細(xì)胞分裂。結(jié)果，容易產(chǎn)生和維持這些細(xì)胞，從實(shí)施本發(fā)明的各種方法。
本發(fā)明提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是重組細(xì)胞可被多種不同的HIV病毒株感染，包括來自臨床分離物或?qū)嶒?yàn)室適應(yīng)株的野生型和突變型HIV株。結(jié)果，本發(fā)明的方法可廣泛應(yīng)用于所有HIV病毒株。
本發(fā)明的還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可方便監(jiān)測(cè)和測(cè)定HIV病毒對(duì)重組細(xì)胞的感染。通過使用一種表達(dá)受到HIV感染調(diào)控的報(bào)道基因，可以用簡單的檢測(cè)方法，例如比色法檢測(cè)HIV感染。通過受到HIV感染選擇性調(diào)控的報(bào)道基因的表達(dá)，減少了例如由于非HIV病毒感染引起的假陽性信號(hào)。
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是重組細(xì)胞不僅允許HIV病毒進(jìn)入和感染，還促使其在重組細(xì)胞中有效復(fù)制，并傳遞成熟HIV病毒顆粒以感染培養(yǎng)物中的其它細(xì)胞。通過使用一種細(xì)胞系(其中HIV能感染培養(yǎng)物中的一些細(xì)胞，復(fù)制，然后感染培養(yǎng)物中的其它細(xì)胞)，并通過將病毒復(fù)制與細(xì)胞分裂結(jié)合，使報(bào)道基因產(chǎn)生的信號(hào)放大，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)被感染的細(xì)胞比在沒有HIV復(fù)制的情況下被感染的多。例如，樣品中所含的一個(gè)病毒粒子最終能夠感染細(xì)胞培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞。該特征使得施加到重組細(xì)胞培養(yǎng)物中的樣品所含的HIV病毒能被靈敏檢測(cè)到。
通過利用上述優(yōu)點(diǎn)，以及下面詳述的特征，可在許多與HIV有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室和臨床應(yīng)用的各種方法和試驗(yàn)中使用重組細(xì)胞系。
應(yīng)注意的是，本發(fā)明的方法和細(xì)胞可以針對(duì)除了HIV外的各種病毒可以改變和適應(yīng)，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、冠狀病毒、皰疹病毒和腺病毒。例如，可構(gòu)建無限增殖細(xì)胞系，它含有一系列受體和共同受體，使得靶病毒的一種或多種病毒株能夠感染、復(fù)制和擴(kuò)增；和一種報(bào)道基因，其表達(dá)受到靶病毒表達(dá)的特定基因產(chǎn)物的調(diào)控。
1.重組細(xì)胞系本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)HIV病毒感染的重組細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施例中，重組細(xì)胞含有一種引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，含有一種報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的；重組細(xì)胞能細(xì)胞分裂，并表達(dá)一個(gè)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，其促使HIV病毒生產(chǎn)性感染重組細(xì)胞；和重組細(xì)胞使感染重組細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制并感染重組細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
報(bào)道基因表達(dá)的調(diào)控可涉及上調(diào)，其中HIV特異性蛋白質(zhì)導(dǎo)致報(bào)道基因的表達(dá)開始或增加。另外，報(bào)道基因表達(dá)的調(diào)控可涉及下調(diào)，其中HIV特異性蛋白質(zhì)導(dǎo)致報(bào)道基因的表達(dá)停止或減少。
HIV特異性蛋白質(zhì)可以是HIV反式激活蛋白，例如Tat，一種HIV調(diào)控蛋白例如Rev，HIV輔助蛋白，例如Vpr、Vprx、Vif、Vpu和Nef，HIV結(jié)構(gòu)蛋白，例如Gag和Env，或HIV酶蛋白，例如RT(反轉(zhuǎn)錄酶)、PR(蛋白酶)和IN(整合酶)。報(bào)道基因的調(diào)控可以用本領(lǐng)域已知的各種方法實(shí)現(xiàn)。例如，報(bào)道基因的表達(dá)可以通過反式激活蛋白Tat與含有至少一個(gè)TAR序列拷貝的上游增強(qiáng)子序列直接結(jié)合來調(diào)控。另外，報(bào)道基因的表達(dá)可以通過HIV特異性蛋白和存在于重組細(xì)胞中的反式激活蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來調(diào)控。
在該實(shí)施例的一個(gè)變化中，重組細(xì)胞中的報(bào)道序列含有一種啟動(dòng)子序列，包括HIV病毒特異性增強(qiáng)子序列，和報(bào)道基因，其表達(dá)受到HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列的結(jié)合調(diào)控。
根據(jù)此優(yōu)選例，重組細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)的調(diào)控是用包括HIV病毒特異性增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子序列實(shí)現(xiàn)的，該增強(qiáng)子序列對(duì)HIV特異性反式激活蛋白有轉(zhuǎn)錄反應(yīng)性。HIV病毒感染后，HIV基因組表達(dá)的HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列結(jié)合，增強(qiáng)報(bào)道基因的表達(dá)。檢測(cè)報(bào)道基因產(chǎn)物的存在與否或水平，用于指示HIV病毒的感染。
在一個(gè)特定優(yōu)選例中，報(bào)道序列含有TAR序列的至少一個(gè)拷貝，作為HIV病毒特異性增強(qiáng)子序列。報(bào)道序列的表達(dá)受到HIV特異性反式激活蛋白Tat與增強(qiáng)子序列TAR的結(jié)合調(diào)控。
各種各樣的報(bào)道基因可在本發(fā)明的實(shí)施例中用于報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)，但不限于，容易試驗(yàn)檢測(cè)的酶，例如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、分泌的胚胎堿性磷酸酶(SEAP)、熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)的藍(lán)色熒光蛋白(EBFP)、增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP)和增強(qiáng)的青色熒光蛋白(ECFP)；和可方便使用免疫檢測(cè)法的蛋白質(zhì)，例如激素和細(xì)胞因子。這些報(bào)道基因的表達(dá)還可以通過測(cè)定這些基因轉(zhuǎn)錄的mRNA水平監(jiān)測(cè)。
重組細(xì)胞表達(dá)的一種或多種額外的細(xì)胞表面受體可任選的包括但不限于CXCR4、CCR5、其它趨化因子受體例如CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1，和趨化因子受體樣孤獨(dú)蛋白，例如STRL33/BONZO和GPR15/BOB。
CD4和這些一種或多種額外的細(xì)胞表面受體的存在使具有不同嗜性的HIV病毒株能有效進(jìn)入、感染和復(fù)制。使重組細(xì)胞表達(dá)盡可能多的細(xì)胞表面受體，使重組細(xì)胞能接受幾乎所有的HIV病毒株，而不論其嗜性。這可以通過用所有已知參與HIV感染的細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，或通過與細(xì)胞(例如T細(xì)胞或單核細(xì)胞，其在細(xì)胞表面上表達(dá)這些受體)的細(xì)胞融合來實(shí)現(xiàn)。另外，通過使重組細(xì)胞表達(dá)某些細(xì)胞表面受體，或幾組細(xì)胞表面受體，能設(shè)計(jì)重組細(xì)胞，使其接受某些HIV病毒株而不接受其它HIV病毒株。因此，通過篩選表達(dá)哪一種細(xì)胞表面受體，可設(shè)計(jì)細(xì)胞系用于篩選特定的HIV病毒株或組。
與HIV病毒生產(chǎn)領(lǐng)域所用的人T-細(xì)胞比較，本發(fā)明的重組細(xì)胞系較容易培養(yǎng)，更穩(wěn)定，價(jià)格低廉。已證實(shí)由HIV-1靶向的主要細(xì)胞類型是在體內(nèi)通過CD4受體途徑的輔助型T-淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞譜系的細(xì)胞，而是在組織培養(yǎng)系統(tǒng)中，HIV是CD4+-淋巴細(xì)胞病變性的，且導(dǎo)致巨噬細(xì)胞功能失調(diào)，這直接引起體內(nèi)T-細(xì)胞耗竭。由于在感染的個(gè)體中復(fù)制性的HIV可方便地在外周血和淋巴結(jié)中檢測(cè)到，特別頻繁地使用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)作為HIV體外感染和抗HIV藥物易感性測(cè)試的宿主細(xì)胞。PBMC細(xì)胞的缺點(diǎn)之一是這些原代細(xì)胞必須從供體中獲得，小心培養(yǎng)并每次新鮮制備。這些原代T-細(xì)胞用于商業(yè)目的昂貴并且效率低。另外，這些T-細(xì)胞對(duì)HIV病毒的不同病毒株的接受性隨供體而變，導(dǎo)致臨床檢測(cè)的不確定性。因此，以大量供應(yīng)的方式生產(chǎn)的本發(fā)明重組細(xì)胞是接受HIV感染，相對(duì)穩(wěn)定并可更容易的在體外培養(yǎng)和操縱及適合大批量的商業(yè)復(fù)制，和用于高通量篩選。
2.檢測(cè)樣品中HIV的方法提供了檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法。在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV病毒復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道系列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中HIV病毒存在的樣品接觸；和檢測(cè)重組細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變，該改變表明樣品中存在HIV病毒并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞。
該方法使用的重組細(xì)胞培養(yǎng)物可以是具有上述特征的任何細(xì)胞培養(yǎng)物。第I節(jié)所述的重組細(xì)胞是具有這些特征的細(xì)胞的例子，可用于該方法。
可通過檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的改變，或細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，來檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在病毒復(fù)制?？赏ㄟ^檢測(cè)最初被感染的細(xì)胞，和檢測(cè)不是最初被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞表達(dá)水平的改變來檢測(cè)病毒復(fù)制。
