專利名稱：無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)的合成方法，該方法利用了無細(xì)胞系統(tǒng)。
作為后基因組計(jì)劃的一個中心課題是分析多種多樣蛋白質(zhì)基因的聚合體結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究中所獲得的成果包括結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物化學(xué)等基礎(chǔ)生物學(xué)等的研究，闡述了在作為其應(yīng)用的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中遺傳基因解碼結(jié)果同病因的關(guān)系，而且期待著以至在醫(yī)藥研制的廣闊領(lǐng)域中提供一種極其重要的理論。
作為在生物體外高效率地在細(xì)胞外進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的方法，迄今為止，正在積極地研究從生物體中提取，例如作為細(xì)胞內(nèi)含有蛋白質(zhì)解碼裝置的核糖體成分；并在該核糖體提取液中加入構(gòu)成解碼造型、基質(zhì)的氨基酸、能量源、各種離子、緩沖液，而且通過再加入其它有效基因，在試管內(nèi)合成蛋白質(zhì)的所謂無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法等。(特開平6-98790，特開平6-225783，特開平7-194，特開平9-291，特開平7-147992)。
在供無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用的反應(yīng)系，即無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中使用的蛋白質(zhì)合成用的細(xì)胞提取液或生物體組織提取液的配制中，正在使用大腸桿菌、小麥胚芽或家兔網(wǎng)狀紅血球等。由于無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系在肽合成速度和解碼反應(yīng)的準(zhǔn)確性兩個方面保持了與細(xì)胞相媲美的性能，且具有不需要復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)工序和繁雜的細(xì)胞培養(yǎng)工序，因此研制了迄今為止正在實(shí)際使用的系統(tǒng)。然而，一般認(rèn)為從生物體細(xì)胞提取的細(xì)胞提取液，其蛋白質(zhì)的合成性極其不穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)合成效率低，另外還因?yàn)楸４嬷械募?xì)胞提取液的質(zhì)量也在顯著下降，因此由無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系獲得的合成量因放射性同位素標(biāo)識可檢測程度的量很少，而不能用作實(shí)際生產(chǎn)蛋白質(zhì)的手段。
首先，作為解決現(xiàn)有無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系缺點(diǎn)的方法，本發(fā)明人等提供了一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的方法(WO00/68412號公報(bào))(WO01/27260號公報(bào))，該方法利用了(1)無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成用細(xì)胞提取物制劑以及無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法；以及(2)具有通用性及高效率功能的造型分子。
而且還報(bào)告了為提高蛋白質(zhì)的合成效率、連續(xù)合成無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成裝置。作為現(xiàn)有的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成裝置，可以舉出如使用限外過濾膜法、透析膜法以及將解碼造型固定在透析膜法與樹脂上的柱狀色譜法等[spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123～142]。其中，由于限外過濾膜法和透析膜法操作簡便，因此被廣泛使用。然而，在采用這些過濾膜的連續(xù)法中也存在著尚待解決的難題①所使用的膜材料強(qiáng)度低；②由于網(wǎng)眼阻塞而導(dǎo)致膜功能下降；③由于操作繁雜，因而需要熟練的技術(shù)等。
而且，通過利用限外過濾膜法和透析膜法等，手動進(jìn)行的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法雖可在由少數(shù)遺傳基因合成蛋白質(zhì)中可利用，但能高效率地從多數(shù)遺傳基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)是很困難的。因此研制可高效率地從多數(shù)遺傳基因生產(chǎn)蛋白質(zhì)的高效率全自動多檢測體蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，即發(fā)明解決現(xiàn)有連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法缺點(diǎn)的新技術(shù)乃是當(dāng)務(wù)之急。
另外本發(fā)明的范圍還包括無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于在上述無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法中，在反應(yīng)相和供給相間形成的直接接觸界面為垂直面形狀；而且本發(fā)明的一方面涉及一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于在將含有小麥胚芽提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液預(yù)培養(yǎng)(預(yù)熱)后，加入基質(zhì)和能量源供給溶液，稀釋含有小麥胚芽提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液；另外本發(fā)明的一方面涉及一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于在修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，在合成反應(yīng)停止后的反應(yīng)溶液中使用凝膠過濾柱或半透明膜，重新供給蛋白質(zhì)合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP和磷酸纖維酸等原料和能量源，同時(shí)通過從反應(yīng)溶液排出反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物，以提高合成反應(yīng)效率。
