專利名稱：臨床診斷方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定母體樣本(如血或陰道樣本)內(nèi)胚胎細(xì)胞核及其遺傳物質(zhì)(如DNA或染色體)的方法。然后將此方法中鑒定的胚胎遺傳物質(zhì)用于如產(chǎn)前診斷中。
染色體疾病是人類最常見(jiàn)的遺傳疾病。結(jié)構(gòu)性染色體疾病占懷孕的前三個(gè)月期間與流產(chǎn)有關(guān)致死率的50％以上，并且約占宮內(nèi)或圍產(chǎn)期死亡的5％。另外，0.5％新生兒患有結(jié)構(gòu)性染色體異常。
染色體異?？赡苁菙?shù)目上的或結(jié)構(gòu)上的。數(shù)目異常，即體細(xì)胞組織中46個(gè)正常二倍體染色體數(shù)目發(fā)生變化，包括三體性(多一個(gè)染色體)、單體性(丟一個(gè)染色體)和多體性(整個(gè)多一套染色體)。由染色體斷裂、接著異常部位斷裂的染色體節(jié)端愈合而引起的結(jié)構(gòu)性重排包括所稱的易位、翻轉(zhuǎn)和插入。
染色體結(jié)構(gòu)性重排可出現(xiàn)平衡形式，在這種情況下，所述遺傳物質(zhì)保持與正常狀態(tài)相同。結(jié)構(gòu)性染色體異常的攜帶者通常并不呈現(xiàn)出任何癥狀(除非在斷裂點(diǎn)處出現(xiàn)基因損傷)。結(jié)構(gòu)性染色體異常還可出現(xiàn)非平衡形式，在這種情況下，某些遺傳物質(zhì)缺失和/或復(fù)份。這一般導(dǎo)致發(fā)育遲緩，包括帶有身體和心理殘障的新生兒。
以個(gè)體存在于人群中的最常見(jiàn)染色體異常是與Down氏綜合癥有關(guān)的三體性21?，F(xiàn)普遍接受的是大約有1/650新生兒童患有特征為不同程度嚴(yán)重心理運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩的21三體Down氏綜合癥。世界不同國(guó)家中21三體Down氏綜合癥的發(fā)病率無(wú)明顯差別。
對(duì)兒童和成人的21三體Down氏綜合癥的診斷一般通過(guò)在體外培養(yǎng)血液淋巴細(xì)胞，然后進(jìn)行染色體分析。該細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程需要2-3日，以在細(xì)胞周期的分裂中期聚集足夠的細(xì)胞，而使染色體濃縮至足以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)染色體顯帶法技術(shù)進(jìn)行單個(gè)鑒定的程度。
一般21三體Down氏綜合癥的兒童的唯一明確確證的臨床風(fēng)險(xiǎn)因素與母體的年齡有關(guān)。因此，一般認(rèn)為懷有三體性21兒童的風(fēng)險(xiǎn)性隨母體年齡的增長(zhǎng)增加，在超過(guò)45歲的最高年齡組中，風(fēng)險(xiǎn)性高出10％。目前存在鑒別孕婦很可能懷有三體性21兒童的篩選程序。這些篩選程序包括分析母血樣本的生化特征以及對(duì)胎兒進(jìn)行超聲波掃描，后者目的在于觀察頸部皮膚的厚度，在患有Down氏綜合癥和某些其它染色體疾病的胎兒中，該厚度顯著增加。
超過(guò)某個(gè)年齡(通常為35歲)的孕婦以及經(jīng)篩選被確定為風(fēng)險(xiǎn)性高的婦女一般要進(jìn)行侵襲性處理(絨毛膜絨毛取樣和/或羊膜穿刺術(shù))，以對(duì)胎兒細(xì)胞樣本進(jìn)行染色體分析。這些侵襲方法，除使母體感到不舒適外，還使流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)性增加。因此需要提供一種更有效地進(jìn)行產(chǎn)前診斷的方法，而并不依靠這種侵襲取樣的方法。
眾所周知，在懷孕期間，可在母血中檢測(cè)出胚胎細(xì)胞，其約以百萬(wàn)分之一至千萬(wàn)分之一量存在。這可為產(chǎn)前“非侵襲性”診斷胎兒病癥，如最常見(jiàn)的21三體Down氏綜合癥，提供可能性，這一點(diǎn)也被廣泛認(rèn)知。
Down氏綜合癥和某些其它胚胎細(xì)胞遺傳性疾病以及孕婦并發(fā)癥，如先兆子癇和早產(chǎn)以及自身免疫疾病的產(chǎn)后發(fā)展，特點(diǎn)在于胎兒母體轉(zhuǎn)輸增加，從而導(dǎo)致母血中胚胎細(xì)胞水平增高(參見(jiàn)Pertl和Bianchi Semin Perinatol 23，5，393-402，1999；Bianchi Eur J ObstetGynecol Reprod Biol 92，1，103-8，2000)。
采用特別的免疫學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，然后利用與特定染色體探針原位雜交(FISH)產(chǎn)生的熒光，對(duì)染色體數(shù)目計(jì)數(shù)，對(duì)鑒定母血中的胚胎細(xì)胞進(jìn)行了許多努力和大量工作(參見(jiàn)Hahn等，Mol Hum Repr 4，6，515-521，1998，評(píng)論)。
利用較少侵襲方法從孕婦母體中得到的樣本一般包含一定的母體細(xì)胞和相對(duì)少量胚胎細(xì)胞。目前分離胚胎細(xì)胞的方法包括利用抗體、梯度分級(jí)分離、母體細(xì)胞優(yōu)選分解以及細(xì)胞分選法。但是，母體細(xì)胞依然超出任何分離的胚胎細(xì)胞(見(jiàn)Al-Mufti等Amer J Med Genet85，1，66-75，1999)。雖然這種可能技術(shù)的任何指標(biāo)產(chǎn)生的意義非常大，但是利用這些樣本進(jìn)行產(chǎn)前非侵襲性診斷仍然存在著明顯困難(見(jiàn)Hulten，The Lancet，357，963-4，2001)。
眾所周知端粒構(gòu)成覆蓋染色體末端的重復(fù)DNA序列，其量是變動(dòng)的，年輕人比年老人具有更高數(shù)量的重復(fù)序列。認(rèn)為在端粒復(fù)制的終末期不發(fā)生DNA復(fù)制。這就意味著在每個(gè)細(xì)胞分裂中，該端粒都比以前變得更短?，F(xiàn)還認(rèn)為這種縮短最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡(參見(jiàn)DeLange，Science 279，334-335，1998)。
所有人體染色體得端粒都包含相同的DNA重復(fù)核心。端粒長(zhǎng)度隨個(gè)體年齡的變化是在所有染色體中觀測(cè)到的普遍現(xiàn)象。根據(jù)個(gè)體年齡的不同，端粒重復(fù)長(zhǎng)度的變化估計(jì)約為2-30Kb的DNA。