在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括比較與樣品接觸的細(xì)胞中的表達(dá)水平與一種或多種對(duì)照樣品接觸的細(xì)胞的表達(dá)水平。例如，與不含HIV病毒的樣品接觸的細(xì)胞可作為陰性對(duì)照，而與含有HIV病毒、重組和穩(wěn)定化的HIV病毒，或其它能感染細(xì)胞并導(dǎo)致HIV特異性蛋白質(zhì)表達(dá)的病毒，例如編碼Tat的修飾的腺病毒的樣品接觸的細(xì)胞可作為陽性對(duì)照。使用合適的對(duì)照，報(bào)道基因表達(dá)的誘導(dǎo)與HIV感染可有更好的相關(guān)性。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生重組細(xì)胞的方法，然后檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在。該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體，以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，其表達(dá)受到對(duì)HIV特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；使細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中存在HIV病毒的樣品接觸；和檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
根據(jù)該方法，重組細(xì)胞可通過用含有報(bào)道基因和受體基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞而產(chǎn)生。這些基因的表達(dá)是附加型，因此導(dǎo)致最小基因毒性。另外，轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞中腺病毒表達(dá)對(duì)于較長的時(shí)間(幾周)是穩(wěn)定的，使得各種細(xì)胞操作，例如用于檢測(cè)病人樣品中HIV的存在有足夠時(shí)間。這些重組病毒載體的例子如第6節(jié)所述。
本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)已被HIV感染或可被HIV感染的培養(yǎng)物中HIV病毒存在的方法。該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物，它能促使細(xì)胞的生產(chǎn)性感染，并使感染細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體，以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在培養(yǎng)物中的細(xì)胞感染后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞內(nèi)報(bào)道基因的表達(dá)水平。
根據(jù)該方法，細(xì)胞可以是或可以不是重組的。例如，衍生自PBMC的穩(wěn)定細(xì)胞系對(duì)HIV感染是敏感的。這種細(xì)胞已被HIV感染，或被HIV感染的細(xì)胞可加入細(xì)胞培養(yǎng)物中。在細(xì)胞被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，病毒載體攜帶的報(bào)道基因表達(dá)可以通過對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)(例如Tat)調(diào)控，這可通過測(cè)定報(bào)道基因的表達(dá)水平檢測(cè)。
應(yīng)注意的是，報(bào)道基因的調(diào)控可以上調(diào)或下調(diào)。因此，報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變可以是報(bào)道基因表達(dá)的增加或減少。
上述方法可用于診斷各種樣品(包括但不限于全血、血清、分離的外周血細(xì)胞、T細(xì)胞、其它生物液例如尿液、唾液、淚液和精液)中所含的HIV病毒和實(shí)驗(yàn)室和臨床獲得的分離的野生型或突變型HIV病毒。例如，可用上述方法檢測(cè)個(gè)體的全血用于測(cè)試HIV病毒的存在。另外，可篩選來自單個(gè)捐獻(xiàn)者的血液或骨髓樣品和血庫中儲(chǔ)藏的匯聚的血液樣品中HIV病毒的存在。該方法檢測(cè)甚至一個(gè)HIV病毒顆粒的靈敏性使得可在HIV感染的很早階段診斷病人中的HIV，并可用于防止HIV陽性血液被轉(zhuǎn)輸給病人。
使用上述HIV診斷方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是重組細(xì)胞僅對(duì)HIV病毒特異性反應(yīng)。由于報(bào)道基因的表達(dá)是由HIV特異性基因產(chǎn)物特異性調(diào)控的，因此可在臨床上避免診斷中的不確定性或假陽性報(bào)道。另一方面，通過使用上述方法，可在被HIV感染但沒有可檢測(cè)水平的血清抗體(血清陰性)的病人中檢測(cè)HIV病毒，從而減少使用基于抗體的檢測(cè)方法可能引起的假陰性事故。
上述方法還可用于擴(kuò)增HIV病毒，尤其是在血液樣品中出現(xiàn)少和逃避其它檢測(cè)的病毒株。隨著HIV病毒在重組細(xì)胞中復(fù)制和擴(kuò)增，可在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生高滴度的HIV病毒，并分離，用于克隆新的HIV病毒株等進(jìn)一步的研究。
上述方法還可用于通過使用選擇性表達(dá)某些HIV共同受體的重組細(xì)胞，在樣品中甄別HIV病毒株或嗜性。例如，可在第一重組細(xì)胞系中選擇性表達(dá)T-嗜性病毒株所需的CXCR4共同受體，使HIV的T-嗜性病毒株感染。同時(shí)，由于M-嗜性病毒株需要CCR5共同受體來感染細(xì)胞，可構(gòu)建第二種重組細(xì)胞系，選擇性表達(dá)CDR5，使HIV的M-嗜性株感染。通過使第一和第二種重組細(xì)胞系表達(dá)不同的共同受體，第一和第二種重組細(xì)胞系可在其它HIV病毒株存在下選擇性檢測(cè)T-嗜性、M-嗜性或雙重嗜性株。
另外，第一種重組細(xì)胞系可包括第一種報(bào)道基因，例如GFP，而第二種重組細(xì)胞系可包括第二種報(bào)道基因，例如EBFP。當(dāng)?shù)谝缓偷诙N細(xì)胞系在一種培養(yǎng)物中混合，并與含有未知嗜性的HIV病毒的樣品接觸時(shí)，一種報(bào)道基因的選擇性表達(dá)可指示病毒的一種嗜性，而兩種報(bào)道基因的表達(dá)表明雙重嗜性。在顯微鏡下觀察到的第一和第二種細(xì)胞系發(fā)射的不同熒光將能分別鑒別一種培養(yǎng)物中的各種細(xì)胞系。
上述方法可用于定量分析樣品中的HIV病毒。例如，通過使用具有不同的滴度的對(duì)照樣品，通過與對(duì)照樣品比較可容易地計(jì)算病毒負(fù)荷。另外，還可通過系列稀釋樣品直到在多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)平板中達(dá)到終點(diǎn)感染，即一些細(xì)胞培養(yǎng)平板被感染而其它平板不被稀釋的樣品感染，來確定樣品的病毒滴度。
3.檢測(cè)HIV藥物抗性的方法還提供了檢測(cè)樣品中HIV藥物抗性的方法。這些方法還可用于檢測(cè)用一種或多種藥物治療HIV感染的一個(gè)療程是否由于存在對(duì)所用的一種或多種藥物抗性的一種或多種HIV病毒株而無效。這些方法還可用于分離對(duì)一種或多種抗HIV藥物抗性的HIV病毒株。
在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其(a)能細(xì)胞分裂。(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與含HIV病毒的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸前后在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種或多種抗HIV藥；和檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
在另一個(gè)實(shí)施例中，提供了一種檢測(cè)樣品中HIV藥物抗性的方法。該方法包括取被HIV病毒感染的細(xì)胞培養(yǎng)物，細(xì)胞能促使細(xì)胞生產(chǎn)性感染，并使感染細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，重組病毒載體包括報(bào)道序列，其含有表達(dá)受到HIV表達(dá)特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控的報(bào)道基因，該蛋白質(zhì)是培養(yǎng)物中的細(xì)胞被感染后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種或多種抗HIV藥物；和檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
根據(jù)該實(shí)施例，細(xì)胞細(xì)胞可以是或可以不是重組的。在用重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞之前，細(xì)胞已被HIV感染，或可以通過在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入HIV被感染。細(xì)胞被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后，可通過對(duì)HIV特異性的蛋白質(zhì)，例如Tat調(diào)控載體攜帶的報(bào)道基因的表達(dá)。在抗HIV藥物存在或不存在下，檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)水平的改變應(yīng)提供HIV對(duì)這些藥物的抗性信息。
本方法中使用的抗HIV藥物可以是任何具有已知抗HIV活性，臨床使用前或臨床測(cè)試的藥物?？捎糜诤Y選HIV藥物抗性的抗HIV藥物的例子包括但不限于核苷RT抑制劑，例如齊多夫定、地丹諾辛、扎西他賓、拉米夫定、斯塔夫定、阿巴卡韋、非核苷RT抑制劑，例如奈韋拉平、地拉夫定、依非韋倫(EFAVIRENZ)，蛋白酶抑制劑，例如印地那韋、利托那韋、沙奎那韋、奈非那韋、安潑那韋，HIV整合酶抑制劑，HIV融合抑制劑及其組合。
用于該方法的重組細(xì)胞培養(yǎng)物可以是任何具有上述特征的細(xì)胞。第I節(jié)所述的重組細(xì)胞是具有這些特征的細(xì)胞的例子，并可用于該方法。
可通過檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，或細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)基因的表達(dá)水平的改變，來檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在病毒復(fù)制?？赏ㄟ^檢測(cè)最初被感染的細(xì)胞，和檢測(cè)不是最初被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞表達(dá)水平的改變來檢測(cè)病毒復(fù)制。
在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括比較與樣品接觸的細(xì)胞中的表達(dá)水平與一種或多種對(duì)照樣品接觸的細(xì)胞的表達(dá)水平。例如，與含HIV病毒的樣品接觸，但不與一種或多種抗HIV藥物接觸的細(xì)胞可作為陰性對(duì)照，而與含添加對(duì)一種或多種抗HIV藥物未知有抗體的HIV病毒的樣品接觸的細(xì)胞可優(yōu)先作為陽性對(duì)照。使用合適的對(duì)照，報(bào)道基因表達(dá)的誘導(dǎo)與HIV病毒對(duì)藥物的抗性有更好的相關(guān)性。
應(yīng)注意的是，報(bào)道基因調(diào)控可以上調(diào)或下調(diào)。因此，報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變可以是報(bào)道基因表達(dá)的增加或減少。
在該實(shí)施例的一個(gè)變化中，細(xì)胞培養(yǎng)物與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸前接觸。另外，細(xì)胞培養(yǎng)物可以與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸后接觸，并培養(yǎng)足夠的時(shí)間，使HIV病毒發(fā)生復(fù)制。這對(duì)于在測(cè)試藥物抗性前在樣品中具有低滴度的HIV病毒的最初復(fù)制特別有利。
上述方法可用于檢測(cè)病人樣品中所含的HIV病毒、分離的病毒原種或?qū)嶒?yàn)室適應(yīng)的HIV病毒株的藥物抗性。由于重組細(xì)胞對(duì)一個(gè)HIV病毒顆粒的超敏感，逃過藥物療法的HIV病毒株或哪些不是主要的循環(huán)變體的病毒株可在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制并分離，用于進(jìn)一步基因型分析。
