專利名稱：檢測和定量人p450分子種類的方法以及用于該方法的探針和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測和定量人P450分子種類的方法以及用于該方法的探針和試劑盒。
在開發(fā)新藥中，重要的是要了解人細(xì)胞色素P450的分子種類(下文簡稱“P450”)對施用新藥的作用(表達(dá)水平的變化)。這是因?yàn)槿绻鸓450分子種類的表達(dá)水平的變化是未知的，則不可能預(yù)測與新藥同時(shí)施用的藥物或另一物質(zhì)導(dǎo)致新藥的功效和副作用增加或減少，或者預(yù)測同時(shí)施用的藥物的功效和副作用增加或減少。因此，新藥的安全性不能得到證實(shí)。
所以，在藥物領(lǐng)域，如新藥開發(fā)，一直希望得到涉及P450分子種類的信息，尤其是單獨(dú)測定P450分子種類水平的技術(shù)以獲得涉及各個(gè)P450分子種類的信息。單獨(dú)測定分子種類的技術(shù)的開發(fā)將使下列行為成為可能，例如，容易地了解一種新藥與另一種藥的相互作用和該新藥對特異病狀中的機(jī)體的影響，以及獲得關(guān)于新藥的副作用的信息，由此確保其安全性。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是擴(kuò)增核酸眾所周知的方法。在PCR技術(shù)中，將RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-PCR)、競爭性RT-PCR等用于檢測和定量痕量的mRNA，并顯示它們的有效性。
近年來，使用PCR已經(jīng)建立了實(shí)時(shí)的定量檢測技術(shù)(TaqMan PCR，Genome Res.，6(10)，986(1996)，ABI PRISMTMSequence DetectionSystem，Applied Biosystem)。該技術(shù)采用特定的熒光-標(biāo)記的探針(TaqMan探針)測定核酸量。更具體而言，該技術(shù)采用下列原理例如，將在5’末端具有報(bào)道染料和3’末端具有淬火染料的熒光-標(biāo)記的探針與靶DNA退火，并將DNA進(jìn)行正常PCR。隨著延伸反應(yīng)進(jìn)行，從5’末端通過DNA聚合酶所擁有的5’-3’外切核酸酶活性水解探針。結(jié)果將5’末端的報(bào)道染料從3’末端的淬火染料分離，由此消除由兩個(gè)染料之間的空間所產(chǎn)生的FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移，由于兩個(gè)熒光染料的共振導(dǎo)致報(bào)道染料的能量水平降低，熒光強(qiáng)度減少)效應(yīng)，并增加了已受到淬火染料控制的報(bào)道染料的熒光強(qiáng)度。靶核酸通過測定熒光強(qiáng)度的增加可以實(shí)時(shí)方式被選擇地定量和檢測。
該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于其能在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)測試各種樣品，這是由于與使用常規(guī)PCR的檢測和定量技術(shù)不同，該技術(shù)不包括復(fù)雜步驟，如PCR后擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和分析電泳圖。
一般而言，當(dāng)在臨床測試中心等中進(jìn)行臨床測試時(shí)，必須在有限的時(shí)間內(nèi)檢查極大量的樣品。所以，對開發(fā)有效測試技術(shù)存在相當(dāng)?shù)囊?。?shí)時(shí)定量檢測技術(shù)是滿足該需求有希望的候選對象。
本發(fā)明人將他們的注意力轉(zhuǎn)向到使用PCR實(shí)時(shí)定量檢測技術(shù)上，并設(shè)想如果檢測技術(shù)可用于檢測人P450分子種類，則使用相同的儀器在相同的PCR條件下可單獨(dú)檢測和定量該分子種類。
然而，如上所述，目前已知有大約30個(gè)P450分子種類參與了化學(xué)物質(zhì)的代謝。盡管各個(gè)種類的mRNA序列是已知的，但是人們認(rèn)為找到寡核苷酸(用作引物對)是困難的，所述寡核苷酸相互之間不重疊，并且能足夠擴(kuò)增這些分子種類作為靶基因以及與所述靶基因的特定部分雜交。困難的還有設(shè)想在引物對之間的特定區(qū)域中組成探針，該探針在相同PCR條件下與靶基因的雜交速度比其引物更快，并且只特異于一個(gè)分子種類。具體而言，雖然兩個(gè)已知核苷酸序列的核酸之間雜交的容易度在一定程度上通過計(jì)算熔點(diǎn)(Tm)可估算出來，但是引物和基于估算而選擇的探針的組合在DNA測定中沒有必要帶來好的結(jié)果。所以，針對全部現(xiàn)有已知P450分子種類的每一個(gè)，期望獲得專家的許多嘗試實(shí)驗(yàn)來篩選用于實(shí)時(shí)PCR檢測的引物對和探針的組合，所述檢測能夠單獨(dú)測定其基因。
本發(fā)明的另一目的是提供用于上述方法的探針和引物對。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明人對P450分子種類反復(fù)進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和研究。結(jié)果是本發(fā)明人成功地找到了由引物對和探針組成的組，這些組特異于29個(gè)P450分子種類的特定基因，即引物對和探針的組能夠單獨(dú)地檢測和定量編碼分子種類的基因?；诖税l(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供了用于檢測和定量P450分子種類的探針，各個(gè)探針包含與下列基因區(qū)域(1)-(29)中的一種可雜交的寡核苷酸。
(1)CYP1A1基因第616-641位的區(qū)域(2)CYP1A2基因第884-909位的區(qū)域(3)CYP1B1基因第1176-1203位的區(qū)域或第785-812位的區(qū)域(4)CYP2A6/7基因第195-218位的區(qū)域(5)CYP2A6基因第40-69位的區(qū)域(6)CYP2A7基因第889-913位的區(qū)域(7)CYP2B6基因第533-560位的區(qū)域或第1175-1202位的區(qū)域(8)CYP2C8基因第375-400位的區(qū)域或第863-894位的區(qū)域(9)CYP2C9基因第913-888位的區(qū)域或第863-890位的區(qū)域(10)CYP2C18基因第1420-1444位的區(qū)域(11)CYP2C19基因第913-887位的區(qū)域或第863-894位的區(qū)域(12)CYP2D6基因第748-775位的區(qū)域(13)CYP2E1基因第1096-1117位的區(qū)域(14)CYP2F1基因第608-635位的區(qū)域(15)CYP2J2基因第485-508位的區(qū)域(16)CYP3A3/4基因第876-905位的區(qū)域(17)CYP3A4基因第946-918位的區(qū)域(18)CYP3A5基因第850-822位的區(qū)域(19)CYP3A7基因第850-819位的區(qū)域(20)CYP4A11基因第666-691位的區(qū)域或第241-266位的區(qū)域(21)CYP4B1基因第997-1024位的區(qū)域(22)CYP4F2基因第1182-1205位的區(qū)域(23)CYP4F3基因第1188-1212位的區(qū)域(24)CYP4F8基因第1341-1370位的區(qū)域(25)CYP11B1基因第1209-1234位的區(qū)域(26)CYP11B2基因第1209-1239位的區(qū)域(27)CYP17基因第1230-1255位的區(qū)域(28)CYP19基因第437-465位的區(qū)域(29)CYP27基因第197-224位的區(qū)域更具體而言，本發(fā)明提供上述探針，其進(jìn)一步包含報(bào)道染料和淬火染料，兩者皆附著于寡核苷酸上；在上述探針中寡核苷酸具有20-40個(gè)的堿基長度；在上述探針中寡核苷酸包含在SEQ ID NO1至SEQ IDNO35中的一個(gè)所示的序列；在上述探針中寡核苷酸由在SEQ ID NO1至SEQ ID NO35中的一個(gè)所示的序列組成。
進(jìn)一步，本發(fā)明提供檢測和定量一種或多種P450分子種類的試劑盒，所述試劑盒包含至少一組正向引物和反向引物的引物對以及探針，各個(gè)引物和探針包含與以下(1)-(35)中所示的基因區(qū)域可雜交的寡核苷酸。
(1)引物對CYP1A1基因的第589-610位區(qū)域和第685-664位區(qū)域；探針該基因的第616-641位區(qū)域(2)引物對CYP1A2基因的第860-880位區(qū)域和第951-931位區(qū)域；探針該基因的第884-909位區(qū)域(3)引物對CYP1B1基因的第1155-1174位區(qū)域和第1228-1207位區(qū)域；探針該基因的第1176-1203位區(qū)域(4)引物對CYP2A6/7基因的第173-193位區(qū)域和第254-236位區(qū)域；探針該基因的第195-218位區(qū)域(5)引物對CYP2A6基因的第20-48位區(qū)域和第171-146位區(qū)域；探針該基因的第40-69位區(qū)域(6)引物對CYP2A7基因的第861-884位區(qū)域和第1000-978位區(qū)域；探針該基因的第889-913位區(qū)域(7)引物對CYP2B6基因的第513-531位區(qū)域和第587-564位區(qū)域；探針該基因的第533-560位區(qū)域(8)引物對CYP2C8基因的第352-372位區(qū)域和第425-407位區(qū)域；探針該基因的第375-400位區(qū)域(9)引物對CYP2C9基因的第659-682位區(qū)域和第937-915位區(qū)域；探針該基因的第913-888位區(qū)域