可采用特定軟件和對(duì)端粒探針雜交的染色體進(jìn)行顯微鏡像分析來(lái)測(cè)定染色體特異性端粒長(zhǎng)度(Poon等，Cytometry 36，267-278，1999)。這些研究表明在各染色體端粒含量?jī)?nèi)的個(gè)別細(xì)胞核之間可能存在一些變化。盡管如此，如以上所述，端粒長(zhǎng)度隨主體年齡顯著降低。以此為基礎(chǔ)，胚胎細(xì)胞中各染色體的端粒長(zhǎng)度應(yīng)比新生兒長(zhǎng)，也比成人的長(zhǎng)(見(jiàn)De Pauw等，Cytometry 32，3，163-1690)。因此，說(shuō)明胚胎細(xì)胞比母體細(xì)胞具有更長(zhǎng)的端粒，即每個(gè)染色體具有更高的的端粒DNA重復(fù)序列(Friedrich等，Pediatr Res 49，2，256-6，2001)。
本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，可利用這種特性為基礎(chǔ)區(qū)分母體組織樣本(如血液或血清樣本)中存在的母體和胚胎細(xì)胞核和/或其中的遺傳物質(zhì)，尤其是染色體和DNA。
因此本發(fā)明提供一種鑒定母血(包括血清或血漿成分)或陰道樣本內(nèi)胚胎細(xì)胞核、染色體和DNA的方法，該方法包括(a)將該樣本中的細(xì)胞核的染色體經(jīng)酶核酸外切消化以切出各染色體的末端區(qū)段，然后(b)檢測(cè)作為所述消化過(guò)程結(jié)果保留的胚胎細(xì)胞核DNA中但不存在于母體細(xì)胞核DNA中的DNA序列。
實(shí)際上，本發(fā)明以胚胎和母體DNA內(nèi)端粒重復(fù)數(shù)目的差別為基礎(chǔ)，對(duì)母體組織樣本中的胚胎細(xì)胞核直接進(jìn)行鑒別。在步驟(a)中，從末端區(qū)段內(nèi)部消化細(xì)胞核內(nèi)的染色體DNA。在這個(gè)過(guò)程中，首先將樣本中存在的所有的染色體的端粒片段進(jìn)行消化。然后進(jìn)行一段時(shí)間的外切核酸酶消化，該時(shí)間足以除去至少所有母體端粒DNA序列。
如果此刻停止消化，胚胎染色體將保留某些端粒DNA。然后采用例如對(duì)端粒DNA具有特異性的標(biāo)記探針，檢測(cè)該DNA，在這種情況下所述探針只對(duì)胚胎DNA雜交。
該方法優(yōu)選采用母血樣本(包括血清和/或血漿成分)進(jìn)行。本文所用表述“血液樣本”包括全血、血清或血漿，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從中分離出具核細(xì)胞。
該方法可在細(xì)胞原位進(jìn)行。在這種情況下，通過(guò)核膜，將外切核酸酶引入到細(xì)胞核中。為實(shí)現(xiàn)該目的，例如可通過(guò)利用酶，如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X 100，將細(xì)胞核膜透化處理進(jìn)行。
在開(kāi)始步驟中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，采用固定方法，如卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，將所述細(xì)胞中染色體固定，以用于分析。
當(dāng)步驟(b)中檢測(cè)的序列是標(biāo)記染色體時(shí)，優(yōu)選它是臨近端粒(亞端?；蚨肆?的染色體標(biāo)記，因此使得將標(biāo)記物本身用于產(chǎn)前診斷成為可能。在任何情況下，都可將包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核的鑒定作為“非侵襲性”產(chǎn)前診斷的初始步驟。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，將消化后樣本中存在的DNA用對(duì)該DNA序列(如端粒序列)具有特異性的初級(jí)標(biāo)記探針雜交。最優(yōu)選，用可見(jiàn)標(biāo)記物(尤其是熒光標(biāo)記物)將該初級(jí)探針標(biāo)記，然后檢測(cè)樣本中的熒光。這一步可原位進(jìn)行，例如在細(xì)胞載玻片上進(jìn)行，或者另外可用流式分選方法從母體細(xì)胞核中分離出胚胎細(xì)胞核(已被熒光標(biāo)記)。
進(jìn)行外切核酸消化的適當(dāng)?shù)拿赴˙AL31。為保證更能控制消化過(guò)程，優(yōu)選采用僅消化DNA特定區(qū)段的酶。更詳細(xì)地講，可以三個(gè)階段方法進(jìn)行消化，其中在第一階段，除去DNA的3’突出端，在第二階段，切除3’-5’ss區(qū)段，在第三階段，消化ss區(qū)段。完成第一和第三階段的適當(dāng)?shù)拿赴ňG豆核酸酶，第二階段的適當(dāng)?shù)拿赴ㄍ馇泻怂崦窱II。
為提供可靠的消化以區(qū)分包含染色體和DNA的母體和胚胎細(xì)胞核所需的條件，如酶濃度、緩沖液系統(tǒng)、溫度和培養(yǎng)時(shí)間需要小心選擇，并且這些條件根據(jù)因素(如所用的特定酶)而變。
作為不同染色體末端之間的端粒DNA序列重復(fù)數(shù)目變異的結(jié)果，優(yōu)選以一種染色體特異性方式，先將這些酶系統(tǒng)“校準(zhǔn)”比較理想。通過(guò)分析各種條件下的染色體外切核酸酶端粒消化的結(jié)果，可實(shí)現(xiàn)該類型的校準(zhǔn)。
另一種校準(zhǔn)具體酶系統(tǒng)的方法是獲得母體和胚胎組織樣本中各個(gè)具體染色體的端粒長(zhǎng)度上的基線信息。該方法可通過(guò)在細(xì)胞周期的分裂中期，對(duì)端粒DNA序列熒光原位雜交(FISH)進(jìn)行。采用端粒與亞端粒DNA探針結(jié)合的FISH，可將各染色體末端的具體端粒突出顯示。通過(guò)顯微鏡像分析，采用對(duì)比基因組雜交(CGH)軟件程序，可進(jìn)行端粒序列測(cè)定。
還可利用胚胎臍帶穿刺術(shù)(cordocentesis)的血液樣本和送遞中的臍血樣本，以獲得母體和胚胎組織樣本中各個(gè)具體染色體臂的端粒DNA序列長(zhǎng)度正常變異的另外基線信息。一經(jīng)采用本發(fā)明方法鑒定，即可對(duì)胚胎DNA、染色體或細(xì)胞核進(jìn)行產(chǎn)前診斷，以確定染色體/DNA異常(如Down氏綜合癥、Edward氏綜合癥和Klinefelter氏綜合癥)的存在或者其它信息(如胎兒的性別)。
另外，采用本發(fā)明方法可獲得的信息，尤其是有關(guān)母體樣本中胚胎細(xì)胞濃度量的信息，用于產(chǎn)前篩選/診斷以及多種母體癥狀的診斷。包括妊娠并發(fā)癥如先兆子癇、預(yù)測(cè)早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)以及自身免疫疾病的產(chǎn)后發(fā)展。