圖2表示使用小麥胚芽提取液的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法合成的綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)圖2A是通過14C-亮氨酸攝入量測量合成蛋白質(zhì)的結(jié)果；縱軸蛋白質(zhì)合成量；橫軸培養(yǎng)時(shí)間；表示采用現(xiàn)有修補(bǔ)式(○-○)以及口徑為7mm(□--□的大)、5mm(□-□的中)、或3mm(□-□的小)反應(yīng)容器的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式(層疊方式)的蛋白質(zhì)合成。■-■表示的是表示采用稀釋修補(bǔ)式的蛋白質(zhì)合成。表示縱軸蛋白質(zhì)合成量的放射能讀數(shù)是用單位等量的胚芽提取液量來表示。圖2B是合成生成物放射自體放射照相術(shù)的照片。
圖3表示通過使用小麥胚芽提取液的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法合成的二氫葉酸還原酶(DHFR)。
圖3A表示通過14C-亮氨酸吸入量測量合成蛋白質(zhì)的結(jié)果。表示使用現(xiàn)有修補(bǔ)式(○-○)與口徑為7mm反應(yīng)容器的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式(層疊方式)合成的蛋白質(zhì)(■-■)。表示縱軸蛋白質(zhì)合成量的放射能讀數(shù)是由單位等量的胚芽提取液量來表示。圖3B是考馬氏亮藍(lán)著色的合成物SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳圖。
圖4表示通過采用大腸桿菌提取液的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法合成的GFP。
圖4A是表示通過14C-亮氨酸吸入量測量合成蛋白質(zhì)的結(jié)果。表示使用現(xiàn)有修補(bǔ)式(○-○)和口徑為7mm反應(yīng)容器連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式(層疊方式)合成蛋白質(zhì)(■-■)。(□-□)表示通過稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法合成蛋白質(zhì)，表示縱軸蛋白質(zhì)合成量的放射能讀數(shù)由單位等量大腸桿菌提取液表示。圖4B是合成生成物放射自體放射照相術(shù)的照片。
圖5表示通過使用小麥胚芽提取液的不連續(xù)凝膠過濾修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法合成的GFP(□-□)。箭頭表示進(jìn)行反應(yīng)液凝膠過濾處理的時(shí)間；(■-■)表示未進(jìn)行凝膠過濾處理時(shí)的結(jié)果。
圖6表示具有通用性的質(zhì)粒pEU1的結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明一方面涉及一種連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法，其特征在于在一般的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，使含有生物提取物的合成反應(yīng)溶液(反應(yīng)相)與基質(zhì)以及能量源供給溶液(供給相)，不經(jīng)半透明膜或限外過濾膜等過濾隔離，而直接接觸，通過兩相接觸界面的自由擴(kuò)散，將供給相的基質(zhì)和能量源分子連續(xù)供給反應(yīng)相，同時(shí)通過使反應(yīng)相中生成的副產(chǎn)物向供給相排出來延長反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間，并以此來提高合成效率。
在上述連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，兩相的界面可作為水平面形成，也可作為垂直面形成。要將該界面形成水平面，例如在反應(yīng)容器首先加反應(yīng)相形成下層，然后為不使兩相界面發(fā)生紊亂，可在該反應(yīng)相上輕輕地層疊供給相(參照

圖1)。反應(yīng)容器在按其形態(tài)及尺寸，同時(shí)也可不賦予兩相間的溶質(zhì)的充分?jǐn)U散速度，例如可使用試管和多孔穴微型濃度滴定盤等，但不僅限于這些用具。另外在將合成反應(yīng)溶液(反應(yīng)相)與供給溶液(供給相)疊層后，通過對含有這些溶液的反應(yīng)容器施加離心操作也可使兩相界面形成垂直面的形狀。
兩相的接觸界面面積大的時(shí)候由擴(kuò)散產(chǎn)生的物質(zhì)交換率高，蛋白質(zhì)的合成率升高。因此，供給相對反應(yīng)相最佳的容量比因兩相界面面積而改變。供給相對反應(yīng)相的容量比雖沒有特別限制，例如界面為圓形，其直徑為7mm時(shí)，則從1∶4開始，而1∶8為理想，1∶5則更理想。
形成上述反應(yīng)相的合成反應(yīng)液由含有形成無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)所需要的生物體提取物以及蛋白質(zhì)合成的造型所需要的mRNA，以及現(xiàn)在已經(jīng)使用的修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中使用的組分構(gòu)成。生物體提取物可使用在現(xiàn)有無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成法中使用的眾所周知的生物體提取物，例如小麥胚芽提取物、大腸桿菌提取物或家兔網(wǎng)狀紅血球提取物等，這些提取物的配制可按照眾所周知的方法進(jìn)行。小麥胚芽提取物使用現(xiàn)刊[Madin K.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412號公報(bào))中記載的方法配制是理想的。合成反應(yīng)溶液，作為生物體提取物，在具體使用例如小麥胚芽提取物時(shí)，將該提取物含量占48％總?cè)萘?濃度200A260nmunits/ml)，按照最終濃度組分[1,000units/ml核糖核酸酶抗生劑(RNAsin)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml纖維酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鳥苷三磷酸(GTP)、16mM纖維酸磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]構(gòu)成。合成反應(yīng)溶液的組分不限于上述組分，也可采用更高效率地進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的組分。例如代替上述mRNA，在含有質(zhì)粒(目的遺傳基因做代碼)、RNA聚合酶、以及核苷酸類等復(fù)制反應(yīng)溶液中合成mRNA后，繼續(xù)將凝膠過濾法和透析膜法等使用該復(fù)制反應(yīng)溶液的組分轉(zhuǎn)變成由適于解碼反應(yīng)的組分構(gòu)成的溶液，也可將所得到的溶液作為合成反應(yīng)溶液(參照下述對照例1)。
