專利名稱：具有改變的特性的變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親代Termamyl樣α-淀粉酶的變體(突變體)，這些變體具有α淀粉酶的活性，并且在如下幾方面的性質(zhì)中，顯示出至少一種與所述親代α淀粉酶有所不同底物特異性，底物結(jié)合性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對(duì)氧化的穩(wěn)定性，Ca2+依賴性，比活性，和溶解度，特別是在生產(chǎn)與應(yīng)用環(huán)境下。
背景技術(shù)：
α淀粉酶(α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)組成一組催化淀粉和其它直鏈和支鏈1，4-糖苷鍵寡糖和多糖水解的酶。
在現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)中，在發(fā)酵、純化、回收過程的中和產(chǎn)物配制中可出現(xiàn)高蛋白濃度。
在發(fā)酵過程中，蛋白的濃度取決于所用的宿主細(xì)胞。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，蛋白濃度一般為0.1克/升發(fā)酵液以上。而在芽孢桿菌中大量重組生產(chǎn)α-淀粉酶時(shí)，蛋白濃度可高達(dá)250克/升發(fā)酵液。經(jīng)過純化，蛋白濃度可以達(dá)到大約1000克/升水平。這樣的高濃度導(dǎo)致不希望有的沉淀，而使得活性蛋白丟失。增加產(chǎn)物的強(qiáng)度是目前的趨勢(shì)，這種增加的強(qiáng)度可使酶在更重要的溶液中得以維持。蛋白溶液濃度的升高通常導(dǎo)致蛋白的沉淀，而沉淀的蛋白很難溶解成活性蛋白。
所以，本發(fā)明的目標(biāo)是提供具有以下改變的特性的α-淀粉酶，特別是使其溶解度增加。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明的目的是提供Termamyl樣淀粉酶的變體，它們與相應(yīng)親代α-淀粉酶即未突變的α淀粉酶相比，具有α-淀粉酶活性，并且相對(duì)于親代α-淀粉酶，顯示如下性質(zhì)中至少一種性質(zhì)的改變底物特異性，底物結(jié)合性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對(duì)氧化的穩(wěn)定性，Ca2+依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的溶解度。
命名法在本說(shuō)明書和權(quán)利要求中，用到了常用的1個(gè)字母和3個(gè)字母的氨基酸代碼。為便于參考，本發(fā)明中的α-淀粉酶變體用下面的命名法來(lái)描述原氨基酸位置取代的氨基酸依照這種命名法，舉例來(lái)說(shuō)，將第30位的丙氨酸取代為天冬酰胺，表示為Ala30Asn或A30N在相同位置缺失丙氨酸表示為Ala30*或A30*插入另外一個(gè)氨基酸殘基，如賴氨酸，表示為Ala30AlaLys或A30AK一段連續(xù)的氨基酸殘基的缺失，例如，第30-33位的氨基酸殘基被缺失，表示為(30-33)*或Δ(A30-N33)。
當(dāng)某一α-淀粉酶與其他α-淀粉酶相比有一個(gè)“缺失”，并在該位置上又插入了一個(gè)氨基酸則表示為*36Asp或*36D即，在第36位插入了天冬氨酸。
多突變被“+”號(hào)分隔開，如Ala30Asp+Glu34Ser或A30N+E34S代表第30位的丙氨酸和第34位的谷氨酸分別被天冬酰胺和絲氨酸取代。
當(dāng)一個(gè)或多個(gè)可選擇的氨基酸殘基插入同一給定位點(diǎn)時(shí)，表示為A30N，E或A30N或A30E另外，當(dāng)本文中鑒定出一個(gè)適于修飾的位點(diǎn)而沒有提示任何特定的修飾時(shí)，應(yīng)理解為任何一個(gè)氨基酸殘基都可以取代這個(gè)位點(diǎn)上現(xiàn)有的氨基酸。例如，當(dāng)提到在位點(diǎn)30的丙氨酸的修飾，而又沒有特別指明進(jìn)行何種修飾時(shí)，應(yīng)理解為該丙氨酸可以被缺失或被下列任何一個(gè)氨基酸所取代R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。
進(jìn)一步的，“A30X”代表下列任何一種取代
A30R，A30N，A30D，A30C，A30Q，A30E，A30G，A30H，A30I，A30L，A30K，A30M，A30F，A30P，A30S，A30T，A30W；A30Y，或A30V；或簡(jiǎn)寫為A30R，N，D，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F(xiàn)，P，S，T，W，Y，V。


圖1是五種親代Termamyl樣α-淀粉酶氨基酸序列的比對(duì)。最左邊的數(shù)字分別代表如下的氨基酸序列1SEQ ID NO4(SP722)2SEQ ID NO2(SP690)3SEQ ID NO10(BAN)4SEQ ID NO8(BLA)5SEQ ID NO6(BSG)。
圖2顯示由4個(gè)酶分子組成的晶格的格點(diǎn)視圖。每個(gè)分子都有8個(gè)相互作用的區(qū)域。
圖3顯示由4個(gè)酶分子組成的晶格的頂視圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是提供多肽(如酶，特別是α-淀粉酶)，這些多肽相對(duì)于所述親代多肽在如下性質(zhì)中有至少一種性質(zhì)改變底物特異性，底物結(jié)合性，底物裂解模式，熱穩(wěn)定性，pH/活性特征曲線，pH/穩(wěn)定性特征曲線，針對(duì)氧化的穩(wěn)定性，Ca2+依賴性，比活性和溶解度，特別是在制備條件下的溶解度。以下有對(duì)這些性質(zhì)的進(jìn)一步描述。
多肽本發(fā)明的多肽包括具有生物活性，抗微生物活性，和酶活性的蛋白質(zhì)。
涉及的酶活性包括蛋白酶，淀粉酶，CGT酶(CGTase)，甘露聚糖酶(mannanase)，產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)，葡萄糖淀粉酶，糖酶(carbohydrase)，轉(zhuǎn)移酶，裂解酶，氧化還原酶，脂肪酶的活性。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶是一種α-淀粉酶，特別是芽孢桿菌屬或曲霉屬α-淀粉酶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，芽孢桿菌屬α-淀粉酶是Termamyl樣淀粉酶。
具有生物活性的多肽包括紅細(xì)胞生成素(EPO)，TPO，生長(zhǎng)激素，調(diào)節(jié)肽，凝血因子，抗體等。
改變了溶解度的多肽蛋白(多肽)晶體是由系統(tǒng)排列的相同單位在三維結(jié)構(gòu)上緊密堆積而成。晶格可以包含一個(gè)或多個(gè)蛋白分子和大量的水。在三級(jí)結(jié)構(gòu)中也發(fā)現(xiàn)有離子例如鈣離子，鈉離子，氯離子，硫酸根離子和較大的分子如表面活性劑和底物(在晶體生長(zhǎng)過程中出現(xiàn))。雖然單個(gè)分子和單個(gè)原子很小，但相同單位的重復(fù)排列有利于進(jìn)行X-線衍射，從而為蛋白質(zhì)工程提供結(jié)構(gòu)信息。
相對(duì)于晶體來(lái)說(shuō)，沉淀物與聚集體是較小的單位，并且單個(gè)分子比在晶體中時(shí)更加無(wú)序。然而分子間的某些作用與在非常有序的晶體中所見相同，并因此可用三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和分子間信息來(lái)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)工程改造的、具有改變的特性的α-淀粉酶變體，所述特性特別是沉淀趨勢(shì)下降，即溶解度增加。