染色體異常的產(chǎn)前診斷的具體方法，可通過(guò)將所述樣本與二級(jí)標(biāo)記的探針接觸進(jìn)行，該探針在可與樣本中的DNA雜交的條件下，對(duì)DNA的特定染色體或診斷區(qū)段具有特異性。因此，對(duì)源于胚胎的已識(shí)別的核、染色體或DNA中該二級(jí)探針的檢測(cè)，將能提供有關(guān)胎兒的信息。根據(jù)具體診斷目的的不同，如果該二級(jí)探針對(duì)染色體18、21或13和/或X或Y染色體具有特異性，即是有用的。
據(jù)推測(cè)X/Y、13、18和21的FISH探針組合可檢測(cè)目前可通過(guò)對(duì)未選擇孕婦中羊水樣本的全染色體分析(核型)確定的所有異常中的約70％。排除高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦外(通過(guò)如父母是已知的結(jié)構(gòu)染色體異常(如易位)攜帶者的家族病史確認(rèn)，或者已通過(guò)超聲波檢測(cè)出胎兒結(jié)構(gòu)異常確認(rèn))，檢測(cè)率可增加到99％以上。還應(yīng)指出的是可使用對(duì)不同類型異常具有特異性的探針。
優(yōu)選該二級(jí)探針帶有可見(jiàn)性標(biāo)記物，如熒光標(biāo)記物。在本發(fā)明方法的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，在步驟(b)中，采用初級(jí)熒光標(biāo)記的探針測(cè)定所述胚胎DNA序列，所述二級(jí)探針帶有與所述初級(jí)探針不同波長(zhǎng)處熒光的熒光標(biāo)記物，其中通過(guò)檢測(cè)該初級(jí)標(biāo)記物中的熒光，檢測(cè)胚胎DNA。鑒定后，立即將所檢測(cè)的熒光波長(zhǎng)變?yōu)樗龆?jí)探針的波長(zhǎng)，并觀察兩種探針中的熒光是否發(fā)射于相似的細(xì)胞核、染色體或DNA中。這可很容易通過(guò)改變所用熒光檢測(cè)器上的濾器實(shí)現(xiàn)。
在優(yōu)選方案中，上述亞端粒標(biāo)記物應(yīng)位于每個(gè)染色體臂內(nèi)特有的染色體DNA序列中盡可能遠(yuǎn)的位置上。這些標(biāo)記物被相對(duì)于各位置的各染色體末端預(yù)先選定。所選擇的適宜的DNA標(biāo)記物在戰(zhàn)略上位于包含特異性染色體的獨(dú)特DNA的亞端粒染色體位置。這個(gè)位置是優(yōu)選的一個(gè)主要原因。
應(yīng)用亞端?；蚨肆Ｈ旧w/DNA標(biāo)記物不僅便于對(duì)染色體畸形(如三體性)數(shù)目定量，并且還可對(duì)某些相對(duì)普通的不平衡結(jié)構(gòu)的染色體重排(如不平衡易位)定量。根據(jù)染色體所涉及的易位不同，不平衡易位被視為一種特異性染色體亞端?；蚨肆?biāo)記物的復(fù)制與另一種特異性染色體亞端?；蚨肆?biāo)記物的缺失的結(jié)合。另外，其它相對(duì)普通的染色體畸形可按該方法或類似的方法識(shí)別。它們包括與胚胎畸形和/或心理運(yùn)動(dòng)發(fā)育遲緩有關(guān)的特別標(biāo)記染色體，如胚胎iso 12p、iso 18p或isodic 15，以及可產(chǎn)生與正常狀況有關(guān)的4種特別標(biāo)記。
通過(guò)適當(dāng)選擇產(chǎn)前胚胎診斷所用的熒光DNA標(biāo)記物，可采用這種方法測(cè)定大多數(shù)導(dǎo)致胚胎發(fā)育障礙的染色體異常。這些異常包括以下說(shuō)明的Down氏綜合癥、Klinefelter氏綜合癥和Edward氏綜合癥。
在本發(fā)明一實(shí)施方案中，取得母體組織樣本如血液樣本(包括血漿或血清成分)，然后通過(guò)常規(guī)方法，如Lymphoprep(Sigma)或Percoll(Amersham Pharmacia)方法，從其中分離出非分裂的具核細(xì)胞。
然后采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，如暴露于化學(xué)試劑溶血卵磷脂、皂苷或TritonX中，將細(xì)胞核膜透化處理。
在下列步驟中，通過(guò)常規(guī)技術(shù)，如暴露于卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，將細(xì)胞核染色體固定。
然后將該細(xì)胞核涂布于顯微鏡用載玻片上，與外切核酸酶(如BAL 31)一起溫育一定時(shí)間，該時(shí)間足以消化母體端粒，但留下某些胚胎端粒DNA。
向所述細(xì)胞中加入全端粒標(biāo)記的探針，如熒光標(biāo)記探針。該探針粘附于胚胎細(xì)胞核中的染色體的端粒片段上，但并不與失去其端粒片段的母體細(xì)胞核的染色體相互作用。
如果此刻對(duì)載玻片進(jìn)行檢測(cè)，胚胎細(xì)胞核具有熒光，而母體細(xì)胞核不具熒光。或者，可用本領(lǐng)域已知的流式細(xì)胞計(jì)方法，從母體細(xì)胞中分離出熒光胚胎細(xì)胞。
在具體的實(shí)施方案中，分離后，將二級(jí)不同標(biāo)記的探針引入到所述細(xì)胞中。適當(dāng)?shù)牟煌瑯?biāo)記的探針也可帶有可見(jiàn)標(biāo)記物，如不同的熒光標(biāo)記物(熒光團(tuán))。無(wú)論該胚胎細(xì)胞的DNA是否與所述二級(jí)探針結(jié)合，都可采用本領(lǐng)域熟知的熒光顯微鏡檢術(shù)和分離濾器進(jìn)行測(cè)定。
一般常用的熒光團(tuán)包括DAPI、熒光素、FITC、Cy3、Cy5、羅丹明染料和德克薩斯紅。
本發(fā)明另一方面提供一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)胚胎細(xì)胞核、染色體和DNA的試劑盒，該試劑盒包括一種能消化DNA末端區(qū)段的外切核酸酶以及一種用于檢測(cè)在染色體末端區(qū)段中發(fā)現(xiàn)的特定DNA序列的標(biāo)記探針，如熒光標(biāo)記探針。
該試劑盒可包含一或多種實(shí)現(xiàn)以上所述方法所需的其它的試劑或物品。更詳細(xì)地講，該試劑盒還可包含二級(jí)標(biāo)記探針，如不同的熒光標(biāo)記探針，該探針對(duì)特定的染色體片段的某些DNA序列具有特異性，因此能診斷不同的染色體病癥。
所述試劑盒還包含核細(xì)胞分離劑(如Percoll或Lymphoprep)和/或核膜穿孔劑(如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X100)和/或用于端粒消化的外切核酸酶(如BAL31)。
應(yīng)重點(diǎn)指出的是對(duì)胚胎細(xì)胞核本身的獨(dú)立鑒別是進(jìn)行可靠的非侵襲性產(chǎn)前診斷所必需的(見(jiàn)Hulten，The Lancet，357，963-4，2001)。本發(fā)明提供達(dá)到這種要求的方法。
