專利名稱：用殺蟲劑處理轉(zhuǎn)基因玉米種子的制作方法
相關專利和專利申請的交叉參考本申請是在2000年10月6日提交的第60/238,406號美國臨時專利申請的非臨時部分，并要求該臨時申請的優(yōu)先權。
(2)相關技術的描述據(jù)估計，每年在美國有15％的農(nóng)作物受到昆蟲和相關節(jié)肢動物的破壞，在發(fā)展中國家甚至更高。此外，競爭性雜草和寄生以及腐生植物甚至更有可能導致產(chǎn)量損失。
當在播種后植物病原體、昆蟲和其它這樣的土壤攜帶的害蟲破壞種子時，某些損害是在土壤中發(fā)生的。在玉米生產(chǎn)中，其余損害大部分是由食蟲一噬食或破壞植物根部的昆蟲類害蟲；和切根蟲、歐洲玉米鉆孔蟲和噬食或破壞植物地上部分的其它害蟲引起的。關于害蟲破壞農(nóng)作物的類型和機制的一般性描述可參見例如Metcalf，Destructive and Useful Insects，(1962)；和Agrios，PlantPathology，3rd Ed.，Academic Press(1988)。
玉米是美國中西部最重要的谷類農(nóng)作物。在該地區(qū)中最嚴重的玉米昆蟲類害蟲是三種條葉甲屬(Diabrotica)甲蟲的幼蟲形式。這些害蟲包括西部玉米食蟲-玉米幼芽根葉甲(Diabrotica vergiferavergifera LeConte)，北部玉米食蟲-Diabrotica berberi Smith和Diabrotica berberi Lawrence，和南部玉米食蟲-十一星瓜葉甲(Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)。事實上，在美國，用于控制玉米食蟲的殺昆蟲劑(insecticide)比用于任何其它玉米害蟲的殺昆蟲劑要多，并且處理的總英畝數(shù)大于任何其它害蟲。
玉米食蟲(CRW)在其中玉米在之前的季節(jié)生長的田地中在卵階段過冬。它們的卵在從五月末到六月的期間孵化。如果在接下來的一年中沒有繼續(xù)種植玉米農(nóng)作物，幼蟲將死亡。因此，玉米食蟲的影響直接作用于其中系統(tǒng)地連續(xù)種植玉米的區(qū)域中，美國中西部的許多地區(qū)是這種情況。
孵化后，幼蟲經(jīng)過三個幼蟲階段或齡期，期間它們噬食玉米根部系統(tǒng)。幼蟲階段的完成需要約三周。由幼蟲噬食所引起的對玉米根部系統(tǒng)的破壞是由于玉米食蟲造成的收獲損失的主要原因。在大部分根部系統(tǒng)被削弱或破壞后玉米植物倒下并倒伏在田地中是其損失的主要原因，因為倒伏的玉米不能通過常規(guī)機械化機器收割并遺留在田地中。
幼蟲發(fā)育完成后，幼蟲轉(zhuǎn)化成不能動的蛹，并由其轉(zhuǎn)化成在整個夏季從土壤中出現(xiàn)的成熟甲蟲，其中出現(xiàn)的時間取決于生長的位置。出現(xiàn)后，成熟的甲蟲吃食約兩周，然后雌性甲蟲開始產(chǎn)卵。開始時成蟲主要在其出現(xiàn)的同一田地中吃食，但是后來它們遷移到其它田地。頂峰成蟲活動通常于七月末或八月初發(fā)生在美國玉米地帶的連續(xù)種植玉米的田地中，但是成蟲活動可以在第一年末或晚熟的玉米田中達到頂峰。出現(xiàn)約兩周后，食蟲甲蟲開始在玉米田中產(chǎn)卵(關于更多的信息參見例如Corn Rootworms，F(xiàn)ield Crops Pest Management Circular#16，0hio Pest Management & Survey Program，The Ohio StateUniversity，Extension Division，Columbus，OH.；可在www.ag.ohio-state.edu/～obioline/icm-fact/fc-16.html上在線獲得，Sep.13，2000；和McGahen等人，Corn Insect ControlCornRootworm，PENpages number 08801502，F(xiàn)actsheet available fromPennsylvania State University，State College，PA，1989)。
目前在連續(xù)種植玉米的常規(guī)農(nóng)業(yè)實踐中，通常施用殺昆蟲劑來保護玉米根部系統(tǒng)不被食蟲幼蟲嚴重噬食。常規(guī)慣例是治療成熟的甲蟲或治療幼蟲。對于成熟的甲蟲，常規(guī)治療制劑的實例包括施用甲萘威殺昆蟲劑(例如以1.0-2.0Ibs活性/英畝施用SEVIN80S，)；殺滅菊酯或高氰戊菊酯(例如以0.1-0.2Ibs活性/英畝施用PYDRIN2.4EC，或以0.03-0.05Ibs活性/英畝施用ASANA0.66EC)；馬拉松(以0.9Ibs活性/英畝施用57％E)；氯菊酯(例如以0.1-0.2Ibs活性/英畝施用AMBUSH2.0EC，或以0.1-0.2Ibs活性組分/英畝施用POUNCE)；或以0.25-0.5Ibs活性/英畝施用PENNCAP-M。
為了治療CRW幼蟲，常規(guī)慣例是在播種時或播種后，但是盡可能在接近卵孵化時施用土壤殺昆蟲劑。常規(guī)治療包括呋喃丹殺昆蟲劑(例如以8oz/1000ft行施用的FURADAN15G)；毒死蜱(例如以8oz/1000ft行施用的LORSBAN15G)；地蟲磷(例如以4.5-6.0oz/1000ft行施用的DYFONATE20G)；甲拌磷(例如以6oz/1000ft行施用的THIMET20G)；特丁磷(例如以8oz/1000ft行施用的COUNTER15G)；或七氟菊酯(例如以4-5oz/1000ft行施用的FORCE3G)。
已知上面列出的許多化學殺蟲劑通常對人和動物有害。這些殺蟲劑引起的環(huán)境危害經(jīng)常由于通過葉噴霧來施用殺蟲劑或者將殺蟲劑直接施用到土壤表面上這樣的操作而加劇。風漂流、瀝濾和徑流可導致一大部分殺蟲劑從所需的活動地帶遷移到表面水內(nèi)，并與鳥類、動物和人直接接觸。
由于擔心化學殺蟲劑對公眾健康和環(huán)境有影響，人們已經(jīng)付出了很大努力來減小化學殺蟲劑的用量。最近，大部分努力是花費在開發(fā)能表達源自微生物的昆蟲毒素的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物上。例如，Estruch等人的U.S.專利5,877,012公開了將蛋白從微生物例如桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、Clavibacter和根瘤菌屬(Rhizobium)克隆和表達到植物中以獲得抗這些害蟲例如黑切根蟲、粘蟲、幾種鉆孔蟲和其它昆蟲類害蟲的轉(zhuǎn)基因植物。Privalle等人的出版物WO/EP97/07089描述了用編碼過氧化物酶的重組DNA序列轉(zhuǎn)化單子葉植物例如玉米，用于保護植物不被玉米鉆孔蟲、螟蛉和切根蟲噬食。Jansens等人在Crop Sci.，37(5)1616-1624(1997)中報道了含有編碼控制歐洲玉米鉆孔蟲生殖的結晶蛋白的得自蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的基因的轉(zhuǎn)基因玉米的生產(chǎn)。Koziel等人的U.S.專利5,625,136和5,859,336報道了用得自蘇云金芽孢桿菌的編碼δ-內(nèi)毒素的基因轉(zhuǎn)化玉米得到了具有改善的抗歐洲玉米鉆孔蟲能力的轉(zhuǎn)基因玉米。Armstrong等人在Crop Science，35(2)550-557(1995)中提供了關于表達源自蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米的大田試驗的綜述性報道。
已知野生型Btδ-內(nèi)毒素具有抗鞘翅類昆蟲的低活性，并且Kreig等人報道了首次分離出鞘翅類昆蟲毒性蘇云金芽孢桿菌菌株(參見U.S.專利4,766,203)。U.S.專利4,797,279和4,910,016也公開了產(chǎn)生具有某些鞘翅類昆蟲活性的蛋白的野生型和雜交的蘇云金芽孢桿菌菌株。然而最近，更精確的基因工程方法已表明有希望開發(fā)這樣的修飾的蘇云金芽孢桿菌蛋白，它們的玉米食蟲活性大大高于由野生型菌株產(chǎn)生的蛋白(參見例如Ecogen，Inc.和Monsanto Company的WO99/31248)。
然而，不知道任何單獨的轉(zhuǎn)基因事件是否足以在致力于連續(xù)種植玉米的重感染田地有效地保護玉米不被玉米食蟲破壞。事實上，從長遠來看通過任一種轉(zhuǎn)基因事件來防治玉米食蟲可能不理想，因為有可能產(chǎn)生耐受性目標害蟲變種。
常規(guī)形式的殺蟲劑施用的另一替代選擇是用殺蟲劑處理植物種子。使用殺真菌劑來保護種子在種植后不被破壞以及使用低水平的殺昆蟲劑來保護例如玉米種子不被金針蟲破壞已經(jīng)使用了一段時間。用殺蟲劑處理種子的優(yōu)點是給種子提供了保護作用，同時將殺蟲劑的必需量減至最小和限制必需的與殺蟲劑的接觸量以及不同的田地使用次數(shù)。
通過將殺昆蟲劑直接施用到植物種子上來防治害蟲的其它實例描述在例如U.S.專利5,696,144中，該專利公開了下述內(nèi)容與從未處理的種子生長出的對照植物相比，歐洲玉米鉆孔蟲對從用1-芳基吡唑化合物以500克/公擔種子的比例處理過的種子生長出的玉米的噬食破壞較小。此外，Turnblad等人的U.S.專利5,876,739(及其母專利U.S.專利5,849,320)公開了一種防治土壤攜帶的昆蟲的方法，包括用含有一種或多種聚合粘合劑與殺昆蟲劑的包衣處理種子。該參考文件提供了其認為是用于該包衣的候選化合物的一覽殺昆蟲劑，并且還列舉了多種可能的目標昆蟲。然而，雖然U.S.專利5,876,739聲稱用包含特定殺昆蟲劑的包衣處理玉米種子能保護玉米根部不被玉米食蟲損害，但是其沒有指出或建議這樣的處理可用于具有轉(zhuǎn)基因事件的種子。