由于蛋白分子為球形和通常有不規(guī)則的表面結(jié)構(gòu)，晶格中會(huì)出現(xiàn)大孔，這些大孔被更加雜亂的溶劑如水占據(jù)。實(shí)際上，大多數(shù)蛋白質(zhì)表面都覆蓋著水層，這就是為什么通過X光晶體學(xué)方法得到的蛋白結(jié)構(gòu)與溶液中的蛋白結(jié)構(gòu)相同的一個(gè)原因。蛋白分子只在極少區(qū)域直接相互接觸，但溶劑介導(dǎo)的接觸可以象“膠水”一樣把晶體粘在一起。
通常，蛋白的溶解度受有機(jī)溶劑，鹽類如硫酸銨、氯化鈉和氯化鈣，和改變分子表面電荷的pH變化的影響。這些因素在將酶維持于溶液中的酶生產(chǎn)以及得到有效晶體的結(jié)晶學(xué)實(shí)驗(yàn)中都有涉及。大的對(duì)稱晶體需要緩慢增加蛋白質(zhì)濃度或者改變蛋白表面來(lái)加強(qiáng)分子間相互接觸而得到。
不是所有的蛋白都結(jié)晶為有效于X光晶體學(xué)確定方法的形式，但是，如果模板分子與目的分子的同源性足夠高，那么根據(jù)已有的三級(jí)結(jié)構(gòu)，可以建立精確的模型。
當(dāng)同源多肽(如酶，特別是以下定義的Termamyl樣α-淀粉酶)在三級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上相比較時(shí)，最主要差異在于分子表面。
盡管如此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，Termamyl樣α-淀粉酶(SP722，公開于SEQ IDNO4)表面的(直接或通過水分子間接)參與晶體形成的氨基酸殘基，在其它Termamyl樣α淀粉酶的晶體形成中(以下描述)也起了關(guān)鍵作用。
以下描述了用另一種Termamyl樣α淀粉酶結(jié)構(gòu)(SP722結(jié)構(gòu)，附錄1中公開)建立一個(gè)Termamyl樣α淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型的實(shí)例。
可以理解，本發(fā)明的概念與以下描述的建模方法可以推廣到所有的多肽，蛋白，特別是酶，如α淀粉酶。
SP722的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及對(duì)另一種Termamyl樣α淀粉酶三級(jí)結(jié)構(gòu)的建模本發(fā)明的α淀粉酶突變體是基于附錄1中SP722(SEQ ID NO4)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)的，其它多肽的突變體通過其它的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)。堿性Termamyl樣α-淀粉酶的結(jié)晶(SP722)(如SEQ ID NO4中顯示，也在美國(guó)專利5,824,531中有描述)是用懸滴法(本領(lǐng)域已知的方法)得到的，其三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))見本文附錄1。
其晶格包含4個(gè)酶分子，每個(gè)分子有8個(gè)相互作用的區(qū)域(圖2和圖3)。其中兩個(gè)區(qū)域被確定在酶的圍繞活性位點(diǎn)的一例，在α-淀粉酶上相對(duì)于活性位點(diǎn)的背側(cè)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大的區(qū)域。所述側(cè)還有兩個(gè)相互作用的區(qū)域，分子的頂部和底部各有一個(gè)相互作用的側(cè)面，形成“頂”對(duì)“底”的相互作用。
可以從圖2看出兩個(gè)環(huán)繞活性位點(diǎn)的相互作用區(qū)域與一個(gè)反向平行的相鄰分子上的兩個(gè)相同區(qū)域之間相互作用。同樣，背側(cè)區(qū)域與第三個(gè)反向平行的淀粉酶分子上的背側(cè)區(qū)域相接觸，但所有這些接觸都是由水分子介導(dǎo)。還可以從圖2、圖3看出相互作用的區(qū)域分散在整個(gè)分子。
另一堿性Termamyl樣α-淀粉酶模型AA560是基于附錄1公開的SP722的三級(jí)結(jié)構(gòu)建立的。α-淀粉酶AA560與模板淀粉酶(SP722)大約有87％相同，且序列對(duì)比排列不含有插入或缺失。在蛋白的生產(chǎn)過程中，即從發(fā)酵到純化的過程中，由于存在高度的同源性(同一性)，相同的對(duì)稱性和相同的晶體間相互作用，蛋白表面相同的相互作用區(qū)域參與蛋白濃度增加情況下的晶體形成和沉淀(參見背景章節(jié))。
在這些相互作用區(qū)域中構(gòu)建突變，表達(dá)并純化酶，用“材料與方法”章節(jié)中描述的方法，在實(shí)施例8和實(shí)施例9描述的不同條件下，對(duì)蛋白溶解度進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)可以應(yīng)用于如下Termamyl樣α-淀粉酶與SEQ ID NO12所示的Termamyl樣α-淀粉酶至少60％相同，優(yōu)選至少70％相同，更優(yōu)選80％相同，甚至更優(yōu)選85％相同，甚至更優(yōu)選90％相同，甚至95％相同，甚至97％相同，甚至99％相同。這些發(fā)現(xiàn)優(yōu)選適用于堿性Termamyl樣α-淀粉酶，特別是那些與SP722(SEQ ID NO4，在圖1的序列對(duì)比中顯示為1號(hào)的序列)比較時(shí)，在對(duì)比的一級(jí)結(jié)構(gòu)中沒有添加或缺失氨基酸的，長(zhǎng)度相同的堿性Termamyl樣α-淀粉酶。這些發(fā)現(xiàn)尤其可以用于以下堿性Termamyl樣α-淀粉酶SP690(SEQ ID NO2)，SP722(SEQ ID NO4)，AA560(SEQ ID NO12)，#707α-淀粉酶(SEQ ID NO13)，公開在KSM AP1378中的KSMAPE 1738α-淀粉酶，WO97/11324中公開的α-淀粉酶，或者它們的片段或截短形式。后面提到的這些堿性Termamyl樣α淀粉酶在上述相互作用的區(qū)域周圍有非常類似的晶體三級(jí)結(jié)構(gòu)，而且有485個(gè)氨基酸長(zhǎng)的相同的一級(jí)結(jié)構(gòu)。
與此不同的是，例如，Termamyl(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為4的序列)與SP722對(duì)比排列時(shí)，缺少兩個(gè)氨基酸殘基(1位和2位)；在174位和181-182位有缺口；在378-381位多了3個(gè)氨基酸殘基。
BAN(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為3的序列)與SP722對(duì)比缺少5個(gè)氨基酸殘基(1-4位和488位)；在174位、181-182位有缺口；在378-381位多了3個(gè)氨基酸殘基。
BSG(圖1的對(duì)比中序列號(hào)為5的序列)與SP722對(duì)比缺少1個(gè)氨基酸殘基(1位)；在489-519位多了31個(gè)氨基酸殘基。
KSM-K36和KSM-K38(EP1,022,334-A)與SP722對(duì)比缺少5個(gè)氨基酸殘基(1位和2位)，并在174位、181-182位有缺口。
AA180，AA20和Amrk385(丹麥專利申請(qǐng)PA2000 00347或PCT/DK01/00133)與SP722對(duì)比在261位多了一個(gè)氨基酸。
以下描述如何根據(jù)一種Termamyl樣α-淀粉酶建立另一種Termamyl樣α-淀粉酶的模型。在實(shí)施例4中描述了根據(jù)SP722建立AA560的模型。這種方法可以推廣用于其它的多肽如以上所提到的多肽。