另一方面，還應(yīng)指出的是對(duì)不同F(xiàn)ISH顏色信號(hào)，可使用多種熒光團(tuán)組合(直接或間接標(biāo)記)以鑒別端粒序列和染色體特異性序列，這一點(diǎn)在本領(lǐng)域是眾所周知的。FISH本身是目前發(fā)展迅速的領(lǐng)域。
最后重點(diǎn)指出的是，如其它研究者說(shuō)明的一樣，所述FISH-FISH方法本身簡(jiǎn)單、快速，尤其與其它技術(shù)相比來(lái)看。所有富集和制備的處理時(shí)間，包括原位雜交，一共大約6小時(shí)。某些步驟可適于自動(dòng)化操作。應(yīng)用市場(chǎng)現(xiàn)有的計(jì)算機(jī)軟件，對(duì)顯微鏡分析自動(dòng)化也同樣適用，其中目前本身已存在自動(dòng)熒光點(diǎn)計(jì)數(shù)。
現(xiàn)通過(guò)實(shí)施例并參考附帶的圖示，詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。


圖1用示意圖說(shuō)明在母體和胚胎染色體/DNA中存在的端粒差別以及對(duì)其的酶促消化作用；
圖2用示意圖說(shuō)明采用本發(fā)明的母體和胚胎細(xì)胞混合群方法，應(yīng)用(a)端粒特異性FISH探針和(b)染色體Y特異性FISH探針進(jìn)行分析的結(jié)果；圖3用示意圖說(shuō)明采用本發(fā)明的母體和胚胎細(xì)胞混合群方法，應(yīng)用(a)端粒特異性FISH探針和(b)染色體21特異性FISH探針進(jìn)行分析的結(jié)果；實(shí)施例1從成年女性血樣和羊水樣本(含胚胎帶核細(xì)胞)中分離帶核細(xì)胞。在含有范圍為1/10和1/100至1/1000體積百分比的不同比例的胚胎和成人細(xì)胞的混懸液中，兩種類型的細(xì)胞混合在一起。
然后將混懸液暴露于溶血卵磷脂中以誘發(fā)細(xì)胞/細(xì)胞核的膜的透化作用，接著固定、制備顯微術(shù)載玻片，隨后暴露進(jìn)行核酸外切DNA消化。然后將這些細(xì)胞先用全端粒探針、再用染色體特異性探針雜交以進(jìn)行熒光顯微鏡分析。1)細(xì)胞制備將裝于EDTA管中的10ml新鮮血液與10ml磷酸鹽緩沖液(PBS)混合。然后將10ml Lymphoprep(Nycomed Pharma AS，Oslo，Norway)置于50ml管中，然后慢慢在頂部加上一層10ml的所述稀釋血液。
以2000rpm速度，將所述試管離心30分鐘。然后通過(guò)傾斜該試管，采用精密移液管吸出細(xì)胞層(3-5ml)，移出血漿下的薄淋巴細(xì)胞層。之后，將分離的淋巴細(xì)胞用PBS稀釋使得最終體積達(dá)到20ml。隨后以2000rpm速度，將這些細(xì)胞離心15分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞沉淀溶解于5ml PBS中。
以2000rpm速度，將男性三體性21妊娠的羊水樣本離心15分鐘。小心棄去上清液，將細(xì)胞沉淀再混懸于5ml PBS中。2)細(xì)胞混合液將各種成年女性細(xì)胞和男性胚胎細(xì)胞樣本的混合物制成終體積為10ml的溶液。胚胎與成人細(xì)胞的比例在1/10、1/100和1/1000體積百分比的范圍之內(nèi)。3)細(xì)胞/細(xì)胞核的膜的透化作用將溶血卵磷脂(5μg/ml的乙酸鈉溶液)加入到淋巴細(xì)胞和羊水樣本的混合液中。在4℃下，將這些細(xì)胞溫育2分鐘。加入2.5ml多聚甲醛終止該反應(yīng)。然后以2000rpm速度，將這些細(xì)胞旋轉(zhuǎn)15分鐘，用含有1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS洗滌2次。4)載玻片的制備和固定將200μl細(xì)胞混懸液置于干凈的載玻片上，放置干燥。然后將細(xì)胞用加入該載玻片上的200μl 2％甲醛固定，放置10分鐘。隨后將所述載玻片在PBS中洗滌，再通過(guò)一系列乙醇脫水。5)核酸外切酶消化在加熱板(40℃-50℃)上，將載玻片老化2小時(shí)。在每片載玻片50μl緩沖液中，用1-5單位的Bal 31酶(NeW England Bio labs)進(jìn)行酶消化。將載玻片置于37℃加熱板上10分鐘。室溫下，通過(guò)在2xSSC中洗滌所述載玻片，終止酶促反應(yīng)。然后將載玻片通過(guò)一系列乙醇脫水，空氣干燥。6)端粒的PAN FISH根據(jù)制造商的全端粒DNA試劑盒(Dako，Glostrup，Denmark)的使用說(shuō)明，將所述載玻片在Tris-緩沖鹽溶液(TBS)、3.7％甲醛和預(yù)處理溶液中洗滌。然后將載玻片通過(guò)一系列乙醇脫水，空氣干燥。向各載玻片上加入10μl FITC標(biāo)記的探針，然后蓋上一片玻璃蓋玻片。在80℃下，將這些載玻片溫育3分鐘，然后在室溫下暗處溫育30分鐘。將所述載玻片通過(guò)漂洗和沖洗溶液，通過(guò)一系列乙醇脫水。將這些載玻片空氣干燥，然后用包括DAPI的Vectashield(VectorLaboratories，Peterborough，UK)進(jìn)行復(fù)染色，隨后用蓋玻片覆蓋、密封。7)采用Vysis非整倍性檢測(cè)試劑盒，與染色體21、13、18、X和Y特異性的探針雜交通過(guò)將所述載玻片浸入丙酮中2分鐘，從載玻片上移去蓋玻片。然后將載玻片脫水，干燥。采用金剛石尖頭劃痕，在載玻片上標(biāo)記兩個(gè)雜交區(qū)段。通過(guò)浸入73℃下70％甲酰胺30％2xSSC中5分鐘，將靶DNA變性。向靶區(qū)段1中加入10μl CEP 18/X/Y探針混合物，向靶區(qū)段2中加入10μl LSI 13/21探針混合物(Vysis，US)，將蓋玻片放在所述探針溶液上。用橡膠膠水將蓋玻片密封，將載玻片放入預(yù)熱的濕化容器中，在37℃溫箱中放置16小時(shí)或過(guò)夜。移去蓋玻片，將載玻片在73℃下0.4xSSC/0.3％NP-40溶液中洗滌2分鐘。然后將載玻片置于室溫下2xSSC/0.1％NP-40溶液中1分鐘。當(dāng)完全干燥后，將10μl DAPI II復(fù)染劑(Vysis，US)加入到所述靶區(qū)段內(nèi)，在蓋玻片下密封。8)顯微鏡檢術(shù)采用100倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當(dāng)?shù)臑V器觀測(cè)信號(hào)，采用帶有SmartCapture軟件(Vysis，US)的CCD照相機(jī)獲得圖象。載玻片的掃描從蓋玻片的上部左角開(kāi)始，從頂部到底部移動(dòng)。