用硝基亞氨基或硝基胍基化合物殺蟲劑處理具有轉(zhuǎn)基因事件的種子已經(jīng)提到過(參見例如WO99/35913)，然而，沒有發(fā)現(xiàn)關于這樣的治療的可能應用或效力的任何指導，或如何讓這樣的治療可能起作用-例如每單位數(shù)量的種子所必需的活性組分的量-的詳細描述，并且沒有提供任何能夠給出理由讓人們相信所提出的治療將實際提供適當保護的實施例。
因此，雖然最近在植物基因工程方面的進展已提高了不用使用化學殺蟲劑來保護植物不被害蟲破壞的能力，并且雖然象用殺蟲劑處理種子一樣，這樣的技術已經(jīng)減輕了殺蟲劑對環(huán)境的有害作用，但是仍然有很多問題限制了在實際田地條件下成功使用這些方法。因此，提供保護植物，尤其是玉米植物不被害蟲噬食破壞的改進方法將是有用的。如果這樣的方法能減少常規(guī)化學殺蟲劑的必需施用比例，并且如果其還能限制農(nóng)作物種植和耕作所需的單獨田間操作的次數(shù)，將是特別有用的。
本發(fā)明還涉及新的轉(zhuǎn)基因玉米植物種子，所述種子給所生長出的玉米植物提供了增強的抗一種或多種害蟲噬食性破壞的抵抗性，其中所述種子包含具有抗一種或多種害蟲當中至少一種的活性的轉(zhuǎn)基因事件，并且所述種子已經(jīng)用有效量的殺蟲劑處理過。
本發(fā)明還涉及已通過本發(fā)明方法處理的新的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
因此，在由本發(fā)明實現(xiàn)的幾個優(yōu)點中，可注意的有提供了保護植物、尤其是玉米植物不被害蟲噬食性破壞的改進方法；提供了能減少常規(guī)化學殺蟲劑的必需施用比例的方法；和提供了限制農(nóng)作物種植和耕作所必需的單獨田間操作的次數(shù)的方法。發(fā)明詳述依據(jù)本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可通過下述方法保護玉米植物抗一種或多種害蟲的噬食性破壞，所述方法包括提供包含具有抗至少一種害蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子；和用有效量的殺蟲劑處理該轉(zhuǎn)基因玉米種子。在優(yōu)選的本發(fā)明實施方案中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有抗玉米食蟲的活性的轉(zhuǎn)基因事件與用一些殺蟲劑處理種子的組合給進行這種處理的種子提供了意想不到的協(xié)同性優(yōu)點，包括保護所生長出的玉米植物不被玉米食蟲破壞的意想不到的優(yōu)良效力。特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在保護所生長出的玉米植物抗更嚴重水平的玉米食蟲破壞-已知能減少玉米產(chǎn)量的破壞水平-方面，具有引起CryBb.11231內(nèi)毒素生成的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子與用吡蟲啉處理這樣的種子的組合意想不到地優(yōu)于單獨的轉(zhuǎn)基因事件或單獨地用吡蟲啉處理。
已經(jīng)進行過基因工程改造以引入編碼以表達出具有抗鞘翅類害蟲活性的Cry3δ-內(nèi)毒素的源自蘇云金芽孢桿菌的外源基因的玉米植物和種子是已知的，用殺蟲劑處理種子(甚至某些轉(zhuǎn)基因種子)的方法也是已知的。然而，直至本發(fā)明以前，沒有認識到可用一定有效量的一些殺蟲劑來處理具有這樣的Cry3事件的玉米種子，其結果是這樣的組合能有效地、優(yōu)選意想不到地優(yōu)良地提高殺蟲劑和轉(zhuǎn)基因事件的效力，并且將提供下述其它優(yōu)點提高使殺蟲活性與抗害蟲壓力相匹配的能力，降低處理和/或施用的成本，提高種子操作的安全性，以及降低轉(zhuǎn)基因事件與殺蟲劑任一種或二者對環(huán)境的影響。
特別是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在優(yōu)選的實施方案中，用約100克-約400克的一些殺蟲劑/l00kg種子處理能夠表達一些修飾的Cry3Bb蛋白的轉(zhuǎn)基因玉米種子提供了意想不到的優(yōu)良的抗玉米食蟲的保護作用。此外，據(jù)信這樣的組合還能有效地保護生長出的玉米植物抗黑切根蟲的破壞。還據(jù)信本發(fā)明種子具有降低殺蟲劑使用成本的性質(zhì)，因為與不使用本發(fā)明方法相比，可使用較少量的殺蟲劑來獲得所需水平的保護。此外，由于使用較少的殺蟲劑，并且由于在播種之前施用以及沒有單獨的田地施用，所以相信本發(fā)明方法對于操作者和環(huán)境是安全的，并且可能成本低于常規(guī)方法。
當提及某些作用是“協(xié)同作用”時，其包括在轉(zhuǎn)基因事件與殺蟲劑的組合的殺蟲活性(效力)方面的組合協(xié)同作用。然而，這并不是意味著這樣的協(xié)同作用限制在殺蟲活性上，它們應當還包括意想不到的優(yōu)點例如活性范圍增加、有利的活性特征如破壞的類型和量減少、減少殺蟲劑和施用的成本、減少殺蟲劑在環(huán)境中的分布、減少殺蟲劑暴露于生產(chǎn)、操作和播種玉米植物的個人以及本領域技術人員已知的其它優(yōu)點。
本發(fā)明還提供了提高使殺蟲活性與抗害蟲壓力相匹配的能力的優(yōu)點。這是指這樣的能力，設計轉(zhuǎn)基因事件與殺蟲劑處理的組合，以在目標害蟲對種子或植物的噬食壓力達到最大時給種子或所生長出的植物提供有效殺蟲活性。例如，當給具有玉米食蟲轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子施用殺蟲劑例如吡蟲啉或terfluthrin時，可在設計用于提供殺蟲劑緩釋的包衣中施用該殺蟲劑?？蛇x擇釋放速度，以使得殺蟲劑在玉米的發(fā)芽后階段提供抗其它害蟲例如黑切根蟲的保護作用，同時轉(zhuǎn)基因事件在植物發(fā)育的后期提供對玉米食蟲的保護作用-當需要這樣的保護作用時。
本文所用術語“殺蟲作用”和“殺蟲活性”或“活性”是指抗害蟲的毒害作用。術語“抗(一種或多種)害蟲活性”也具有相同含義。當提及種子或植物“被保護以抗一種或多種害蟲的噬食性破壞”時，這是指這樣的種子或植物具有這樣的特征，該特征具有對一種或多種害蟲的直接或間接的作用，這種作用導致與在相同條件下對不具有該特征的植物的噬食性破壞相比，這種或這些害蟲對具有該特征的植物的種子、根部、芽和葉子的噬食破壞減輕了。這樣的直接或間接作用包括引起害蟲死亡，將害蟲從植物種子、根部、芽和/或葉子中驅(qū)逐出去，抑制害蟲對植物種子、根部、芽和/或葉子的噬食，或抑制害蟲在種子、根部、芽和/或葉子上產(chǎn)卵，和抑制或預防害蟲的繁殖。
術語“殺昆蟲活性”與殺蟲活性具有相同含義，但是其限于其中害蟲是昆蟲的情況。除非另有說明，否則當術語“殺蟲劑”在本文中使用時，該術語是指在外部提供給種子的殺蟲劑，并且其不包括由特定種子或從特定種子生長出的植物產(chǎn)生的活性劑。然而，所用的術語“殺蟲活性”和“殺昆蟲活性”可以指在外部提供的殺蟲劑和/或由種子或植物產(chǎn)生的活性劑的活性。
本發(fā)明的一個特征是轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子。本文所用術語“轉(zhuǎn)基因玉米植物”是指玉米植物或源自轉(zhuǎn)化的玉米植物細胞或原生質(zhì)體的其后代，其中植物DNA含有本來在相同株系的天然非轉(zhuǎn)基因植物中不存在的引入的外源DNA分子。
轉(zhuǎn)基因玉米種子是含有編碼殺蟲蛋白的外源基因的種子。這類殺蟲蛋白描述于下列文獻中Schnepf等人的Microbiology & MolecularBiology Reviews，62775-806(1998)，以及ffrench-Constant和Bowen的CMSL Cell.Mol.Life Sci.，57828-833(2000)。在一個本發(fā)明實施方案中，殺蟲蛋白是殺昆蟲蛋白。
種子優(yōu)選含有源自蘇云金芽孢桿菌菌株的外源基因，特別是，所述外源基因優(yōu)選是編碼源自蘇云金芽孢桿菌的殺昆蟲δ-內(nèi)毒素的基因。這樣的δ-內(nèi)毒素描述在WO99/31248和U.S.專利6,063,597中，并包括Cry3毒素。編碼可用于本發(fā)明中的修飾的蘇云金芽孢桿菌鞘翅類害蟲毒性結晶蛋白的核酸片段描述在U.S.專利6,060,594中，并且包含編碼這樣的殺昆蟲蛋白的核酸序列的抗昆蟲轉(zhuǎn)基因植物公開在U.S.專利6,023,013中。本發(fā)明δ-內(nèi)毒素優(yōu)選包括Cry3B蛋白，甚至更優(yōu)選地，所述δ-內(nèi)毒素包括鞘翅類害蟲活性Cry3Bb蛋白。Hfte和Whitely在Microbiol.Rev.，53242-255，1989中提出了蘇云金芽孢桿菌殺昆蟲結晶蛋白的命名原則。該命名原則已經(jīng)被修正過，并且該修正的命名原則可參見http//epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil-Crickmore/Bt/index.html。在本文中可使用該修正的命名原則來描述轉(zhuǎn)基因事件特征以及由轉(zhuǎn)基因事件編碼的δ-內(nèi)毒素蛋白。
當術語“轉(zhuǎn)基因事件”在本文中使用時，這樣的術語是指上述基因工程改造的DNA，但是還包括由修飾的基因編碼的蛋白。因此，在玉米種子或玉米植物中的轉(zhuǎn)基因事件包括表達蛋白的能力。當提及“轉(zhuǎn)基因事件具有抗害蟲的活性為時，應當理解，事實上是由基因編碼的蛋白具有這樣的活性，并且是在當?shù)鞍妆磉_并與害蟲接觸時實現(xiàn)這樣的活性。