而且，上述合成反應(yīng)溶液的組分可根據(jù)所用生物體提取物的種類適當(dāng)?shù)丶右愿淖?。使用大腸桿菌作為生物體提取物時(shí)，可使用根據(jù)現(xiàn)刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds，IRL Press，Oxford]配制的大腸桿菌提取物，并可按照該方法組分配制蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液。例如使大腸桿菌提取物含量占50％總含量，然后配制由下述最終濃度的組分[57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸氨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、0.3U/ml丙酮酸酶(PYRUVATNAZE)、0.17mg/ml大腸桿菌tRNA混合液、34mg/ml L-5-甲?；?5，6，7，8-四氫葉酸、6.7μg/ml質(zhì)粒(目的遺傳基因)；33μg/ml T7 RNA聚合酶、1.2mM ATP各0.85mM GTP、以及UTP和CTP、56mM磷烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)]構(gòu)成的復(fù)制反應(yīng)溶液。首先在合成mRNA后，繼續(xù)在凝膠過濾法和透析膜法等中將該復(fù)制反應(yīng)溶液的組分轉(zhuǎn)換成由適用于解碼反應(yīng)組分構(gòu)成的溶液，也可將所得到的溶液用作合成反應(yīng)溶液(參照下述對照例1)。而且在使用大腸桿菌提取液的合成無細(xì)胞蛋白質(zhì)系時(shí)，如上所述，在復(fù)制反應(yīng)液中首先合成mRNA后，通過在該復(fù)制反應(yīng)溶液上將供給溶液層疊，也可以在靜置條件下以適于解碼反應(yīng)的溫度進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。合成反應(yīng)溶液的組分不僅限定于上述組分，也可以使用更高效率進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的組分。例如，代替上述復(fù)制反應(yīng)溶液中的質(zhì)粒(目的遺傳基因)、T7RNA聚合酶、UTP以及CTP，也可以適當(dāng)添加用眾所周知的方法(Gurevich，V.V.，(1996)Methods in Enzymology，275，383-397)配制的目的遺傳基因進(jìn)行編碼的mRNA，來配制出適于解碼反應(yīng)的組分的合成反應(yīng)溶液。
另一方面，可在上述合成反應(yīng)溶液中通過添加纖維醇、木糖醇以及或血糖醇(Ficoll)等糖乙醇，提高該合成反應(yīng)液的粘度和密度，進(jìn)而控制反應(yīng)相與供給相的兩相間的混合速度，以促進(jìn)蛋白質(zhì)合成反應(yīng)更加穩(wěn)定。
而且形成上述供給相的供給溶液含有基質(zhì)和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP、纖維磷酸以及合成蛋白質(zhì)反應(yīng)所需要的其它離子以及緩沖液等。具體來說，例如在反應(yīng)相中使用含有小麥胚芽提取液的上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液時(shí)，可以使用由30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、1.2mM ATP、0.25mM GTP、16mM纖維磷酸、0.380mM精脒以及20種L型氨基酸(各0.3mM)的組分構(gòu)成的供給溶液。而且在反應(yīng)相中使用含有大腸桿菌提取液的上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液時(shí)，可以使用由組分，例如57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸胺、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、34mg/ml L-5甲?；?5，6，7，8四氫葉酸、1.2mMATP、0.85mM GTP以及UTP和CTP、56mM磷烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)構(gòu)成的供給溶液。
在靜置條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)，反應(yīng)溫度是在各種無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中通常使用的最佳溫度。作為生物體提取物，在使用小麥胚芽提取物時(shí)，是從20℃開始，到30℃，理想的溫度是26℃；使用大腸桿菌提取物時(shí)，從30℃開始，到37℃，理想的溫度是30℃。
而且本發(fā)明一方面涉及稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，該方法在利用小麥胚芽提取物的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，將反應(yīng)溶液預(yù)培養(yǎng)(預(yù)熱)后，通過添加稀釋溶液稀釋合成反應(yīng)溶液，進(jìn)而延長合成反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間，由此提高蛋白質(zhì)合成效率。
在稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，使用現(xiàn)有的修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液，例如使用由上述組分構(gòu)成的合成反應(yīng)溶液，首先經(jīng)15分鐘至30分鐘預(yù)培養(yǎng)，進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。然后添加基質(zhì)和能量源，基質(zhì)和能量源如含有氨基酸、ATP、GTP、纖維酸磷酸以及蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中需要的其它離子類和緩沖液等上述連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式蛋白質(zhì)合成方法中的供給溶液及其相同組分的溶液，在反應(yīng)液中含有的小麥胚芽提取液從7％稀釋到12％的程度的狀態(tài)下進(jìn)行合成反應(yīng)。蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的最佳溫度，在使用小麥胚芽提取物時(shí)從20℃開始，到30℃，最理想的溫度是26℃。由于眾所周知發(fā)酵素和解碼蛋白質(zhì)基因一般在低濃度下穩(wěn)定性降低，因此預(yù)先在合成反應(yīng)液中通過添加眾所周知的穩(wěn)定劑，例如纖維醇、木糖醇和血糖醇等，也可以獲得更高效率的合成反應(yīng)。
上述稀釋修補(bǔ)式蛋白質(zhì)合成方法在使用小麥胚芽提取物的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成系中是非常有效的，但是在采用大腸桿菌提取物的系中卻未發(fā)現(xiàn)這種效果。據(jù)認(rèn)為其原因在于小麥胚芽提取液的特性。
