專利名稱：檢測核酸合成的反應(yīng)產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢測核酸發(fā)生擴增的方法。
然而，由于在樣品中存在很少量的目標基因的檢測通常不容易，需要擴增目的基因本身、其檢測信號等等。
在核酸擴增中，檢測發(fā)生擴增的最普遍方法是通過擴增后溶液進行瓊脂糖凝膠電泳和擴增產(chǎn)物結(jié)合熒光嵌入劑如溴化乙腚，由此觀察特殊熒光來實施的。當沒有其它DNA污染的可能且僅出現(xiàn)感興趣的擴增產(chǎn)物時，擴增后向溶液中添加熒光嵌入劑而省略電泳，可觀察到熒光。盡管這些方法簡單，還需要UV燈和暗室觀察熒光。
而且，當使用用各種標記物質(zhì)包括熒光染料標記引物或核苷酸進行擴增時，存在檢測摻入擴增產(chǎn)物中的標記的方法。然而這個方法需要分離沒有摻入擴增產(chǎn)物中的游離標記引物(或核苷酸)。因此，這個方法不適合使用很少量反應(yīng)溶液的基因擴增。而且，標記的引物和核苷酸昂貴。
為了達到上述目的，本發(fā)明人進行了專心的研究。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)使用由核酸擴增過程本身產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑能以簡單高敏感的方式檢測核酸發(fā)生擴增。這引導了本發(fā)明的完成。
更特別地是，本發(fā)明涉及通過使用產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑檢測使用酶發(fā)生核酸合成的方法。此外，本發(fā)明涉及通過擴增多核苷酸鏈上目標區(qū)域和使用擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑來檢測核酸發(fā)生擴增的方法。使用不溶物質(zhì)作為指示劑的檢測可通過測定濁度或檢測沉淀來實施。濁度的測定或沉淀的檢測可通過添加凝結(jié)劑(如聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖)來實施。
擴增方法包括實施下列步驟(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與F3序列相同的引物；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為模板合成DNA。這個方法稱作“環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)方法”。
也可以用LAMP方法進行擴增，按照與上面LAMP不同的實施方案的下列步驟(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c和第二條任意序列F2c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第三條任意序列R1和第四條任意序列R2；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；含有與R2序列相同的引物和在其5’端，序列R1c與R1互補；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為擴增模板合成DNA。
根據(jù)步驟(c)的DNA合成可在解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(如甜菜堿、三甲胺N-氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜和甲酰胺)存在下進行。
本發(fā)明進一步涉及監(jiān)測核酸擴增的方法，其中擴增多核苷酸鏈中的目標區(qū)域和隨時間檢測擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)?？捎美缟鲜鯨AMP方法進行擴增。
此外，本發(fā)明涉及檢測核酸發(fā)生擴增或監(jiān)測核酸擴增的試劑盒，包括下列元件(a)當以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇了第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇了第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3時，含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物，在序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與R3序列相同的引物；(b)催化互補鏈的鏈移位型合成的聚合酶；(c)作為元件(b)底物的核苷酸；(d)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(如甜菜堿、三甲胺N氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜和甲酰胺)；和(e)凝結(jié)劑(如聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖)。
本發(fā)明進一步涉及檢測核酸發(fā)生擴增或監(jiān)測核酸擴增的試劑盒，包括下列元件(a)當以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇了第一條任意序列F1c和第二條任意序列F2c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇了第三條任意序列R1和第四條任意序列R2時，含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；和含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；(b)催化互補鏈的鏈移位型合成的聚合酶；(c)作為元件(b)底物的核苷酸；(d)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(如甜菜堿、三甲胺N氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜和甲酰胺)；和(e)凝結(jié)劑(如聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖)。