(10)引物對CYP2C18基因的第1394-1414位區(qū)域和第1473-1451位區(qū)域；探針該基因的第1420-1444位區(qū)域(11)引物對CYP2C19基因的第858-880位區(qū)域和第943-921位區(qū)域；探針該基因的第913-887位區(qū)域(12)引物對CYP2D6基因的第720-740位區(qū)域和第912-891位區(qū)域；探針該基因的第748-775位區(qū)域(13)引物對CYP2E1基因的第1070-1088位區(qū)域和第1146-1123位區(qū)域；探針該基因的第1096-1117位區(qū)域(14)引物對CYP2F1基因的第585-606位區(qū)域和第744-723位區(qū)域；探針該基因的第608-635位區(qū)域(15)引物對CYP2J2基因的第460-482位區(qū)域和第592-571位區(qū)域；探針該基因的第485-508位區(qū)域(16)引物對CYP3A3/4基因的第850-872位區(qū)域和第1014-993位區(qū)域；探針該基因的第876-905位區(qū)域(17)引物對CYP3A4基因的第825-854位區(qū)域和第973-948位區(qū)域；探針該基因的第946-918位區(qū)域(18)引物對CYP3A5基因的第684-705位區(qū)域和第881-859位區(qū)域；探針該基因的第850-822位區(qū)域(19)引物對CYP3A7基因的第684-705位區(qū)域和第881-859位區(qū)域；探針該基因的第850-819位區(qū)域(20)引物對CYP4A11基因的第640-663位區(qū)域和第805-784位區(qū)域；探針該基因的第666-691位區(qū)域(21)引物對CYP4B1基因的第974-995位區(qū)域和第1081-1061位區(qū)域；探針該基因的第997-1024位區(qū)域(22)引物對CYP4F2基因的第1092-1113位區(qū)域和第1276-1256位區(qū)域；探針該基因的第1182-1205位區(qū)域(23)引物對CYP4F3基因的第1073-1094位區(qū)域和第1267-1246位區(qū)域；探針該基因的第1188-1212位區(qū)域(24)引物對CYP4F8基因的第1278-1299位區(qū)域和第1390-1371位區(qū)域；探針該基因的第1341-1370位區(qū)域
(25)引物對CYP11B1基因的第1158-1179位區(qū)域和第1415-1396位區(qū)域；探針該基因的第1209-1234位區(qū)域(26)引物對CYP11B2基因的第1167-1189位區(qū)域和第1429-1407位區(qū)域；探針該基因的第1209-1239位區(qū)域(27)引物對CYP17基因的第1200-1221位區(qū)域和第1294-1272位區(qū)域；探針該基因的第1230-1255位區(qū)域(28)引物對CYP19基因的第414-435位區(qū)域和第487-467位區(qū)域；探針該基因的第437-465位區(qū)域(29)引物對CYP27基因的第171-193位區(qū)域和第292-271位區(qū)域；探針該基因的第197-224位區(qū)域(30)引物對CYP1B1基因的第766-783位區(qū)域和第961-941位區(qū)域；探針該基因的第785-812位區(qū)域(31)引物對CYP2B6基因的第1146-1168位區(qū)域和第1228-1207位區(qū)域；探針該基因的第1175-1202位區(qū)域(32)引物對CYP2C8基因的第783-804位區(qū)域和第926-905位區(qū)域；探針該基因的第863-894位區(qū)域(33)引物對CYP2C9基因的第766-789位區(qū)域和第910-891位區(qū)域；探針該基因的第863-890位區(qū)域(34)引物對CYP2C19基因的第748-769位區(qū)域和第943-922位區(qū)域；探針該基因的第863-894位區(qū)域(35)引物對CYP4A1 1基因的第209-230位區(qū)域和第288-268位區(qū)域；探針該基因的第241-266位區(qū)域更具體而言，本發(fā)明提供上述試劑盒，其中探針進(jìn)一步包含報(bào)道染料和淬火染料，兩者皆附著于寡核苷酸上。
優(yōu)選地，上述試劑盒中的引物對和探針的組選自下列(1)-(35)的組，即在組中引物和探針各包含以下所示的SEQ ID NO的序列。更優(yōu)選地，組中的引物和探針各由以下所示的SEQ ID NO的序列組成。
(1)一組包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探針(2)一組包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探針(3)一組包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探針(4)一組包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探針(5)一組包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探針(6)一組包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探針(7)一組包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探針(8)一組包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探針(9)一組包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探針(10)一組包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探針(11)一組包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探針(12)一組包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探針(13)一組包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探針(14)一組包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探針(15)一組包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探針
(16)一組包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探針(17)一組包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探針(18)一組包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探針(19)一組包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探針(20)一組包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探針(21)一組包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探針(22)一組包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探針(23)一組包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探針(24)一組包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探針(25)一組包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探針(26)一組包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探針(27)一組包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探針(28)一組包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探針(29)一組包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探針(30)一組包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探針
(31)一組包含在SEQ ID N096和97中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探針(32)一組包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探針(33)一組包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探針(34)一組包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探針(35)一組包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探針上述組用于檢測和定量下列P450分子種類。
組(1)CYP1A1組(2)CYP1A2組(3)和(30)CYP1B1組(4)CYP2A6/7組(5)CYP2A6組(6)CYP2A7組(7)和(31)CYP2B6組(8)和(32)CYP2C8組(9)和(33)CYP2C9組(10)CYP2C18組(11)和(34)CYP2C19組(12)CYP2D6組(13)CYP2E1組(14)CYP2F1組(15)CYP2J2組(16)CYP3A3/4組(17)CYP3A4組(18)CYP3A5