比較來看，用于檢測(cè)抗HIV藥物抗性的方法較不靈敏，耗費(fèi)時(shí)間而且需要一定的技術(shù)水平。目前使用的方法包括基于PCR擴(kuò)增病毒RNA，然后對(duì)擴(kuò)增的DNA模板進(jìn)行測(cè)序的檢測(cè)HIV基因組突變的基因型檢測(cè)法，和基于重組HIV病毒的表型檢測(cè)法(Hirsch，M.S.(1998)JAMA 2791964-1991)。不僅已開發(fā)了最靈敏的基于PCR的試驗(yàn)不夠靈敏，不足以檢測(cè)低于50拷貝/mL的血漿HIV RNA，而且由于實(shí)驗(yàn)室中攜帶其它HIV樣品或來自PCR過程中的隨機(jī)聚合酶差錯(cuò)，可產(chǎn)生突變的假陽性。重組病毒檢測(cè)法需要首先RT-PCR擴(kuò)增多于1000拷貝/mL的血漿HIV RNA，將病毒cDNA克隆入HIV載體，然后在允許的細(xì)胞系中培養(yǎng)病毒。整個(gè)過程花費(fèi)兩周以上，產(chǎn)生結(jié)果并且需要高度熟練的工作人員來進(jìn)行該試驗(yàn)。
因此，本發(fā)明提供的方法能更靈敏的檢測(cè)復(fù)制性HIV病毒(以僅約5個(gè)病毒顆粒/mL)，更有效的測(cè)試HIV藥物抗性(小于1周)，更經(jīng)濟(jì)的進(jìn)行高通量篩選。
4.設(shè)計(jì)為病人定制的HIV混合物治療的方法還提供了取一個(gè)已知被一種或多種HIV病毒株感染的病人，確定一種或多種抗HIV藥物的哪種組合能有效治療該病人的方法。這些方法可用于當(dāng)一個(gè)病人最初用抗HIV藥物治療或在一個(gè)病人被一種或多種抗HIV藥物治療一段時(shí)間后，可能產(chǎn)生了一種或多種對(duì)所用的抗HIV藥物抗性的病毒株的時(shí)候。
在一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括取多種細(xì)胞培養(yǎng)物，各細(xì)胞培養(yǎng)物含有重組細(xì)胞，它們(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道系列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與含有HIV病毒的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸之前或之后在各細(xì)胞培養(yǎng)物中加入不同組的一種或多種抗HIV藥物；和在多種細(xì)胞培養(yǎng)物中比較報(bào)道基因的表達(dá)。
在一個(gè)變化中，多種細(xì)胞培養(yǎng)物中的每一種與不同組的一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸前接觸。
在另一個(gè)變化中，多種細(xì)胞培養(yǎng)物中的每一種與不同組的一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸后接觸，并培養(yǎng)充足的時(shí)間使HIV病毒產(chǎn)生復(fù)制。
抗HIV藥物可以是任何具有已知抗HIV活性的藥物，例如第3部分中所述的那些藥物，及其組合。
用于該方法的重組細(xì)胞的培養(yǎng)物可以是任何具有上述特征的細(xì)胞。第I部分中所述的重組細(xì)胞是具有這些特征的細(xì)胞的例子，可用于該方法。
可通過檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，或細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，來檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在病毒復(fù)制?？赏ㄟ^檢測(cè)最初被感染的細(xì)胞，和檢測(cè)不是最初被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞表達(dá)水平的改變來檢測(cè)病毒復(fù)制。
在該實(shí)施例的另一個(gè)變化中，該方法進(jìn)一步包括當(dāng)采用不同的抗HIV藥物或不采用抗HIV藥物時(shí)，比較報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。例如，與含HIV病毒的樣品接觸，但不與一種或多種抗HIV藥物的樣品接觸的重組細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，而與含HIV病毒或修飾的腺病毒的一種或多種抗HIV藥物的樣品接觸的重組細(xì)胞培養(yǎng)物作為陽性對(duì)照。使用合適的對(duì)照，報(bào)道基因表達(dá)的抑制與藥物的抗HIV效力有更好的相關(guān)性。
應(yīng)注意的是，報(bào)道基因調(diào)控可以上調(diào)或下調(diào)。因此，報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變可以是報(bào)道基因表達(dá)的增加或減少。
在該實(shí)施例的一個(gè)變化中，細(xì)胞培養(yǎng)物與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸前接觸。另外，細(xì)胞可以與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸后接觸，并培養(yǎng)足夠的時(shí)間，使HIV病毒發(fā)生復(fù)制。這種HIV病毒的預(yù)擴(kuò)增對(duì)于要測(cè)試藥物抗性的含有低滴度HIV病毒的病人樣品特別有利。
該部分提供的方法可用于篩選在抑制HIV病毒感染和/或復(fù)制中最有活性的抗HIV藥物或藥物組合。篩選可以針對(duì)幾乎所有的HIV病毒株進(jìn)行，不論其基因型或嗜性。產(chǎn)生的結(jié)果可以幫助HIV感染病人的醫(yī)生監(jiān)測(cè)HIV藥物抗性，優(yōu)化藥物療法和使用最有效的藥物“混合物”來治療病人。通過使用對(duì)于各病人定制的這種藥物混合物，并在治療過程中調(diào)節(jié)，醫(yī)生可以成功地防止HIV病毒產(chǎn)生藥物抗性。另外，醫(yī)生可避免由于用無效的抗HIV藥物治療病人產(chǎn)生的不必要的副作用和藥物毒性。
這些方法中使用的重組細(xì)胞有豐富和穩(wěn)定的來源，以及培養(yǎng)細(xì)胞的方便，使人們能用本部分提供的方法以高通量篩選方式可能測(cè)試比其它方法更多的藥物混合物組合。另外，由于病人樣品中所含的HIV病毒可能攜帶藥物抗性株，常規(guī)的藥物篩選不能有效發(fā)現(xiàn)最佳的藥物療法。通過使用該部分提供的方法，可通過設(shè)計(jì)和徹底測(cè)試針對(duì)HIV病毒或HIV受體的不同組分的不同藥物組合，容易鑒別出最有效的藥物方案。
5.篩選組合物的抗HIV活性的方法本發(fā)明還提供了篩選不知道具有抗HIV活性的組合物的抗HIV活性的方法。如本文所用的，組合物指任何物質(zhì)的組合物，包括單個(gè)分子、大分子例如蛋白質(zhì)和核苷酸，或兩種或多種分子或大分子的組合。在一個(gè)優(yōu)選例中，該方法包括取一種重組細(xì)胞培養(yǎng)物，它們(a)能細(xì)胞分裂，(b)表達(dá)CD4受體和一種或多種額外的細(xì)胞表面受體，這些受體是HIV病毒感染必需的，(c)使HIV復(fù)制并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中的未感染細(xì)胞，和(d)含有引入重組細(xì)胞的報(bào)道系列，其含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在HIV病毒感染重組細(xì)胞后由HIV病毒基因組表達(dá)的；使細(xì)胞培養(yǎng)物與含有HIV病毒的樣品接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)物與樣品接觸之前或之后加入對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物不知道有抗HIV活性的一種或多種藥物；和檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因的表達(dá)水平的變化。
用于該方法的重組細(xì)胞的培養(yǎng)物可以是任何具有上述特征的細(xì)胞。第I節(jié)所述的重組細(xì)胞是具有這些特征的細(xì)胞的例子，可用于該方法。
藥物可以是任何天然來源或合成產(chǎn)生的抗HIV候選藥物。藥物可以是任何靶向HIV病毒的任何組分的任何藥物，例如RT抑制劑、蛋白酶抑制劑、針對(duì)HIV mRNA或病毒RNA基因組的反義和核酶寡核苷酸、TAR序列或RRE(rev應(yīng)答元件)的假目標(biāo)、可溶性CD4、Gag或Env蛋白突變體等競爭性抑制劑、和與HIV受體或共同受體結(jié)合，阻止HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的藥物。
可通過檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，或細(xì)胞培養(yǎng)物中報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變，來檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞的報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
在一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在病毒復(fù)制?？赏ㄟ^檢測(cè)最初被感染的細(xì)胞，和檢測(cè)不是最初被感染的細(xì)胞培養(yǎng)物中細(xì)胞表達(dá)水平的改變來檢測(cè)病毒復(fù)制。
在另一個(gè)實(shí)施例中，檢測(cè)表達(dá)水平的改變包括比較樣品中的表達(dá)水平與一種或多種對(duì)照樣品中的表達(dá)水平。例如，與含HIV病毒的樣品接觸，但不與任何潛在的抗HIV藥物的樣品接觸的重組細(xì)胞培養(yǎng)物作為陰性對(duì)照，而與含HIV病毒和已知具有抗HIV活性的一種或多種藥物的樣品接觸的重組細(xì)胞培養(yǎng)物作為陽性對(duì)照。使用合適的對(duì)照，報(bào)道基因表達(dá)的調(diào)節(jié)與藥物的抗HIV效力有更好的相關(guān)性。
應(yīng)注意的是，報(bào)道基因調(diào)控可以上調(diào)或下調(diào)。因此，報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變可以是報(bào)道基因表達(dá)的增加或減少。
在該實(shí)施例的一個(gè)變化中，細(xì)胞培養(yǎng)物與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸前接觸。另外，細(xì)胞可以與一種或多種抗HIV藥物在與含有HIV病毒的樣品接觸后接觸，并培養(yǎng)足夠的時(shí)間，使HIV病毒發(fā)生復(fù)制。這對(duì)于針對(duì)藥物測(cè)試前樣品中含有低滴度HIV病毒的初始擴(kuò)增特別有利。
上述方法可用于高通量篩選針對(duì)各種含HIV樣品的抗HIV候選藥物，尤其是由組合化學(xué)產(chǎn)生的化合物文庫。這些方法可以能夠快速制備和處理多孔板(例如96孔培養(yǎng)板)中的細(xì)胞的任何方式進(jìn)行。測(cè)試藥物的儲(chǔ)存液以及其它試驗(yàn)試劑可手工制備，所有的隨后移液、稀釋、混合、洗滌、培養(yǎng)、樣品讀數(shù)和數(shù)據(jù)收集可用市售的機(jī)器人移液裝置、自動(dòng)化工作站、分析儀器檢測(cè)試驗(yàn)產(chǎn)生的信號(hào)。這些檢測(cè)儀的例子包括但不限于分光光度計(jì)、比色計(jì)、光度計(jì)、熒光計(jì)和測(cè)量放射性同位素衰變的裝置。
上述方法用于高通量篩選特別合算，因?yàn)橹亟M細(xì)胞是無限增殖的，容易培養(yǎng)，與原代人細(xì)胞，例如PBMC細(xì)胞相比更穩(wěn)定。另外，可通過在比色或熒光平板閱讀機(jī)上檢測(cè)96-孔培養(yǎng)板中的報(bào)道基因產(chǎn)物的水平直接監(jiān)測(cè)多種藥物的多個(gè)劑量對(duì)HIV感染和復(fù)制的影響。
6.本發(fā)明重組細(xì)胞系的構(gòu)建用于本發(fā)明的重組細(xì)胞系可用許多方法構(gòu)建?？梢酝ㄟ^用單獨(dú)攜帶報(bào)道基因和受體基因的幾個(gè)質(zhì)粒和載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞構(gòu)建重組細(xì)胞系。另外，可用同時(shí)攜帶報(bào)道基因和受體基因的單個(gè)質(zhì)?；虿荒軓?fù)制的病毒載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，產(chǎn)生重組細(xì)胞。