用于表征組成本發(fā)明引物的核苷酸序列的術(shù)語“相同”和“互補”不是指絕對相同或絕對互補。也就是說，相同序列是包括能夠與某一序列退火的與核苷酸序列互補的某一序列。另一方面，互補序列是指在嚴格條件下能夠退火以提供互補鏈合成來源的序列。在本發(fā)明中，術(shù)語“相同”是指核苷酸序列的同源性，例如90％或更高，通常95％或更高，更優(yōu)選98％或更高。術(shù)語“互補”是指與互補序列相同的核苷酸序列。特別的是，當核苷酸序列與互補序列的同源性是例如90％或更高，通常95％或更高，更優(yōu)選98％或更高，可以說“互補”。優(yōu)選，當互補核苷酸序列作為互補鏈合成源時，在其3’末端具有至少一個與互補序列完全一致的核苷酸。
下面將詳細描述本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，合成或擴增多核苷酸鏈上的目標區(qū)域，然后檢測合成或擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)的存在，由此與核酸發(fā)生擴增關(guān)聯(lián)。1.檢測目標根據(jù)本發(fā)明的檢測目標包括所有不溶于水的焦磷酸鹽。當核苷酸摻入核酸鏈末端時，產(chǎn)生焦磷酸。術(shù)語“焦磷酸”和“焦磷酸鹽離子”這里用作同義詞。與焦磷酸形成不溶鹽的物質(zhì)中，鎂離子是聚合酶所需的必要成分。因此，焦磷酸鎂適用于這種檢測。當除了焦磷酸鎂的焦磷酸是檢測目標時，方法中需要一些設(shè)計方案，添加與焦磷酸形成不溶鹽的物質(zhì)。更特別的是，可在擴增前添加對聚合酶具有微弱抑制作用或不具有抑制作用的物質(zhì)。盡管一種物質(zhì)強烈抑制聚合酶，如果其量少至不產(chǎn)生抑制作用的程度的話，它也可在擴增前加入。當意欲加入大量強烈抑制聚合酶的物質(zhì)時，可在擴增后向反應(yīng)溶液中添加該物質(zhì)進行類似檢測。除了焦磷酸鎂外的檢測目標包括焦磷酸鈣、焦磷酸鋇和焦磷酸鉛。
本發(fā)明中的術(shù)語“多核苷酸”是指待擴增的核酸，通常包括DNA和RNA。生物樣品中通常包括該核酸。生物樣品是指動物、植物或微生物組織、細胞、培養(yǎng)物和分泌物，或來自它們的提取物。生物樣品包括細胞內(nèi)寄生基因組DNA或RNA如病毒或支原體。該核酸可以來源于生物樣品中所含的核酸。其實例包括由mRNA合成的cDNA和在來源于生物樣品的核酸基礎(chǔ)上擴增的核酸。2.使用酶合成核酸在使用酶合成核酸中，在酶協(xié)助下將核苷酸添加到核酸末端的過程中有時產(chǎn)生焦磷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用這種核酸合成產(chǎn)生的焦磷酸作為指示劑可檢測核酸發(fā)生擴增。
酶包括下列
大腸桿菌DNA聚合酶；Taq DNA聚合酶；T4 DNA聚合酶；逆轉(zhuǎn)錄酶；SP6 RNA聚合酶；T7 RNA聚合酶；末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶；Poly(A)聚合酶；Bst DNA聚合酶；和Vent DNA聚合酶。
可在任何常規(guī)條件下(T.Maniatis et al.，Molecular cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)實施使用每種酶的反應(yīng)。3.擴增本發(fā)明中待檢測的不溶物質(zhì)是焦磷酸鹽。因此，本發(fā)明中可使用的擴增沒有特別限制，只要焦磷酸由核苷酸摻入核酸鏈而產(chǎn)生。而且，不特別限制聚合酶。例如，除了可利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，可利用擴增方法如LAMP方法，鏈移位擴增(SDA)方法(例如，日本專利審查出版(kokoku)號7-114718)，和基于核酸序列的擴增(NASBA)方法(日本專利號2,650,159)。目前，PCR是體外擴增核酸技術(shù)的最普遍方法。
在LAMP方法中，環(huán)結(jié)構(gòu)在待擴增核苷酸序列末端形成，同時伴隨從那里起始的聚合酶引起的延伸，與環(huán)內(nèi)區(qū)域雜交的引物將延伸產(chǎn)物解散為單鏈，通過鏈移位來延伸核酸鏈。由于產(chǎn)生的單鏈核酸在其末端具有自身互補區(qū)域，它在末端形成環(huán)，開始新的延伸。實際的LAMP方法在等溫條件下進行，因此，上述反應(yīng)同時或并列發(fā)生。LAMP方法以除了等溫條件下進行的鏈移位型反應(yīng)之外的大量擴增產(chǎn)物為特征。其原因之一是LAMP方法不包括滅活聚合酶的熱變性。大量擴增產(chǎn)物是指產(chǎn)生大量焦磷酸，即大量不溶物質(zhì)。因此，LAMP方法適合作為本發(fā)明使用的核酸擴增的方法。(1)LAMP方法首先，示出了LAMP方法方案(

圖1和圖2)。在LAMP方法中，制備作為擴增目標的模板多核苷酸?？捎没瘜W合成方法，或按照常規(guī)方法從生物材料如組織或細胞制備模板多核苷酸(DNA或RNA)。在這種情況下，制備模板多核苷酸使得擴增的目標區(qū)域兩端(5’端和3’端)存在合適長度的序列(稱作“雙側(cè)序列”)(圖1A)。術(shù)語“雙側(cè)序列”是指包含目標區(qū)域5’末端到多核苷酸鏈5’末端區(qū)域的序列和目標區(qū)域3’末端到多核苷酸鏈3’末端區(qū)域的序列(圖1A中雙向箭頭(←→)指出的部分)。雙側(cè)序列的長度是在目標區(qū)域5’端和3’端有10至1,000個核苷酸，和優(yōu)選30至500個核苷酸。