而且一般認(rèn)為，在該方法中，預(yù)培養(yǎng)是極其重要的工序，如果將該項(xiàng)操作省略，則降低蛋白質(zhì)合成反應(yīng)效率，因此在這種預(yù)培養(yǎng)時(shí)應(yīng)形成穩(wěn)定的初始解碼復(fù)合體，然而有關(guān)這種特異現(xiàn)象的分子結(jié)構(gòu)的實(shí)體仍然是今后的課題。
另外，本發(fā)明一方面涉及無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于在修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，對合成反應(yīng)停止后的反應(yīng)液使用凝膠過濾柱或半透明膜，重新供給蛋白質(zhì)合成所需要的基質(zhì)和能量源，例如氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等原料，同時(shí)通過從反應(yīng)溶液中將反應(yīng)生成的副產(chǎn)物排出，來提高合成反應(yīng)的效率。該方式是向蛋白質(zhì)合成反應(yīng)與基質(zhì)以及能量源的反應(yīng)液提供以及排出副產(chǎn)物的操作是由不連續(xù)的工序構(gòu)成的修補(bǔ)方法，因此在基本機(jī)制上與Spirin等人的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法不同。
在該不連續(xù)修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，使用反應(yīng)容器，例如試管等，按照現(xiàn)有的方法開始修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。在合成反應(yīng)停止后，通過將反應(yīng)液的溫度降低到0～4℃，使蛋白質(zhì)合成反應(yīng)完全停止。將反應(yīng)停止后的反應(yīng)液，加到預(yù)先在基質(zhì)以及能量源，例如在氨基酸、ATP、GTP以及含有纖維酸磷酸等溶液中，達(dá)到平衡的低分子化合物分離用的凝膠過濾粒子，例如使用交聯(lián)葡聚糖G-25等層析法上。達(dá)到平衡所使用的溶液可使用與上述連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式蛋白質(zhì)合成方法中的供給液組分相同的溶液。
由上述凝膠過濾操作，可使副產(chǎn)物排出到交聯(lián)葡聚糖粒子中，而且可將被轉(zhuǎn)換為新的氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成溶液回收成排泄部分。如果將所回收的溶液重新保溫，則開始解碼反應(yīng)，蛋白質(zhì)合成反應(yīng)進(jìn)行數(shù)小時(shí)。合成反應(yīng)再次停止時(shí)，再反復(fù)上述凝膠過濾操作。由于這種方法的循環(huán)可使在通常的修補(bǔ)式方法中在短時(shí)間內(nèi)停止的合成反應(yīng)延續(xù)很長時(shí)間，其結(jié)果可使蛋白質(zhì)合成回收量上升。
而且在上述不連續(xù)的修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，以將基質(zhì)以及能量源等再供給以及已排出副產(chǎn)物為目的，即使使用透析法代替上述凝膠過濾法，也可獲得與其相同或超過以上結(jié)果的效果。
如上所述，在涉及本發(fā)明的①使含有細(xì)胞提取液的合成反應(yīng)溶液構(gòu)成的反應(yīng)相與含有氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等的基質(zhì)以及能量源供給液構(gòu)成的供給相直接接觸，通過兩相接觸界面由自由擴(kuò)散，將供給相的基質(zhì)以及能量源連續(xù)供給到反應(yīng)相中，同時(shí)將反應(yīng)相中產(chǎn)生的副產(chǎn)物排出到供給相中的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)法；②在使用小麥胚芽的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，通過降低合成反應(yīng)溶液中含有的細(xì)胞提取液濃度的稀釋修補(bǔ)法；而且在③蛋白質(zhì)合成反應(yīng)停止后，利用凝膠過濾法或透析法，重新將蛋白質(zhì)合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維酸磷酸等基質(zhì)，以及能量源提供給合成反應(yīng)溶液，同時(shí)將反應(yīng)中生成的副產(chǎn)物不連續(xù)排出的不連續(xù)修補(bǔ)法。該不連續(xù)修補(bǔ)法與現(xiàn)有的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法不同，作為無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法是極其有效的。這些方法也可以分別單獨(dú)加以實(shí)施，也可以進(jìn)行配套利用。例如以提高蛋白質(zhì)合成效率為目的，可實(shí)施連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)法和不連續(xù)修補(bǔ)法，也可以將稀釋修補(bǔ)法與不連續(xù)修補(bǔ)法配套加以實(shí)施。另外，提高最初添加的細(xì)胞提取物或組織提取物的濃度，也可將上述三種方法配套加以實(shí)施。
另外，通過本發(fā)明，可延長無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間，因此與現(xiàn)有的修補(bǔ)法相比，則可進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)的合成效率；并建立了具有與利用Spirin建立的半導(dǎo)體膜的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法[Spirin，A.，etal.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]同等以上性能的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法。
現(xiàn)舉出以下實(shí)施例，更詳細(xì)地說明本發(fā)明。本發(fā)明不限于下述的實(shí)施例所限定的范圍。
小麥胚芽提取物是根據(jù)現(xiàn)刊[Madin K.et al.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]、(WO00/68412號公報(bào))中記載的方法所獲得的。