采用FITC濾器，開(kāi)始對(duì)端粒熒光進(jìn)行分析。使用England Finder(Graticules Ltd，Kent，UK)記錄陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的位置。然后用Orange濾器(Vysis，US)，對(duì)區(qū)段1和2上的細(xì)胞核再檢測(cè)，以分別對(duì)染色體Y和21進(jìn)行鑒定和計(jì)數(shù)。9)結(jié)果采用FITC濾器的熒光顯微鏡檢術(shù)表明在某些細(xì)胞核中有端粒信號(hào)，而在其它細(xì)胞核中沒(méi)有或幾乎沒(méi)有信號(hào)。顯示這些端粒信號(hào)的細(xì)胞核比例對(duì)應(yīng)于所制備和分析的胚胎和成人細(xì)胞核的混合物的預(yù)期比例。因此，胚胎細(xì)胞的濃度越低，非熒光細(xì)胞核的比例越高，反之如此。記錄適當(dāng)細(xì)胞核群的圖象，并記錄它們的位置。(圖2A和3A)。
接著，采用Orange濾器(Vysis，US)，分析所述相同的細(xì)胞群，以鑒定胚胎男性三體性21核，該核被認(rèn)為帶有一個(gè)Y染色體和三個(gè)染色體21信號(hào)。對(duì)每類細(xì)胞混合物(1/10，1/100，1/1000百分體積的胚胎與成人細(xì)胞)的總共1000個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行分析，分析該載玻片區(qū)域1的Y信號(hào)，載玻片區(qū)域2的染色體21信號(hào)。
發(fā)現(xiàn)具有端粒熒光性(即被認(rèn)為是胚胎細(xì)胞)的細(xì)胞核和Y信號(hào)的出現(xiàn)具有97.3％的一致性。Y熒光性的結(jié)果與根據(jù)制造商手冊(cè)對(duì)純胚胎細(xì)胞群(95-100)的對(duì)應(yīng)分析結(jié)果一致。(圖2B)。
發(fā)現(xiàn)具有端粒熒光性(即被認(rèn)為是胚胎細(xì)胞)的細(xì)胞核和三種染色體21信號(hào)的出現(xiàn)具有稍低的一致性。在重復(fù)試驗(yàn)中，該值在83-90％之間。但是這些結(jié)果與我們?cè)趲в信咛トw性的羊水樣本中常規(guī)記錄的結(jié)果一致，并且在制造商手冊(cè)記錄的范圍之內(nèi)。(圖3B)。10)說(shuō)明這些結(jié)果表明采用端粒和染色體特異性探針的雙重FISH分析，以及隨之在一時(shí)間過(guò)程內(nèi)的端粒酶促消化，可能在胚胎和成人細(xì)胞之間進(jìn)行區(qū)分。實(shí)施例2用母血對(duì)胚胎47、XY+21 Down氏綜合癥的產(chǎn)前診斷1.妊娠和血樣在獲準(zhǔn)Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書(shū)后，通過(guò)靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女取血12ml，加入到2個(gè)乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細(xì)胞的富集根據(jù)(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，F(xiàn)etal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說(shuō)明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進(jìn)行母血血漿內(nèi)胚胎帶核細(xì)胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉(zhuǎn)試管混合。用移液管將6ml該血液/PBS混合物加入到4個(gè)15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長(zhǎng)細(xì)插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開(kāi)始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉(zhuǎn)移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細(xì)胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)制備常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和固定將固定細(xì)胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術(shù)載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細(xì)胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過(guò)一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實(shí)施例1(第5段)中說(shuō)明的方案，用3單位的Bal 31酶進(jìn)行酶消化。5.采用全端粒、Y和21探針組合進(jìn)行FISH將0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標(biāo)記的探針(Appligene Oncor)、1μl LSI染色體21光譜橙探針(Vysis Ltd.)和1μl CEP(III)光譜水探針(Vysis Ltd.)與7.5μl的Hybrisol VI(Oncor Appligene)一起混合，作為每個(gè)載玻片的用量。將10μl該探針混合物置于含有所述靶細(xì)胞的顯微載玻片上。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過(guò)夜。
次日進(jìn)行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。在該載玻片上加上30μl標(biāo)記熒光素的抗毛地黃毒苷元抗體，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用DAPI復(fù)染。6.顯微鏡檢術(shù)分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當(dāng)?shù)臑V器觀測(cè)信號(hào)，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統(tǒng)和分析系統(tǒng)(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機(jī)獲得圖象并儲(chǔ)存相關(guān)圖象。