WO99/31248和U.S.專利6,063,597描述了對蘇云金芽孢桿菌δ-內(nèi)毒素基因進行基因工程改造以能夠表達出修飾的δ-內(nèi)毒素的方法。修飾的δ-內(nèi)毒素與野生型蛋白的不同之處在于，與由野生型生物體產(chǎn)生的蛋白相比，它們具有特定的氨基酸取代、加入或缺失。在本文中，通過使用星號(*)或通過用其識別數(shù)字描述特定蛋白來表示這樣的修飾的δ-內(nèi)毒素。因此，基因修飾的Cry3δ-內(nèi)毒素可以用Cry3*表示，其實例包括但不限于Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3gb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb.11098。
已發(fā)現(xiàn)，在WO99/31248和U.S.專利6,063,597中描述的某些修飾的δ-內(nèi)毒素具有增強的抗鞘翅類昆蟲，特別是抗條葉甲屬昆蟲，包括玉米食蟲的活性。本文所用術語“增強的活性”是指，當在相同條件下測試時，與沒有氨基酸修飾的同一內(nèi)毒素的活性相比，修飾的內(nèi)毒素的增強的殺昆蟲活性。特別是，已發(fā)現(xiàn)，Cry3*δ-內(nèi)毒素具有增強的抗玉米食蟲的活性，因此優(yōu)選用于本發(fā)明。更優(yōu)選的是Cry3B*δ-內(nèi)毒素，甚至更優(yōu)選的是Cry3Bb*δ-內(nèi)毒素。甚至更優(yōu)選的轉(zhuǎn)基因事件是包含表達下表所列的修飾的δ-內(nèi)毒素的能力的那些。該表還顯示了包含表達各自的新內(nèi)毒素的基因的轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌菌株，其在Agricultural Research Service Collection(NRRL)at 1815 N.University Street，Peoria，I11.91904中保存的日期以及保藏號。
還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當與具有轉(zhuǎn)基因事件、并且轉(zhuǎn)基因事件具有一定水平的抗害蟲有效性的種子聯(lián)合使用時，優(yōu)選的本發(fā)明應用是減輕害蟲的噬食性破壞。為了舉例說明怎樣的有效水平是優(yōu)選的，下列實例將使用Iowa Root Rating Method(Hills and Peters，J.Econ.Entomol.，64764-765，1971)，該方法以1-6的等級估量玉米食蟲對玉米根部的噬食性破壞。在該等級評定中，1＝?jīng)]有破壞或僅少數(shù)較小的噬食疤痕；2＝明顯的噬食疤痕，但是沒有根被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)；3＝幾個根被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)，但是根的整個節(jié)點的同等物沒有被毀壞；4＝一個根節(jié)點被完全毀壞；5＝兩個根節(jié)點被完全毀壞；且6＝三個或更多個根節(jié)點被毀壞。毀壞的根定義為已經(jīng)毀掉至基部根的1.5英寸內(nèi)的根部。毀掉的根不用必須源自一個節(jié)點，但是所有毀掉的根都必須等于完整節(jié)點的同等物以視為毀壞的節(jié)點。
如果與沒有轉(zhuǎn)基因事件的相同農(nóng)作物相比，轉(zhuǎn)基因事件將害蟲的噬食性破壞減少了一定量，但是沒有防止目標害蟲的基本上所有破壞，則本文所用的轉(zhuǎn)基因事件在抗目標害蟲的有效水平的優(yōu)選范圍內(nèi)。例如，如果10％的轉(zhuǎn)基因玉米遭受了4或更高級(按照Iowa 1-6等級)的破壞，而80％的非轉(zhuǎn)基因玉米遭受了4或更高級的破壞，則可以說對轉(zhuǎn)基因玉米的破壞是對非轉(zhuǎn)基因玉米的破壞的(10/80)×100＝12.5％。應當理解，對于本發(fā)明目的，如果在相同條件下具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米受到害蟲的破壞是非轉(zhuǎn)基因玉米所受到的相同害蟲破壞的約5％-約50％，則玉米中的轉(zhuǎn)基因事件在優(yōu)選的有效水平范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，在相同條件下具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米受到害蟲的破壞是非轉(zhuǎn)基因玉米所受到的相同害蟲破壞的約10％-約40％，甚至更優(yōu)選地，在相同條件下具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米受到害蟲的破壞是非轉(zhuǎn)基因玉米所受到的相同害蟲破壞的約15％-約30％、還更優(yōu)選約20％-約30％。當使用如本文所用的術語“約”來描述對玉米的破壞程度時，應當理解，該破壞程度可在所述限度之上或之下多達1％或2％，并且仍然視為在所述范圍內(nèi)。例如，4.5％破壞應當視為“約5％”。
雖然不希望受縛于這個或任何其它理論，但是據(jù)信，當與提供抗目標害蟲的在優(yōu)選有效范圍內(nèi)的保護的轉(zhuǎn)基因事件聯(lián)合使用時，用殺蟲劑處理種子可提供顯著的優(yōu)點。此外還據(jù)信，本領域技術人員眾所周知得到具有在優(yōu)選有效范圍內(nèi)的轉(zhuǎn)基因事件在什么情況下是有利的。
本發(fā)明還包括具有一種以上轉(zhuǎn)基因事件的種子和植物。這樣的組合稱為“堆積的”轉(zhuǎn)基因事件。這些堆積的轉(zhuǎn)基因事件可以是針對同一目標害蟲的轉(zhuǎn)基因事件，或者它們可針對不同的目標害蟲。在一個優(yōu)選的方法中，具有表達Cry3蛋白的能力的種子還具有表達至少一種不同于Cry3蛋白的其它殺昆蟲蛋白的能力。
在另一個優(yōu)選的方法中，具有表達Cry3蛋白的能力的種子還具有提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件。提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件更優(yōu)選是提供抵抗草甘膦、N-(膦?；谆?甘氨酸，包括這些除草劑的異丙基胺鹽形式的能力的轉(zhuǎn)基因事件，甚至更優(yōu)選是能有效地給得自gonsanto Co.，St.Louis，MO的ROUNDUP READY植物和種子提供除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因事件。
在本發(fā)明方法中，用殺蟲劑處理具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子。
適用于本發(fā)明的殺蟲劑包括除蟲菊酯和合成擬除蟲菊酯；噁二嗪衍生物類；chloronicotinyls類；硝基胍衍生物類；三唑類；有機磷酸酯類；吡咯類；吡唑類；苯基吡唑類；二?；骂?；生物/發(fā)酵產(chǎn)物；和氨基甲酸酯類。關于在這些分類內(nèi)的殺蟲劑的進一步信息可參見例如The Pesticide Manual，11th Ed.，C.D.S.Tomlin，Ed.，BritishCrop Protection Council，F(xiàn)arnham，Surry，UK(1997)。
可用于本發(fā)明的擬除蟲菊酯包括除蟲菊酯和合成擬除蟲菊酯。優(yōu)選用于本發(fā)明方法的除蟲菊酯包括但不限于2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)-環(huán)丙烷甲酸的2-烯丙基-4-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮酯，和/或(2-甲基-1-丙烯基)-2-甲氧基-4-氧代-3-(2-丙烯基)-2-環(huán)戊烯-1-基酯及其順式和反式異構體的混合物(Chemical AbstractsService Registry Number(″CAS RN″)8003-34-7)。
優(yōu)選用于本發(fā)明的合成擬除蟲菊酯包括(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(殺滅菊酯；CAS RN 51630-58-1)、(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(S)-4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(高氰戊菊酯；CAS RN 66230-04-4)、(3-苯氧基苯基)-甲基(+)順式-反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氯菊酯；CAS RN 52645-53-1)、(±)α-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基(+)-順式，反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氯氰菊酯；CAS RN 52315-07-8)、(乙體氯氰菊酯；CAS RN 65731-84-2)、(辛體氯氰菊酯；CAS RN 71697-59-1)、S-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)順式/反式3-(2，2-二氯乙烯基)2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(己體氯氰菊酯；CAS RN 52315-07-8)、(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(溴氰菊酯；CAS RN52918-63-5)、α-氰基-3-苯氧基芐基2，2，3，3，-四甲基環(huán)丙烷甲酸酯(甲氰菊酯；CAS RN 