預(yù)先確定的區(qū)域從含目標區(qū)域的和雙側(cè)序列的模板多核苷酸鏈(圖1A)中的雙側(cè)序列中任意選擇。特別是，以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈的3’末端的順序選擇第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c(圖1B)。類似地，以從目標區(qū)域的5’末端到多核苷酸鏈的5’末端的順序選擇第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3(圖1B)。當選擇任意序列F1c和任意序列R1時，F(xiàn)1c和R1之間的距離可以是0個核苷酸，即是相鄰的?？晒┻x擇地，可以以F1c和R1允許部分重疊的方式進行選擇。第一至第六區(qū)域是根據(jù)制備的多核苷酸鏈的序列獨自和任意選擇的。每個待選擇區(qū)域優(yōu)選包含5至100個核苷酸，和更優(yōu)選10至50個核苷酸。核苷酸長度的選擇利于下述引物退火。
優(yōu)選選擇每個任意序列使得LAMP方法得到的擴增產(chǎn)物優(yōu)先啟動序列F1c和F1之間以及序列R1和序列R1c之間的分子內(nèi)退火，而不是分子間退火，如圖2L所示，并形成末端環(huán)結(jié)構(gòu)。例如，為了優(yōu)先啟動分子內(nèi)退火，當選擇任意序列時，考慮序列F1c和序列F2c之間的距離以及序列R1和序列R1c之間的距離是重要的。更特別的是，優(yōu)選兩個序列位于0至500個核苷酸的距離內(nèi)，優(yōu)選0至100個核苷酸，和最優(yōu)選10至70個核苷酸。數(shù)值分別代表不含序列F1c和F2c以及序列R1和R2的核苷酸數(shù)量。
隨后，設(shè)計和合成稱作“FA引物”的引物，且它與F2c退火。術(shù)語“FA引物”包括與F2c區(qū)互補的序列F2和與F1c相同的另一個序列(為了方便，這可以稱作“F1c”)。其實例包括具有F1c的3’末端與F2的5’末端相連的結(jié)構(gòu)的那些序列(圖1C)。術(shù)語“退火”是指核苷酸鏈通過基于Watson-Crick模型的核苷酸配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)。FA引物與模板多核苷酸鏈中的序列F2c退火后，DNA鏈合成從FA引物中的F2開始啟動(圖1D)。隨后，含與F3c互補的序列F3的引物(以下這可以稱作“F3引物”)與模板多核苷酸鏈的序列F3c退火(圖1D)。然后從退火的F3引物(圖1E)開始進行鏈移位型DNA合成。當通過多核苷酸與用于合成互補鏈的模板雜交已產(chǎn)生的雙鏈結(jié)構(gòu)，進行從引物開始合成互補鏈的反應(yīng)，同時多核苷酸與模板分離時，這個過程術(shù)語稱作“鏈移位型DNA合成”。其具體的例子包括合成進行使得FA引物合成的鏈移位到F3引物合成的鏈的反應(yīng)。換句話說，F(xiàn)A引物合成的模板多核苷酸的互補鏈可以以互補鏈分離的方式被從F3引物延伸的鏈移位。
上述合成可得到兩種類型的核苷酸鏈，下列的(i)和(ii)。
(i)含有與模板多核苷酸鏈的序列“(3’)F3c-F2c-F1c-目標區(qū)域-R1-R2-R3(5’)”互補的序列“(5’)F3-F2-F1-目標區(qū)域-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸鏈(圖1F)。
(ii)核苷酸鏈移位(分離)而形成單鏈，即含有在其5’末端具有與F1c相同序列的“(5’)F1c-F2-F1-目標區(qū)域-R1c-R2c-R3c(3’)”的核苷酸鏈(圖1G)。
根據(jù)上述(ii)，F(xiàn)1和F1c在核苷酸鏈中彼此互補，因此，它們基于F1和F1c之間分子內(nèi)氫鍵彼此雜交，由此形成發(fā)夾環(huán)(圖1G)。F2包含在發(fā)夾環(huán)中。
隨后，根據(jù)上述(ii)，稱作“RA引物”的引物與核苷酸鏈中序列R2c退火。在RA引物中，與序列R1互補的序列R1c的3’端與序列R2的5’端連接。然后DNA鏈合成從RA引物開始啟動(圖1H)。當從RA引物開始合成的延伸DNA到達F1和F1c形成的雙鏈末端時，延伸DNA以如圖1E所示的移位相同的模式移位F1c序列(圖1I)。含與序列R3c互補的序列R3的引物(以下它可以稱作“R3引物”)接著與模板多核苷酸鏈的R3c退火(圖1I)。然后從退火的R3引物開始進行鏈移位型DNA合成(圖2J)?；谏鲜龊铣?，合成兩種類型的核苷酸鏈，即下列(iii)和(iv)。
(iii)與序列“(5’)F1c-F2-F1-目標區(qū)域-R1c-R2c-R3c(3’)”互補的核苷酸鏈“(3’)F1-F2c-F1c-目標區(qū)域-R1-R2-R3(5’)”(圖2K)。
(iv)核苷酸鏈(3’)F1-F2c-F1c-目標區(qū)域-R1-R2-R1c(3’)”，具有與3’末端最接近的F1，和與5’末端最接近的R1c(圖2L)。
上述(iv)的序列通過3’端存在的序列F1和F1c間和5’端的序列R1和R1c間的鏈內(nèi)氫鍵形成發(fā)夾環(huán)(圖2L)。
隨后，上述(iv)的核苷酸鏈，F(xiàn)A引物的F2區(qū)域在3’端發(fā)夾環(huán)部分與F2c退火(圖2M)。DNA鏈合成由鏈內(nèi)氫鍵從F1開始啟動。在圖1M中，從F1開始合成的延伸鏈到達R1-R2-R1c形成的開放發(fā)夾環(huán)5’末端。相比之下，當反應(yīng)從F2開始進行時，合成了與“F1c-目標區(qū)域-R1-R2-R1c”組成的鏈互補的-條鏈。在這種情況下，從F1開始合成的鏈F1和“F1c-目標區(qū)域-R1c-R2c-R1”被從F2開始合成的鏈移位。這提供了具有單鏈伸出結(jié)構(gòu)“-目標序列-R1c-R2c-R1”的雙鏈DNA(圖2N)。這個構(gòu)建體啟動由鏈內(nèi)氫鍵引起的從R1開始的DNA鏈合成(圖2N)。基于上述合成，得到了兩種類型的核苷酸序列，下列的(v)和(vi)。
(v)序列“(3’)R1-R2-R1c-目標區(qū)域-F1-F2-F1c-目標區(qū)域-R1-R2c-R1c-目標區(qū)域-F1-F2c-F1c-目標區(qū)域-R1-R2-R1c(5’)”(圖20)。
(vi)F1c位于最接近3’末端和R1位于最接近5’末端的序列“(3’)F1c-F2-F1-目標區(qū)域-R1c-R2c-R1(3’)”(圖2P)。