對(duì)共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行測(cè)定。大多數(shù)，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(綠)信號(hào)，它們被認(rèn)為是源于母體的核。用FITC、光譜橙和光譜水濾器，對(duì)其余5個(gè)細(xì)胞核捕獲圖象。這些5/1000細(xì)胞核可同時(shí)包含綠色端粒信號(hào)和水Y信號(hào)，因此被認(rèn)定為是源于男性胚胎的細(xì)胞核。但是，當(dāng)這5個(gè)細(xì)胞核還包含三個(gè)紅信號(hào)時(shí)，即表明該胚胎可能具有Down氏綜合癥的核型47、XY+21。概述和結(jié)論在通過(guò)Percoll梯度富集血漿部分胚胎細(xì)胞后，通過(guò)采用探針混合物Tel/Y/21對(duì)存在的端粒序列識(shí)別并對(duì)Y和染色體21信號(hào)計(jì)數(shù)，進(jìn)行FISH研究。
該實(shí)施例表明根據(jù)所用的探針混合物，以及體外酶促消耗后通過(guò)其保留的端粒熒光診斷Y/21源于胚胎細(xì)胞核，可鑒定該染色體的組成。這種組合能夠確定該胚胎是否是男性以及是否具有21三體Down氏綜合癥。實(shí)施例3用母血對(duì)胚胎47、XX、+21 Down氏綜合癥的產(chǎn)前診斷1.妊娠和血樣在獲準(zhǔn)Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書(shū)后，通過(guò)靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女中取血12ml，加入到2個(gè)乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細(xì)胞的富集根據(jù)(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999 R.-D.Wagner，F(xiàn)etal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說(shuō)明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進(jìn)行母血血漿內(nèi)胚胎帶核細(xì)胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉(zhuǎn)試管混合。用移液管將6ml該血液/pBS混合物加入到4個(gè)15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長(zhǎng)細(xì)插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開(kāi)始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉(zhuǎn)移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細(xì)胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)制備常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和固定將固定細(xì)胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術(shù)載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細(xì)胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過(guò)一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實(shí)施例1(第5段)中說(shuō)明的方案，用3單位的Bal 31酶進(jìn)行酶消化。5.采用全端粒、X/Y、13、18和21探針組合進(jìn)行FISH將0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標(biāo)記的探針(Appligene Oncor)與0.5μl生物素標(biāo)記的StarFISH人染色體全端粒探針(Cambio)混合。然后將該端?；旌衔锛尤氲?0μl MultiVysionTMPGT(Vysis Ltd.)中。將該探針混合物置于含有所述靶細(xì)胞的顯微載玻片上。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過(guò)夜。
次日進(jìn)行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。將30μl預(yù)混合的雙重顏色檢測(cè)試劑(Oncor Appligene)加到該載玻片上，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用DAPI復(fù)染。6.顯微鏡檢術(shù)分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當(dāng)?shù)臑V器觀測(cè)信號(hào)，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統(tǒng)和分析系統(tǒng)(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機(jī)獲得圖象并儲(chǔ)存相關(guān)圖象。
對(duì)共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行測(cè)定。大多數(shù)，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(黃)信號(hào)，它們被初步認(rèn)為是源于母體的核。用FITC、光譜橙、光譜水和光譜金濾器，對(duì)其余5個(gè)細(xì)胞核捕獲圖象。這些5/1000細(xì)胞核包含黃端粒信號(hào)，因此被認(rèn)定為是源于胚胎的細(xì)胞核。
這些細(xì)胞核可以例如還含有染色體13的兩個(gè)紅信號(hào)、染色體21的兩個(gè)綠信號(hào)、染色體X的兩個(gè)水信號(hào)以及對(duì)應(yīng)于染色體18的三個(gè)藍(lán)信號(hào)，但沒(méi)有Y染色體的金信號(hào)。這種圖譜表明該胚胎具有核型47、XY+18，表明為Edward氏綜合癥。概述和結(jié)論在通過(guò)Percoll梯度富集血漿部分胚胎細(xì)胞后，通過(guò)采用探針混合物Tel/13/18/X/Y/21對(duì)存在的端粒序列識(shí)別并對(duì)13、18、X、Y和染色體21信號(hào)計(jì)數(shù)，進(jìn)行FISH研究。