64257-84-7)、(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基(R)-2-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氨基]-3-甲基丁酸酯(氟胺氰菊酯；CASRN 102851-06-9)、(2，3，5，6-四氟-4-甲基苯基)-甲基-(1α，3α)-(Z)-(±)-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(七氟菊酯；CAS RN 79538-32-2)、(±)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)-4-(二氟甲氧基)-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(氟氰戊菊酯；CAS RN70124-77-5)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯苯菊酯；CAS RN 69770-45-2)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯氰菊酯；CAS RN 68359-37-5)、(β-氟氯氰菊酯；CAS RN 68359-37-5)、(四氟菊酯；CAS RN 118712-89-3)、(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基(Z)-(1R-順式)-2，2-二甲基-3-[2-(2，2，2-三氟-三氟甲基-乙氧基羰基)乙烯基]環(huán)丙烷甲酸酯(氟酯菊酯；CAS RN101007-06-1)、α-氰基-3-苯氧基芐基-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯的(1R順式)S和(1S順式)R對映異構體對(甲體氯氰菊酯、CAS RN 67375-30-8)、[1R，3S)3(1′RS)(1′，2′，2′，2′-四溴乙基)]-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基酯(四溴菊酯；CAS RN 66841-25-6)、氰基-(3-苯氧基苯基)甲基2，2-二氯-1-(4-乙氧基苯基)環(huán)丙烷甲酸酯(乙氰菊酯；CAS RN 63935-38-6)、[1α，3α(Z)]-(±)-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯((RS)氯氟氰菊酯；CAS RN 68085-85-8)、[1α(S)，3α(Z)]-氰基(3-苯氧基苯基)甲基-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氯氟氰菊酯；CAS RN91465-08-6)、(2-甲基[1，1′-聯(lián)苯]-3-基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯菊酯；CAS RN 82657-04-3)、5-1-芐基-3-呋喃基甲基-d-順式(1R，3S，E)2，2-二甲基-3-(2-氧代，-2，2，4，5-四氫亞噻吩基甲基)環(huán)丙烷甲酸酯(噻嗯菊酯，RU15525；CAS RN 58769-20-3)、[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]-3-呋喃基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(芐呋菊酯；CASRN 10453-86-8)、(1R-反式)-[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]甲基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(右旋反滅蟲菊酯；CAS RN28434-01-7)、3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酰亞氨基甲基-(1RS)-順式-反式-菊酸酯(胺菊酯；CAS RN 7696-12-0)、3-苯氧基芐基d，1-順式，反式2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(苯醚菊酯；CAS RN26002-80-2)、(烯炔菊酯；CAS RN 54406-48-3)、(苯醚氰菊酯；CASRN 39515-40-7)、(烯酮菊酯；CAS RN 23031-36-9)、(咪炔菊酯；CASRN 72963-72-5)、(RS)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代環(huán)戊-2-烯基-(1A，3R；1R，3S)-2，2-二甲基-3-(2-甲基丙-1-烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(丙烯除蟲菊；CAS RN 584-79-2)、(反丙烯除蟲菊；CAS RN 584-79-2)和(ZXI8901；CAS RN 160791-64-0)。相信-種或多種上述合成擬除蟲菊酯的混合物也可用于本發(fā)明。特別優(yōu)選的合成擬除蟲菊酯是七氟菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯菊酯、氯菊酯和氟氯氰菊酯。甚至更優(yōu)選的合成擬除蟲菊酯是七氟菊酯和氯氟氰菊酯，還更優(yōu)選的是七氟菊酯。
噁二嗪衍生物類的殺昆蟲劑可用于本發(fā)明方法。優(yōu)選用于本發(fā)明的噁二嗪衍生物類包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亞氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氫化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪。
Chloronicotinyl類殺昆蟲劑也可用于本發(fā)明方法。優(yōu)選用于本發(fā)明組合物中的Chloronicotinyl類包括啶蟲清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒(methyleneimiclamicle)；CAS RN135410-20-7)、吡蟲啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亞胺；CAS RN 138261-41-3)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺；CAS RN 120738-89-8)。
硝基胍類殺昆蟲劑可用于本發(fā)明方法。優(yōu)選用于本發(fā)明的硝基胍包括MTI 446(nidinotefuran)。
可用于本發(fā)明方法中的吡咯類、吡唑類和苯基吡唑類包括在U.S.專利5,952,358中描述的那些。優(yōu)選的吡唑類包括氟唑蟲清(4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基吡咯-3-甲腈；CAS RN122453-73-0)、唑螨酯((E)-1，1-二甲基乙基-4-[[[[(1，3-二甲基-5-苯氧基-1H-吡唑-4-基)亞甲基]氨基]氧基]甲基]苯甲酸酯；CAS RN111812-58-9)和吡螨胺(4-氯-N-[[4-1，1-二甲基乙基)苯基]甲基]-3-乙基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺；CAS RN 119168-77-3)。優(yōu)選的苯基吡唑類是銳勁特(5-氨基-[2，6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-[(1R，S)-(三氟甲基)亞磺酰基]-1H-吡唑-3-甲腈；CAS RN 120068-37-3)。
可用于本發(fā)明的二?；骂惏ㄌ囟”锦ｋ?4-氯苯甲酸-2-苯甲?；?2-(1，1-二甲基乙基)-酰肼；CAS RN 112226-61-6)、甲氧苯酰肼(RH-2485；N-叔丁基-N′-(3-甲氧基-鄰甲苯甲?；?-3，5-二甲苯酰肼；CAS RN 161050-58-4)和雙苯酰肼(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2，(4-乙基苯甲?；?酰肼；CAS RN 112410-23-8)。
三唑類例如殺草強(CAS RN 61-82-5)和唑蚜威可用于本發(fā)明方法。優(yōu)選的三唑是唑蚜威([[1-[(二甲基氨基)羰基]-3-(1，1-二甲基乙基)-1H-1，2，4-三唑-5-基]硫基]乙酸乙酯；CAS RN 112143-82-5)。
生物/發(fā)酵產(chǎn)物例如齊墩螨素(阿維菌素；CAS RN 71751-41-2)和艾克敵105(XDE-105，CAS RN 131929-60-7)可用于本發(fā)明方法。
有機磷酸酯類殺昆蟲劑也可用作本發(fā)明方法的一個組分。優(yōu)選的有機磷酸酯類殺昆蟲劑包括高滅磷(CAS RN 30560-19-1)、毒死蜱(CASRN 2921-88-2)、甲基毒死蜱(CAS RN 5598-13-0)、二嗪農(nóng)(CAS RN333-41-5)、克線磷(CAS RN 22224-92-6)和馬拉松(CAS RN 121-75-5)。
此外，氨基甲酸酯類殺昆蟲劑可用于本發(fā)明方法中。優(yōu)選的氨基甲酸酯類殺昆蟲劑是涕滅威(CAS RN 116-06-3)、甲萘威(CAS RN63-25-2)、呋喃丹(CAS RN 1563-66-2)、甲氨叉威(CAS RN 23135-22-0)和硫雙威(CAS RN 59669-26-0)。
當在本文中描述殺昆蟲劑時，應當理解，該描述包括表現(xiàn)出與所述形式的殺昆蟲劑相同的殺昆蟲活性的殺昆蟲劑的鹽形式以及殺昆蟲劑的任何異構體和/或互變異構體形式。