上述(v)和(vi)的核苷酸鏈通過鏈內(nèi)氫鍵分別形成R2c作為環(huán)部分的發(fā)夾環(huán)和F2和R2c作為另一個環(huán)部分的發(fā)夾環(huán)。RA引物與兩個序列，即上述(v)和(vi)中形成發(fā)夾環(huán)的R2c部分的退火，啟動從該引物開始的DNA合成，進行含目標序列的核苷酸鏈(含(vi)所示序列的互補鏈)合成。這條互補鏈與圖2L所示的序列相同，因此，根據(jù)圖2L至P的反應(yīng)其后重復。相比之下，圖1A的反應(yīng)可繼續(xù)進行，因此，重復這一系列合成進行多核苷酸鏈的擴增。
使用四種類型引物，即FA引物、RA引物、F3引物和R3引物進行上述擴增?？晒┻x擇地，僅使用兩種類型的引物，F(xiàn)A引物和RA引物，不使用F3引物和R3引物可啟動等溫條件下的擴增。在這個可供選擇的擴增中，優(yōu)選反應(yīng)系統(tǒng)中存在解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑，例如，甜菜堿、三甲胺N-氧化物(TMANO)、脯氨酸、二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺。(2)反應(yīng)條件在反應(yīng)中按照LAMP方法，下列成分加入模板單鏈核苷酸中，在緩沖液中可形成組成FA或RA的核苷酸序列和其互補核苷酸序列間穩(wěn)定的核苷酸配對，通過在能夠保持酶活性的室溫溫育進行反應(yīng)。溫育溫度是50至75℃，優(yōu)選55至70℃，溫育時間是1分鐘至10小時和優(yōu)選5分鐘至4小時。
(i)四種類型的寡核苷酸(FA，RA，外引物F3和外引物R3)(ii)DNA聚合酶引起的鏈移位型互補鏈合成(iii)作為DNA聚合酶底物的核苷酸根據(jù)上面兩個實施方案的LAMP方法中，F(xiàn)A引物和RA引物也稱作“內(nèi)引物”，F(xiàn)3引物和R3引物也稱作“外引物”。
從外引物的核苷酸鏈合成應(yīng)該在從內(nèi)引物的核苷酸鏈合成之后開始。滿足這個條件的方法包括設(shè)置內(nèi)引物的濃度高于外引物的濃度。更特別的是，可設(shè)置內(nèi)引物的濃度高于外引物2-50倍，優(yōu)選4至25倍。
催化鏈移位型互補鏈合成的聚合酶(這可以稱作“鏈移位型聚合酶”)包括Bst DNA聚合酶、Bca(exo-)DNA聚合酶、大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、Vent DNA聚合酶、Vent(Exo-)DNA聚合酶(從Vent DNA聚合酶去除了核酸外切酶活性)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(Exo-)DNA聚合酶(從Deep Vent DNA聚合酶去除了核酸外切酶活性)、φ29噬菌體DNA聚合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-TaqDNA聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，和KOD DNA聚合酶(ToyoboCo.，Ltd.)。
這個反應(yīng)在例如，給出酶反應(yīng)合適pH的緩沖液、維持酶催化活性或退火所需的鹽、酶的保護性試劑，和如果需要，解鏈溫度(Tm)調(diào)節(jié)劑存在下進行。使用緩沖液，如在弱堿至中性范圍內(nèi)具有緩沖作用的Tris-HCl。根據(jù)使用的DNA聚合酶調(diào)節(jié)pH。對于鹽，適合添加MgCl2、KCl、NaCl、(NH4)2SO4等來維持酶的活性并調(diào)節(jié)核酸的解鏈溫度(Tm)。牛血清白蛋白或糖可用作酶的保護性試劑。此外，甜菜堿(N，N，N-三甲基甘氨酸)、三甲胺N-氧化物(TMANO)、脯氨酸、二甲基亞砜(DMSO)或甲酰胺用作解鏈溫度(Tm)的調(diào)節(jié)劑。通過使用解鏈溫度(Tm)的調(diào)節(jié)劑，可在限制的溫度條件下調(diào)節(jié)寡核苷酸退火。特別是，甜菜堿和三甲胺N-氧化物(TMANO)由于其均衡穩(wěn)定的特性，也可有效提高鏈移位的效率。通過0.2至3.0M量的甜菜堿，優(yōu)選大約0.5至1.5M添加到反應(yīng)溶液中，可期望它促進本發(fā)明核酸擴增的作用。因為這些對解鏈溫度作用而降低解鏈溫度的這些調(diào)節(jié)劑，不得不考慮其它反應(yīng)條件如鹽濃度和反應(yīng)溫度，根據(jù)經(jīng)驗確定給出合適嚴格性和反應(yīng)性的條件。4.檢測根據(jù)本發(fā)明檢測核酸發(fā)生擴增的方法中，反應(yīng)產(chǎn)物中的不溶物質(zhì)用作檢測指示劑。此外，隨時間檢測擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)能夠監(jiān)測核酸擴增。待檢測的不溶物質(zhì)是用于擴增的核苷酸產(chǎn)生的焦磷酸和反應(yīng)溶液中的金屬離子結(jié)合產(chǎn)生的焦磷酸鹽，例如，焦磷酸鎂。
(1)直觀檢測檢測擴增產(chǎn)生的這個不溶物質(zhì)的最簡單方法是擴增后直觀檢測反應(yīng)溶液的濁度。第二個最簡單的方法是擴增后反應(yīng)溶液離心和直觀檢測沉淀的不溶物質(zhì)。
(2)濁度檢測測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度或分散光強度來確定反應(yīng)溶液的濁度。得到的濁度可用作檢測核酸擴增的指示劑。當測定吸光度時，可使用普遍使用的測定裝置。測定吸光度的波長可適當確定，通常在300至800nm進行測定，優(yōu)選在340至400nm的主波長，和補充波長600至800nm。當測定分散光強度時，可使用普遍使用的測定裝置。
根據(jù)本發(fā)明，特別是，測定吸光度對時間的改變能夠根據(jù)反應(yīng)持續(xù)時間監(jiān)測核酸擴增的進程。
(3)使用過濾器檢測反應(yīng)產(chǎn)物可通過濾色器過濾，可直觀檢測或基于光反射比改變來檢測過濾器上的殘留物。