a)宿主細(xì)胞系可用各種各樣的無限增殖的細(xì)胞系構(gòu)建本發(fā)明所用的重組細(xì)胞系。在一個(gè)實(shí)施例中，重組細(xì)胞是無限增殖的腫瘤細(xì)胞。使用腫瘤細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)之一是腫瘤細(xì)胞經(jīng)歷較快的細(xì)胞周期或分裂，進(jìn)一步增強(qiáng)培養(yǎng)物中病毒的復(fù)制和擴(kuò)增。無限增殖的腫瘤細(xì)胞系可從原代腫瘤細(xì)胞或建立的腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生。另外，還可用正常細(xì)胞，只要這些細(xì)胞是無限增殖的。例子包括但不限于人轉(zhuǎn)化的原代胚腎293細(xì)胞，用端粒酶基因轉(zhuǎn)染無限增殖的原代細(xì)胞(Bodnar，A.G.等(1998)Science 279349-352)和通過SV40轉(zhuǎn)化無限增殖的正常細(xì)胞。這些無限增殖的細(xì)胞可無限增殖，從而提供豐富和經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞來源。
可任選的，天然但低水平表達(dá)CD4或共同受體(例如CXCR4和CCR5)的細(xì)胞也可作為本發(fā)明的宿主細(xì)胞。例如，可用表達(dá)CD4和低水平的CXCR4的Hud78或CME-NKR細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的重組細(xì)胞。
b)報(bào)道基因和受體基因的單獨(dú)載體為了建立接受HIV感染的細(xì)胞系，首先可將CD4和一種或多種其它HIV受體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或引入無限增殖的細(xì)胞。一種或多種其它HIV受體優(yōu)選包括CXCR4和CCR5受體。然后將檢測(cè)HIV感染的報(bào)道基因轉(zhuǎn)移到表達(dá)CD4和一種或多種HIV受體的宿主細(xì)胞中。
據(jù)信CD4受體是HIV進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要受體。近來發(fā)現(xiàn)特定的趨化因子受體，例如CXCR4和CCR5受體在介導(dǎo)HIV進(jìn)入和對(duì)不同靶細(xì)胞的嗜性中起重要作用(Berger，E.A.(1997)AIDS 11，增刊.aS3-S16；Dimitrov，D.S.(1997)Cell91721-730綜述)。HIV病毒的巨噬細(xì)胞嗜性(M-嗜性)株可在原代CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中復(fù)制，并利用β-趨化因子受體CCR5和較不常見的使用CCR3受體。T細(xì)胞系嗜性(T-嗜性)HIV株也可以在原代CD4+T細(xì)胞中復(fù)制，但可以在體外通過α-趨化因子受體CXCR4感染建立的CD4+T細(xì)胞系。除了CXCR4許多T-嗜性株還可使用CCR5。趨化因子受體樣HIV共同受體STRL33在活化的外周血淋巴細(xì)胞和T-細(xì)胞系中表達(dá)，功能可作為HIV-1和SIV的M-嗜性、T-嗜性和雙重嗜性株的Env蛋白的進(jìn)入輔助因子。還用許多體外試驗(yàn)鑒別了其它HIV共同受體，包括趨化因子受體CCR2b、CCR3、CCR8和CX3CR1，以及幾種趨化因子受體樣孤獨(dú)受體蛋白，例如GPR15/BOB和STRL33/BONZO。這些HIV共同受體中的幾個(gè)或一組可以介導(dǎo)不同的HIV病毒株進(jìn)入宿主細(xì)胞。通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或?qū)⑦@些受體引入無限增殖細(xì)胞系，宿主細(xì)胞系可接受具有廣譜嗜性的HIV株。特別是，通過無限增殖的細(xì)胞與表達(dá)已知參與與HIV感染的細(xì)胞表面受體的細(xì)胞，例如T細(xì)胞或單核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞-細(xì)胞融合，可用各種HIV受體同時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)無限增殖的細(xì)胞。
通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或?qū)⑦x定組的共同受體引入無限增殖的細(xì)胞系或在細(xì)胞表面選擇性的表達(dá)某些共同受體，可設(shè)計(jì)接受一些HIV病毒株但不接受其它HIV病毒株的細(xì)胞系。例如，可以在重組細(xì)胞中選擇性表達(dá)T嗜性病毒株所需的CXCR4共同受體，使感染HIV的T嗜性株。同時(shí)，M-嗜性株需要CCR5共同受體來感染細(xì)胞。通過使重組細(xì)胞不表達(dá)CCR5共同受體，在M-嗜性株的存在下重組細(xì)胞系可選擇性檢測(cè)T-嗜性株。
為了高靈敏度水平的檢測(cè)HIV感染，在表達(dá)CD4受體和一種或多種其它HIV受體的無限增殖細(xì)胞系中引入具有高誘導(dǎo)率的“分子開關(guān)”。分子開關(guān)是一種報(bào)道基因，當(dāng)細(xì)胞被HIV感染時(shí)誘導(dǎo)其表達(dá)?？捎酶鞣N報(bào)道基因，包括lacZ(編碼β-半乳糖苷酶)、熒光素酶、CAT基因、SEAP基因和編碼熒光蛋白，例如綠色熒光蛋白(GFP)、增強(qiáng)的藍(lán)色熒光蛋白(EBFP)、增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP)和增強(qiáng)的青色熒光蛋白(ECFP)的基因。
報(bào)道基因的啟動(dòng)子區(qū)含有堿性啟動(dòng)子和一個(gè)或多個(gè)HIV特異性增強(qiáng)子序列的拷貝。堿性啟動(dòng)子可以是任何細(xì)胞或病毒啟動(dòng)子，例如β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、胰島素啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、HIV-LTR(HIV長末端重復(fù))、Rous肉瘤病毒RSV-LTR和猿病毒SV40啟動(dòng)子的堿性啟動(dòng)子區(qū)。HIV特異性增強(qiáng)子序列可以是通過與一種或多種HIV特異性基因產(chǎn)物直接或間接相互作用，調(diào)節(jié)報(bào)道基因表達(dá)的任何序列。例如，可用HIV反式激活蛋白Tat的效應(yīng)元件(TAR)增強(qiáng)報(bào)道基因的表達(dá)。在HIV感染后，病毒基因組表達(dá)的Tat與TAR序列結(jié)合，并與堿性啟動(dòng)子偶聯(lián)，誘導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)?？蛇B接一個(gè)以上的TAR序列拷貝，來進(jìn)一步增強(qiáng)報(bào)道基因的表達(dá)，提高誘導(dǎo)率。
另外，宿主細(xì)胞表達(dá)的HIV基因產(chǎn)物、DNA結(jié)合蛋白(例如GAL4 DNA結(jié)合域)、反式激活蛋白(例如衍生自單純皰疹病毒的VP16反式激活蛋白結(jié)構(gòu)域)之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用可誘導(dǎo)報(bào)道基因的表達(dá)。HIV特異性基因產(chǎn)物與DNA結(jié)合蛋白以及反式激活蛋白結(jié)合后，通過將DNA-結(jié)合蛋白與反式激活蛋白大致接近來實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的重建。重新構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子然后可通過堿性啟動(dòng)子上游的增強(qiáng)子序列(例如GAL4增強(qiáng)子序列)和DNA結(jié)合蛋白之間的特異性結(jié)合來活化下游報(bào)道基因表達(dá)。
應(yīng)注意的是，報(bào)道基因的表達(dá)還可以由HIV特異性蛋白質(zhì)間接地調(diào)控。例如，報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄可在強(qiáng)啟動(dòng)子，例如噬菌體T7或SP6啟動(dòng)子的控制下，而T7或SP6聚合酶的表達(dá)由含有堿性啟動(dòng)子和HIV特異性增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子調(diào)控。HIV特異性蛋白與增強(qiáng)子序列結(jié)合后，增強(qiáng)了T7或SP6聚合酶的表達(dá)。結(jié)果細(xì)胞中表達(dá)的T7或SP6聚合酶可以與報(bào)道基因上游的T7或SP6啟動(dòng)子結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞中報(bào)道基因的表達(dá)。
可用各種方法將基因引入無限增殖的細(xì)胞?？墒褂玫姆椒ǖ睦影ǖ幌抻诹姿徕}介導(dǎo)的定向轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體輔助的轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。HIV受體還可以通過與在細(xì)胞表面表達(dá)這些受體的天然細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，引入宿主細(xì)胞?？捎每股?，例如潮霉素、G418、半胱甲酯(zeocin)等，或基于單純皰疹病毒tk基因篩選表達(dá)轉(zhuǎn)染的基因的細(xì)胞克隆。各受體基因的表達(dá)可以通過Western印跡法用抗體檢測(cè)蛋白質(zhì)，通過Western印跡法用核苷酸探針檢測(cè)RNA，或通過熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)用細(xì)胞表面表達(dá)的HIV受體作為抗原加以證實(shí)。
圖1A和1B表示含有HIV受體基因和報(bào)道基因的質(zhì)粒載體的兩個(gè)例子。
如圖1A所示，CD4和HIV共同受體是以相對(duì)方向從SV40早和晚啟動(dòng)子表達(dá)的。編碼CD4和CCR5受體的基因是從SV40早啟動(dòng)子通過SA位點(diǎn)處的剪切機(jī)制表達(dá)的。編碼CXCR4和潮霉素抗性的基因是作為雙順反子從SV40晚啟動(dòng)子表達(dá)的，其中Hygro被內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)隔開。潮霉素抗性基因的表達(dá)能夠篩選細(xì)胞。質(zhì)粒還含有原核復(fù)制起始點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因，用于細(xì)菌中DNA增殖。報(bào)道基因由一個(gè)分開的質(zhì)粒攜帶，該質(zhì)粒含有第二個(gè)選擇基因(tk)。兩個(gè)質(zhì)?？赏瑫r(shí)或依次共轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞?？捎每股睾Y選表達(dá)所有轉(zhuǎn)染的基因的細(xì)胞克隆。
編碼HIV受體和共同受體的基因也可用圖1B所示的兩個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體表達(dá)。受體基因由小鼠白血病病毒(MLV)LTR-啟動(dòng)子表達(dá)，各蛋白質(zhì)是由剪切的mRNA或IRES(B.1)表達(dá)的。報(bào)道序列由第二個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶。報(bào)道基因的轉(zhuǎn)錄是在MLV LTR啟動(dòng)子的反向，除去了增強(qiáng)子序列，以防從LTR啟動(dòng)子(B.2)失控表達(dá)。
采用包裝的細(xì)胞系，例如基于293T細(xì)胞系的穩(wěn)定和瞬時(shí)生產(chǎn)品系包裝將這些載體包裝入感染性但不可復(fù)制的病毒顆粒。包裝細(xì)胞系表達(dá)所有必需的蛋白質(zhì)Gag、Pol和Env，它們是包裝、加工、反轉(zhuǎn)錄和含有Psi包裝信號(hào)的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合必需的。
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染入包裝細(xì)胞系。然后，收集包裝細(xì)胞中產(chǎn)生的病毒顆粒，用于感染靶細(xì)胞。由于病毒顆粒是不能復(fù)制的，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶的基因穩(wěn)定整合入靶細(xì)胞基因組，并能在上游啟動(dòng)子控制下表達(dá)，而不產(chǎn)生感染性病毒顆粒。可用抗生素篩選表達(dá)所有轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因的細(xì)胞，并用Northern印跡法、Western印跡法或FACS證實(shí)。另外，可通過用攜帶HIV特異性基因，例如tat的修飾的腺病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物來篩選表達(dá)報(bào)道序列的細(xì)胞。