Termamyl樣α-淀粉酶模型的建立WO96/23874提供了Termamyl樣α-淀粉酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))和X光晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，所述Termamyl樣α-淀粉酶由解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(BANTM)N末端的300個(gè)氨基酸殘基和地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(SEQ ID NO8)C末端301-483位氨基酸殘基組成。WO96/23874進(jìn)一步描述了，在分析親代Termamyl樣α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，建立該親代Termamyl樣α-淀粉酶的相對(duì)于其親代特性已改變的變體的模型的方法。
依照WO96/23874可以建立其它Termamyl樣結(jié)構(gòu)模型，該文獻(xiàn)納入本文作為參考。
至于獲得本發(fā)明的變體，如實(shí)施例1所述，基于SP722的三級(jí)結(jié)構(gòu)(附錄1中公開)設(shè)計(jì)了AA560的三級(jí)結(jié)構(gòu)(建模)。其它Termamyl樣α-淀粉酶(例如本文公開的)的結(jié)構(gòu)可以用類似的方法建立。
Termamyl樣α淀粉酶芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的多種α淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源(相同)的。多種芽孢桿菌α-淀粉酶的同一性可從以下表1中觀察到表1百分比同一性707 AP1378 BAN BSGSP690SP722 AA560 Termamyl707100.086.466.966.5 87.6 86.295.568.1AP1378 86.4 100.067.168.1 95.1 86.686.069.4BAN 66.967.1 100.065.6 67.1 68.866.980.7BSG 66.568.165.6 100.0 67.9 67.166.365.4SP690 87.695.167.167.9100.0 87.287.069.2SP722 86.286.668.867.1 87.2100.086.870.8AA560 95.586.066.966.3 87.0 86.8 100.068.3Termamyl68.169.480.765.4 69.2 70.868.3 100.0例如，地衣芽孢桿菌α淀粉酶包含SEQ ID NO8所示的氨基酸序列(可以TermamylTM商品名購(gòu)買到)，已發(fā)現(xiàn)其與包含SEQ ID NO10所示氨基酸序列的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶有約81％的同源性，與包含SEQ ID NO6所示氨基酸序列的嗜熱脂肪芽孢桿菌的α-淀粉酶有約65％的同源性。其它同源的α淀粉酶包括WO95/26397中公開的SP690和SP722，本文中SEQ ID NO2和SEQ ID NO4分別對(duì)它們進(jìn)行了的描述。其它淀粉酶有來(lái)源于芽孢桿菌的AA560α-淀粉酶(SEQ ID NO12)和來(lái)源于芽孢桿菌的#707α-淀粉酶(顯示在SEQ ID NO13)，Tsukamoto et al.，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，151(1988)，pp.25-31對(duì)此有描述。
KSM AP1378α-淀粉酶公開于WO97/00324(來(lái)自KAO公司)。另外，EP1,022,334中公開了K38和K38α-淀粉酶，對(duì)此本發(fā)明也有涉及。
其他同源的α-淀粉酶包括由EP0252666描述的地衣芽孢桿菌菌株(ATCC27811)產(chǎn)生的α-淀粉酶，以及WO91/00353和WO94/18314中所確定的α-淀粉酶。其它商品化的Termamyl樣α-淀粉酶包括用以下商品名稱出售的產(chǎn)品OptithermTM和TakathermTM(Solvay出品)；MaxamylTM(Gist-brocades/Genencor出品)，Spezym AATM和SpezymeΔAATM(Genencor出品)，還有KeistaseTM(Daiwa出品)，PurastarTMST 5000E，PURASTRATMHPAML(Genencor Int.出品)。
由于這些α淀粉酶的結(jié)構(gòu)同源性，所以它們被認(rèn)為屬于同一類α-淀粉酶，即“Termamyl樣α-淀粉酶”。
因此，本文術(shù)語(yǔ)“Termamyl樣α-淀粉酶”意指那些在氨基酸水平上與TermamylTM，即具有本文SEQ ID NO8所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基本相同的α-淀粉酶。
換言之，以下所有具有本文SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，和13所示氨基酸序列的α-淀粉酶，被認(rèn)為是“Termamyl樣α-淀粉酶”。其它Termamyl樣α-淀粉酶是如下α-淀粉酶i)與上述SEQ ID NO2，4，6，8，10，12，和13所示氨基酸序列中至少一種氨基酸序列有至少60％，如至少70％，例如至少75％，或至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少97％，至少99％的同源性，和/或ii)由能與編碼上述α-淀粉酶的DNA序列(本說(shuō)明書中SEQ ID NO1，3，5，7，9，它們分別編碼本文SEQ ID NO2，4，6，8，10，12所示氨基酸序列)雜交的DNA序列編碼。
關(guān)于特性i)，同源性是兩個(gè)序列之間提示第一個(gè)序列從第二個(gè)序列衍生的同一性程度。同源性可通過本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序如GCG軟件包提供的GAP程序適當(dāng)確定(如上所述)。這時(shí)，Gap GCGv8可以用如下默認(rèn)參數(shù)缺口產(chǎn)生罰分為5.0，缺口延伸罰分為0.3，默認(rèn)得分矩陣，對(duì)核酸序列和蛋白質(zhì)序列分別為3.0和0.1。GAP用Needleman/Wunsch/Sellers方法進(jìn)行排列對(duì)比。
Termamyl(SEQ ID NO8)和另一種Termamyl樣α-淀粉酶的結(jié)構(gòu)對(duì)比可以用來(lái)確定其它Termamyl樣α-淀粉酶中等效的/相應(yīng)的位置。一種獲得所述結(jié)構(gòu)對(duì)比的方法是應(yīng)用GCG軟件包的Pile Up程序，采用缺口罰分默認(rèn)值，即缺口產(chǎn)生罰分用3.0，缺口延伸罰分用0.1。其它結(jié)構(gòu)對(duì)比方法包括疏水簇分析(Gaboriaud et al.，(1987)，F(xiàn)EBS LETTERS 224，pp.149-155)和反向穿梭(reverse threading)法(Huber，T；Tord，AE，PROTEIN SCIENCE Vol.7，No.1pp.142-149(1998)。
雜交用于鑒定多肽，如具有以上ii)特性的Termamyl樣α-淀粉酶的寡核苷酸探針，可以在所述α-淀粉酶的全部或部分核苷酸或氨基酸序列基礎(chǔ)上適當(dāng)制備。
雜交檢測(cè)的適當(dāng)條件包括在5×SSC中預(yù)浸泡，于～40℃，在含有20％甲酰胺，5×Denhardt溶液，50mM磷酸鈉，pH6.8，和50mg變性的超聲波處理的小牛胸腺DNA的溶液中預(yù)雜交1小時(shí)，然后于～40℃，在補(bǔ)充有100mM ATP的上述相同溶液中雜交18小時(shí)，再于40℃，用2×SSC，0.2％ SDS洗濾膜三次，每次30分鐘(低嚴(yán)緊度)，優(yōu)選在50℃(中等嚴(yán)緊度)，更優(yōu)選在65℃(高嚴(yán)緊度)，甚至更優(yōu)選在約75℃(極高嚴(yán)緊度)進(jìn)行洗滌。雜交方法的更多細(xì)節(jié)描述于Sambrook等，Molecular_CloningA Laboratory Manual，第二版Cold SpringHarbor，1989。