添加凝結(jié)劑如聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖可增加沉淀產(chǎn)量并可提高檢測敏感性。而且，這些不溶物質(zhì)可被染色或標記，由此利于檢測或提高檢測敏感性。例如，添加酸性橙染色不溶物質(zhì)，因此利于檢測。5.檢測核酸發(fā)生擴增或監(jiān)測核酸擴增的試劑盒根據(jù)上面4條在檢測核酸發(fā)生擴增的方法或監(jiān)測核酸擴增的方法中，可包裝實施所需的試劑并作為試劑盒供應(yīng)。具體的例子包括含下列元件的試劑盒。[試劑盒元件](a)當以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇了第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇了第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3時，
含有與F2c互補的序列F2的引物，和在F2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物，在序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與R3序列相同的引物；(b)催化互補鏈的鏈移位型合成的聚合酶；(c)作為元件(b)底物的核苷酸；和(d)凝結(jié)劑(如聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖)。
試劑盒元件可根據(jù)待使用的LAMP方法的實施方案變化。特別是，含有與序列F3c互補的序列F3的引物和含有與任意序列R3相同的引物可任選地從元件(a)中省去。優(yōu)選，加入解鏈溫度調(diào)節(jié)劑(例如，甜菜堿、三甲胺N-氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜或甲酰胺)作為元件。此外，可任選加入給出酶反應(yīng)的合適條件的緩沖液和檢測反應(yīng)產(chǎn)物合成所需的試劑。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，反應(yīng)所需的試劑可以以分裝在反應(yīng)容器的狀態(tài)提供。
圖2顯示了LAMP方法的擴增方案。
圖3顯示了LAMP方法擴增得到的白色沉淀產(chǎn)物的照片。
圖4顯示了LAMP反應(yīng)溶液的吸收光譜的線圖。
圖5顯示了白色沉淀和商業(yè)上得到的Mg3(PO4)2和Mg2P2O7的紅外線吸收光譜的線圖。
圖6顯示了波長400nm下，濁度與焦磷酸鹽離子濃度之間的關(guān)系。
圖7顯示了在波長500nm下，LAMP反應(yīng)溶液濁度隨時間變化的線圖。
圖8顯示了在波長400nm下，LAMP反應(yīng)溶液濁度隨時間變化的線圖。
圖9顯示了濁度與合成DNA的量之間的關(guān)系的線圖。
圖10顯示了閾時間和模板DNA量之間的關(guān)系的線圖。
發(fā)明最佳實施方式將參考下列實施例更詳細描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些實施例。[實施例1](1)LAMP反應(yīng)反應(yīng)溶液的組分(100μl)20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO41M甜菜堿0.4mM dNTP8 U Bst DNA聚合酶未變性1×104分子λDNA(SEQ ID NO1)用作待擴增的多核苷酸。5′-GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGCTGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTCTTCATAATTCAATCCATTTACTATGTTATGTTCTGAGGGGAGTGAAAATTCCCCTAATTCGATGAAGATTCTTGCTCAATTGTTATCAGCTATGCGCCGACCAGAACACCTTGCCGATCAGC-3′(SEQID NO1)SEQ ID NO1中相當于目標區(qū)域、F1c、F2c、F3c、R1、R2和R3的區(qū)域如下。
目標區(qū)域僅僅是“G”，SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第92位F1cSEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第68-91位(24bp)F2cSEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第25-50位(26bp)F3cSEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第1-24位(24bp)R1SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第93-115位(23bp)R2SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第129-152位(24bp)R3SEQ ID NO1所示核苷酸序列中的第153-172位(20bp)具有下列序列的引物放入反應(yīng)溶液中并允許在65℃反應(yīng)1小時。
引物1600nM內(nèi)引物FA5’-TCCCCTCAGAACATAACATAGTAATGCGGTAAGTCGCATAAAAACCATTC-3’(SEQ ID NO2)1600nM內(nèi)引物RA5’-TGAAAATTCCCCTAATTCGATGAGGTCGGCGCATAGCTGATAACAAT-3’(SEQID NO3)400nM外引物F35’-GCTTATCTTTCCCTTTATTTTTGC-3’(SEQ ID NO4)400nM外引物R35’-GCTGATCGGCAAGGTGTTCT-3’(SEQ ID NO5)(2)LAMP產(chǎn)生的白色沉淀LAMP反應(yīng)完成后，以10,000rpm離心5分鐘。離心后，在管底檢測白色沉淀(0.2μl管)(在圖3右側(cè))。圖3左側(cè)的管是陰性對照(無模板)。(3)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物吸光度的測定測定設(shè)備Ultrospec 2000，Pharmacia Biothech Ltd.