組(19)CYP3A7組(20)和(35)CYP4A11組(21)CYP4B1組(22)CYP4F2組(23)CYP4F3組(24)CYP4F8組(25)CYP11B1組(26)CYP11B2組(27)CYP17組(28)CYP19組(29)CYP27本發(fā)明進(jìn)一步提供了檢測和定量一種或多種P450分子種類的方法，該方法包括下述的步驟(a)-(c)，具體而言，在所述方法步驟(c)中，通過檢測由激發(fā)光輻射所產(chǎn)生的熒光并測定熒光強(qiáng)度來檢測和定量水解的一種或多種探針(a)制備含有一種或多種P450基因的樣品；(b)使用本發(fā)明的試劑盒將該樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR，其可以是RT-PCR)，所述試劑盒包括至少一個(gè)上述組的引物對和探針，以擴(kuò)增樣品中一種或多種編碼P450分子種類的基因；以及(c)檢測并測定在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中水解的一種或多種探針。
在此說明書中，氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸等的縮寫是在IUPAC-IUB通訊中對生物命名(IUPAC-IUB Communication onBiological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984))或“對含有核苷酸序列或氨基酸序列的說明書的準(zhǔn)備指南”(日本專利局)(“Guideline for preparation of a specification containing nucleotidesequences or amino acid sequences”(JPO))所提供的那些，或本領(lǐng)域常用的那些。
本說明書中的術(shù)語“基因”包括雙鏈DNA以及單鏈的有義或反義DNA組成的雙鏈的DNA。該術(shù)語進(jìn)一步包括參與這些基因表達(dá)的mRNA和與該mRNA互補(bǔ)的cDNA。術(shù)語“核苷酸”(“寡核苷酸”)包括RNA和DNA。
更優(yōu)選的是根據(jù)實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，使用以報(bào)道染料和淬火染料標(biāo)記的探針來實(shí)施本發(fā)明的方法。
實(shí)時(shí)檢測技術(shù)能夠容易和快速地以實(shí)時(shí)方式在相同的PCR或RT-PCR條件下對分子種類的基因進(jìn)行單獨(dú)定量，該技術(shù)的建立很有益于臨床和藥物領(lǐng)域。例如，該技術(shù)可容易地定量人樣品中的P450mRNA表達(dá)，這在醫(yī)藥開發(fā)的動(dòng)力學(xué)測試中是重要的，由此使得知曉P450分子種類當(dāng)其與化學(xué)物質(zhì)如藥物接觸時(shí)的活性成為可能。具體而言，在新藥的開發(fā)中，要求研究者研究P450的代謝活性。通常，P450的代謝活性已通過單獨(dú)檢測各個(gè)P450分子的表達(dá)水平進(jìn)行了研究，這是一種復(fù)雜、費(fèi)工和費(fèi)時(shí)的方法。相反，本發(fā)明提供在相同條件下對P450分子的表達(dá)水平容易和快速地進(jìn)行定量的方法，這極其有用的，尤其是在新藥開發(fā)中。
對分離組織或活檢獲得的組織中P450分子種類的mRNA表達(dá)的研究，本發(fā)明的方法也是有效的。因此，本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于使用從少量組織中抽提出的總RNA，就能容易和快速地處理各種樣品并獲得所需的檢測。
肝、腎等中由酶誘導(dǎo)或其他方法所導(dǎo)致的特定P450分子種類的表達(dá)水平的變化與血液(血液中的核細(xì)胞)中表達(dá)水平的變化存在著相關(guān)的可能性。然而，由于血液中表達(dá)水平低，需要大量的血用于測定。本發(fā)明的測定方法使用任意組的上述由本發(fā)明人設(shè)計(jì)的引物對和探針，使用少量的樣品和普通設(shè)備就能容易和快速地檢測和定量P450分子種類。所以，本發(fā)明的方法可檢測和定量血液或相似樣品中編碼各個(gè)P450分子種類的基因，由此使得估算分子種類的表達(dá)水平稱為可能。本發(fā)明的探針和引物對本發(fā)明的探針和引物對各包括與P450分子種類的特異區(qū)域可雜交的寡核苷酸。
如本文所用的術(shù)語“可雜交”表示在下列PCR(RT-PCR)條件下能與特異區(qū)域雜交48℃30分鐘1個(gè)循環(huán)，95℃10分鐘1個(gè)循環(huán)以及50個(gè)循環(huán)，各循環(huán)由95℃15秒和60℃1分鐘組成。
一般而言，可雜交的寡核苷酸具有與特異區(qū)域的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸序列。然而本領(lǐng)域已知，即使由例如約20個(gè)核苷酸組成的引物或探針與其模板鏈也可能有約1或2個(gè)錯(cuò)配，該引物或探針與其模板鏈雜交，并因此以PCR引物或檢測探針起作用。因而，本發(fā)明的引物和探針包括那些含有少量錯(cuò)配的核苷酸序列。當(dāng)然，錯(cuò)配數(shù)優(yōu)選盡可能少。
本發(fā)明的探針和引物要求具有以下特征它們生成的擴(kuò)增產(chǎn)物長度為約50-約400bp；各個(gè)組中的引物盡可能地靠近探針；各個(gè)序列中的G(鳥嘌呤)和C(胞嘧啶)的比例盡可能地靠近50％；它們一排中不含有4個(gè)或更多個(gè)G(鳥嘌呤)核苷酸。本發(fā)明探針要求的另一特征是它們具有Tm約為70℃。進(jìn)一步，要求引物具有Tm約為60℃。
滿足上述要求的各個(gè)引物或探針的寡核苷酸中的核苷酸數(shù)至少15，通常15-50，優(yōu)選20-40。如果引物或探針中的核苷酸數(shù)遠(yuǎn)大于上述范圍，則引物或探針難以與單鏈DNA雜交。另一方面，如果核苷酸數(shù)太少，則雜交的特異性降低。
引物和探針的核苷酸的特定例子如下描述。依賴于分子種類，使用SEQ ID NO1-35(探針)和SEQ ID NO36-105(引物)中所示的序列。
優(yōu)選地，用作本發(fā)明探針和引物的寡核苷酸由在這些SEQ ID NO中的一個(gè)所示的核苷酸序列所組成。但是，它們并不限于這些寡核苷酸，并且可能具有少量的錯(cuò)配，只要它們主要包含這些核苷酸序列中的一個(gè)。
P450分子種類的mRNA序列是已知的，并且以下列登記編號登記在GenBank中。
(1)CYP1A1基因NM_000499(2)CYP1A2基因AF182274(3)CYP1B1基因NM_000104(4)CYP2A6/7基因AF182275/NM_000764(5)CYP2A6基因AF182275(6)CYP2A7基因NM_000764(7)CYP2B6基因AF182277(8)CYP2C8基因NM_000770(9)CYP2C9基因M61857(10)CYP2C18基因M61856(11)CYP2C19基因NM_000769(12)CYP2D6基因NM_000106(13)CYP2E1基因AF182276(14)CYP2F1基因NM_000774(15)CYP2J2基因NM_000775(16)CYP3A3/4基因NM_000776/AF182273(17)CYP3A4基因AF182273
(18)CYP3A5基因NM_000777(19)CYP3A7基因NM_000765(20)CYP4A11基因NM_000778(21)CYP4B1基因NM_000779(22)CYP4F2基因NM_001082(23)CYP4F3基因NM_000896(24)CYP4F8基因NM_007253(25)CYP11B1基因NM_000497(26)CYP11B2基因NM_000498(27)CYP17基因NM_000102(28)CYP19基因NM_000103(29)CYP27基因M62401在本說明書中，分子種類的特異區(qū)域以登記在上述登記編號下的基因序列所指明。
用作本發(fā)明探針和引物的寡核苷酸可以常規(guī)方式采用全自動(dòng)合成儀如DNA合成儀(Perkin-Elmer)等方便地合成。將所得的寡核苷酸可使用市售的濾芯等按需進(jìn)行純化。實(shí)時(shí)定量和檢測通過PCR使用本發(fā)明的引物對和探針的實(shí)時(shí)檢測P450分子種類的方法下文詳細(xì)描述。
本發(fā)明的實(shí)時(shí)檢測探針包括附著在一端如5′端的報(bào)道染料和附著在另一端如3′端的淬火染料。報(bào)道染料發(fā)射熒光，例如在用激發(fā)光輻射后，當(dāng)淬火染料極其接近報(bào)道染料時(shí)，其作用于報(bào)道染料上以抑制熒光發(fā)射。報(bào)道染料的例子包括6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素(TET)、2，7-二甲氧基-4，5-二氯-6-羧基熒光素(JOE)、六氯-6-羧基熒光素(HEX)等。淬火染料的例子包括6-羧基四甲基若丹明(TAMRA)等。
通過將報(bào)道染料和淬火染料附著于具有特異序列的寡核苷酸可制備本發(fā)明的探針。例如，F(xiàn)AM分子可以磷酸酯的形式附著于探針5′端的磷酸基團(tuán)上，通常采用若干個(gè)亞甲基鏈作為接頭。進(jìn)一步，TAMRA分子可通過下列結(jié)構(gòu)單位以酰胺鍵附著于3′端。 對于本發(fā)明方法來說采用一種或多種本發(fā)明的引物對和探針是必須的。另外，根據(jù)已知的PCR(例如，Science，230，1350(1985))或RT-PCR(Genome Res.，6(10)，986(1996))尤其是實(shí)時(shí)檢測技術(shù)(例如TaqMan PCR，ABI PRISMTM 7700 SEQUENCE DETECTIONSYSTEM，Applied Biosystems，Verl，June 1996)可實(shí)施該方法。