本文中，“衍生”一詞不僅指所述菌株產(chǎn)生或可誘導(dǎo)產(chǎn)生的α-淀粉酶，還指由分離自這種菌株的DNA序列編碼的α-淀粉酶和在所述DNA序列轉(zhuǎn)化的宿主生物中產(chǎn)生的α-淀粉酶。該術(shù)語(yǔ)還指由合成的和/或cDNA來(lái)源的DNA序列編碼的α-淀粉酶，其有所述α淀粉酶的可鑒別的特征。該術(shù)語(yǔ)也指親代α-淀粉酶的天然產(chǎn)生的變體，即天然產(chǎn)生的α-淀粉酶經(jīng)一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的修飾(插入，取代，缺失)后產(chǎn)生的變體。
親代Termamyl樣α-淀粉酶根據(jù)本發(fā)明，如上所述的所有Termamyl樣α-淀粉酶，都可以作為親代(即，骨架(backbone))α-淀粉酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，親代α-淀粉酶衍生自地衣芽孢桿菌，例如，上述那些α-淀粉酶之一，如具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的地衣芽孢桿菌α-淀粉酶。尤其優(yōu)選的親代α-淀粉酶是SP722α-淀粉酶和AA560α-淀粉酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，親代α-淀粉酶有一個(gè)或多個(gè)以下突變/取代Δ(R81-G182)；Δ(D183-G184)；Δ(D183-G184)+N195F；RR181Q+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+R181Q。
親代雜合體Termamyl樣α-淀粉酶親代α-淀粉酶(即骨架α-淀粉酶)也可以是雜合體α-淀粉酶，即包含來(lái)自至少兩種α-淀粉酶的部分氨基酸序列之組合的α-淀粉酶。
親代雜合體α-淀粉酶可以是這樣一種α-淀粉酶，在氨基酸序列同源性(同一性)和/或DNA雜交(如以上所確定的)基礎(chǔ)上，能確定其屬于Termamyl樣α-淀粉酶家族。在此情況下，雜合體α-淀粉酶通常由以下部分組成Termamyl樣α-淀粉酶的至少一部分和從微生物(細(xì)菌或真菌)和/或哺乳動(dòng)物來(lái)源的Termamyl樣α-淀粉酶或非Temamyl樣α-淀粉酶中選定的一種或多種其它的α-淀粉酶的部分。
所以，親代雜合體α-淀粉酶可包含來(lái)源于至少兩種Termamyl樣α-淀粉酶，或來(lái)源于至少一種Termamyl樣和至少一種非Termamyl樣細(xì)菌α-淀粉酶，或來(lái)源于至少一種Termamyl樣α-淀粉酶和至少一種真菌α-淀粉酶的部分氨基酸序列的組合。作為部分氨基酸序列的來(lái)源的Termamyl樣α-淀粉酶，可以是本文所涉及的那些具體Termamyl樣α-淀粉酶中的任何一種。
例如，親代α-淀粉酶可以包含來(lái)源于地衣芽孢桿菌菌株α-淀粉酶的C末端部分和來(lái)源于解淀粉芽孢桿菌菌株或嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株α-淀粉酶的N末端部分。例如，親代α-淀粉酶可包含地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的C末端部分至少430個(gè)氨基酸，并且可包含a)相當(dāng)于解淀粉芽孢桿菌具有SEQ ID NO10所示氨基酸序列的α-淀粉酶N末端37個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段，和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的α-淀粉酶C末端445個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段，或與該Termamyl序列相同的雜合體Termamyl樣α-淀粉酶，即SEQ ID NO8所示地衣芽孢桿菌α-淀粉酶，但其成熟蛋白的N末端35個(gè)氨基酸殘基，已被BAN(成熟蛋白)即SEQ ID NO10所示的解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶N末端33個(gè)殘基取代；或b)相當(dāng)于嗜熱脂肪芽胞桿菌具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的α-淀粉酶N末端68個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段和相當(dāng)于地衣芽孢桿菌具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的α-淀粉酶C末端415個(gè)氨基酸殘基的氨基酸片段。
另一種適合的親代雜合體α-淀粉酶是此前WO96/23874(出自NovoNordisk)中描述的，其由BAN，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶的N末端(成熟蛋白的1-300位氨基酸)和Termamyl的C末端(成熟蛋白的301-483位氨基酸)構(gòu)成。
改變的特性以下討論表現(xiàn)為本發(fā)明變體的突變和其所導(dǎo)致的所需特性改變(相對(duì)于親代Termamyl樣α-淀粉酶)之間的相互關(guān)系。
如上所述，本發(fā)明涉及特性改變的，特別是在生產(chǎn)條件下特性改變的Termamyl樣α-淀粉酶。
涉及到改變的特性時(shí)，尤其涉及的親代Termamyl樣α-淀粉酶是上述提到的親代Termamyl樣α-淀粉酶和親代雜合體Termamyl樣α-淀粉酶。以SP722α-淀粉酶作為起點(diǎn)，但例如Termamyl，BSG，BAN，AA560，SP690，AA180，KSM，AP1378，和#707，K38，和K36的相應(yīng)位點(diǎn)也應(yīng)理解為已公開。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體的溶解度已經(jīng)增加，尤其是在洗滌或清洗條件下。
本發(fā)明一方面涉及上述具有特性改變的變體。
第一方面，親代Termamyl樣α-淀粉酶的變體在選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)(用SEQ ID NO12的氨基酸編號(hào))包含改變R28，R118，N174；R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314；R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484，其中(a)所述每一改變是(i)在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個(gè)氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或(iii)用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，(b)變體有α淀粉酶活性和(c)每一位點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于具有SEQ ID NO12所示AA560氨基酸序列的親代Termamyl樣α-淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在SP722(SEQ ID NO4)中，這種相應(yīng)位點(diǎn)是R28；N94；L118；N125；Q174；R181；G182；D183；G184；A186；W189；N195，M202，Y298；N299；N302；S303；N306；A310；N314；K320；H324；Q345；F396，T400，W439，Q444；N445，K446，Q449，K458；N471；K484。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體有一個(gè)或多個(gè)如下突變/取代(用SEQID NO12的編號(hào))ΔG184；Δ(R181-G182)；Δ(D183-G184)；R28N，K；S94K；R118K；N125A，R，K；N174D；R181Q，E，K；G186R；W189R，K；N195F；M202L；Y298H，F(xiàn)；N299A；K302R；S303Q；N306G，D，R，K；R310A，K，Q，E，H，D，N；N314D；R320K；H324K；E345R，D，K，N；Y396F；R400T，K；W439R；R444K；N445K，Q；K446N；Q449E；R458K；N471E；N484Q。