用于本發(fā)明方法中的殺昆蟲劑可以是作為這樣的殺昆蟲劑進行市售的任何等級或純度。在市售制劑中作為雜質(zhì)伴隨殺昆蟲劑的其它物質(zhì)可在本發(fā)明方法和組合物中耐受，只要這樣的其它物質(zhì)不使組合物不穩(wěn)定或顯著降低或破壞任何殺昆蟲劑組分或轉(zhuǎn)基因事件抗目標害蟲的活性即可。本領域技術人員可很容易確定出可耐受的雜質(zhì)和不可耐受的雜質(zhì)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明方法可用于保護種子和植物抗多種農(nóng)業(yè)害蟲，包括昆蟲、螨蟲、真菌、酵母、霉菌和細菌。
當昆蟲是本發(fā)明的目標害蟲時，這樣的害蟲包括但不限于鱗翅目(Lepidoptera)，例如長翅卷蛾屬(Acleriss pp.)、小卷蛾屬(Adoxophyess pp.)、透翅蛾屬(Aegeria spp.)、地老虎屬(Agrotis spp.)、棉葉波紋夜蛾(Alabamaargillaceae)、Amylois spp.、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黃卷蛾屬(Archips spp)、銀帶卷葉蛾屬(Argyrotaenia spp.)、夜蛾屬(Autographa spp.)、玉米楷夜蛾(Busseola fusca)、粉斑螟(Cadracautella)、桃小食心蟲(Carposina nipponensis)、禾草螟屬(Chilospp.)、卷蛾屬(Choristoneuras pp.)、葡萄果蠹蛾(Clysiaambiguella)、稻縱卷螟屬(Cnaphalocrociss pp.)、卷葉蛾屬(Cnephasia spp.)、Cochylis spp.、鞘蛾屬(Coleophora spp.)、Crocidolomia binotalis、蘋果異形小卷蛾(Cryptophlebialeucotreta)、豆小卷蛾屬(Cydia spp.)、異草螟屬(Diatraea spp.)、展葉松夜蛾(Diparopsis castanea)、金剛鉆屬(Earias spp.)、粉斑螟屬(Ephestia spp.)、松花小卷蛾屬(Eucosma spp.)、Eupoeciliaambiguella、黃毒蛾屬(Euproctis spp.)、切根蟲屬(Euxoa spp.)、小卷葉額屬(Grapholita spp.)、Hedya nubiferana、棉鈴蟲屬(Heliothis spp.)、菜心野螟(Hellula undalis)、美國白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、旋紋潛蛾(Leucoptera scitella)、細蛾屬(Lithocollethis spp.)、花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾屬(Lymantria spp.)、潛蛾屬(Lyonetia spp.)、天幕毛蟲屬(Malacosoma spp.)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、煙草天蛾(Manduca sexta)、冬尺蛾屬(Operophtera spp.)、玉米螟(Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾屬(Pammene spp.)、褐卷蛾屬(Pandemis spp.)、小眼夜蛾(Panolisflammea)、棉紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)、馬鈴薯麥蛾(Phthorimaea operculella)、菜粉蝶(Pieris rapae)、菜粉蝶屬(Pieris spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、巢蛾屬(Praysspp.)、三化螟屬(Scirpophaga spp.)、大螟屬(Sesamia spp.)、長須卷蛾屬(Sparganothis spp.)、斜紋夜蛾屬(Spodoptera spp.)、透翅蛾屬(Synanthedon spp.)、帶蛾屬(Thaumetopoea spp.)、卷葉蛾屬(Tortrix spp.)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)和巢蛾屬(Yponomeuta spp.)；鞘翅目(Coleoptera)，例如叩甲屬(Agriotes spp.)、花象甲屬(Anthonomus spp.)、甜菜隱食甲(Atomaria linearis)、甜菜莖跳甲(Chaetocnema tibialis)、香蕉根象甲屬(Cosmopolites spp.)、象蟲屬(Curculio spp.)、皮蠹屬(Dermestes spp.)、條葉甲屬(Diabrotica spp.)、植瓢蟲屬(Epilachna spp.)、Eremnus spp.、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)、稻象甲屬(Lissorhoptrus spp.)、鰓金龜屬(Melolontha spp.)、Orycaephilus spp.、草莓根象甲(Otiorhynchusspp.)、Phlyctinus spp.、麗金龜屬(Popillia spp.)、跳甲屬(Psylliodes spp.)、動根蠹屬(Rhizopertha spp.)、金龜甲科(Scarabeidae)、米象屬(Sitophilus spp.)、麥蛾屬(Sitotrogaspp.)、擬步行蟲屬(Tenebrio spp.)、擬谷溫屬(Tribolium spp.)和皮蠹屬(Trogoderma spp.)；直翅目(Orthoptera)，例如蜚蠊屬(Blatta spp.)、小蠊屬(Blattella spp.)、螻蛄屬(Gryllotalpa spp.)、馬得拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飛蝗屬(Locusta spp.)、大蠊屬(Periplaneta ssp.)和蚱蜢屬(Schistocerca spp.)；等翅目(Isoptera)，例如Reticulitemes ssp；嚙蟲目(Psocoptera)，例如節(jié)虱屬(Liposcelis spp.)；虱目(Anoplura)，例如血虱屬(Haematopinus spp.)、長顎虱屬(Linognathus spp.)、虱屬(Pediculus spp.)、癭綿蚜屬(Pemphigus spp.)和根瘤蚜屬(Phylloxera spp.)；食毛目(Mallophaga)，例如Damalinea spp.和嚙毛虱屬(Trichodectes spp.)；纓翅目(Thysanoptera)，例如花薊馬屬(Franklinella spp.)、條薊馬屬(Hercinothrips spp.)、帶薊馬屬(Taeniothrips spp.)、棕黃薊馬(Thrips palmi)、棉薊馬(Thrips tabaci)和非洲桔硬薊馬(Scirtothrips aurantii)；異翅亞目(Heteroptera)，例如臭蟲屬(Cimex spp.)、可可瘤盲蝽(Distantiella theobroma)、紅蝽屬(Dysdercus spp.)、Euchistus spp.、褐盾蝽屬(Eurygasterspp.)、稻緣蝽屬(Leptocorisa spp.)、綠蝽屬(Nezara spp.)、網(wǎng)蝽屬(Piesma spp.)、紅腹獵蝽屬(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、稻黑蝽屬(Scotinophara spp.)和錐蝽屬(Triatoma spp.)；同翅目(Homoptera)，例如綿紛虱(Aleurothrixus floccosus)、粉虱屬(Aleyrodesbrassicae)、圓盔蚧屬(Aonidiella spp.)、蚜科(Aphididae)、蚜蟲屬(Aphis spp.)、圓盾蚧屬(Aspidiotus spp.)、甘薯粉虱(Bemisiatabaci)、蠟蚧屬(Ceroplaster spp.)、茶褐圓蚧(Chrysomphalusaonidium)、薔薇輪蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐軟蚧(Coccus hesperidum)、微葉蟬屬(Empoasca spp.)、蘋果綿蚜(Eriosoma larigerum)、紅斑葉蟬屬(Erythroneura spp.)、Gascardia spp.、灰稻虱屬(Laodelphax spp.)、Lacanium corni、蠣蚧屬(Lepidosaphes spp.)、Macrosiphus spp.、瘤額蚜屬(Myzusspp.)、Nehotettix spp.、褐飛虱屬(Nilaparvata spp.)、Paratoriaspp.、癭綿蚜屬(Pemphigus spp.)、游球菌屬(Planococcus spp.)、桑白蚧屬(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧屬(Pseudococcus spp.)、葉虱屬(Psylla ssp.)、棉蚧(Pulvinaria aethiopica)、圓盾蚧屬(Quadraspidiotus spp.)、縊管屬(Rhopalosiphum spp.)、盔蚧屬(Saissetia spp.)、葉蟬屬(Scaphoideus spp.)、麥二叉蚜屬(Schizaphis spp.)、Sitobion spp.、溫室粉虱(Trialeurodesvaporariorum)、木虱(Trioza erytreae)和桔盾蚧(Unaspiscitri)；膜翅目(Hymenoptera)，例如Acromyrmex、切葉蟻屬(Atta spp.)