本發(fā)明的方法尤其可用于檢測靶P450分子種類的mRNA或cDNA，以確定P450分子種類的表達(dá)水平。在這種情況下，表達(dá)特異分子種類的組織被切除，以常規(guī)方式抽提總RNA。然后，以常規(guī)方式合成與該RNA互補(bǔ)的cDNA，接著通過PCR使用一種或多種本發(fā)明的引物對和探針進(jìn)行擴(kuò)增?；蛘?，在以常規(guī)方式抽提總RNA后，使用一種或多種本發(fā)明的引物和探針，可將該RNA直接進(jìn)行RT-PCR。
PCR和RT-PCR基本上根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行。PCR或RT-PCR條件可根據(jù)已知技術(shù)選擇，并與其中所使用的那些條件相似。具體而言，可優(yōu)選使用下文給出的實(shí)施例中所示的條件。
根據(jù)常規(guī)技術(shù)基本上也可進(jìn)行檢測，例如通過用氬激光輻射PCR混合物并使用CCD照相機(jī)檢測發(fā)射的熒光。
本發(fā)明發(fā)方法可容易和快速地測定和檢測P450分子種類的各自基因。檢測和定量P450分子種類的試劑盒本發(fā)明還提供實(shí)施上述方法的試劑盒。該試劑盒包括一組或多組上述的引物和探針。該試劑盒可進(jìn)一步含有已知的用作質(zhì)控的核酸以及測定該核酸的引物對和探針。
本發(fā)明的方法可單獨(dú)檢測和定量P450分子種類。此外，本發(fā)明的方法能快速和準(zhǔn)確地定量P450分子種類。因此，本發(fā)明方法的應(yīng)用使得有效獲得新藥與另一種藥在人體中的相互作用和不相容性的基本數(shù)據(jù)成為可能。
使用兩個(gè)極其接近的熒光染料，根據(jù)一個(gè)染料(報(bào)道染料)的熒光波長的波長區(qū)域與另一個(gè)染料(淬火染料)的激發(fā)光波長相互重疊時(shí)所產(chǎn)生的FRET，進(jìn)行定量測定。在其中引發(fā)FRET的兩個(gè)染料附著于末端上的探針(TaqMan探針)與衍生自特定P450分子種類并由PCR擴(kuò)增的cDNA雜交。PCR延伸反應(yīng)在此狀態(tài)開始，TaqMan探針被TaqDNA聚合酶的5’-3’內(nèi)切核酸酶活性水解，從而釋放出報(bào)道染料并且增加兩個(gè)染料間的物理距離。結(jié)果增加了已被FRET抑制的報(bào)道染料的熒光強(qiáng)度。由于熒光強(qiáng)度增加與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的增加成正比，因而，通過測定各個(gè)PCR循環(huán)后熒光強(qiáng)度的增加可實(shí)現(xiàn)目的cDNA的定量。
在此測試中，F(xiàn)AM作為報(bào)道染料附著于探針的5’端，而TAMRA作為淬火染料附著于3’端。根據(jù)文獻(xiàn)(Genome Res.，6(10)，986(1996))所描述的技術(shù)實(shí)施這些染料的附著以及TaqMan探針的制備。
使用全自動(dòng)DNA/RNA合成儀(ABI)、dNTP底物和指定的試劑合成用作引物和探針的寡核苷酸。
作為樣品RNA，下列RNA被分離、純化和以總RNA的形式使用來自肺的CYP4B1和CYP2F1；來自小腸的CYP1B1；來自胎兒肝臟庫的CYP3A7；來自前列腺的CYP4F8；來自胎盤的CYP19和來自腎上腺的CYP11B1、CYP11B2和CYP17。作為其他分子種類的樣品RNA，使用從成人肝臟庫中純化的總RNA。所有這些總RNA購自Clontech Laboratories，Inc.。
將總RNA用不含核糖核酸酶的水稀釋至20μg/ml，然后用具有濃度50μg/ml的酵母tRNA(GIBCO)5倍連續(xù)稀釋。各溶液5μl用于測定中。
使用TaqMan一步RT-PCR Master Mix試劑盒(PE AppliedBiosystems)和ABI PRISMTM7700序列檢測體系(PE AppliedBiosystems)在50μl/管的體系中進(jìn)行RT-PCR，該試劑盒包含300nM正向引物、900nM反向引物以及200nM TaqMan探針。
PCR條件如下48℃30分鐘1個(gè)循環(huán)，95℃10分鐘1個(gè)循環(huán)，以及50個(gè)循環(huán)，各個(gè)循環(huán)由95℃15秒以及60℃1分鐘所組成。各個(gè)循環(huán)后測定熒光強(qiáng)度。
表1表示在上述測試中所用的靶分子種類以及引物對和探針。表2代表測試結(jié)果(校準(zhǔn)曲線)。
表1

表2

在表2中，采用從100000pg總RNA/50μl反應(yīng)混合物中連續(xù)5倍稀釋的RNA溶液制作的校準(zhǔn)曲線顯示CYP3A4在濃度低至1.28pg總RNA/50μl反應(yīng)混合物下是可定量的；當(dāng)定量極限是1.28pg-4000pg總RNA時(shí)，其他分子種類的校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)是0.99或更高。然而，CYP4A11的校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)是0.96。測試實(shí)施例2設(shè)計(jì)的引物-探針組的P450分子種類特異性的確認(rèn)(1)測試方法為了證實(shí)本發(fā)明方法可特異地區(qū)別P450分子種類，如下進(jìn)行了該測試。以如測試實(shí)施例1中相同的方式采用本發(fā)明方法對腎上腺、肝臟、胎兒肝臟、小腸、腎臟、肺、腦、前列腺、睪丸、子宮和胎盤的組織中P450分子種類的表達(dá)進(jìn)行測試。將獲得的結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道中的結(jié)果進(jìn)行比較。
以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)作為內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，測試重復(fù)三次。
組織的總RNA庫購自Clontech Laboratories，Inc.。
對于用于制作校準(zhǔn)曲線的組織，總RNA的濃度是20000pg總RNA/50μl反應(yīng)混合物，而對于其他組織則為100000pg總RNA/501反應(yīng)混合物。
表3和表4表示結(jié)果。表還顯示總RNA來源的特性(收集數(shù)、年齡、性別、種族和死亡原因)。表中，“ND”表示低于定量極限。
表3

表3(續(xù)前頁)

表4

表4(續(xù)前頁)

將表中所示結(jié)果與下列文獻(xiàn)1-5所報(bào)道的現(xiàn)有技術(shù)得到的那些結(jié)果進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)基本上相關(guān)。進(jìn)一步，用現(xiàn)有技術(shù)不能檢測的分子種類可用本發(fā)明方法檢測。由本發(fā)明方法獲得的結(jié)果展示了相互之間不重疊的組織-特異的表達(dá)模式。因此，這證實(shí)本發(fā)明方法能夠單獨(dú)定量P450分子種類。
文獻(xiàn)1Drug Metabolism and Disposition 27,840-809(1999)文獻(xiàn)2Exp.Toxic.Pathol.，51,412-417(1999)文獻(xiàn)3Biochemical Pharmacology，52,379-383(1996)文獻(xiàn)4Biochemical Pharmacology，57,1407-1413(1999)文獻(xiàn)5Pharmacology & Therapeutics，84,429-445(1999)工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供在相同PCR條件下以實(shí)時(shí)方式容易和快速地單獨(dú)檢測和定量人P450分子種類的方法，以及提供用于本方法的探針和引物。本發(fā)明方法在臨床和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域是有用的。