優(yōu)選的雙重，三重和多重突變(以SEQ ID NO12為編號(hào)基礎(chǔ))包括Δ(D183-G184)+R181Q；Δ(D183-G184)+G186R；Δ(D183-G184)+N195F；Δ(D183-G184)+M202L；Δ(D183-G184)+G186R+N195F；Δ(D183-G184)+N195F+R400T；Δ(D183-G184)+N195F+W439R；Δ(D183-G184)+N195F+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+N484Q；Δ(D183-G184)+N195F+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+N484E；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+N471E；Δ(D183-G184)+N195F+H324K；Δ(D183-G184)+N195F+Y396F；Δ(D183-G184)+N195F+K446D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q；Δ(D183-G184)+N195F+R181E；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N；N445Q+K446N；N445Q+K446N+N484E；N445Q+K446N+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N484E；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N+N484E；
Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Y243F；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I；Δ(D183-G184)+N195F+E212R；Δ(D183-G184)+N195F+M116R；Δ(D183-G184)+N195F+K142H+D144H+R158H；Δ(D183-G184)+N195F+K142H+D144H；Δ(D183-G184)+N195F+R158H；Δ(D183-G184)+N195F+E345R；Δ(D183-G184)+N195F+W189R；Δ(D183-G184)+N195F+Y298H；Δ(D183-G184)+N195F+N299A；Δ(D183-G184)+N195F+K302R+S303Q；Δ(D183-G184)+N195F+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+Y298H+N299A+K302R+S303Q+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+N125A；Δ(D183-G184)+N195F+N125R；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A+Q311N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R320K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+K302N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R310A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N306D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306D；N174D+N314D；Δ(D183-G184)+N195F+N306D+R310H+E345D；
Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+W189R+S94K；Δ(D183-G184)+R181Q+W189R+S94K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+S94K；Δ(D183-G184)+N195F+R181K+N125R；Δ(D183-G184)+N195F+R181K+N125K；Δ(D183-G184)+N195F+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+W189R；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R444K+N445KΔ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125R+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+S94K+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N306R+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+N195F+R118K+R320K+R458K+R444K+N445K；Δ(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K；考慮的變體包括在實(shí)施例中提到的具體變體和上述突變與一種或多種如下突變/取代的進(jìn)一步組合Δ(D183-G184)；N195F；R181Q；G186R；M202L；V206F，L，M；N193S，T，P。
增加的溶解度當(dāng)把所有上述突變?nèi)缦滤鲇糜谝唤MTermamyl樣α-淀粉酶中的任何一種α-淀粉酶，都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生溶解度改變的Termamyl樣α-淀粉酶變體。
所以，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的變體是親代Termamyl樣α-淀粉酶的變體，其與親代Termamyl樣α-淀粉酶相比，溶解度已提高(如上定義)，并包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)的改變(用SEQ ID NO12進(jìn)行氨基酸編號(hào))R28，R118，N174，R181，G182，D183，G184，G186，W189，N195，M202，Y298，N299，K302，S303，N306，R310，N314，R320，H324，E345，Y396，R400，W439，R444，N445，K446，Q449，R458，N471，N484，其中
(a)所述每一改變是(i)在占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸下游插入一個(gè)氨基酸，(ii)缺失占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，或(iii)用另一氨基酸取代占據(jù)該位點(diǎn)的氨基酸，(b)變體有α淀粉酶活性和(c)每一位點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于具有SEQ ID NO12所示AA560氨基酸序列的親代Termamyl樣α-淀粉酶的氨基酸序列位點(diǎn)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明中溶解度增加的變體與親代α-淀粉酶相比具有一種或多種如下取代ΔG184；Δ(R181-G182)；Δ(D183-G184)；R28N，K；S94K；R118K；N125A，R，K；N174D；R181Q，E，K；G186R；W189R，K；N195F；M202L；Y298H，F(xiàn)；N299A；K302R；S303Q；N306G，D，R，K；R310A，K，Q，E，H，D，N；N314D；R320K；H324K；E345R，D，K，N；Y396F；R400T，K；W439R；R444K；N445K，Q；K446N；Q449E；R458K；N471E；N484Q。