而且為了合成構(gòu)成小麥胚芽無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中的解碼造型的mRNA，利用了遠(yuǎn)藤建立的、具有通用性的質(zhì)粒pEU1(圖6)(WO01/27260號公報(bào))。作為編碼的目的蛋白質(zhì)的遺傳基因，使用水母的綠色螢光蛋白質(zhì)(GFP)的遺傳基因(gfp遺傳基因)，按照通常方法插入到上述的質(zhì)粒中。將所得到的質(zhì)粒經(jīng)HindIII切斷，加工成直鏈型；并將其制成復(fù)制造型，采用通常方法合成mRNA。所合成的mRNA在5′終端不具有CAP，作為非解碼排列，在5′終端上具有AMV-Ω排列、在3′終端上具有質(zhì)粒產(chǎn)生的500鹵基排列。所謂上述AMV-Ω排列是指將紫花苜?；ㄈ~病毒(AMV-mRNA)的5′終端引導(dǎo)結(jié)構(gòu)與煙草花斑病毒mRNA(TMV-mRNA)的5′終端Ω排列直接結(jié)合的鹵基排列(WO01/27260號公報(bào))。由于添加這些非解碼系列，因而增強(qiáng)了RNA的穩(wěn)定性。其結(jié)果若使用該RNA，則提高無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成效率。而且即使使用5′終端上具有CAP的mRNA，也可獲得以下相同的結(jié)果。
然后，小麥胚芽提取物含量占48％全容量(濃度為200A260nmunits/ml)，配制了由下列最終濃度的組分[1,000units/ml核糖核酸抗生劑(RNAsin)(寶公司制造)、30mM HEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、0.5mg/ml纖維酸激酶、1.2mM腺苷三磷酸(ATP)、0.25mM鳥苷三磷酸(GTP)、16mM纖維磷酸、0.380mM精脒、20種L型氨基酸(各0.3mM)、0.05％NP-40、600μg/ml mRNA]構(gòu)成的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液。為了測量蛋白質(zhì)的合成量，對上述1ml的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液，添加4μCi的14C高亮酸(300mCi/mmol)[Proc，Natl Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。
這種蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液放入口徑7mm、5mm以及3mm的反應(yīng)容器(分別為微型濃度滴定盤、1.5ml容量的試管以及0.2ml容量的試管)中，為了不使界面出現(xiàn)紊亂，在其上部靜靜地將5倍容量度供給液[30mMHEPES-KOH(pH7.6)、95mM醋酸鉀、2.65mM醋酸鎂、2.85mM二硫蘇糖醇、1.2mg/ml ATP、0.25mM的GTP、16mM的纖維磷酸、0.380mM的精脒、以及20種L型氨基酸(各0.3mM)層疊。在靜止條件下，在26℃下經(jīng)過3、6、9以及17個小時(shí)的培養(yǎng)，進(jìn)行合成蛋白質(zhì)的反應(yīng)。所合成的蛋白質(zhì)的質(zhì)量根據(jù)普通方法，以放射性同位素的三氯醋酸難溶部分的攝入量為指標(biāo)進(jìn)行測量。所合成的蛋白質(zhì)經(jīng)x線自動照相術(shù)采用普通方法[Endo，Y.etal.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]進(jìn)行檢測。其結(jié)果表示在圖2(A)以及圖2(B)中。
為了對照，實(shí)施了現(xiàn)有的修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法。在該方法中，mRNA、小麥胚芽提取物、以及含有小麥胚芽提取物的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液，雖與上述連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中所使用的液體相同，但也在不添加供給溶液上有所不同。
如圖2(A)所示，在所有的修補(bǔ)式(○-○)方法中，在反應(yīng)開始后的1小時(shí)內(nèi)，停止了蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)。其結(jié)果與現(xiàn)刊[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]所記載的結(jié)果完全一致。
一方面，在采用口徑為7mm的反應(yīng)容器(界面的面積為0.385cm2)的層疊式(大型□--□)中，即使反應(yīng)開始17小時(shí)，也還繼續(xù)合成反應(yīng)，其合成量達(dá)到現(xiàn)有的修補(bǔ)方法的9倍以上。另一方面使用規(guī)格尺寸不同的反應(yīng)容器，研究了影響該合成反應(yīng)的反應(yīng)相與供給相間的界面面積的影響，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)反應(yīng)開始9小時(shí)后的合成效率在與使用口徑7mm的反應(yīng)容器時(shí)相比較，5mm口徑的反應(yīng)容器(界面的面積為0.196cm2)(中型□--□)中合成效率為91％；在口徑3mm的反應(yīng)容器(界面的面積為0.071cm2)(小型□-□)中合成效率為75％。
而且如圖2(B)所示的x線自動照相術(shù)，由現(xiàn)有的修補(bǔ)法以及連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式的兩種方式合成的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)時(shí)間經(jīng)過與合成物分子量以及合成量，如圖2(A)所示，均完全支持采用14C-亮氨酸攝入量的測定研究蛋白質(zhì)合成量所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在圖2(B)中，表示出連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式為層疊式。而且采用連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的結(jié)果僅表示出在口徑為7mm反應(yīng)容器所得到的結(jié)果。
而且在該方法中，使用下述對照例1中所示出的復(fù)制、解碼整體型蛋白質(zhì)合成法在復(fù)制反應(yīng)液中合成mRNA后，繼續(xù)由使用凝膠過濾法及透析法將該復(fù)制反應(yīng)溶液的組分變換成適于解碼反應(yīng)的組分構(gòu)成的溶液。通過將所得到的溶液用作合成反應(yīng)溶液，進(jìn)而即使在合成與上述相同的蛋白質(zhì)反應(yīng)時(shí)也能獲得相同的結(jié)果。