序列表<110>株式會社大塚制藥工場(Otsuka Pharmaceutical Factory Inc.)<120>檢測和定量人P450分子種類的方法以及用于該方法的探針和試劑盒(A method for detecting human P450 molecular species and a prove and a kit therefor)<130>SCT022595-09<150>2000-164214<151>2000-06-01<160>105<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP1A1基因<400>1cgctatgacc acaaccacca agaact 26<210>2<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP1A2基因<400>2ctagagccag cggcaacctc atccca 26<210>3<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>3cagctttgtg cctgtcacta ttcctcat 28<210>4<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2A6/7基因<400>4tggccccgtg ttcaccattc actt 24<210>5<211>30<212>DNA<213>人P450 CYP2A6基因<400>5tgcctgactg tgatggtctt gatgtctgtt 30<210>6<211>25<212>DNA<213>人P450 CYP2A7基因<400>6aacctcttca ttgcaggcac cgaga25<210>7<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>7tcatctgctc catcgtcttt ggaaaacg 28<210>8<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>8tttctccctc acaaccttgc ggaatt 26<210>9<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>9ttgtgcttgt cgtctctgtc ccagct 26<210>10<211>25<212>DNA<213>人P450 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atctcccgcc atgt 24<210>23<211>25<212>DNA<213>人P450 CYP4F3基因<400>23tgccgtctct cgctgctgca cccaa25<210>24<211>30<212>DNA<213>人P450 CYP4F8基因<400>24cgaaaacgcc cagaagaggt cacctatggc 30<210>25<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP11B1基因<400>25gcgcgtgttc ctctactctc tgggtc 26<210>26<211>31<212>DNA<213>人P450 CYP11B2基因<400>26acaggttttc ctctactcgc tgggtcgcaa t 31<210>27<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP17基因<400>27tcagttcatg cctgagcgtt tcttga 26<210>28<211>29<212>DNA<213>人P450 CYP19基因<400>28ccttctttat gaaagctctg tcaggcccc29<210>29<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP27基因<400>29tgcgcttctt ctttcagctg ttcgttca 28<210>30<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>30agcagctcaa ccgcaacttc agcaactt 28<210>31<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>31tgagcactgc tctccatgac ccacacta 28<210>32<211>32<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>32ttggcactgt agctgatcta tttgttgctg ga32<210>33<211>28<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>33aaaacactgc agttgacttg tttggagc 28<210>34<211>32<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>34taatcactgc agctgactta cttggagctg 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23<210>48<211>19<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>48ccattccatt accgccaac 19<210>49<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>49aggaactctt gatcttggta gtgg 24<210>50<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>50aagagatgga aggagatccg g21<210>51<211>19<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>51tcaatgctcc tcttcccca 19<210>52<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>52ctcctatcat tgattacttc ccgg 24<210>53<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>53ggagaaggag agcatatctc agg 23<210>54<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP2C18基因<400>54aggatattga catcaccccc a21<210>55<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2C18基因<400>55tcagacagga atgaagcaga gct 23<210>56<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>56cttggtaatc actgcagctg act 23<210>57<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>57tcagcaggag aaggagagca tat 23<210>58<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP2D6基因<400>58cctacgcttc caaaaggctt t21<210>59<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2D6基因<400>59agagaacagg tcagccacca ct 22<210>60<211>19<212>DNA<213>人P450 CYP2E1基因<400>60ttcagcggtt catcaccct 19<210>61<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2E1基因<400>61gaggtatcct ctgaaaatgg tgtc 24<210>62<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2F1基因<400>62gctcaccatt atccgcctta tc 22<210>63<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2F1基因<400>63gaggtctctc aggcacttga ag 22<210>64<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2J2基因<400>64agcttagagg aacgcattca gga 23<210>65<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2J2基因<400>65cgaaggtgat ggagcaaatg at 22<210>66<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP3A3/4基因<400>66actgagtccc acaaagctct gtc 23<210>67<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP3A3/4基因<400>67aactgcatca atttcctcct gc 22<210>68<211>30<212>DNA<213>人P450 CYP3A4基因<400>68gattgactct cagaattcaa aagaaactga 30<210>69<211>26<212>DNA<213>人P450 CYP3A4基因<400>69ggtgagtggc cagttcatac ataatg 26<210>70<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP3A5基因<400>70ccttacccca gtttttgaag ca 22<210>71<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP3A5基因<400>71tccagatcag acagagcttt gtg 23<210>72<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP3A7基因<400>72ccttacccca attcttgaag ca 22<210>73<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP3A7基因<400>73tccagatcag acagagcttt gtg 23<210>74<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>74tctcagtcct acatacaggc catt 24<210>75<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>75gttggatcac ttggtctgtg tg 22<210>76<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4B1基因<400>76cctggtttct