在更優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明溶解度增加的變體(由“材料與方法”部分描述的方法之一確定)包括(以SEQ ID NO12為基礎(chǔ)編號(hào))Δ(D183-G184)+R181Q；Δ(D183-G184)+G186R；Δ(D183-G184)+N195F；Δ(D183-G184)+M202L；Δ(D183-G184)+G186R+N195F；Δ(D183-G184)+N195F+R400T；Δ(D183-G184)+N195F+W439R；Δ(D183-G184)+N195F+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+N484Q；Δ(D183-G184)+N195F+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+N484E；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+N471E；Δ(D183-G184)+N195F+H324K；Δ(D183-G184)+N195F+Y396F；
Δ(D183-G184)+N195F+K446D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q；Δ(D183-G184)+N195F+R181E；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N；N445Q+K446N；N445Q+K446N+N484E；N445Q+K446N+Q449E；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N484E；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+K446N；Δ(D183-G184)+N195F+R181E+N445Q+K446N+N484E；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+Y243F；Δ(D183-G184)+N195F+N445Q+K446N+V209I；Δ(D183-G184)+N195F+E212R；Δ(D183-G184)+N195F+M116R；Δ(D183-G184)+N195F+K142H+D144H+R158H；Δ(D183-G184)+N195F+K142H+D144H；Δ(D183-G184)+N195F+R158H；Δ(D183-G184)+N195F+E345R；Δ(D183-G184)+N195F+W189R；Δ(D183-G184)+N195F+Y298H；Δ(D183-G184)+N195F+N299A；Δ(D183-G184)+N195F+K302R+S303Q；Δ(D183-G184)+N195F+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+Y298H+N299A+K302R+S303Q+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+N125A；Δ(D183-G184)+N195F+N125R；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R310A+Q311N；
Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R320K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Q319K+R320D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+K302N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+E345N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+Y298F；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+R28N+R310A；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D+N306D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N128D；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N445Q+K446N+N306D；N174D+N314D；Δ(D183-G184)+N195F+N306D+R310H+E345D；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+W189R+S94K；Δ(D183-G184)+R181Q+W189R+S94K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+S94K；Δ(D183-G184)+N195F+R181K+N125R；Δ(D183-G184)+N195F+R181K+N125K；Δ(D183-G184)+N195F+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+N306G；Δ(D183-G184)+N195F+R181Q+W189R；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R444K+N445KΔ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N125R+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+S94K+R118K+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+R181Q+N195F+R118K+N306R+R320K+R458K；Δ(D183-G184)+N195F+R118K+R320K+R458K+R444K+N445K；Δ(D183-G184)+N195F+S94K+R118K+N306R+R320K+R458K；本發(fā)明的其它組合包括實(shí)施例中提到的具體組合和一種或多種如下取代N195F；R181Q；G186R；M202L；V206F，L，M；N193P。
穩(wěn)定性在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的穩(wěn)定性，尤其是在特別高的pH值(即pH8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的穩(wěn)定性(提高或降低)的重要突變(包括氨基酸取代和缺失)，包括“改變的特性”部分所列舉的任何一種突變。
Ca2+穩(wěn)定性改變的Ca2+穩(wěn)定性是指酶在Ca2+損耗的條件下穩(wěn)定性已得到改進(jìn)，即，提高或降低了穩(wěn)定性。在本發(fā)明的上下文中，那些獲得改變的Ca2+穩(wěn)定性，尤其是在特別高的pH值(即pH8-10.5)條件下，獲得改進(jìn)的Ca2+穩(wěn)定性(提高或降低的穩(wěn)定性)的重要突變(包括氨基酸取代和缺失)，包括“改變的特性”部分所列舉的任何一種突變。
比活性本發(fā)明另一方面，與獲得比活性改變，尤其在10-60℃溫度下，優(yōu)選20-50℃，尤其30-40℃溫度下增強(qiáng)或降低比活性的變體有關(guān)的重要突變(包括氨基酸取代和缺失)，包括“改變的特性”部分所列舉的任何突變。