從以上的結(jié)果可以看出①使用小麥胚芽提取液的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式蛋白質(zhì)合成方法，比現(xiàn)有的修補(bǔ)法明顯提高合成效率；②其合成效率在反應(yīng)相與供給相間的界面面積越大越優(yōu)異。而且也判明了采用該方法導(dǎo)致的合成量上升是由于延續(xù)合成反應(yīng)的時(shí)間所造成的緣故。實(shí)施例2作為稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法的一個實(shí)施例，進(jìn)行了通過使用含有在實(shí)施例1中配制的小麥胚芽提取物以及GFP進(jìn)行編碼的mRNA蛋白質(zhì)合成溶液，按現(xiàn)有的修補(bǔ)式在26℃進(jìn)行15分鐘的預(yù)培養(yǎng)，然后添加5倍容量的稀釋溶液后，經(jīng)在靜置條件下，進(jìn)一步在26℃進(jìn)行3、6、9小時(shí)培養(yǎng)，合成了蛋白質(zhì)。稀釋溶液使用了與在實(shí)施例1中配制的供給溶液相同組分的溶液。所合成蛋白質(zhì)的量進(jìn)行與實(shí)施例1相同的測定，其結(jié)果示于圖2(A)(■-■)及圖2(B)。
如圖2(A)所表明的那樣，與在1小時(shí)內(nèi)合成反應(yīng)的現(xiàn)有的修補(bǔ)式(O-○)比較，如果用稀釋式進(jìn)行無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，則直到反應(yīng)開始6小時(shí)止，呈線性延續(xù)了合成反應(yīng)(■-■)。
而且圖2(B)所示的x線自動照相術(shù)照片完全支持圖2(A)示出的14C-亮氨酸攝取量研究蛋白質(zhì)合成量所獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
該稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法的合成效率雖不如實(shí)施例1表示的連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式，但蛋白質(zhì)的合成量與現(xiàn)有的修補(bǔ)法相比，則是它的3倍，而表現(xiàn)出相當(dāng)高的合成效率。
而且在該方法中，也使用下述對照例1示出的復(fù)制、解碼整體形蛋白質(zhì)合成方法，在復(fù)制反應(yīng)液中合成mRNA后，繼續(xù)使用凝膠過濾法和透析法等將該復(fù)制反應(yīng)溶液組分轉(zhuǎn)換成適于解碼反應(yīng)的組分構(gòu)成的溶液，在將所得到的溶液用作合成反應(yīng)溶液、進(jìn)而即使在合成與上述相同的蛋白質(zhì)時(shí)也獲得同樣的結(jié)果。
而且在上述稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，在省略預(yù)培養(yǎng)反應(yīng)操作時(shí)，未發(fā)現(xiàn)上述的那種合成反應(yīng)顯著延續(xù)現(xiàn)象。另外，在使用大腸桿菌提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成系中也未發(fā)現(xiàn)稀釋修補(bǔ)式的效果。
如上所述，在使用小麥胚芽提取物的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中，證實(shí)了稀釋修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法也是蛋白質(zhì)合成的有效手段。
除了mRNA是編碼DHFR的mRNA以外，還使用與實(shí)施例1相同組分的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液進(jìn)行與實(shí)施例1相同的蛋白質(zhì)合成，其結(jié)果示于圖3。測量所合成蛋白質(zhì)的量是以按照常規(guī)方法將放射性同位素三氯醋酸不溶部分色譜的吸入量作為指標(biāo)來進(jìn)行，所合成蛋白質(zhì)的檢驗(yàn)使用由SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法進(jìn)行分離和考馬氏亮藍(lán)(CBB)染色法[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]進(jìn)行著色。
如圖3(A)所示，在DHFR合成中，連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法(■-■)的合成反應(yīng)時(shí)間也比現(xiàn)有的修補(bǔ)法(○-○)有明顯地延續(xù)。采用SDS-聚丙酰胺凝膠電泳法分析合成反應(yīng)的時(shí)間經(jīng)過與合成物量的結(jié)果[圖3(B)，箭頭表示DHFR考馬氏亮藍(lán)著色帶]完全支持圖3(A)示出的結(jié)果。從測定合成DHFR帶著色強(qiáng)度可以判明采用連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法在8小時(shí)反應(yīng)中，每1ml的反應(yīng)容量可合成0.9mg的DHFR。實(shí)施例4通過使用大腸桿菌提取液證實(shí)了連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法即使使用從任何生物種配制細(xì)胞提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系也是普遍有效的。
根據(jù)現(xiàn)刊[Pratt，J.M.，Transcription and Translation(1984)，179-209，Hames，B.D.& Higgins，S.J.，eds，IRL Press，Oxford]配制了大腸桿菌提取液。而且在本實(shí)施例中，首先用復(fù)制、解碼整體型無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系(參照對照例1)合成mRNA。在通過凝膠過濾法將含有該mRNA的復(fù)制反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)變成適于解碼反應(yīng)的反應(yīng)溶液組分后，加在反應(yīng)容器中，通過與實(shí)施例相同的方法將溶液層疊，在靜置條件下在30℃進(jìn)行了蛋白質(zhì)合成反應(yīng)。
首先配制含50％總?cè)萘康拇竽c桿菌提取液、且由下述的最終濃度組分，即57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸銨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、0.3U/ml丙酮酸酶(PYRUVATNAZE)、0.17mg/ml大腸桿菌tRNA混合液、34mg/ml的L-5甲?；?，6，7，8-四氫葉酸、6.7μg/m質(zhì)粒(將GFP遺傳基因編碼)、33μg/ml T7RNA聚合酶、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)組成的大腸桿菌無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)液，在30℃進(jìn)行90分鐘的培養(yǎng)，合成了mRNA。然后通過凝膠過濾法將上述溶液的組分轉(zhuǎn)變成適于解碼反應(yīng)的組分后，將該溶液25μl移送到反應(yīng)容器(口徑7mm微型濃度滴定盤)上，靜靜地將下述組分的供給溶液層疊，在30℃下合成蛋白質(zhì)。在以氨基酸攝入作為指標(biāo)測定蛋白質(zhì)合成時(shí)，將4μCi14C-亮氨酸(300mCi/mmol)添加到1ml上述反應(yīng)溶液中。