ctactgcatg gc 22<210>77<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP4B1基因<400>77ccagatcatc ccactggaag a21<210>78<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4F2基因<400>78ccgtgagcct aaagagattg aa 22<210>79<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP4F2基因<400>79cgaaaacact gatgaggcag a21<210>80<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4F3基因<400>80tacaagagct tctgaaggac cg 22<210>81<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4F3基因<400>81tgatgaggca gataatgcct tt 22<210>82<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4F8基因<400>82aatccatcac aacccctcag tc 22<210>83<211>20<212>DNA<213>人P450 CYP4F8基因<400>83ccgccgagaa aggaataaaa 20<210>84<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP11B1基因<400>84gagctcagac ttggtgcttc ag 22<210>85<211>20<212>DNA<213>人P450 CYP11B1基因<400>85tggaggtgtt tcagcacatg 20<210>86<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP11B2基因<400>86cttggtgctt cagaactacc aca 23<210>87<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP11B2基因<400>87ttagtgtctc caccaggaag tgc 23<210>88<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP17基因<400>88tcacaatgag aaggagtggc ac 22<210>89<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP17基因<400>89agcttactga cggtgagatg agc 23<210>90<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP19基因<400>90agagctctgg aaaacaactc ga 22<210>91<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP19基因<400>91ctgtgaccat acgaacaagg c21<210>92<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP27基因<400>92agaggagatt ccacgtctag gac 23<210>93<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP27基因<400>93acatccacat tggaccgtac tt 22<210>94<211>18<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>94accgttttcc gcgaattc18<210>95<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP1B1基因<400>95gtacgttctc caaatccagc c21<210>96<211>23<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>96ccccaaggac acagaagtat ttc 23<210>97<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2B6基因<400>97gattgaaggc gtctggtttt tc 22<210>98<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>98ggactttatc gattgcttcc tg 22<210>99<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C8基因<400>99ccatatctca gagtggtgct tg 22<210>100<211>24<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>100gacatgaaca accctcagga cttt 24<210>101<211>20<212>DNA<213>人P450 CYP2C9基因<400>101tgcttgtcgt ctctgtccca 20<210>102<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>102gaacaccaag aatcgatgga ca 22<210>103<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP2C19基因<400>103tcagcaggag aaggagagca ta 22<210>104<211>22<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>104aggagctaca acggattcag aa 22<210>105<211>21<212>DNA<213>人P450 CYP4A11基因<400>105acgaactttg cctccccata g2權(quán)利要求
1.檢測和定量人細(xì)胞色素P450分子種類的探針，所述探針包含與下列基因區(qū)域(1)-(29)中的一種可雜交的寡核苷酸(1)CYP1A1基因第616-641位的區(qū)域(2)CYP1A2基因第884-909位的區(qū)域(3)CYP1B1基因第1176-1203位的區(qū)域或第785-812位的區(qū)域(4)CYP2A6/7基因第195-218位的區(qū)域(5)CYP2A6基因第40-69位的區(qū)域(6)CYP2A7基因第889-913位的區(qū)域(7)CYP2B6基因第533-560位的區(qū)域或第1175-1202位的區(qū)域(8)CYP2C8基因第375-400位的區(qū)域或第863-894位的區(qū)域(9)CYP2C9基因第913-888位的區(qū)域或第863-890位的區(qū)域(10)CYP2C18基因第1420-1444位的區(qū)域(11)CYP2C19基因第913-887位的區(qū)域或第863-894位的區(qū)域(12)CYP2D6基因第748-775位的區(qū)域(13)CYP2E1基因第1096-1117位的區(qū)域(14)CYP2F1基因第608-635位的區(qū)域(15)CYP2J2基因第485-508位的區(qū)域(16)CYP3A3/4基因第876-905位的區(qū)域(17)CYP3A4基因第946-918位的區(qū)域(18)CYP3A5基因第850-822位的區(qū)域(19)CYP3A7基因第850-819位的區(qū)域(20)CYP4A11基因第666-691位的區(qū)域或第241-266位的區(qū)域(21)CYP4B1基因第997-1024位的區(qū)域(22)CYP4F2基因第1182-1205位的區(qū)域(23)CYP4F3基因第1188-1212位的區(qū)域(24)CYP4F8基因第1341-1370位的區(qū)域(25)CYP11B1基因第1209-1234位的區(qū)域(26)CYP11B2基因第1209-1239位的區(qū)域(27)CYP17基因第1230-1255位的區(qū)域(28)CYP19基因第437-465位的區(qū)域(29)CYP27基因第197-224位的區(qū)域。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述寡核苷酸具有附著其上的報(bào)道染料和淬火染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述寡核苷酸具有20-40個(gè)堿基的長度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的探針，其中所述寡核苷酸包括SEQ ID NO1-SEQ ID NO35中所示序列的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的探針，其中所述寡核苷酸由SEQ ID NO1-SEQ ID NO35中所示序列的一種組成。