本發(fā)明變體的一般突變那些能夠增加酶活性位點(diǎn)周圍流動(dòng)性(mobiliy)的突變(包括氨基酸的取代與缺失)是特別令人關(guān)注的。這可以通過破壞活性位點(diǎn)附近(即在優(yōu)選距離構(gòu)成活性位點(diǎn)的任何氨基酸殘基10，或8，或6，或4的范圍內(nèi))的穩(wěn)定作用而實(shí)現(xiàn)。
以下是降低側(cè)鏈大小的突變實(shí)例Ala突變?yōu)镚lyVal突變?yōu)锳la或GlyIle突變?yōu)長(zhǎng)eu，Val，Ala或GlyThr突變?yōu)镾er期望通過這些突變使活性位點(diǎn)區(qū)的柔性增加，這可用引入空腔或通過填充突變留下的空間的結(jié)構(gòu)重排來(lái)實(shí)現(xiàn)。
本發(fā)明的變體優(yōu)選除上述突變外還包含一種或多種修飾。因此，α-淀粉酶變體部分存在的一個(gè)或多個(gè)脯氨酸殘基被非脯氨酸殘基取代可能是有利的，所述非脯氨酸殘基可以是任何可能的天然產(chǎn)生的非脯氨酸殘基，優(yōu)選是丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或亮氨酸。
同樣，親代α-淀粉酶中一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基被非半胱氨酸殘基，如，絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、纈氨酸或亮氨酸取代可能是優(yōu)選的。
此外，本發(fā)明的變體或者只經(jīng)歷一種修飾，或者以任何上述修飾的組合方式被修飾，以使對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO10的185-209位氨基酸的氨基酸片段中存在的天冬氨酸和/或谷氨酸，各自被天冬酰胺和/或谷氨酰胺取代。在這些Termamyl樣α-淀粉酶中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO10序列185-209位氨基酸片段的氨基酸片段中存在的一個(gè)或多個(gè)賴氨酸殘基被精氨酸取代，也是人們所關(guān)注的。
可以理解，本發(fā)明包含引入二種或多種上述修飾的變體。
此外，在如下一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)引入突變可能是有利的(用SEQ ID NO10(TermamylTM)來(lái)編號(hào))M15，V128，A111，H133，W138，T149，M197，N188，A209，A210，H405，T412，尤其是如下單個(gè)，雙重，三重或多重突變M15X，特別是M15T，L；V128X，特別是V128E；H133X，特別是H133Y；N188X，特別是N188S，T，P；M197X，特別是M197T，L；A209X，特別是A209V；M197T/W138F；M197T/W138Y；M15T/H133Y/N188S；M15/V128E/H133Y/N188S；E119C/S130C；D124C/R127C；H133Y/T149I；G475R，H133Y/S187D；H133Y/A209V；在AA560中所述修飾對(duì)應(yīng)于L17X，特別是L17T；E130X；Y135X；W140X，特別是W140F，Y；T193X；特別是S，P；M202X，特別是M202T，L；V214X；涉及的突變組合包括
M202T/W140F；M202T/W140Y；L17T/T193S；L17T/N193P；E121C/S132C；N126C/Q129C；T151I；G480R。
制備本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法將突變引入基因的多種方法為本領(lǐng)域所知。在簡(jiǎn)短討論如何克隆α-淀粉酶編碼DNA序列后，以下討論在α-淀粉酶編碼序列的特定位點(diǎn)產(chǎn)生突變的方法。
克隆編碼α-淀粉酶的DNA序列編碼親代α-淀粉酶的DNA序列可以用本領(lǐng)域熟知的多種方法，從任何產(chǎn)生所需α-淀粉酶的細(xì)胞或微生物中分離出來(lái)。首先，從具有目的α-淀粉酶的生物中獲得染色體DNA和/或信使RNA，建立基因組DNA和/或cDNA文庫(kù)。然后，如果α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸探針，用于從所述生物中制備的基因組文庫(kù)中鑒定α-淀粉酶編碼克隆?；蛘撸阎?淀粉酶基因同源序列的標(biāo)記寡核苷酸探針用作探針，在較低嚴(yán)緊度的雜交和洗滌條件下，鑒定α-淀粉酶編碼克隆。
鑒定α-淀粉酶編碼克隆的另一種方法是將基因組DNA插入到表達(dá)載體，如質(zhì)粒，用所得基因組DNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化的α-淀粉酶陰性菌，然后，在含有α-淀粉酶底物的瓊脂培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)，以獲得能表達(dá)所要鑒定的α-淀粉酶的克隆。
另外，編碼酶的DNA序列還可以用已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如，亞磷酰胺法(如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters22，1981，pp.1859-1869所述)或Matthes等描述的方法(Matthes et a1.，The EMBO J.3，1984，pp.801-805)得到。在亞磷酰胺法中，寡聚核苷酸是例如用DNA自動(dòng)合成儀合成的，對(duì)其進(jìn)行純化，退火，連接，并克隆到合適的載體。
最后，DNA序列可以是采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制得的、基因組序列與合成的序列，合成的序列與cDNA來(lái)源的序列，或基因組序列與cDNA來(lái)源的序列的混合(適當(dāng)?shù)?，這些片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)DNA序列的各部分)。DNA序列還可以用特定引物通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)得到，如US4,683,202或R.K.Saiki et al.，Science239，1988，pp.487-491所述。
α-淀粉酶變體的表達(dá)根據(jù)本發(fā)明，可使用表達(dá)載體，以酶的形式表達(dá)通過上述方法，或通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法產(chǎn)生的編碼變體的DNA序列，所述表達(dá)載體一般包括編碼啟動(dòng)子，操縱子，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯起始信號(hào)的控制序列，并任選包括阻抑基因或多種激活基因。