構(gòu)成mRNA復(fù)制造型的質(zhì)粒，使用以具有木川報(bào)告的T7-噬菌作催化劑排列的pK7-RAS[Kigawa，T.，et al.，(1995)J.Biomol.NMR，6，129-134]為基礎(chǔ)，由RAS遺傳基因置換水母GFP遺傳基因的溶液。
大腸桿菌無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系利用的供給溶液組分由最終濃度為57mM HEPES-KOH(pH8.2)、75mM醋酸鉀、36mM醋酸銨、16mM醋酸鎂、1.7mM二硫蘇糖醇、34mg/ml的L-5甲?；?5，6，7，8四氫葉酸、1.2mM的ATP、0.85mM的GTP以及UTP和CTP、56mM磷酸烯醇丙酮酸、20種L型氨基酸(各0.2mM)構(gòu)成。以蛋白質(zhì)合成攝入氨基酸量為指標(biāo)進(jìn)行測量時(shí)，對于1ml反應(yīng)溶液，添加4μCi14C-亮氨酸。
圖4(A)中示出了由14C-亮氨酸的攝入量來測定的蛋白質(zhì)的合成結(jié)果。GFP的合成反應(yīng)在現(xiàn)有的修補(bǔ)法(○-○)中，在反應(yīng)開始后3小時(shí)內(nèi)完全停止，但在連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法(■-■)中，延續(xù)到直至反應(yīng)開始17小時(shí)后。由氨基酸攝入量計(jì)算合成蛋白質(zhì)量時(shí)，采用連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法的合成量達(dá)到修補(bǔ)法合成蛋白質(zhì)量的4倍以上。采用圖4(B)示出的x線自動照相術(shù)的合成反應(yīng)時(shí)間經(jīng)過與合成物的分子量以及合成量的分析結(jié)果完全支持圖4(A)的結(jié)果。另一方面，在上述蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液(反應(yīng)相)中，將上述供給溶液(供給相)層疊后，立即由渦流攪拌器將兩相混合的對照性實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)合成量明顯地低于現(xiàn)有的修補(bǔ)法。
這一事實(shí)與Kim的報(bào)告完全相同[Kim，D.M.，(1996)Eur.J.Biochem.239，881-886]，即在大腸桿菌無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系中制備反應(yīng)溶液中高濃度的細(xì)胞提取液對提高合成效率是十分重要的。這一結(jié)果明確地表明，連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式所觀察到的蛋白質(zhì)合成反應(yīng)延續(xù)時(shí)間的延長現(xiàn)象僅僅是由于反應(yīng)溶液中蛋白質(zhì)的合成中所需要的成分，例如不是由于核蛋白體等濃度的下降所引起的反應(yīng)速度下降，而是連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法所具有的特性。
另一方面，使用大腸桿菌提取液在復(fù)制解碼整體型無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系(參照對照例1)中，首先在合成mRNA后，與實(shí)施例1相同，使供給液在反應(yīng)溶液上層疊，在靜置條件下即使在30℃進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)也可得到與上述相同的結(jié)果。
實(shí)施例5下面，說明通過利用凝膠過濾法的不連續(xù)修補(bǔ)式制造小麥胚芽的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法的實(shí)施例。首先與實(shí)施例1配制的溶液相同，使蛋白質(zhì)的合成溶液填加到普通的小型試管或96穴槽的濃度滴定盤上，在靜置條件下按照通常的方法在26℃下進(jìn)行反應(yīng)。在該反應(yīng)條件下，蛋白質(zhì)合成數(shù)小時(shí)，例如在含有48％總?cè)萘康男←溑哐刻崛∫簳r(shí)，反應(yīng)開始1小時(shí)內(nèi)，合成反應(yīng)完全停止。這一現(xiàn)象可從采用蛋白質(zhì)對氨基酸的攝入量的測量以及蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行核糖體分析中發(fā)現(xiàn)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]。在上述合成反應(yīng)停止的反應(yīng)溶液使用由預(yù)先在含有基質(zhì)及能量源，例如氨基酸、ATP、GTP、蛋白質(zhì)合成反應(yīng)中所需要的其它離子與緩沖液中進(jìn)行平衡的交聯(lián)葡聚糖糖柱色譜G-25色柱進(jìn)行凝膠過濾后，另在26℃進(jìn)行了蛋白質(zhì)合成。該供給溶液的組分與實(shí)施例1中使用的供給溶液相同。
如在圖5所示的14C-亮氨酸的攝入結(jié)果那樣，在現(xiàn)有的修補(bǔ)式中，合成反應(yīng)在反應(yīng)開始后1小時(shí)內(nèi)完全停止(■-■)。但是，在反應(yīng)開始3小時(shí)后，進(jìn)行如上所述的凝膠過濾操作(圖5中用箭頭表示)。而且在培養(yǎng)時(shí)，再次開始蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)(□-□)。另外，從14C-亮氨酸的攝入速度梯度大致與反應(yīng)開始初期的速度梯度相同，所以判明了與反應(yīng)初期的蛋白質(zhì)合成效率相比沒有降低凝膠過濾后的蛋白質(zhì)合成效率。
而且，在該方法中使用下述對照例1中示出的復(fù)制解碼整體型蛋白質(zhì)的合成方法在復(fù)制反應(yīng)溶液中合成mRNA后，繼續(xù)將在凝膠過濾法和透析法等中將該復(fù)制反應(yīng)溶液的組分轉(zhuǎn)換為由適于解碼反應(yīng)的組分構(gòu)成的溶液，并將所得到的溶液用作合成反應(yīng)液，在進(jìn)行與上述同樣的蛋白質(zhì)合成時(shí)也獲得了相同的結(jié)果。
由于使用小麥胚芽的上述無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系是極其穩(wěn)定的[Endo，Y.et al.，(1992)J.Biotech.，25，221-230]、[Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)，97，559-564]，因此，通過反復(fù)進(jìn)行該凝膠過濾操作，可使反應(yīng)時(shí)間延續(xù)很長時(shí)間。因此，上述不連續(xù)修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法，例如作為在使用小麥胚芽的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成系中的高效率合成方法是有用的。對照例1由復(fù)制解碼整體型蛋白質(zhì)合成方法在復(fù)制反應(yīng)溶液中合成mRNA后，繼續(xù)將在凝膠過濾法和透析法等中將該復(fù)制反應(yīng)溶液的組分轉(zhuǎn)換為由適于解碼反應(yīng)的組分構(gòu)成的溶液，可將所得到的溶液用作合成反應(yīng)溶液。