6.檢測和定量一種或多種人細(xì)胞色素P450分子種類的試劑盒，其包含至少一組正向引物和反向引物的引物對和探針，所述引物和探針各包含與以下(1)-(35)中所示的基因區(qū)域可雜交的寡核苷酸(1)引物對CYP1A1基因的第589-610位區(qū)域和第685-664位區(qū)域；探針該基因的第616-641位區(qū)域(2)引物對CYP1A2基因的第860-880位區(qū)域和第951-931位區(qū)域；探針該基因的第884-909位區(qū)域(3)引物對CYP1B1基因的第1155-1174位區(qū)域和第1228-1207位區(qū)域；探針該基因的第1176-1203位區(qū)域(4)引物對CYP2A6/7基因的第173-193位區(qū)域和第254-236位區(qū)域；探針該基因的第195-218位區(qū)域(5)引物對CYP2A6基因的第20-48位區(qū)域和第171-146位區(qū)域；探針該基因的第40-69位區(qū)域(6)引物對CYP2A7基因的第861-884位區(qū)域和第1000-978位區(qū)域；探針該基因的第889-913位區(qū)域(7)引物對CYP2B6基因的第513-531位區(qū)域和第587-564位區(qū)域；探針該基因的第533-560位區(qū)域(8)引物對CYP2C8基因的第352-372位區(qū)域和第425-407位區(qū)域；探針該基因的第375-400位區(qū)域(9)引物對CYP2C9基因的第659-682位區(qū)域和第937-915位區(qū)域；探針該基因的第913-888位區(qū)域(10)引物對CYP2C18基因的第1394-1414位區(qū)域和第1473-1451位區(qū)域；探針該基因的第1420-1444位區(qū)域(11)引物對CYP2C19基因的第858-880位區(qū)域和第943-921位區(qū)域；探針該基因的第913-887位區(qū)域(12)引物對CYP2D6基因的第720-740位區(qū)域和第912-891位區(qū)域；探針該基因的第748-775位區(qū)域(13)引物對CYP2E1基因的第1070-1088位區(qū)域和第1146-1123位區(qū)域；探針該基因的第1096-1117位區(qū)域(14)引物對CYP2F1基因的第585-606位區(qū)域和第744-723位區(qū)域；探針該基因的第608-635位區(qū)域(15)引物對CYP2J2基因的第460-482位區(qū)域和第592-571位區(qū)域；探針該基因的第485-508位區(qū)域(16)引物對CYP3A3/4基因的第850-872位區(qū)域和第1014-993位區(qū)域；探針該基因的第876-905位區(qū)域(17)引物對CYP3A4基因的第825-854位區(qū)域和第973-948位區(qū)域；探針該基因的第946-918位區(qū)域(18)引物對CYP3A5基因的第684-705位區(qū)域和第881-859位區(qū)域；探針該基因的第850-822位區(qū)域(19)引物對CYP3A7基因的第684-705位區(qū)域和第881-859位區(qū)域；探針該基因的第850-819位區(qū)域(20)引物對CYP4A11基因的第640-663位區(qū)域和第805-784位區(qū)域；探針該基因的第666-691位區(qū)域(21)引物對CYP4B1基因的第974-995位區(qū)域和第1081-1061位區(qū)域；探針該基因的第997-1024位區(qū)域(22)引物對CYP4F2基因的第1092-1113位區(qū)域和第1276-1256位區(qū)域；探針該基因的第1182-1205位區(qū)域(23)引物對CYP4F3基因的第1073-1094位區(qū)域和第1267-1246位區(qū)域；探針該基因的第1188-1212位區(qū)域(24)引物對CYP4F8基因的第1278-1299位區(qū)域和第1390-1371位區(qū)域；探針該基因的第1341-1370位區(qū)域(25)引物對CYP11B1基因的第1158-1179位區(qū)域和第1415-1396位區(qū)域；探針該基因的第1209-1234位區(qū)域(26)引物對CYP11B2基因的第1167-1189位區(qū)域和第1429-1407位區(qū)域；探針該基因的第1209-1239位區(qū)域(27)引物對CYP17基因的第1200-1221位區(qū)域和第1294-1272位區(qū)域；探針該基因的第1230-1255位區(qū)域(28)引物對CYP19基因的第414-435位區(qū)域和第487-467位區(qū)域；探針該基因的第437-465位區(qū)域(29)引物對CYP27基因的第171-193位區(qū)域和第292-271位區(qū)域；探針該基因的第197-224位區(qū)域(30)引物對CYP1B1基因的第766-783位區(qū)域和第961-941位區(qū)域探針該基因的第785-812位區(qū)域(31)引物對CYP2B6基因的第1146-1168位區(qū)域和第1228-1207位區(qū)域；探針該基因的第1175-1202位區(qū)域(32)引物對CYP2C8基因的第783-804位區(qū)域和第926-905位區(qū)域；探針該基因的第863-894位區(qū)域(33)引物對CYP2C9基因的第766-789位區(qū)域和第910-891位區(qū)域；探針該基因的第863-890位區(qū)域(34)引物對CYP2C19基因的第748-769位區(qū)域和第943-922位區(qū)域；探針該基因的第863-894位區(qū)域(35)引物對CYP4A11基因的第209-230位區(qū)域和第288-268位區(qū)域；探針該基因的第241-266位區(qū)域。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其中所述探針進(jìn)一步包含附著其上的報(bào)道染料和淬火染料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其包含至少一組選自下列組(1)-(35)的引物對和探針(1)一組包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探針(2)一組包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探針(3)一組包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探針(4)一組包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探針(5)一組包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探針(6)一組包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探針(7)一組包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探針(8)一組包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探針(9)一組包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探針(10)一組包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探針(11)一組包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探針(12)一組包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探針(13)一組包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探針(14)一組包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探針(15)一組包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探針(16)一組包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探針(17)一組包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探針(18)一組包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探針(19)一組包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探針(20)一組包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探針(21)一組包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探針(22)一組包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探針(23)一組包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探針(24)一組包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探針(25)一組包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探針(26)一組包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探針(27)一組包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探針(28)一組包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探針(29)一組包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探針(30)一組包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探針(31)一組包含在SEQ ID NO96和97中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探針(32)一組包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探針(33)一組包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探針(34)一組包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探針(35)一組包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探針。