應(yīng)注意的是，還可以通過可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，例如四環(huán)素效應(yīng)元件TRE來控制HIV受體的表達(dá)。例如，一個(gè)或多個(gè)HIV共同受體可通過由Clontech提供的Tet-on和Tet-off表達(dá)系統(tǒng)的控制的表達(dá)選擇性呈現(xiàn)在細(xì)胞表面(Gossen，M.和Bujard，H.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895547-5551)。在Tet-on系統(tǒng)中，通過加入四環(huán)素衍生的強(qiáng)力霉素(Dox)激活基因表達(dá)，而在Tet-off系統(tǒng)中，去除四環(huán)素(Tc)或Dox啟動(dòng)基因表達(dá)。還可用任何可誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物基因表達(dá)系統(tǒng)。例子包括使用熱休克因子、類固醇激素、重金屬離子、佛波酯和干擾素，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中條件性表達(dá)基因的系統(tǒng)。
c)構(gòu)建重組細(xì)胞的重組載體系統(tǒng)重組載體系統(tǒng)還可用于將報(bào)道基因和受體基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中，以產(chǎn)生本發(fā)明的重組細(xì)胞。載體可以是質(zhì)?；虿《?。重組載體系統(tǒng)可由單個(gè)載體或多個(gè)重組載體組成。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用一個(gè)重組質(zhì)粒將報(bào)道基因和受體基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒含有所述報(bào)道序列含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，受體和共同受體的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
可用幾種非病毒方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中。非病毒方法的例子包括但不限于磷酸鈣沉淀、電穿孔、直接顯微注射、DNA-負(fù)荷的脂質(zhì)體和lipofectamine-DNA復(fù)合物、細(xì)胞超聲處理、用高速微粒的基因轟擊、和受體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。
在一個(gè)優(yōu)選例中，單載體系統(tǒng)是基于重組病毒，例如修飾或重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒。單病毒載體系統(tǒng)含有報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
重組病毒是優(yōu)選復(fù)制缺陷型或不可復(fù)制型。這些病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，將外源基因轉(zhuǎn)移到核，并在其中表達(dá)外源基因和病毒基因。病毒載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常比非病毒載體系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率高得多。
對(duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒，病毒基因組以非特異性方式整合入宿主基因組，并在轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞中穩(wěn)定、有效的表達(dá)外源基因和病毒基因。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼報(bào)道基因和受體基因的核酸插入病毒基因組中某些病毒序列的位置，產(chǎn)生復(fù)制缺陷型病毒。在含有g(shù)ag、pol和env基因但缺少LTR和psi組件的包裝細(xì)胞系中產(chǎn)生含有插入的基因的病毒顆粒。當(dāng)含有插入的基因的重組質(zhì)粒和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和psi序列一起被引入此細(xì)胞系(例如通過磷酸鈣沉淀)中，psi序列使重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物包裝入病毒顆粒中，然后分泌入培養(yǎng)基中。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，可任選地濃縮，并用于將報(bào)道基因和受體基因轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞，產(chǎn)生本發(fā)明的重組細(xì)胞。
在更多優(yōu)選例中，單載體系統(tǒng)是不可復(fù)制的重組腺病毒載體。與逆轉(zhuǎn)錄病毒相比，腺病毒載體的優(yōu)點(diǎn)之一是腺病毒DNA感染入宿主細(xì)胞不導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA可以游離形式復(fù)制，而沒有潛在的基因毒性。另外，腺病毒結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在廣泛擴(kuò)增后未檢測(cè)到基因組重排。腺病毒載體可感染各種細(xì)胞，不論其細(xì)胞周期階段。腺病毒載體已被安全地用于基因治療試驗(yàn)，其中病人耐受了滴注到肺中的1013個(gè)感染性顆粒。干燥成粉末的復(fù)制缺陷型腺病毒可安全運(yùn)輸和儲(chǔ)藏相當(dāng)長的時(shí)間，而不喪失其感染性。
腺病毒由于其中等大小的基因組、操作方便、高滴度、廣泛的靶細(xì)胞范圍和高感染性特別適用作為基因轉(zhuǎn)移載體。病毒基因組的兩端都含有100-200個(gè)堿基對(duì)的末端反向重復(fù)(ITL)，它們是病毒DNA復(fù)制和包裝必需的順式(cis)元件?；蚪M的早(E)和晚(L)區(qū)含有不同的轉(zhuǎn)錄單元，在病毒DNA復(fù)制開始時(shí)分開。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)和一些細(xì)胞基因。E2區(qū)(E2A和E2B)的表達(dá)導(dǎo)致病毒DNA復(fù)制所需的蛋白質(zhì)合成。這些蛋白質(zhì)參與DNA復(fù)制、晚基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉。晚基因的產(chǎn)物包括大部分病毒衣殼蛋白，它們僅在主要晚啟動(dòng)子(MLP)產(chǎn)生的一個(gè)主要轉(zhuǎn)錄物顯著加工后表達(dá)。MLP在感染晚期特別有效，所有該啟動(dòng)子產(chǎn)生的mRNA具有5′三分前導(dǎo)序列(TL)序列，使其成為翻譯的優(yōu)選mRNA。
不可復(fù)制的腺病毒載體的產(chǎn)生和增殖在輔助細(xì)胞系中進(jìn)行。輔助細(xì)胞系表達(dá)必需基因，例如E1、E2、E4或晚期基因，它們已從病毒載體中除去。輔助細(xì)胞系可衍生自人細(xì)胞系，例如人胚腎細(xì)胞(例如293細(xì)胞)、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。另外，輔助細(xì)胞可衍生自其它接受人腺病毒的哺乳動(dòng)物物種的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括例如Vero細(xì)胞或其它猴胚胎間充質(zhì)細(xì)胞或上皮細(xì)胞。
重組腺病毒載體可衍生自任何血清型或亞組A-F。C組的腺病毒5型可能是獲得不可復(fù)制的腺病毒載體以構(gòu)建本發(fā)明的重組細(xì)胞的優(yōu)選起始材料。這是由于腺病毒5型是人腺病毒，已知其大量的生物化學(xué)和遺傳信息，而且它在歷史上已被用作大多數(shù)使用腺病毒作為載體的構(gòu)建。
重組腺病毒載體含有報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，受體和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
重組腺病毒載體可以是不可復(fù)制的，但攜帶腺病毒包裝信號(hào)。腺病毒載體攜帶編碼HIV受體，例如CD4、CXCR4和CCR5的基因，和報(bào)道基因，例如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、熒光蛋白(例如GFP和BFP)、分泌的胚胎堿性磷酸酶(SEAP)、激素和細(xì)胞因子。載體還可以攜帶編碼白細(xì)胞介素(例如IL-2和IL-12)的基因，它使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞更容易受到HIV感染。載體還可以攜帶真核聚腺苷酸化序列，例如SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)或牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化位點(diǎn)。
編碼HIV受體的基因可置于位于腺病毒載體靠近左側(cè)末端重復(fù)(L-TR)的E1區(qū)組成型(例如CMV和SV40)或可誘導(dǎo)(例如四環(huán)素誘導(dǎo)性)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。報(bào)道基因可置于重組腺病毒載體的右側(cè)末端，例如在重組腺病毒載體靠近右側(cè)末端重復(fù)(R-TR)的E4區(qū)中。
應(yīng)注意的是，各種HIV受體可以用一個(gè)攜帶所有HIV受體的重組病毒載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。另外，受體基因也可由多個(gè)重組病毒載體，各含有一個(gè)或多個(gè)HIV受體攜帶，賦予細(xì)胞不同向性。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生上述重組細(xì)胞的試劑盒。該試劑盒含有重組載體和能被載體感染的細(xì)胞系，重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系中的細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法。該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；和在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法。該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；和在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，重組病毒載體含有報(bào)道序列，它含有報(bào)道基因，其表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞后由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，該受體和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
另外，本發(fā)明的重組細(xì)胞可以通過用含有報(bào)道序列的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已表達(dá)CD4和一種或多種HIV共同受體，例如CXCR4和CCR5的細(xì)胞產(chǎn)生。CD4和一種或多種HIV共同受體可以足夠使細(xì)胞被HIV病毒生產(chǎn)性感染的水平表達(dá)。
可任選的，本發(fā)明的重組細(xì)胞還可以通過用表達(dá)CD4和一種或多種HIV共同受體的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已含有報(bào)道序列的細(xì)胞產(chǎn)生。在HIV病毒感染后，報(bào)道序列上報(bào)道基因的表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)(例如Tat)激活。