該實(shí)施例表明通過(guò)體外酶促消耗后其余端粒熒光，而診斷為源于胚胎本身的細(xì)胞核，可鑒定該細(xì)胞核染色體的組成(對(duì)應(yīng)于探針混合物13/18/X/Y/21)。這組合能夠確定該胚胎是否是女性以及是否具有Edward氏綜合癥。實(shí)施例4用母血對(duì)胚胎47、XXY Klinefelter氏綜合癥的產(chǎn)前診斷1.妊娠和血樣在獲準(zhǔn)Ethical Approval from the Local Ethical Committee的同意通知書(shū)后，通過(guò)靜脈穿刺從妊娠期16周的懷孕婦女中取血12ml，加入到2個(gè)乙二胺四乙酸(EDTA)管中。2.胚胎細(xì)胞的富集根據(jù)(Ganshirt等，Diagnostic Cytogenetics，Springer Lab Manual，1999R.-D.Wagner，F(xiàn)etal Cells In Maternal Blood，pp401-415)中說(shuō)明的稍加改變的方法，采用三密度梯度進(jìn)行母血血漿內(nèi)胚胎帶核細(xì)胞的富集。
將12ml該EDTA血液加入到12ml磷酸鹽緩沖液(PBS)中，倒轉(zhuǎn)試管混合。用移液管將6ml該血液/PBS混合物加入到4個(gè)15ml聚苯乙烯管中。采用連有注射器的長(zhǎng)細(xì)插管，放入三層PercollR(AmershamPharmacia)。開(kāi)始放入下層3ml 40％的Percoll，接著3ml 45％的Percoll，然后3ml 50％的Percoll。然后以500g速度，將該混懸液離心30分鐘。移出血漿層，轉(zhuǎn)移至清潔的試管中，再在500g速度下離心10分鐘。將該細(xì)胞沉淀在PBS中洗滌，然后根據(jù)細(xì)胞遺傳學(xué)制備常規(guī)使用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，用3∶1甲醇∶乙酸固定。3.載玻片的制備和后固定將固定細(xì)胞混懸液置于硅烷化的顯微鏡檢術(shù)載玻片上，放置干燥。然后在玻片染色缸中，再將該細(xì)胞混懸液甲醛固定10分鐘(50mlPBS，0.5g MgCl2，1.3ml甲醛)，通過(guò)一系列乙醇(70％，95％，100％)脫水，空氣干燥。4.核酸外切酶消化按實(shí)施例1(第5段)中說(shuō)明的方案，用3單位的Bal 31酶進(jìn)行酶消化。5.采用全端粒和18/X/Y探針組合進(jìn)行FISH將9.5μlAneuvysion CEP 18/X/Y(Vysis Ltd.)和0.5μl全端粒毛地黃毒苷元標(biāo)記的探針(Oncor)加在載玻片上，蓋上蓋玻片。然后在75℃下的加熱板上，將該載玻片變性5分鐘，用橡膠溶液密封，在37℃濕化箱中雜交過(guò)夜。
次日進(jìn)行雜交后清洗。將載玻片在43℃下50％甲酰胺中洗滌15分鐘，在37℃下2xSSC中洗滌8分鐘，然后置于室溫下的1xPBT中。在該載玻片上加上30μl標(biāo)記熒光素的抗毛地黃毒苷元抗體，在37℃下保持5分鐘。最后，將該載玻片在1xPBT中洗滌3次，每次2分鐘，空氣干燥，用一滴4’，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，VectashieldLtd.)復(fù)染。6.顯微鏡檢術(shù)分析采用40倍物鏡的Zeiss軸向落射熒光顯微鏡篩選載玻片。用適當(dāng)?shù)臑V器觀測(cè)信號(hào)，采用帶有SmartCapture圖象獲得系統(tǒng)和分析系統(tǒng)(Vysis/Applied Imaging)的CCD照相機(jī)獲得圖象并儲(chǔ)存相關(guān)圖象。
對(duì)共計(jì)1000個(gè)細(xì)胞核進(jìn)行測(cè)定。大多數(shù)，如995/1000(99.5％)，不包含端粒(綠)信號(hào)，它們被認(rèn)為是源于母體的核。另一方面，5個(gè)核包含端粒信號(hào)以及Y信號(hào)，被認(rèn)定為是源于胚胎的細(xì)胞核。
這5個(gè)核中的4個(gè)可能有兩個(gè)X信號(hào)，這種組合信號(hào)與胚胎核型47、XXY，即Klinefelter氏綜合癥一致。余下的一個(gè)細(xì)胞具有一個(gè)X和一個(gè)Y信號(hào)，被認(rèn)為是正常的46、XY男性細(xì)胞核。這5個(gè)細(xì)胞都具有兩個(gè)染色體18信號(hào)。
在這種情況下，可得出結(jié)論該胚胎具有與Klinefelter氏綜合癥一致的核型47、XXY。但是應(yīng)注意把帶有代表X雜交失敗的工藝人工產(chǎn)物(假的陰性胚胎細(xì)胞)的XY染色體成分的單細(xì)胞核或者另一種胚胎實(shí)際是一種核型47、XY[1]/47、XXY[4]的Klinefelter嵌合體的存在可能性區(qū)分開(kāi)來(lái)，是不可能的。概述和結(jié)論在通過(guò)Percoll梯度富集血漿部分胚胎細(xì)胞后，通過(guò)采用探針混合物X/Y/18(Vysis Ltd)對(duì)X、Y和染色體18計(jì)數(shù)，并應(yīng)用全端粒毛地黃毒苷元標(biāo)記的探針(Appligene Oncor)進(jìn)行端粒序列識(shí)別，從而進(jìn)行FISH研究。
該實(shí)施例表明根據(jù)所用的探針混合物，采用全端粒探針，以及體外酶促消耗后通過(guò)其余端粒熒光診斷為源于胚胎的細(xì)胞核中的X/Y/18，可鑒定胚胎細(xì)胞核染色體的組成?；趲в蠿XY和XY細(xì)胞核與端粒熒光的一致性，我們可以確定該胚胎具有非嵌合型或嵌合型Klinefelter氏綜合癥。
權(quán)利要求
1.一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核的方法，該方法包括(a)用酶使該樣本中的細(xì)胞核染色體進(jìn)行核酸外切消化以除去各染色體的末端區(qū)段，然后(b)檢測(cè)作為所述消化過(guò)程的結(jié)果而仍然存在于胚胎染色體中但是不存在于母體DNA中的DNA序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中將所述酶引入所述細(xì)胞中，這樣可使細(xì)胞核的染色體和所述DNA組分在該細(xì)胞內(nèi)原位進(jìn)行核酸外切消化。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中通過(guò)給予如溶血卵磷脂、皂苷或Triton X 100試劑，可使所述核膜能透過(guò)所述酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中在初始步驟中，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如暴露于卡諾依氏液(乙酸∶甲醇，3∶1)或甲醛，固定細(xì)胞核染色體。
5.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中胚胎染色體保留的所述DNA序列是端粒序列。