光徑長度1cm細胞含量100μlLAMP反應(yīng)完成后，測定在500nm的吸光度。當在先反應(yīng)樣品顯示1.21的吸光度，反應(yīng)失敗的樣品(陰性對照)顯示0.25。
使用1cm細胞在室溫測定吸收光譜的結(jié)果，LAMP反應(yīng)溶液顯示出從300nm至600nm的寬吸收光譜(圖4)。
由于dNTPs或DNA在這種波長長度域內(nèi)不具有吸收性，推論這個寬的吸收是基于反應(yīng)溶液中細小顆粒對入射光的散射。為了證實上述推論，使用光散射顆粒分析儀分析反應(yīng)溶液。結(jié)果，證實了具有平均直徑大約2μm的細小顆粒形成。
因此，發(fā)現(xiàn)使用吸光度(濁度)作為指示劑可證實通過LAMP反應(yīng)核酸發(fā)生擴增。[實施例2]沉淀分析假定LAMP方法得到的白色沉淀是焦磷酸鎂，首先檢測它是否是焦磷酸鹽。100μl 1N NaOH加入實施例1得到的沉淀中，混合物在65℃溫育5分鐘。離心后，上清轉(zhuǎn)移到另一個管中，為了中和溶液，向其中加入100μl 1N HCl。向溶液中添加0.1N AgNO3，混合物變白(產(chǎn)生Ag4P2O7)。這表明該物質(zhì)是焦磷酸鹽。
隨后，使用鈦黃試劑檢測該金屬是否是鎂。鈦黃試劑用來檢測鎂或硼。然而，檢測的反應(yīng)系統(tǒng)中不含硼，因此，陽性結(jié)果將意味著僅存在鎂。
加入20μ1 0.1N HCl并溶解沉淀后，加入1μ1 2mg/ml鈦黃試劑。為了堿性化溶液，加入20μl 1N NaOH。結(jié)果，觀察到沉淀，鈦黃試劑檢測顯示淺紅褐色。這證明在白色沉淀中存在鎂。
對沉淀進行IR光譜分析。具體地，離心凝結(jié)實施例1得到的沉淀。凝結(jié)的產(chǎn)物用水洗滌三次，然后在硅膠干燥器中干燥1周。用KBr方法在室溫獲得的時間內(nèi)，對得到的干燥物質(zhì)進行IR光譜測定；64次/測定。商業(yè)上可獲得的焦磷酸鎂(Mg2P2O7)和單磷酸鎂(Mg3(PO4)2)(Merck制造)用作對照。結(jié)果，沉淀的IR光譜與商業(yè)上可獲得的Mg2P2O7一致如圖5所示。由于沒有觀察到有機化合物特定的CH突出峰(一般2,900cm-1；圖5中破折號箭頭周圍)，得出結(jié)論沉淀基本不含有機物質(zhì)。
這個結(jié)果證明白色沉淀是焦磷酸鎂。[實施例3]鎂離子和焦磷酸鹽離子沉淀的產(chǎn)生K2P2O7加入下列反應(yīng)溶液，使?jié)舛冗_到期望水平，讓混合物在65℃反應(yīng)1小時。測定反應(yīng)溶液的吸光度檢測由此產(chǎn)生的沉淀(A 440nm)。反應(yīng)溶液的組分20mM Tris-HCl pH8.810mM KCl10mM(NH4)2SO44mM MgSO4結(jié)果在圖6中顯示。如圖6所示，當P2O7離子濃度超過0.5mM時，產(chǎn)生沉淀。為了產(chǎn)生0.5mM或更多P2O7離子，應(yīng)該合成4μg/25μl或更多DNA。一般來說，LAMP可合成20μg/25μl或更多DNA。相比之下，PCR合成的DNA量是LAMP合成的大約1/100，因此，普通PCR不產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀。當將來發(fā)明擴增方法如能合成大量DNA的LAMP時，這個方法在檢測擴增發(fā)生中有用。[實施例4]LAMP反應(yīng)中吸光度隨時間的變化(監(jiān)測)在石英池(1cm細胞)中65℃進行LAMP反應(yīng)1.5小時。反應(yīng)溶液的組分和材料如引物與實施例1中使用的那些相同。在反應(yīng)過程中，隨時間在500nm測定吸光度。結(jié)果，陰性對照的吸光度不顯示任何改變，然而，陽性對照顯示吸光度增加，在60分鐘具有一個峰(圖7)。在圖7中，符號“○”代表反應(yīng)溶液，符號“●”代表陰性對照(無模板)。
類似地，使用1×10-20mol前列腺特異性抗原(PSA)作為模板，在石英池中65℃進行LAMP反應(yīng)40分鐘，隨時間在A400nm測定吸光度。5′-TGCTFGTGGCCTCTCGTGGCAGGGCAGTCTGCGGCGGTGTTCTGGTGCACCCCCAGTGGGTCCTCACAGCTGCCCACTGCATCAGGAACAAAAGCGTGATCTTGCTGGGTCGGCACAGCCTGTTTCATCCTGAAGACACAGGCCAGGTATTTCAGGTCAGCCACAGCTTCACACACCC-3′(SEQ ID NO6)在SEQ ID NO6中，相當于目標區(qū)域、F1c、F2c、F3c、R1、R2和R3的區(qū)域如下。
目標區(qū)域SEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第91-102位(12bp)F1cSEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第68-90位(23bp)F2cSEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第26-44位(19bp)F3cSEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第1-18位(18bp)
R1SEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第103-122位(22bp)R2SEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第139-161位(23bp)R3SEQ ID NO6所示核苷酸序列中的第162-178位(17bp)具有下列序列的引物放入反應(yīng)溶液中并允許在65℃反應(yīng)1小時。
引物1600nM內(nèi)引物FA5’-TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG-3’(SEQ IDNO7)1600nM內(nèi)引物RA5’-TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG-3’(SEQ IDNO8)400nM外引物F35’-TGCTTGTGGCCTCTCGTG-3’(SEQ ID NO9)400nM外引物R35’-GGGTGTGTGAAGCTGTG-3’(SEQ ID NO10)結(jié)果，陰性對照吸光度不顯示任何改變，然而，陽性對照在大約30分鐘達到平臺(圖8)。