本發(fā)明的重組細(xì)胞還可通過用表達(dá)CD4或至少一種HIV共同受體，其水平足夠促始HIV病毒在細(xì)胞中生產(chǎn)性感染的重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)已含有報(bào)道序列和CD4或至少一種HIV共同受體的細(xì)胞產(chǎn)生。在HIV病毒感染后，報(bào)道序列上報(bào)道基因的表達(dá)被對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)(例如Tat)激活。
本發(fā)明的重組病毒載體還可用于轉(zhuǎn)導(dǎo)天然但以低水平表達(dá)CD4或共同受體(例如CXCR4和CCR5)的細(xì)胞。例如，Hud78或CME-NKR細(xì)胞表達(dá)CD4和低水平的CXCR4。這些細(xì)胞可被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些重組病毒載體含有CD4或其它在培養(yǎng)物中產(chǎn)生細(xì)胞的HIV感染必需的共同受體。另外，細(xì)胞可被上述實(shí)施例所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。通過在細(xì)胞中引入含有HIV受體的載體，HIV的表達(dá)水平可通過使用強(qiáng)啟動(dòng)子(例如CMV和SV40啟動(dòng)子)顯著提高，以超表達(dá)受體。
本發(fā)明的重組病毒載體還可用于產(chǎn)生使用可誘導(dǎo)啟動(dòng)子在一段受控時(shí)間內(nèi)，或用腺病毒載體在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)受體的細(xì)胞。這使多樣和有效的產(chǎn)生各種各樣的細(xì)胞，可用于檢測(cè)細(xì)胞中的HIV感染，篩選抗HIV藥物和檢測(cè)細(xì)胞中的HIV藥物抗性。
總的說來，本發(fā)明提供了新穎的重組載體和細(xì)胞系，以及使用這些細(xì)胞系的方法。這些方法便利、合算廉并對(duì)HIV感染和復(fù)制的檢測(cè)超靈敏。這些方法對(duì)臨床前藥物研究和開發(fā)的高產(chǎn)量篩選，以及在臨床對(duì)抗HIV藥物抗性中設(shè)計(jì)更有效的抗-HIV藥物混合物非常有用。
實(shí)施例1.用HIV病毒生產(chǎn)性感染重組的HeLa細(xì)胞用人宮頸癌HeLa細(xì)胞建立重組細(xì)胞系。用表達(dá)載體(pRepD4R4)和載體(pTAR3Clac)以1∶1的比例共轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。如圖2A所示，表達(dá)載體pRepD4R4包括CD4受體基因和CXCR4受體基因，它們被IRES序列分開。如圖2B所示，載體pTAR3C1ac包括一報(bào)道序列，其含有包括3個(gè)TAR序列的拷貝和一個(gè)CMV堿性啟動(dòng)子，和lacZ報(bào)道基因，其表達(dá)是在啟動(dòng)子的控制下。通過在含有900μg/ml G418的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。所選的細(xì)胞的各克隆隨后一式兩份培養(yǎng)，用低滴度HIV儲(chǔ)液感染其中的一份。低滴度HIV原種是從被B-細(xì)胞嗜性HIV原病毒DNA(GRCSF株)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液收集而來的，在轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)3天。
感染儲(chǔ)液中所含的HIV后，病毒基因組表達(dá)的Tat蛋白質(zhì)與TAR結(jié)合，并誘導(dǎo)lacZ報(bào)道基因表達(dá)，產(chǎn)生高水平的β-半乳糖苷酶。鑒定表達(dá)β-半乳糖苷酶并被X-gal染成藍(lán)色的細(xì)胞克隆，增殖最深的藍(lán)色集落未感染的一份中的細(xì)胞。這些被選擇的細(xì)胞稱為HeLaD4R4細(xì)胞。
測(cè)試所述構(gòu)建的HeLaD4R4細(xì)胞的HIV感染。表達(dá)人CD4受體的HeLaT4細(xì)胞(也稱為HT4)用作為對(duì)照。HeLaD4R4細(xì)胞和HeLaT4細(xì)胞在DMEM和5％胎牛血清中培養(yǎng)。
在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長的細(xì)胞，并用從上述HIV原病毒轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的1毫升稀釋的HIV原種(約10感染顆粒/mL)感染。細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)，在最初感染后1、3、4、5天用1％甲醛固定2分鐘。細(xì)胞用0.5％甲醛固定2分鐘，并用X-gal(0.5％)37℃染色過夜。由于lacZ報(bào)道基因產(chǎn)物β-半乳糖苷酶將底物從無色轉(zhuǎn)化成深藍(lán)色，作為被HIV感染的結(jié)果，表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞顯現(xiàn)明顯的藍(lán)色。
圖3A顯示在接觸HIV3天后的對(duì)照HeLaT4細(xì)胞。如所見的，幾乎所有HeLa細(xì)胞不被染成藍(lán)色，只有極少數(shù)細(xì)胞被染上淡蘭色。這表明沒有HIV CXCR4的細(xì)胞幾乎不被感染，HIV病毒不在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制。
圖3B-2E顯示在1、3、4和5天后的HeLaD4R4。如圖3B所見，在1天后可輕易檢測(cè)到感染，如藍(lán)細(xì)胞所示。如圖3C和3D分別所示，在3和4天后逐漸有更多的細(xì)胞被感染并染成藍(lán)色。如圖3E所示，孔中幾乎所有的細(xì)胞被感染并在5天后被染成深藍(lán)色。
圖3B-3E所示的結(jié)果表明約10個(gè)HIV病毒顆粒最初感染一些細(xì)胞后，HIV能夠進(jìn)行生產(chǎn)性感染，即感染一個(gè)完全接受病毒復(fù)制的細(xì)胞并產(chǎn)生子代病毒顆粒(Stevenson，M.AIDS 11增刊.aS25-S33)。另外，感染的細(xì)胞似乎維持正常形態(tài)，即維持與培養(yǎng)板的底物結(jié)合，而不是變圓并與板分離。
圖3E所示的結(jié)果特別重要，因?yàn)樽畛跫拥綐悠分械腍IV病毒顆粒能在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制并散播感染其它最初未被培育的細(xì)胞(與圖3B和3E比較)。這與僅僅由于細(xì)胞分裂而使染成藍(lán)色的細(xì)胞增加是明顯相反的。
圖3F顯示另一個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中加入AZT(100μg/mL)來抑制HIV復(fù)制和感染。如圖3F所見，在AZT存在下感染4天后，僅幾簇細(xì)胞被感染并染成藍(lán)色。稀疏的藍(lán)色細(xì)胞簇最有可能是幾個(gè)被加到孔中的HIV病毒顆粒最初感染的細(xì)胞分裂得到的細(xì)胞。
通過將圖2F與圖3B-3E比較，可以看到AZT能有效作為抗-HIV藥物，因?yàn)閳?bào)道基因的表達(dá)由于AZT的存在顯著下降。圖3F與3B-3E中的結(jié)果的比較是一個(gè)例子，說明如何用本發(fā)明檢測(cè)HIV藥物抗性和篩選組合物的抗HIV活性。
2.HIV診斷的方法提供了在樣品中檢測(cè)HIV的例子。該方法可用于診斷被HIV感染的病人。根據(jù)該方法，將重組細(xì)胞接種到多孔板中。將少量要測(cè)試的病人血清分成幾份加到孔中。在培養(yǎng)2-4天后，處理細(xì)胞，根據(jù)所用的報(bào)道基因的類型分析結(jié)果。例如，當(dāng)lacZ基因用作重組細(xì)胞的報(bào)道基因時(shí)，用含有β-半乳糖苷酶的底物X-Gal、低濃度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的處理溶液溫和地固定細(xì)胞，而不滅活報(bào)道蛋白。當(dāng)綠色熒光蛋白(GFP)基因作為重組細(xì)胞的報(bào)道基因時(shí)，在UV顯微鏡下直接觀察細(xì)胞。存在發(fā)射綠色熒光的細(xì)胞表明細(xì)胞被樣品中所含的HIV病毒感染。通過使用GFP作為報(bào)道基因，可直接在培養(yǎng)過程中的任何時(shí)間直接監(jiān)測(cè)HIV復(fù)制，而不用固定和處理細(xì)胞，以確保足夠的HIV病毒在培養(yǎng)物中復(fù)制。
可用上述診斷試驗(yàn)作為HIV感染病人的單獨(dú)測(cè)試，或與HIV藥物抗性和其它HIV診斷測(cè)試結(jié)合。
可用陽性對(duì)照因子確保重組細(xì)胞對(duì)HIV感染有反應(yīng)?？捎脭y帶編碼HIV反式激活蛋白Tat的HIV tat基因的缺陷型流感病毒株作為陽性對(duì)照因子。用流感病毒作為載體將HIV tat基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，模擬HIV感染。HIV本身不能理想的用作陽性對(duì)照，因?yàn)镠IV不夠穩(wěn)定，容易喪失活性，因此病毒不能長期儲(chǔ)藏。相反，可將流感病毒干燥成粉末，并長期儲(chǔ)藏。另外，該流感病毒株衍生自一種流感病毒株(腺病毒5型)，它是病毒復(fù)制缺陷型，因此廣泛用作陽性對(duì)照更安全。
3.檢測(cè)HIV藥物抗性的方法提供了一個(gè)如何實(shí)施檢測(cè)HIV藥物抗性的方法的例子。將重組細(xì)胞接種到多孔平板的各孔中。一式兩份的孔中含有各種要測(cè)試的抗HIV藥物。將少量病人血清加到各孔中，培養(yǎng)數(shù)天。培養(yǎng)2-4天后，處理細(xì)胞并根據(jù)所用的報(bào)道基因類型分析結(jié)果。例如，當(dāng)lacZ基因用作重組細(xì)胞的報(bào)道基因時(shí)，用含有β-半乳糖苷酶的底物X-Gal、低濃度甲醛(1％)和戊二醛(0.1％)的處理溶液溫和地固定細(xì)胞，而不滅活報(bào)道子蛋白。對(duì)于定量分析，可用ONPG試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞提取物測(cè)定β-Gal的水平。當(dāng)綠色熒光蛋白(GFP)基因用作重組細(xì)胞的報(bào)道基因時(shí)，在UV顯微鏡下直接觀察細(xì)胞。為了定量分析，用FACS分揀熒光細(xì)胞，并測(cè)定表達(dá)GFP報(bào)道基因的細(xì)胞數(shù)。
如果含有特定藥物的孔中的細(xì)胞以足夠的水平表達(dá)報(bào)道基因，表明樣品中所含的HIV病毒在測(cè)試的劑量下對(duì)于藥物是抗性的，病毒復(fù)制并在抗HIV藥物存在下在重組細(xì)胞中傳播感染。
未加入血清樣品的孔可用作陰性對(duì)照?？蓪?duì)各測(cè)試的藥物進(jìn)行陰性對(duì)照。還可對(duì)于各測(cè)試的藥物進(jìn)行陽性對(duì)照，例如使用實(shí)施例2所述的陽性對(duì)照因子(攜帶HIV tat基因的腺病毒)，從確保重組細(xì)胞功能正常。
4.確定病人血清中病毒負(fù)荷的方法提供了一個(gè)如何確定病人血清中病毒負(fù)荷的方法。將約1毫升病人血清逐步稀釋，例如1∶10、1∶100、1∶1000等，加到含有重組細(xì)胞的孔中。仍誘導(dǎo)孔中重組細(xì)胞的報(bào)道基因表達(dá)的最高稀釋度是HIV在病人血清中的滴度(濃度)。當(dāng)病毒負(fù)荷變低，可進(jìn)行更精細(xì)的稀釋步驟來更精確地確定病人血清中病毒顆粒的數(shù)目。
該方法可用于確定每毫升病人血清中存在多少病毒顆粒。由于培養(yǎng)物中的重組細(xì)胞對(duì)甚至一個(gè)病毒顆粒也是敏感的，因此該方法可檢測(cè)僅由一個(gè)病毒顆粒引起的感染，因此適合檢測(cè)含有低滴度HIV的病人樣品，甚至每毫升病人血清僅幾個(gè)病毒顆粒。這樣的高靈敏度對(duì)于監(jiān)測(cè)抗HIV藥物治療的過程是重要的。與“超靈敏”的基于PCR的試驗(yàn)(僅能檢測(cè)每毫升病人血清數(shù)百個(gè)或更多病毒顆粒)相比，該方法更靈敏，而且可用于檢測(cè)樣品中滴度低得多的HIV。這對(duì)于檢測(cè)抗HIV藥物治療后，當(dāng)病毒滴度低于常規(guī)HIV檢測(cè)法的可檢測(cè)水平時(shí)，病人樣品中的HIV病毒特別重要。