、莖蜂屬(Cephus spp.)、葉蜂屬(Diprions pp.)、鋸節(jié)葉蜂科(Diprionidae)、云杉葉蜂(Gilpiniapolytoma)、葉蜂屬(Hoplocampa spp.)、田蟻屬(Lasius spp.)、蟻屬(Monomorium pharaonis)、鋸角葉蜂屬(Neodiprion spp)、水蟻屬(Solenopsis spp.)和胡蜂屬(Vespa ssp.)；雙翅目(Diptera)，例如伊蚊屬(Aedes spp.)、Antherigona soccata、Bibio hortulanus、麗蠅屬(Calliphora erythrocephala)、實蠅屬(Ceratitis spp.)、金蠅屬(Chrysomyia spp.)、庫蚊屬(Culex spp.)、疽蠅屬(Cuterebraspp.)、實蠅屬(Dacus spp.)、黃猩猩果蠅(Drosophilamelanogaster)、廁蠅屬(Fannia spp.)、馬蠅屬(Gastrophilusspp.)、舌蠅屬(Glossina spp.)、皮蠅屬(Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、潛蠅屬(Liriomysa spp.)、綠蠅屬(Luciliaspp.)、豆干黑潛蠅屬(Melanagromyza spp.)、蒼蠅屬(Musca ssp.)、狂蠅屬(Oestrus spp.)、Orseolia spp.、瑞典麥桿蠅(Oscinellafrit)、甜菜潛葉蠅(Pegomyia hyoscyami)、春麥蠅屬(Phorbiaspp.)、蘋實蠅(Rhagoletis pomonella)、蕈蠅屬(Sciara spp.)、螫蠅屬(Stomoxys spp.)、虻屬(Tabanus spp.)、Tannia spp.和大蚊屬(Tipula spp.)；蚤目(Siphonaptera)，例如角葉蚤屬(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；和纓尾目(Thysanura)，例如西洋衣魚(Lepisma saccharina)。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當昆蟲類害蟲是條葉甲屬害蟲時，特別是當害蟲是玉米幼芽根葉甲(Diabrotica virgifera)、Diabrotica barberi或十一星瓜葉甲(Diabrotica undecimpunctata)時，本發(fā)明是特別有效的。
其中相信本發(fā)明是特別有效的另一應用是，殺蟲劑具有抗雜草或寄生或腐生植物的活性，并且轉(zhuǎn)基因事件具有抗選自玉米幼芽根葉甲、Diabrotica barberi和十一星瓜葉甲的害蟲的活性。相信當雜草或寄生或腐生植物是稱為“Striga”的非洲植物時，本發(fā)明方法是更優(yōu)選有用的，當殺蟲劑是ROUNDUP(得自Monsanto Company)時，是甚至更優(yōu)選的。
在本發(fā)明方法中，將殺蟲劑施用給轉(zhuǎn)基因玉米種子。雖然相信本發(fā)明方法可給任何生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)基因種子施用，但是種子優(yōu)選處于在處理期間不發(fā)生任何損害的足夠耐久的狀態(tài)。一般情況下，種子應當是從田地中收獲的；從植物中取出的；和與任何穗、莖、外殼、和外層果肉或其它非種子植物材料中分離開的種子。種子還優(yōu)選生物穩(wěn)定至一定程度，以使得處理不會給種子帶來任何生物損害。在一個實施方案中，例如，可給已經(jīng)收獲、清潔并干燥至水分含量低于約15％重量的玉米種子施以處理。在另一個實施方案中，種子可以是在用殺蟲劑處理之前或期間已經(jīng)干燥過，然后用水和/或另一材料清潔和/或再干燥的種子。在所述的限定中，相信可在收獲種子與播種種子之間的任何時間給種子施以處理。本文所用的術語“未播種的種子”包括在收獲種子與將種子播種在土地中以讓植物出芽和生長之間的任何時期的種子。
當提及用殺蟲劑“處理”未播種的種子時，這樣的處理不包括其中將殺蟲劑施加到土壤上而不是種子上的操作。例如，與種子播種同時進行的作為在條帶(band)、“T”-條帶或在犁溝中施用殺蟲劑的這樣的處理不包括在本發(fā)明內(nèi)。
殺蟲劑或殺蟲劑組合可“純凈地”施用，即其中不存在任何稀釋或添加的組分。然而，殺蟲劑一般是以殺蟲劑制劑的形式給種子施用。這樣的制劑可含有一種或多種其它所需組分，包括但不限于液體稀釋劑，起殺蟲劑基質(zhì)作用的粘合劑，在應力狀態(tài)下保護種子的填料，和改善包衣柔韌性、粘合性和/或涂布性的增塑劑。此外，對于含有很少或不含填充劑的油性殺蟲劑制劑，可能希望向制劑中加入干燥劑例如碳酸鈣、高嶺土或膨潤土、珍珠巖、硅藻土或任何其它吸附性材料。在種子處理中使用這樣的組分是本領域已知的。參見例如U.S.專利5,876,739。本領域技術人員可根據(jù)欲處理的種子的種類和所選的具體殺蟲劑來容易地選擇所需組分以用于殺蟲劑制劑中。此外，可使用如下文實施例中所述的易于獲得的已知殺蟲劑的市售制劑。
還可以用一種或多種下列組分處理種子其它殺蟲劑，包括僅在地下起作用的化合物；殺真菌劑，例如克菌丹、福美雙、metalaxyl(methoxam＝metalaxyl的拆分異構體)、氟噁菌、噁霜靈和每一這些物質(zhì)的異構體等；除草劑，包括選擇下列的化合物氨基甲酸酯類、硫代氨基甲酸酯類、乙酰胺類、三嗪類、二硝基苯胺類、甘油醚類、噠嗪酮類、尿嘧啶類、苯氧基化合物類、脲和苯甲酸類；除草劑安全劑，例如苯并噁嗪類、二苯甲基衍生物類、N，N-二烯丙基二氯乙酰胺、多種不同的二鹵代?；?、噁唑烷基和噻唑烷基化合物類、乙酮、萘二甲酸酐化合物類和肟衍生物類；肥料；和生物控制劑例如源自根瘤菌屬、桿菌屬、假單胞菌屬、沙雷氏菌屬、木霉屬、Glomus和菌根真菌的天然或重組的細菌和真菌。這些組分可作為種子上的單獨的層加入，或者可作為殺蟲劑組合物的一部分加入。
優(yōu)選地，本發(fā)明新組合物或其它組分在種子處理中的用量應當不抑制種子生殖，或者不對種子引起植物毒害性破壞。
用于處理轉(zhuǎn)基因玉米種子的殺蟲劑制劑可呈下列形式懸浮液；乳液；顆粒在含水介質(zhì)(例如水)中的漿液；可潤濕的粉劑；可潤濕的粒劑(干的可流動粒劑)；和干的粒劑。如果配制成懸浮液或漿液，活性組分在制劑中的濃度優(yōu)選為約0.5％-約99％重量(w/w)、優(yōu)選5-40％。
如上所述，可向制劑中加入其它常用的無活性的或惰性的組分。這樣的惰性組分包括但不限于常規(guī)粘合劑，分散劑例如甲基纖維素(Methocel A15LV或Methocel A15C，例如在種子處理中起聯(lián)合的分散劑/粘合劑的作用)、聚乙烯醇(例如Elvanol 51-05)、卵磷脂(例如Yelkinol P)、聚合分散劑(例如聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVP/VAS-630)，增稠劑(例如粘土增稠劑如Van Gel B以改善粘度和減輕顆粒懸浮液的沉淀)、乳液穩(wěn)定劑、表面活性劑、防凍化合物(例如尿素)、染料、著色劑等。用于本發(fā)明的其它惰性組分可參見McCutcheon′s，vol.1，″Emulsifiers and Detergents，″MC Publishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。用于本發(fā)明的另外的惰性組分可參見McCutcheon′s，vol.2，″Functional Materials，″MCPublishing Company，Glen Rock，N.J.，U.S.A.，1996。
本發(fā)明的殺蟲劑和殺蟲劑組合可通過任何標準種子處理方法給種子施用，這樣的方法包括但不限于在容器(例如瓶子或袋)中混合、機械施用、滾筒處理、噴霧和浸漬?？墒褂萌魏纬Ｒ?guī)活性或惰性物質(zhì)來將種子與本發(fā)明殺蟲劑接觸，例如常規(guī)膜包衣材料，包括但不限于基于水的膜包衣材料例如Sepiret(Seppic，Inc.，F(xiàn)airfield，N.J.)和Opacoat(Berwind Pharm.Services，Westpoint，PA)。
本發(fā)明殺蟲劑可作為種子包衣的組分給種子施用。當通過加入本發(fā)明殺蟲劑組合的一個實施方案來改進時，本領域已知的種子包衣方法和組合物是有用的。這樣的包衣方法及其施用裝置公開在例如下列專利中U.S.專利5,918,413、5,891,246、5,554,445、5,389,399、5,107,787、5,080,925、4,759,945和4,465,017。種子包衣組合物公開在例如下列專利中U.S.專利5,939,356、5,882,713、5,876,739、5,849,320、5,834,447、5,791,084、5,661,103、5,622,003、5,580,544、5,328,942、5,300,127、4,735,015、4,634,587、4,383,391、4,372,080、4,339,456、4,272,417和4,245,432。
有用的種子包衣含有一種或多種粘合劑和至少一種本發(fā)明殺蟲劑組合。
可用于本發(fā)明的粘合劑優(yōu)選包括對所包衣的種子沒有植物毒害作用的天然或合成粘合性聚合物。所述粘合劑可選自聚乙酸乙烯酯；聚乙酸乙烯酯共聚物；乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物；聚乙烯醇；聚乙烯醇共聚物；纖維素，包括乙基纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素和羧甲基纖維素；聚乙烯吡咯烷酮；多糖，包括淀粉、改性淀粉、糊精、麥芽糖糊精、藻酸鹽和脫乙酰殼多糖；脂肪；油；蛋白，包括明膠和玉米蛋白；阿拉伯膠；蟲膠；二氯乙烯與二氯乙烯共聚物；木素磺酸鈣；丙烯酸共聚物；聚丙烯酸乙烯酯；聚氧化乙烯；丙烯酰胺聚合物和共聚物；聚丙烯酸羥乙酯、異丁烯酰胺單體；和聚氯丁二烯。