這個結(jié)果證明隨時間觀察到焦磷酸鎂白色沉淀能夠監(jiān)測LAMP方法隨時間的核酸擴增。[實施例5]濁度和DNA合成量之間的關(guān)系以與實施例4相同方式，用PSA DNA作為模板進行LAMP反應(yīng)。隨時間測定濁度(A400nm)并定量DNA。用PicoGreen dsDNA定量試劑盒(Molecular Probe制造)定量DNA。濁度和DNA量之間的關(guān)系在圖9顯示。從圖9明顯看出，濁度和DNA量之間可觀察到線性相關(guān)，它顯示濁度增加與合成DNA的量成比例。[實施例6]LAMP反應(yīng)模板DNA的定量104，106和108分子PSA DNA用作模板，隨時測定濁度(A 400nm)，測定濁度達到1.0的時間(閾時間)。DNA量與閾時間之間的關(guān)系在圖10中顯示。從圖10明顯看出，DNA量與閾時間之間觀察到線性相關(guān)。因此，證明隨時測定濁度和確定閾時間可定量模板DNA量。[實施例7]使用凝結(jié)劑進行沉淀400μM聚丙烯酸(MW100,000)或10mM羧甲基葡聚糖(MW10,000)加入LAMP反應(yīng)溶液中作為凝結(jié)劑，進行LAMP反應(yīng)。結(jié)果，沉淀量隨凝結(jié)劑的添加而增加。[實施例8]染色不溶物質(zhì)檢測染色焦磷酸鎂沉淀是否會利于檢測。0.1g焦磷酸鎂中加入750μl酸性橙(終濃度65μM)。作為對照，僅制備酸性橙溶液。室溫攪拌4小時后，測定酸性橙上清的吸光度，基于與對照溶液吸光度之間的差異計算焦磷酸鎂上染色的量。
結(jié)果，52.8nmol酸性橙染色到0.1g焦磷酸鎂上。這表明添加到溶液中的酸性橙中有大約一半被焦磷酸鎂白色沉淀吸收。這個結(jié)果提示焦磷酸鎂白色沉淀吸收染料可利于檢測。而且，可能使用上清顏色的改變作為指示劑進行檢測。
不含文本的序列表SEQ ID NO1；合成DNASEQ ID NO2；合成DNASEQ ID NO3；合成DNASEQ ID NO4；合成DNASEQ ID NO5；合成DNASEQ ID NO6；合成DNASEQ ID NO7；合成DNASEQ ID NO8；合成DNASEQ ID NO9；合成DNASEQ ID NO10；合成DNA工業(yè)實用性本發(fā)明提供了檢測核酸發(fā)生擴增的新方法。根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過出現(xiàn)渾濁或沉淀來檢測擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)。因此，可以以很簡單方式檢測發(fā)生了擴增。
序列表<110>EIKEN CHEMICAL CO.，LTD.<120>檢測基因擴增產(chǎn)物的方法<130>PH-1166-PCT<150>JP 2000-132667<151>2000-05-01<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>172<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>1gcttatcttt ccctttattt ttgctgcggt aagtcgcata aaaaccattc ttcataattc 60aatccattta ctatgttatg ttctgagggg agtgaaaatt cccctaattc gatgaagatt 120cttgctcaat tgttatcagc tatgcgccga ccagaacacc ttgccgatca gc 172<210>2<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>2tcccctcaga acataacata gtaatgcggt aagtcgcata aaaaccattc50<210>3<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>3tgaaaattcc cctaattcga tgaggtcggc gcatagctga taacaat 47<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>4gcttatcttt ccctttattt ttgc24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>5gctgatcggc aaggtgttct 20<210>6<211>178<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>6tgcttgtggc ctctcgtggc agggcagtct gcggcggtgt tctggtgcac ccccagtggg 60 tcctcacagctgcccactgc atcaggaaca aaagcgtgat cttgctgggt cggcacagcc 120 tgtttcatcc tgaagacacaggccaggtat ttcaggtcag ccacagcttc acacaccc 178<210>7<211>44<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>7tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg 44<210>8<211>45<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>8tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg 45<210>9<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>9tgcttgtggc ctctcgtg 18<210>10<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成DNA<400>10gggtgtgtga agctgtg1權(quán)利要求
1.通過使用產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑檢測使用酶合成核酸的發(fā)生的方法。
2.通過擴增多核苷酸鏈中的目標區(qū)域和使用擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑檢測核酸發(fā)生擴增的方法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中用下列步驟進行擴增(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，F(xiàn)2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物和在序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與F3序列相同的引物；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為模板合成DNA。