5.篩選抗HIV藥物的方法在此描述了一種進(jìn)行高通量抗HIV藥物篩選的方法的例子。為了篩選新的抗HIV藥物，將重組細(xì)胞接種到多孔培養(yǎng)板，例如96-孔板中。在各孔中加入要測(cè)試抗HIV活性的藥物。在各孔中加入少量HIV原種，使各孔中的細(xì)胞被約10個(gè)病毒顆粒感染。在培養(yǎng)數(shù)日后，在比色或熒光平板閱讀機(jī)上分析孔中的細(xì)胞。將孔與一個(gè)或多個(gè)含有重組細(xì)胞和病毒但不含藥物的孔比較。含有藥物的孔中報(bào)道基因表達(dá)的抑制表明藥物在所測(cè)試的劑量具有抗HIV活性。一旦鑒別出潛在的抗HIV藥物，可重復(fù)測(cè)試從進(jìn)一步證實(shí)該藥物的抗HIV活性。
6.重組腺病毒載體的構(gòu)建通過使用攜帶受體序列和報(bào)道基因的穿梭質(zhì)粒或載體構(gòu)建本發(fā)明的重組腺病毒載體。
圖6A說明一種含有人CD4、CXCR4和CCR5受體的穿梭質(zhì)粒(pLAd.R5-D4-X4)。穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4含有包括左側(cè)長末端重復(fù)L-TR的腺病毒基因組的左側(cè)末端和腺病毒包裝信號(hào)(β)。用多基因表達(dá)盒和CMVie啟動(dòng)子替換腺病毒的E1區(qū)。
將編碼CD4、CXCR4和CCR5受體的基因通過在SA位點(diǎn)的剪切機(jī)制和通過內(nèi)部核糖進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)置于CMVie啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4還含有SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)和原核復(fù)制起始點(diǎn)，以及氨芐青霉素抗性基因，用于細(xì)菌中DNA增殖。
圖4B顯示另一種含有報(bào)道序列的穿梭質(zhì)粒(pPAdMS/Repo)。穿梭質(zhì)粒pRAdMS/Repo含有包括右側(cè)長末端重復(fù)R-TR的腺病毒基因組的右側(cè)末端。大部分E4區(qū)域(除了orf6)被包括含HIV TAR的啟動(dòng)子和報(bào)道基因，例如GFP、SEAP、Luc和LacZ的報(bào)道序列替換。報(bào)道基因的表達(dá)可被HIV的Tat蛋白質(zhì)激活。質(zhì)粒pRAdMS/Repo還含有牛生長激素(BGH)聚腺苷酸化位點(diǎn)，以及原核復(fù)制起始點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因，用于細(xì)菌中DNA增殖。
圖5A和5B說明另一種用于構(gòu)建重組腺病毒載體的設(shè)計(jì)。如圖5A說明的，穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-X4攜帶人CXCR4和CCR5受體。穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-X4含有包括左側(cè)長末端重復(fù)L-TR的腺病毒基因組的左側(cè)末端和腺病毒包裝信號(hào)(β)。用多基因表達(dá)盒和CMVie啟動(dòng)子替換腺病毒的E1區(qū)。將編碼CXCR4和CCR5受體的基因通過在SA位點(diǎn)的剪切機(jī)制置于CMVie啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4還含有SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)和原核復(fù)制起始點(diǎn)，以及氨芐青霉素抗性基因，用于細(xì)菌中DNA增殖。
圖5B說明一種含有人CD4基因的穿梭質(zhì)粒(pPAdCD4)。穿梭質(zhì)粒pPAdCD4含有包括右側(cè)長末端重復(fù)R-TR的腺病毒基因組的右側(cè)末端。CD4的表達(dá)在CMVie啟動(dòng)子的控制下。質(zhì)粒pPAdCD4還含有BGH聚腺苷酸化位點(diǎn)和原核復(fù)制起始點(diǎn)以及氨芐青霉素抗性基因，用于細(xì)菌中DNA增殖。編碼人HIV受體(如CD4、CXCR4和CCR5受體)的基因可在這兩種質(zhì)粒pPAdCD4和pLAd.R5-X4之間互換。在另一種設(shè)計(jì)中，重組腺病毒載體僅攜帶受體基因和共同受體基因。該載體可與重組細(xì)胞系聯(lián)合使用，該細(xì)胞系含有被HIV蛋白質(zhì)(例如Tat)可誘導(dǎo)啟動(dòng)子(例如TAR)控制的報(bào)道基因。相反，攜帶報(bào)道基因的載體可與天然或重組細(xì)胞系聯(lián)合使用，該細(xì)胞系含有編碼HIV受體(CD4)和共同受體(例如CXCR4和CCR5)的基因。
重組腺病毒基因組是由兩個(gè)穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo裝配的，它們分別攜帶腺病毒基因組的左側(cè)末端和右側(cè)末端。分別用限制性酶，例如XbaI和EcoRI消化穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo。
如圖6所示，分離了對(duì)應(yīng)于這兩個(gè)穿梭質(zhì)粒pLAd.R5-D4-X4和pRAdMS/Repo的腺病毒的左側(cè)末端和右側(cè)末端的片段，并與腺病毒基因組的中間部分(腺病毒骨架)連接。
然后，將連接的載體基因組DNA轉(zhuǎn)染入表達(dá)腺病毒的E1蛋白的293HK細(xì)胞。在E1蛋白存在下，去除E1的載體基因組可復(fù)制并包裝成病毒顆粒，即產(chǎn)生本發(fā)明的重組腺病毒載體。
重組腺病毒載體可作為凍干粉末長期保存和運(yùn)輸。重組腺病毒載體可用于檢測(cè)臨床樣品中的HIV存在，用于高通量抗HIV藥物篩選和監(jiān)測(cè)HIV藥物抗性。
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權(quán)利要求
1.一種重組病毒載體，其特征在于，該載體含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述病毒載體是不能復(fù)制的。
3.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述受體基因表達(dá)被HIV特異性蛋白質(zhì)上調(diào)。
4.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述受體基因表達(dá)被HIV特異性蛋白質(zhì)下調(diào)。
5.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)是HIV反式激活蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV反式激活蛋白是Tat。
7.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)選自Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。
8.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述報(bào)道序列含有包括HIV病毒特異性增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子序列，和報(bào)道基因，其表達(dá)通過HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列結(jié)合而調(diào)控。
9.如權(quán)利要求8所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV特異性反式激活蛋白是Tat，而所述HIV特異性增強(qiáng)子序列含有至少一個(gè)TAR序列的拷貝。
10.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)通過HIV特異性蛋白質(zhì)和重組細(xì)胞中存在的反式激活蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控報(bào)道序列的表達(dá)。
11.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)通過HIV特異性蛋白質(zhì)和重組病毒載體中所含的或存在于重組細(xì)胞中的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子之間的蛋白質(zhì)-核苷酸相互作用調(diào)控報(bào)道序列的表達(dá)。
12.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述報(bào)道基因選自β-半乳糖苷酶、熒光素酶、β-葡糖醛酸酶、綠色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌的胚胎堿性磷酸酶、激素和細(xì)胞因子。
13.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因選自CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB基因。
14.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因是CXCR4基因。
15.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因是CCR5基因。
16.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因包括CXCR4和CCR5。
17.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述載體還含有編碼白細(xì)胞介素的基因，所述基因使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)HIV感染更敏感。
18.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述編碼白細(xì)胞介素的基因是編碼白細(xì)胞介素-2或白細(xì)胞介素-12的野生型基因或重組基因。
19.如權(quán)利要求1所述的重組病毒載體，其特征在于，所述載體是重組腺病毒載體。
20.如權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體的E1區(qū)被受體序列替換，保留E1啟動(dòng)子來表達(dá)受體序列。
21.如權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，其特征在于，所述包括重組腺病毒載體的E1啟動(dòng)子的E1區(qū)被外源啟動(dòng)子和受體序列替換，其中外源啟動(dòng)子表達(dá)受體序列。
22.如權(quán)利要求21所述的重組病毒載體，其特征在于，所述外源啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
23.如權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，其特征在于，所述報(bào)道序列位于重組腺病毒載體的右側(cè)末端。
24.如權(quán)利要求23所述的重組病毒載體，其特征在于，所述報(bào)道序列位于重組腺病毒載體的E4或E3區(qū)。
25.如權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體含有腺病毒包裝信號(hào)。
26.如權(quán)利要求19所述的重組病毒載體，其特征在于，所述重組腺病毒載體含有真核聚腺苷酸化序列。
27.如權(quán)利要求26所述的重組病毒載體，其特征在于，所述真核聚腺苷酸化序列是牛生長激素或SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)。
28.一種重組質(zhì)粒，其特征在于，該質(zhì)粒以可操縱性結(jié)合含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的；和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
29.一種試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有重組病毒載體和能被所述載體感染的細(xì)胞系，所述重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
30.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒存在的方法，其特征在于，該方法包括取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物；和在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述病毒載體是不能復(fù)制的。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述受體基因表達(dá)被HIV特異性蛋白質(zhì)上調(diào)。