6.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中采用所述序列特異性的初級(jí)標(biāo)記探針，測(cè)定所述DNA序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述標(biāo)記物是熒光標(biāo)記物。
8.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中通過(guò)流式細(xì)胞分選方法，將鑒定的胚胎細(xì)胞核從母體細(xì)胞核中分離出來(lái)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中采用熒光原位雜交測(cè)定(FISH)鑒定包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核。
10.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中所述酶為BAL31。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中按以下各階段完成核酸外切消化，其中第一步除去3’突出端，第二步切除3’-5’ss區(qū)段，第三步消化ss區(qū)段。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中采用綠豆核酸酶完成所述第一步驟。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其中采用外切核酸酶III進(jìn)行所述第二步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中采用綠豆核酸酶進(jìn)行所述第三步驟。
15.根據(jù)任一項(xiàng)前述權(quán)利要求的方法，其中將鑒定的包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核進(jìn)行產(chǎn)前診斷。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述診斷檢測(cè)染色體異常。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其中通過(guò)將所述樣本與一種或多種二級(jí)標(biāo)記探針接觸進(jìn)行所述診斷，所述探針是特定染色體特異性的或者特定染色體節(jié)段DNA特異性的。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述二級(jí)探針帶有熒光標(biāo)記物。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中采用初級(jí)熒光標(biāo)記的探針測(cè)定所述胚胎染色體節(jié)段和DNA序列，所述二級(jí)探針帶有與所述初級(jí)探針不同波長(zhǎng)處熒光的熒光標(biāo)記物，其中通過(guò)檢測(cè)所述初級(jí)標(biāo)記物的熒光，對(duì)胚胎染色體節(jié)段和DNA序列進(jìn)行檢測(cè)，鑒定后，將所檢測(cè)熒光波長(zhǎng)變?yōu)樗龆?jí)探針的波長(zhǎng)，并觀察兩種探針的熒光是否發(fā)射于所述同一細(xì)胞核，但是鑒定不同染色體節(jié)段和DNA序列。
20.根據(jù)權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)的方法，其中所述二級(jí)探針是染色體18、21、13、X或Y特異性的。
21.根據(jù)權(quán)利要求17-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述二級(jí)探針是一種或多種特定染色體節(jié)段特異性的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，所述方法可用于診斷母體病癥。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述病癥是先兆子癇、預(yù)測(cè)早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)以及自身免疫疾病的后期發(fā)展。
24.根據(jù)權(quán)利要求15、22或23的方法，其中測(cè)定母體樣本中胚胎細(xì)胞的數(shù)量和濃度。
25.一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核的試劑盒，該試劑盒包括能夠消化染色體末端節(jié)段的外切核酸酶以及用于檢測(cè)在染色體末端節(jié)段中存在的特異性DNA序列的標(biāo)記探針。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的試劑盒，其中所述標(biāo)記探針是熒光標(biāo)記探針。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26的試劑盒，它還包括二級(jí)標(biāo)記探針，后者能診斷染色體/DNA病癥。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的試劑盒，其中所述二級(jí)標(biāo)記探針是熒光標(biāo)記探針。
29.一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核的方法，它基本上如本發(fā)明上文有關(guān)實(shí)施例所述。
30.一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)包含染色體和DNA的胚胎細(xì)胞核的試劑盒，它基本上如本發(fā)明上文所述。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒定母體血或陰道樣本內(nèi)包含染色體或DNA的胚胎細(xì)胞核的方法，該方法包括(a)將該樣本中的細(xì)胞核的染色體經(jīng)酶核酸外切消化以除去各染色體的末端區(qū)域，然后(b)檢測(cè)作為所述消化過(guò)程結(jié)果的保留在胚胎DNA中但不存在于母體DNA中的DNA序列。鑒別后，可對(duì)胚胎DNA進(jìn)行例如檢測(cè)染色體異常的診斷。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1436247SQ01811237
公開(kāi)日2003年8月13日 申請(qǐng)日期2001年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月20日
發(fā)明者M·A·胡爾藤 申請(qǐng)人:賽姆格有限公司