攜有編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是能對(duì)其方便地進(jìn)行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經(jīng)常取決于導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自我復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在的載體，所述載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，所述載體包括例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外元件，微型染色體或人工染色體?；蛘?，載體可以是當(dāng)導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)可以整合至宿主細(xì)胞基因組，并與整合了該載體的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，DNA序列應(yīng)該與適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列可操作相連。啟動(dòng)子可以是在選定宿主細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，啟動(dòng)子可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。介導(dǎo)編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體之DNA序列轉(zhuǎn)錄，尤其是在細(xì)菌宿主中的轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動(dòng)子的例子是大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂酶基因dagA啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)麥芽糖淀粉酶基因(amyM)啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶(amyQ)啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子等。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，有用的啟動(dòng)子的例子是得自編碼下列酶的基因的啟動(dòng)子米曲霉TAKA淀粉酶，米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶，黑曲霉中性α-淀粉酶，黑曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑曲霉葡糖淀粉酶，米赫根毛霉脂肪酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶。
本發(fā)明的表達(dá)載體還含有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄終止子，在真核生物中，還含有與編碼本發(fā)明α-淀粉酶變體的DNA序列可操作相連的聚-腺苷酸化序列。終止和聚腺苷酸化序列可適當(dāng)?shù)氐米耘c啟動(dòng)子相同的來(lái)源。
載體可進(jìn)一步含有能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體也可含有選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物可以補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨芐青霉素，卡那霉素，氯霉素或四環(huán)素抗性。另外，載體可含有曲霉屬選擇標(biāo)記，如amdS，argB，niaD和sC，產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記，或者可通過WO91/17243中所述的共-轉(zhuǎn)化來(lái)完成選擇。
盡管細(xì)胞內(nèi)表達(dá)在某些方面(例如當(dāng)使用某些細(xì)菌作為宿主細(xì)胞時(shí))有利，但一般優(yōu)選在細(xì)胞外進(jìn)行表達(dá)。通常，本文所述的芽孢桿菌α-淀粉酶含有允許表達(dá)的蛋白酶分泌至培養(yǎng)基的前區(qū)(preregion)。必要時(shí)，該前區(qū)可被不同的前區(qū)或信號(hào)序列取代，通過取代編碼各個(gè)前區(qū)的DNA序列可以方便地實(shí)現(xiàn)此目的。
分別連接編碼α-淀粉酶變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體，啟動(dòng)子，終止子和其它元件，并將它們插入含有復(fù)制所需信息的適當(dāng)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，1989)。
含有上文所定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞可以有利地用作宿主細(xì)胞，以重組產(chǎn)生本發(fā)明的α-淀粉酶變體?？梢苑奖愕赝ㄟ^將編碼變體的本發(fā)明DNA構(gòu)建體(一個(gè)或多個(gè)拷貝)整合至宿主染色體，用所述DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。一般認(rèn)為整合是有利的，因?yàn)檎虾驞NA序列可以在細(xì)胞中更加穩(wěn)定地維持。根據(jù)常規(guī)方法，例如通過同源或異源重組可以將DNA構(gòu)建體整合至宿主染色體?；蛘撸捎门c不同類型的宿主細(xì)胞有關(guān)的上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物，如哺乳動(dòng)物或昆蟲的細(xì)胞，但優(yōu)選其為微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
適合的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)，解淀粉芽孢桿菌，凝結(jié)芽孢桿菌，環(huán)狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇云金芽孢桿菌，淺青紫鏈霉菌或鼠灰鏈霉菌，或革蘭氏陰性菌如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過，例如原生質(zhì)轉(zhuǎn)化或通過已知的方式用感受態(tài)細(xì)胞實(shí)現(xiàn)。
酵母生物可優(yōu)選糖酵母屬或裂殖酵母屬，例如釀酒酵母。絲狀真菌優(yōu)選屬于曲霉屬，例如，米曲霉或黑曲霉。真菌細(xì)胞可用一種方法轉(zhuǎn)化，該方法涉及原生質(zhì)形成、原生質(zhì)轉(zhuǎn)化、然后細(xì)胞壁以其本身已知的方式再生。曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適合方法如EP 238 023所述。
在另一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)本發(fā)明α-淀粉酶變體的方法，該方法包含在有利于變體生產(chǎn)的條件下培養(yǎng)如上所述宿主細(xì)胞以及從細(xì)胞和/或培養(yǎng)液中回收變體。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，并表達(dá)本發(fā)明α-淀粉酶變體的任何常規(guī)培養(yǎng)基。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基可以商購(gòu)，或者可根據(jù)公開的配方(例如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中所述的配方)生產(chǎn)。
通過眾所周知的方法，包括通過離心或過濾將培養(yǎng)基與細(xì)胞分開，利用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接著利用層析法，如離子交換層析，親和層析等，從培養(yǎng)基中方便地回收宿主細(xì)胞分泌的α-淀粉酶變體。
工業(yè)化應(yīng)用本發(fā)明的α淀粉酶變體有許多在工業(yè)應(yīng)用中有價(jià)值的特性。具體地，本發(fā)明的酶變體可以作為洗滌，清洗餐具，洗滌硬表面的洗滌劑組合物的成分。本發(fā)明的具有改變的特性的變體還可用于淀粉加工，特別是淀粉轉(zhuǎn)化，特別是淀粉的液化等過程(參見，例如US3,912,590，EP專利
發(fā)明者卡斯藤·安德森, 托本·V·博徹特, 比賈尼·R·尼爾森 申請(qǐng)人:諾維信公司