優(yōu)選選擇粘合劑以使它起本發(fā)明殺蟲劑的基質(zhì)的作用。雖然上述粘合劑都可以用作基質(zhì)，但是具體的粘合劑將取決于殺蟲劑組合的性質(zhì)。本文所用術語“基質(zhì)”是指一種或多種粘合劑化合物的連續(xù)固相，在其中分布著一種或多種本發(fā)明殺蟲劑的不連續(xù)相。任選地，填充劑和/或其它組分也可以存在于基質(zhì)中。應當理解，術語基質(zhì)包括可認為是基質(zhì)系統(tǒng)、貯存系統(tǒng)或微囊包封系統(tǒng)的那些。一般情況下，基質(zhì)系統(tǒng)由本發(fā)明殺蟲劑組合與均勻地分散在聚合物內(nèi)的填充劑組成，而貯存系統(tǒng)由包含本發(fā)明殺蟲劑組合的單獨的相組成，其中本發(fā)明殺蟲劑組合分散在周圍的限速聚合相內(nèi)。微囊包封系統(tǒng)包括小顆?；蛞旱蔚陌拢约霸诠腆w基質(zhì)中的分散體。
粘合劑在包衣中的量可以改變，但是應當占種子重量的約0.01-約25％、更優(yōu)選約0.05-約15％、甚至更優(yōu)選約0.1％-約10％。
如上所述，基質(zhì)可任選包含填充劑。填充劑可以是吸收劑或惰性填充劑，例如本領域已知的那些，并且可包括木粉、粘土、活性炭、糖、硅藻土、谷粉、細粒無機固體、碳酸鈣等?？墒褂玫恼惩梁蜔o機固體包括鈣系膨潤土、高嶺土、陶土、滑石粉、珍珠巖、云母、蛭石、硅酸鹽、石英粉、蒙脫石及其混合物?？墒褂玫奶前ê望溠刻呛?。谷粉包括小麥粉、燕麥粉和大麥粉。
選擇填充劑以使其給種子提供適當?shù)奈夂?，例如使用填充劑以提高活性組分的負載率和調(diào)節(jié)活性組分的控制釋放。填充劑可有助于種子包衣的生產(chǎn)或加工。填充劑的量可以改變，但是填充劑組分的重量一般為占種子重量的約0.05-約75％、更優(yōu)選約0.1-約50％、甚至更優(yōu)選約0.5％-約15％。
可用于包衣中的殺蟲劑是本文所述的殺蟲劑。用于處理種子的殺蟲劑的量將根據(jù)種子類型和活性組分的類型而變，但是處理將包括把種子與殺蟲有效量的殺蟲劑組合接觸。當昆蟲是目標害蟲時，該量應當是殺昆蟲有效的殺昆蟲劑的量。本文所用的殺昆蟲有效量是指將殺死處于幼蟲或蛹生長狀態(tài)的昆蟲類害蟲，或?qū)⑹冀K降低或延遲昆蟲類害蟲產(chǎn)生的破壞量的殺昆蟲劑的量。
在處理中施用給種子的殺蟲劑的量一般為約10g-約2000g活性組分/100kg重量的種子。殺蟲劑的量優(yōu)選為約50g-約1000g活性組分100kg種子、更優(yōu)選為約100g-約600g活性組分/100kg種子、甚至更優(yōu)選為約200g-約500g活性組分/100kg重量的種子?；蛘撸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)，殺蟲劑的量優(yōu)選超過約60g殺蟲劑活性組分/100kg種子、更優(yōu)選超過約80g/100kg種子。
在優(yōu)選的本發(fā)明實施方案中，轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3Bb.11231蛋白或Cry3Bb.11098蛋白的能力，且殺蟲劑選自吡蟲啉或七氟菊酯。
用于處理的殺蟲劑必須不抑制種子的出芽，并且應當在目標昆蟲的生命周期中昆蟲引起種子或植物損傷的時間期間有效地保護種子和/或植物。一般情況下，包衣在播種后0-120天是有效的。
本發(fā)明殺蟲劑可以以包衣的形式給種子施用。包衣在調(diào)和高殺蟲劑負載方面是特別有效的，因為可能需要處理通常難治的害蟲例如玉米食蟲，同時又需要防止由于殺蟲劑負載增加所引起的不需要的植物毒害性。
任選地，可在包衣制劑中使用增塑劑。增塑劑通常用于使由包衣層形成的膜具有更強的柔韌性，改善粘合性和涂布性，以及提高加工速度。提高的膜柔韌性對于在貯存、操作或播種期間減小形成碎片、破裂或剝落很重要?？墒褂枚喾N增塑劑，然而，有用的增塑劑包括聚乙二醇、甘油、鄰苯二甲酸丁酯芐酯、乙二醇苯甲酸酯和相關化合物。增塑劑在包衣層中的含量為約0.1-約20％重量。
當用于包衣中的殺蟲劑是油型制劑，并且存在很少或不存在填充劑時，通過將制劑干燥來加快干燥過程可能是有用的。該任選步驟可通過本領域已知的手段來完成，并且可包括加入碳酸鈣、高嶺土或膨潤土、珍珠巖、硅藻土或任何吸收性材料，它們優(yōu)選與殺蟲包衣層同時加入以吸收油或過量水分。有效地提供干的包衣所需的碳酸鈣或相關化合物的量為占種子重量的約0.5-約10％。
用殺蟲劑形成的包衣優(yōu)選是能夠減慢殺蟲劑通過經(jīng)由基質(zhì)擴散或移動到周圍介質(zhì)中而實現(xiàn)的釋放的速度的類型。
除了包衣層以外，還可以用一種或多種下列組分處理種子其它殺蟲劑，包括殺真菌劑和除草劑，除草安全劑；肥料和/或生物控制劑。這些組分可作為單獨一層加入，或者可加在殺蟲包衣層中。
可用任何常規(guī)包衣技術和機器將殺蟲劑制劑施加到種子上，例如流化床技術、滾壓機法、旋轉(zhuǎn)靜態(tài)種子處理器和轉(zhuǎn)筒式包衣器。其它方法例如噴動床也是有用的?？稍诎轮皩⒎N子作填孔處理。包衣后，一般可將種子干燥，然后轉(zhuǎn)移到用于上漿的上漿機中。這樣的操作是本領域已知的。
還可以用膜保護涂層包封用殺蟲劑處理過的種子以保護殺蟲劑包衣。這樣的保護涂層是本領域已知的，并且可使用常規(guī)流化床和轉(zhuǎn)筒膜包衣技術施加。
在另一個本發(fā)明實施方案中，可通過使用固體基質(zhì)填裝來將殺蟲劑引入到種子上或種子中。例如，可將一定量的殺蟲劑與固體基質(zhì)材料混合，然后可讓種子與固體基質(zhì)材料接觸一定時間以將殺蟲劑引入到種子中。之后可任選將種子與固體基質(zhì)材料分離開并貯存或使用，或者將固體基質(zhì)材料與種子的混合物一起貯存或直接播種。用于本發(fā)明的固體基質(zhì)材料包括聚丙烯酰胺、淀粉、粘土、二氧化硅、礬土、土壤、沙子、聚脲、聚丙烯酸酯或者能夠?qū)⑾x劑吸收或吸附一定時間并能夠?qū)⑾x劑釋放到種子上或種子中的任何其它材料。確定殺蟲劑與固體基質(zhì)材料彼此相容是有用的。例如，應當選擇固體基質(zhì)材料，以使得其可以以適當速度在例如數(shù)分鐘、數(shù)小時或數(shù)天的時間內(nèi)釋放殺蟲劑。
本發(fā)明還涉及采用浸滲來作為另一用殺蟲劑處理種子的方法。例如，將植物種子與在溶劑例如水中包含約1％重量-約75％重量殺蟲劑的溶液混合一定時間。所述溶液的濃度優(yōu)選為約5％重量-約50％重量、更優(yōu)選為約10％重量-約25％重量。在種子與溶液混合的期間內(nèi)，種子吸收(吸取)一部分殺蟲劑?？扇芜x將植物種子與溶液的混合物攪拌，例如通過振搖、轉(zhuǎn)動、滾動或其它手段來攪拌。浸滲后，可 將種子從溶液中分離出來，并任選干燥，例如通過輕拍或風干來干燥。
在另一實施方案中，可將殺蟲劑粉末與種子直接混合。可任選使用粘合劑將殺蟲劑粉末粘合在種子表面上。例如，可將一定量的種子與粘合劑混合，并任選攪拌以促進用粘合劑將種子均勻包衣。然后可將用粘合劑包衣的種子與殺蟲劑粉末混合?？蓪⒃摶旌衔飻嚢瑁缤ㄟ^滾動來攪拌，以促進粘合劑與殺蟲劑粉末接觸，由此使殺蟲劑粉末粘著在種子上。
本發(fā)明還提供了已經(jīng)通過上述方法用殺蟲劑處理過的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
本發(fā)明處理的種子可用于以與常規(guī)處理的玉米種子相同的方式繁殖玉米植物?？砂凑张c任何其它殺蟲劑處理過的種子相同的方式將本發(fā)明處理的種子貯存、操作、播種和耕種。應當采取適當?shù)匕踩胧﹣硐拗铺幚淼姆N子與人、食品或飼料、水和鳥類以及野生或家養(yǎng)動物接觸。
在下述實施例中描述優(yōu)選的本發(fā)明實施方案。對于本領域技術人員來說，通過考慮本說明書或本文所公開的本發(fā)明實施方案，在本發(fā)明權利要求書范圍內(nèi)的其它實施方案是顯而易見的。應當理解，本說明書和實施例僅是舉例說明，本發(fā)明范圍和實質(zhì)由權利要求書限定。
下述實施例描述了優(yōu)選的本發(fā)明實施方案。對于本領域技術人員來說，通過考慮本說明書或本文所公開的本發(fā)明實施方案，在本發(fā)明權利要求書范圍內(nèi)的其它實施方案是顯而易見的。應當理解，本說明書和實施例僅是舉例說明，本發(fā)明范圍和實質(zhì)由權利要求書限定。在實施例中，除非另有說明，否則所有百分比都是重量百分比。
實施例1制備具有能有效地抗玉米食蟲的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子，并用吡蟲啉(Gaucho)和七氟菊酯(Raze)處理這樣的種子。
通過在WO 99/31248中描述的關于這些各自事件的方法制備玉米種子以表達蘇云金芽孢桿菌內(nèi)毒素Cry3Bb.11231或Cry3Bb.11098。
如下所述，將具有或不具有各轉(zhuǎn)基因事件的相同雜交種類的玉米種子用吡蟲啉(作為GAUCHO得自Bayer Corp.)或七氟菊酯(作為RAZE得自Wilbur-Ellis Co.，Great Falls，Mont.；Walla Walla，WA)處理。所需殺蟲劑的種子處理制劑是通過將測定量的殺蟲劑在作為載體的水中混合而制得的，并在旋轉(zhuǎn)靜態(tài)種子處理器中于室溫將所得制劑給測定重量的玉米種子施加1分鐘。計算殺蟲劑制劑和玉米種子各自的重量以給種子提供所需的殺蟲劑處理比例。將殺蟲劑混合到足量水中以使制劑有效地分布到該批量的所有種子上，同時將由于種子缺乏對制劑的攝取所致的處理制劑的損失減至最少。在播種之前讓處理的種子無蓋存放至少4小時。