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其包含至少一組選自下列(1)-(35)的引物對和探針(1)一組包含在SEQ ID NO36和37中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO1中所示序列的探針(2)一組包含在SEQ ID NO38和39中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO2中所示序列的探針(3)一組包含在SEQ ID NO40和41中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO3中所示序列的探針(4)一組包含在SEQ ID NO42和43中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO4中所示序列的探針(5)一組包含在SEQ ID NO44和45中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO5中所示序列的探針(6)一組包含在SEQ ID NO46和47中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO6中所示序列的探針(7)一組包含在SEQ ID NO48和49中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO7中所示序列的探針(8)一組包含在SEQ ID NO50和51中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO8中所示序列的探針(9)一組包含在SEQ ID NO52和53中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO9中所示序列的探針(10)一組包含在SEQ ID NO54和55中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO10中所示序列的探針(11)一組包含在SEQ ID NO56和57中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO11中所示序列的探針(12)一組包含在SEQ ID NO58和59中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO12中所示序列的探針(13)一組包含在SEQ ID NO60和61中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO13中所示序列的探針(14)一組包含在SEQ ID NO62和63中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO14中所示序列的探針(15)一組包含在SEQ ID NO64和65中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO15中所示序列的探針(16)一組包含在SEQ ID NO66和67中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO16中所示序列的探針(17)一組包含在SEQ ID NO68和69中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO17中所示序列的探針(18)一組包含在SEQ ID NO70和71中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO18中所示序列的探針(19)一組包含在SEQ ID NO72和73中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO19中所示序列的探針(20)一組包含在SEQ ID NO74和75中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO20中所示序列的探針(21)一組包含在SEQ ID NO76和77中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO21中所示序列的探針(22)一組包含在SEQ ID NO78和79中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO22中所示序列的探針(23)一組包含在SEQ ID NO80和81中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO23中所示序列的探針(24)一組包含在SEQ ID NO82和83中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO24中所示序列的探針(25)一組包含在SEQ ID NO84和85中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO25中所示序列的探針(26)一組包含在SEQ ID NO86和87中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO26中所示序列的探針(27)一組包含在SEQ ID NO88和89中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO27中所示序列的探針(28)一組包含在SEQ ID NO90和91中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO28中所示序列的探針(29)一組包含在SEQ ID NO92和93中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO29中所示序列的探針(30)一組包含在SEQ ID NO94和95中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO30中所示序列的探針(31)一組包含在SEQ ID NO96和97中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO31中所示序列的探針(32)一組包含在SEQ ID NO98和99中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO32中所示序列的探針(33)一組包含在SEQ ID NO100和101中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO33中所示序列的探針(34)一組包含在SEQ ID NO102和103中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO34中所示序列的探針(35)一組包含在SEQ ID NO104和105中所示序列的引物對和包含在SEQ ID NO35中所示序列的探針。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中組(1)-(35)對于檢測和定量下列P450分子種類是有用的組(1)CYP1A1組(2)CYP1A2組(3)和(30)CYP1B1組(4)CYP2A6/7組(5)CYP2A6組(6)CYP2A7組(7)和(31)CYP2B6組(8)和(32)CYP2C8組(9)和(33)CYP2C9組(10)CYP2C18組(11)和(34)CYP2C19組(12)CYP2D6組(13)CYP2E1組(14)CYP2F1組(15)CYP2J2組(16)CYP3A3/4組(17)CYP3A4組(18)CYP3A5組(19)CYP3A7組(20)和(35)CYP4A11組(21)CYP4B1組(22)CYP4F2組(23)CYP4F3組(24)CYP4F8組(25)CYP11B1組(26)CYP11B2組(27)CYP17組(28)CYP19組(29)CYP27。
11.檢測和定量一種或多種人色素P450分子種類的方法，所述方法包含下列步驟(a)制備含有一種或多種人色素P450基因的樣品；(b)使用根據(jù)權(quán)利要求6-10中任一項(xiàng)所述的試劑盒將該樣品進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而擴(kuò)增樣品中一種或多種編碼人細(xì)胞色素P450分子種類的基因；以及(c)檢測和測定在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)過程中水解的一種或多種探針。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中通過檢測和測定用激發(fā)光輻射所產(chǎn)生的熒光來檢測和定量水解的一種或多種探針。
全文摘要
本發(fā)明提供用于檢測和定量人細(xì)胞色素P450分子種類的試劑盒，其包含一種或多種寡核苷酸探針以及一種或多種特異引物對，各個(gè)所述寡核苷酸探針可與編碼人細(xì)胞色素P450種類的特異區(qū)域例如CYP1A1基因的第616－641位的區(qū)域雜交；并提供了使用該試劑盒檢測和定量一種或多種人細(xì)胞色素P450分子種類的方法。
文檔編號C12N15/53GK1441845SQ01810426
公開日2003年9月10日 申請日期2001年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年6月1日
發(fā)明者西村益浩, 矢口寬, 內(nèi)藤真策, 平岡功 申請人:株式會社大塚制藥工場