首先，作為反應(yīng)容器，使用安裝了凝膠過濾器的旋轉(zhuǎn)鼓，在同一容器內(nèi)將造型DNA、4種基質(zhì)核糖核苷-5′-3磷酸，而且按照需要添加CAP分子、RNA聚合酶、精脒、鎂離子以及由適當(dāng)?shù)木彌_液等構(gòu)成的反應(yīng)溶液[80mM HEPES-KOH(pH8.2)、16mM醋酸鎂、2mM精脒、10mM二硫蘇糖醇、2.5mM ATP、2.5Mm GTP、2.5mM CTP、2.5mM的UTP、1U/μL核糖核酸酶抗生劑、3U/μL SP6RNA核糖核酸酶(寶公司制造)]。按照其它用途，配制從上述的復(fù)制反應(yīng)溶液除去造型DNA、RNA聚合酶以及核糖核酸酶抗生劑的溶液，使用透析外液，進(jìn)行透析式連續(xù)合成mRNA。
在mRNA合成后，將旋轉(zhuǎn)鼓低速離心旋轉(zhuǎn)，通過使用實(shí)施例1中示出的蛋白質(zhì)合成溶液(不含mRNA)，進(jìn)行凝膠過濾操作，將上述復(fù)制反應(yīng)溶液轉(zhuǎn)換為適于解碼反應(yīng)的蛋白質(zhì)合成溶液。
工業(yè)實(shí)用性涉及本發(fā)明的上述無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法利用了半透明膜的限外過濾膜法和透析膜法，而且不使用在樹脂上將解碼造型固定的柱層析法等[Spirin，A.，et al.，(1993)Methods in Enzymology，217，123-142]的繁雜方法，通過在傳統(tǒng)的修補(bǔ)式方法中分別引用3種高效率合成反應(yīng)技術(shù)，即使通過任意一種手段都可以高效率地合成利用組織、細(xì)胞提取物的無細(xì)胞系中的蛋白質(zhì)。
涉及本發(fā)明的蛋白質(zhì)合成方法不具有使用現(xiàn)在正在進(jìn)行的連續(xù)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中所發(fā)現(xiàn)的膜材料強(qiáng)度的降低程度，以及因網(wǎng)眼阻塞而導(dǎo)致膜性能下降以及操作繁雜性等缺點(diǎn)，因此與傳統(tǒng)方法比較，可更高效率地進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成。所以，涉及上述本發(fā)明的技術(shù)將是對今后基因組項(xiàng)目結(jié)束而同時(shí)帶來數(shù)量龐大的遺傳基因的功能解析，以及面臨構(gòu)成結(jié)構(gòu)解析基礎(chǔ)的遺傳基因產(chǎn)物(蛋白質(zhì))的生產(chǎn)自動化所需要的基礎(chǔ)的重要技術(shù)。可以認(rèn)為尤其是對多被測體用全自動無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成機(jī)械手的研制等無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)的自動化之重要技術(shù)是不可欠缺的。
權(quán)利要求
1.一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法，該合成方法采用連續(xù)擴(kuò)散修補(bǔ)式，其特征在于，使含有生物體提取物的合成反應(yīng)溶液(反應(yīng)相)與基質(zhì)以及能量源供給液(供給相)直接接觸，通過兩相直接接觸界面的自由擴(kuò)散，將供給相的基質(zhì)以及能量源分子連續(xù)供給反應(yīng)相的解碼反應(yīng)系；同時(shí)通過將反應(yīng)相生成的副產(chǎn)物排出，延長合成反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間，提高合成反應(yīng)效率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法，其特征在于，生物體提取物為小麥胚芽提取液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，生物體提取物是大腸桿菌提取液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，將反應(yīng)相生成的副產(chǎn)物稀釋，向供給相排出。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，在反應(yīng)相與供給相間形成的直接接觸界面為垂直面狀。
6.一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，在將含有小麥胚芽提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)(預(yù)熱)后，添加基質(zhì)及能量源供給溶液，稀釋含有小麥胚芽提取液的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成反應(yīng)溶液。
7.一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，其特征在于，在修補(bǔ)式無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成方法中，在合成反應(yīng)停止后的反應(yīng)溶液中，使用凝膠過濾柱或半透明膜，再供給蛋白質(zhì)合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維磷酸等原料以及能量源；同時(shí)通過從反應(yīng)溶液中排出反應(yīng)中所生成的副產(chǎn)物，提高合成反應(yīng)的效率。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種無細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成方法，該方法使含有生物體提取物的合成反應(yīng)溶液(反應(yīng)相)與基質(zhì)以及能量源供給溶液(供給相)直接接觸，通過接觸界面使供給相的基質(zhì)及能量源分子自由擴(kuò)散，連續(xù)向反應(yīng)相供給；同時(shí)將反應(yīng)相生成的副產(chǎn)物排出到供給相，以延長反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間；該方法通過在將含有小麥胚芽提取物的反應(yīng)溶液預(yù)培養(yǎng)后，添加稀釋溶液加以稀釋，以延長合成反應(yīng)的延續(xù)時(shí)間；該方法在合成反應(yīng)停止后的反應(yīng)液中使用凝膠過濾柱和半透明膜將蛋白質(zhì)合成中所需要的氨基酸、ATP、GTP以及纖維磷酸等基質(zhì)以及能量源再供給；同時(shí)不連續(xù)排出反應(yīng)中的副產(chǎn)物，進(jìn)而提高反應(yīng)效率。
文檔編號C12P21/02GK1449449SQ01814793
公開日2003年10月15日 申請日期2001年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月29日
發(fā)明者遠(yuǎn)藤彌重太, 澤崎達(dá)也, 小笠原富夫 申請人:遠(yuǎn)藤彌重太