33.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述受體基因表達(dá)被HIV特異性蛋白質(zhì)下調(diào)。
34.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)是HIV反式激活蛋白。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述HIV反式激活蛋白是Tat。
36.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)選自Tat、Rev、Vpr、Vpx、Vif、Vpu、Nef、Gag、Env、RT、PR和IN。
37.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述報(bào)道序列含有包括HIV病毒特異性增強(qiáng)子序列的啟動(dòng)子序列，和報(bào)道基因，其表達(dá)通過HIV特異性反式激活蛋白與HIV特異性增強(qiáng)子序列結(jié)合而調(diào)控。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述HIV特異性反式激活蛋白是Tat，而所述HIV特異性增強(qiáng)子序列含有至少一個(gè)TAR序列的拷貝。
39.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)通過HIV特異性蛋白質(zhì)和重組細(xì)胞中存在的反式激活蛋白之間的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)控報(bào)道序列的表達(dá)。
40.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述HIV特異性蛋白質(zhì)通過HIV特異性蛋白質(zhì)和重組病毒載體中所含的或存在于重組細(xì)胞中的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子之間的蛋白質(zhì)-核苷酸相互作用調(diào)控報(bào)道序列的表達(dá)。
41.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述報(bào)道基因選自β-半乳糖苷酶、熒光素酶、β-葡糖醛酸酶、綠色熒光蛋白、藍(lán)色熒光蛋白、黃色熒光蛋白、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、分泌的胚胎堿性磷酸酶、激素和細(xì)胞因子。
42.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因選自CXCR4、CCR5、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR8、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CX3CR1、STRL33/BONZO和GPR15/BOB基因。
43.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因是CXCR4基因。
44.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因是CCR5基因。
45.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述一種或多種共同受體基因包括CXCR4和CCR5。
46.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體還含有編碼白細(xì)胞介素的基因，所述基因使轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞對(duì)HIV感染更敏感。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述編碼白細(xì)胞介素的基因是編碼白細(xì)胞介素-2或白細(xì)胞介素-12的野生型基因或重組基因。
48.如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述載體是重組腺病毒載體。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述重組腺病毒載體的E1區(qū)被受體序列替換，保留E1啟動(dòng)子來表達(dá)受體序列。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述包括重組腺病毒載體的E1啟動(dòng)子的E1區(qū)被外源啟動(dòng)子和受體序列替換，其中外源啟動(dòng)子表達(dá)受體序列。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述外源啟動(dòng)子是CMV啟動(dòng)子。
52.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述報(bào)道序列位于重組腺病毒載體的右側(cè)末端。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，所述報(bào)道序列位于重組腺病毒載體的E4或E3區(qū)。
54.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述重組腺病毒載體含有腺病毒包裝信號(hào)。
55.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述重組腺病毒載體含有真核聚腺苷酸化序列。
56.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于，所述真核聚腺苷酸化序列是牛生長激素或SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)。
57.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種重組細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD4或HIV共同受體；和在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，HIV病毒的基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因或至少一種在細(xì)胞中基本不表達(dá)的HIV共同受體基因，所述CD4基因或HIV共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
58.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞表達(dá)報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染培養(yǎng)物中細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
59.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD4或HIV共同受體，和一種報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染培養(yǎng)物中的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種受體序列，含有CD4基因或至少一種在細(xì)胞中基本不表達(dá)的HIV共同受體基因，所述CD4基因或HIV共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
60.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述細(xì)胞表達(dá)CD4或HIV共同受體，所述CD4基因或HIV共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，該重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是由培養(yǎng)物中感染細(xì)胞后的HIV病毒的基因組表達(dá)的。
61.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；和在培養(yǎng)物中加入多種重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，多種重組病毒載體中的每一種含有一種報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被多種重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，或一種受體序列，含有CD4基因或至少一種HIV共同受體基因，所述CD4基因或HIV共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被多種重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞。
62.一種產(chǎn)生重組細(xì)胞用于檢測(cè)樣品中HIV病毒的存在的方法，其特征在于取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，所述重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述受體基因和共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；使所述細(xì)胞培養(yǎng)物與要分析樣品中HIV病毒的存在的樣品接觸；和檢測(cè)培養(yǎng)物中細(xì)胞報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
63.一種檢測(cè)樣品中HIV藥物抗性的方法，其特征在于，該方法包括取一種細(xì)胞培養(yǎng)物；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，所述重組病毒載體含有一種報(bào)道序列，其含有報(bào)道基因，所述基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，所述蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，和一種受體序列，含有CD4基因和一種或多種共同受體基因，所述共同受體基因的表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；用含有HIV的樣品感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種或多種抗HIV藥物；和檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)報(bào)道基因的表達(dá)水平的改變。
全文摘要
提供了用于檢測(cè)HIV和監(jiān)測(cè)HIV藥物抗性的重組表達(dá)載體和方法。該方法包括采集細(xì)胞培養(yǎng)物；在培養(yǎng)物中加入重組病毒載體以轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，所述重組病毒載體含有報(bào)道序列和受體序列，所述報(bào)道序列含有報(bào)道基因，該基因的表達(dá)由對(duì)HIV病毒特異性的蛋白質(zhì)調(diào)控，該蛋白質(zhì)是在感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的培養(yǎng)物中的細(xì)胞后，由HIV病毒的基因組表達(dá)的，所述受體序列含有CD4和一種或多種共同受體基因，其表達(dá)促使生產(chǎn)性感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，并使感染了轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的HIV病毒復(fù)制，并感染被重組病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物中未感染的細(xì)胞；用含有HIV的樣品感染轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞；在細(xì)胞培養(yǎng)物中加入一種或多種抗－HIV藥物；并檢測(cè)細(xì)胞中報(bào)道基因表達(dá)水平的變化。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1452661SQ01808419
公開日2003年10月29日 申請(qǐng)日期2001年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月26日
發(fā)明者董劍云 申請(qǐng)人:Musc研究發(fā)展基金會(huì)