4.權(quán)利要求2的方法，其中用下列步驟進行擴增(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c和第二條任意序列F2c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第三條任意序列R1和第四條任意序列R2；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，F(xiàn)2的5’端，序列與F1c相同；含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為擴增模板合成DNA。
5.權(quán)利要求3或4的方法，其中在解鏈溫度調(diào)節(jié)劑存在下合成DNA。
6.權(quán)利要求5的方法，其中解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是甜菜堿、三甲胺N-氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜或甲酰胺中任何一個。
7.權(quán)利要求1至6的方法，其中通過測定濁度或檢測沉淀來進行使用不溶物質(zhì)作為指示劑的檢測。
8.權(quán)利要求7的方法，其中進一步加入凝結(jié)劑來測定濁度或檢測沉淀。
9.權(quán)利要求8的方法，其中凝結(jié)劑是聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖。
10.監(jiān)測核酸擴增的方法，其中擴增多核苷酸鏈中的目標區(qū)域，隨時間檢測擴增產(chǎn)生的不溶物質(zhì)。
11.權(quán)利要求10的方法，其中用下列步驟進行擴增(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，F(xiàn)2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與F3序列相同的引物；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為模板合成DNA。
12.權(quán)利要求10的方法，其中用下列步驟進行擴增(a)以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇第一條任意序列F1c和第二條任意序列F2c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇第三條任意序列R1和第四條任意序列R2；(b)制備含有與F2c互補的序列F2的引物，F(xiàn)2的5’端，序列與F1c相同；含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；和(c)在鏈移位型聚合酶、引物、底物和緩沖液存在下，使用核苷酸鏈作為擴增模板合成DNA。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中在解鏈溫度調(diào)節(jié)劑存在下合成DNA。
14.權(quán)利要求13的方法，其中解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是甜菜堿、三甲胺N氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜或甲酰胺中任何一個。
15.權(quán)利要求10-14的方法，其中通過測定濁度來進行使用不溶物質(zhì)作為指示劑的檢測。
16.權(quán)利要求15的方法，其中進一步加入凝結(jié)劑來測定濁度。
17.權(quán)利要求16的方法，其中凝結(jié)劑是聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖。
18.檢測核酸發(fā)生擴增或監(jiān)測核酸擴增的試劑盒，包括下列元件(a)當以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇了第一條任意序列F1c，第二條任意序列F2c和第三條任意序列F3c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇了第四條任意序列R1，第五條任意序列R2和第六條任意序列R3時，含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；含有與F3c互補的序列F3的引物；含有與R2序列相同的引物，在序列的5’端，序列R1c與R1互補；和含有與R3序列相同的引物；(b)催化互補鏈的鏈移位型合成的聚合酶；(c)作為元件(b)底物的核苷酸；(d)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑；和(e)凝結(jié)劑。
19.檢測核酸發(fā)生擴增或監(jiān)測核酸擴增的試劑盒，包括下列元件(a)當以從目標區(qū)域的3’末端到多核苷酸鏈3’末端的順序，選擇了第一條任意序列F1c和第二條任意序列F2c，和以從目標區(qū)域的5’末端到核苷酸鏈5’末端的順序，選擇了第三條任意序列R1和第四條任意序列R2時，含有與F2c互補的序列F2的引物，在F2的5’端，序列與F1c相同；和含有與R2序列相同的引物和在該序列的5’端，序列R1c與R1互補；(b)催化互補鏈的鏈移位型合成的聚合酶；(c)作為元件(b)底物的核苷酸；(d)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑；和(e)凝結(jié)劑。
20.權(quán)利要求18或19的試劑盒，其中解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是甜菜堿、三甲胺N-氧化物、脯氨酸、二甲基亞砜或甲酰胺的任一種，和凝結(jié)劑是聚丙烯酸或羧甲基葡聚糖。
全文摘要
通過使用產(chǎn)生的不溶物質(zhì)作為指示劑檢測使用酶合成核酸的發(fā)生的方法。
文檔編號C12Q1/68GK1440463SQ01812204
公開日2003年9月3日 申請日期2001年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年5月1日
發(fā)明者森安義, 長嶺憲太郎 申請人:榮研化學株式會社