當用吡蟲琳處理種子時，將足量的Gaucho600 FS(含有48.7％重量的吡蟲啉；得自Gustafson LLC)充分混合到水中以形成種子處理制劑，并將該制劑施用給一定重量的玉米種子以提供300克吡蟲啉/100kg種子(0.75mg吡蟲啉/粒種子)或400克吡蟲啉/100kg種子(1.0mg吡蟲啉/粒種子)的處理水平。
當用七氟菊酯處理種子時，將足量的Raze2.5 Fs(合有26.8％重量的七氟菊酯；得自wilbur-Ellis Co.)充分混合到水中以形成種子處理制劑，并將該制劑施用給一定重量的玉米種子以提供300克七氟菊酯活性組分/100kg種子(0.75mg七氟菊酯/粒種子)。
實施例2測定玉米種子中的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與玉米食蟲殺蟲劑種子處理的組合抗西部和北部玉米食蟲的效力的大田試驗。
依據(jù)有關方案并遵守USDA的通知要求來進行大田試驗。這些試驗的目的是測定玉米種子中的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與玉米食蟲殺蟲劑種子處理的組合抗西部和北部玉米食蟲的效力。
對于所選的每個生長位置，試驗田設計包括下列內(nèi)容行間隔30英寸試驗田大小4行×20播種密度2.0粒種子英尺所用的雜交體LH198×LH185或RX670復現(xiàn)試驗4設計隨機完全區(qū)組位置4幼蟲來源通過以400個卵/ft(生長階段V2)人工感染來補充天然感染對于每個生長區(qū)域使用下列種子處理組合編號玉米種子類型殺蟲劑和量(克AI/100kg種子或mg ai/粒種子)1異雜交體 除了低水平的金針蟲保護之外沒有2Cry3Bb.11231 除了低水平的金針蟲保護之外沒有3Cry3Bb.11231 Gaucho600 FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒種子4Cry3Bb.11231 Gaucho600 FS@400g AI/100kg或1.0mgAI/粒種子5Cry3Bb.11231 Raze2.5 FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒種子6異雜交體 Force3G@0.014g AI/m或0.15oz AI/1000ft行，作為5″條帶在播種時在土壤表面施用7異雜交體 Lorsban15G(毒死蜱；得自DowElanco)@0.11g AI/m或1.2oz AI/1000ft行，作為5″條帶在播種時在土壤表面施用使用殺蟲劑的所有種子處理都是如實施例1所述進行的。在編號為1和2的種子處理中，使用Gaucho進行抗金針蟲保護，但是其水平足夠低，以致于預計其對玉米食蟲沒有任何作用(即以約60g活性組分/100kg種子或0.16mg活性組分/粒種子的處理水平)，另外，接受編號為2的處理的種子僅具有轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231，并且沒有進行任何預計將有效地抗玉米食蟲的殺蟲劑處理。
對于接受編號為3-5的處理的種子，通過實施例1中描述的方法施用殺蟲劑。對于接受編號為6和7的處理的種子，將市售Force3G和Lorsban15G在播種時在5″條帶中施用到土壤上。施用水平如上所示，并且在標準商業(yè)慣例的推薦范圍內(nèi)。
依據(jù)上述方案，在四個美國中西部州的4個不同位置播種和生長欲測試的玉米種子。
依據(jù)下述方案測定玉米食蟲的破壞。在階段V4-V6，通過計數(shù)每英畝中植物的數(shù)量來評價早期直立。在階段VT-R1，通過該產(chǎn)業(yè)中眾所周知的方法來評價玉米食蟲破壞，并依據(jù)Iowa 1-6等級評定系統(tǒng)報告玉米食蟲破壞。在該系統(tǒng)中，回收每塊試驗田10顆玉米植物的根部系統(tǒng)，并使用該1-6等級評定系統(tǒng)進行打分，其中1＝?jīng)]有損害或僅少數(shù)較小的噬食疤痕，2＝明顯的噬食疤痕，但是沒有根被吃掉至植物的1.5英寸；3＝至少一個根被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)，但是根的整個節(jié)點沒有被毀壞，4＝一個根節(jié)點被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)，5＝兩個根節(jié)點(圈)被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)，6＝三個或更多個根節(jié)點(圈)被吃掉至植物的1.5英寸內(nèi)。
表1(A).在4個生長位置玉米食蟲對具有常規(guī)表面條帶的異雜交玉米植物和僅具有轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231以及具有其與用所選殺蟲劑進行種子處理的組合的玉米植物的破壞。
從表1(A)的數(shù)據(jù)中可以看出，用吡蟲啉或七氟菊酯以任何水平處理的轉(zhuǎn)基因種子抗玉米食蟲破壞的能力比未用這樣的殺蟲劑處理的種子強。此外，所有組合處理(轉(zhuǎn)基因事件與殺蟲劑處理的組合)的效力都高于用FORCE或LORSBAN進行的常規(guī)表面條帶處理。
因此可以得出這樣的結論，相對于單獨的轉(zhuǎn)基因事件或在播種時接受標準殺蟲劑表面條帶處理的異雜交種子，用吡蟲啉或七氟菊酯處理具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子提供了改善的抵抗性。
實施例3測定玉米種子中的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與吡蟲啉種子處理的組合抗西部和北部玉米食蟲的效力的大田試驗。
依據(jù)有關方案并遵守USDA的通知要求來進行大田試驗。該試驗的目的是測定玉米種子中的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與使用吡蟲啉的玉米食蟲種子處理的組合的效力。
對于所選的每個生長位置，試驗田設計包括下列內(nèi)容行間隔30英寸試驗田大小4行×20播種密度2.0粒種子/英尺所用的雜交體LH198×LH185或RX670復現(xiàn)試驗4設計隨機完全區(qū)組位置4幼蟲來源通過以400個卵/ft(生長階段V2)人工感染來補充天然感染對于每個生長區(qū)域使用下列種子處理組合編號玉米種子類型殺蟲劑和量(克AI/100kg種子或mg ai/粒種子)1 異雜交體除了低水平的金針蟲保護之外沒有2 Cry3Bb.11231除了低水平的金針蟲保護之外沒有3 Cry3Bb.11231Gaucho600FS@300g AI/100kg或0.75mg AI/粒種子4 Cry3Bb.11231Gaucho600FS@400g AI/100kg或1.0mg AI/粒種子5 Cry3Bb.11231Raze2.5FS@300g AI/100kg或0.75mgAI/粒種子6 異雜交體Force3G@0.014g AI/m或0.15oz
AI/1000ft行，作為5″條帶在播種時在土壤表面施用7 異雜交體 Lorsban15G(毒死蜱；得自DowElanco)@0.11gAI/m或1.2oz AI/1000ft行，作為5″條帶在播種時在土壤表面施用使用殺蟲劑的所有種子處理都是如實施例1所述進行的。在編號為1和2的種子處理中，使用Gaucho進行抗金針蟲保護，但是其水平足夠低，以致于預計其對玉米食蟲沒有任何作用(即以約60g活性組分/100kg種子或0.16mg活性組分/粒種子的處理水平)，另外，接受編號為2的處理的種子僅具有轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231，并且沒有進行任何預計將有效地抗玉米食蟲的殺蟲劑處理。
對于接受編號為3-5的處理的種子，通過實施例1中描述的方法施用殺蟲劑。對于接受編號為6和7的處理的種子，將市售Force3G和Lorsban15G在播種時在5″條帶中施用到土壤上。施用水平如上所示，并且在標準商業(yè)慣例的推薦范圍內(nèi)。
依據(jù)上述方案，在四個美國中西部州的4個不同位置播種和生長欲測試的玉米種子。
依據(jù)實施例2中描述的方案測定玉米食蟲的破壞。
表2(A).在不同生長位置玉米食蟲對異雜交玉米植物和僅具有轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231以及具有其與用吡蟲啉殺蟲劑進行種子處理的組合的玉米植物的破壞。
注解關于異雜交體對照的數(shù)據(jù)是按照與在相鄰的試驗田中進行的相關方案相同的方式獲得的。
數(shù)據(jù)表明，單獨的轉(zhuǎn)基因事件和單獨的用吡蟲啉處理種子都提供了超過未處理異雜交體對照的一定水平的抗玉米食蟲保護作用。在較高的破壞水平(即4-6的破壞水平)，具有轉(zhuǎn)基因事件的玉米遭受的破壞是非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏钠茐牡?.7％。因為4.7％可視為約5％，所以Cry3Bb.11231事件可認為在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏钠茐牡募s5％-約50％的優(yōu)選有效范圍內(nèi)。
僅用吡蟲啉以400g/100kg處理種子能有效地抗玉米食蟲破壞，但是吡蟲啉的有效性低于單獨的轉(zhuǎn)基因事件。用吡蟲啉處理轉(zhuǎn)基因種子的組合抗食蟲破壞的有效性高于單獨的殺蟲劑處理或單獨的轉(zhuǎn)基因事件。此外，Cry3Bb.11231與以400g/100kg種子施用的吡蟲啉的組合提供的保護作用好于在播種時作為表面條帶施用的FORCE或LORSBAN的商業(yè)標準處理。
用吡蟲啉處理轉(zhuǎn)基因種子的優(yōu)點包括由于無需單獨施用殺蟲劑而簡化了的播種。此外，播種更容易和更安全，這是因為播種者不用必須操作濃的殺蟲劑。
以3-6的食蟲破壞水平測試吡蟲啉種子處理與具有Cry3Bb.11231轉(zhuǎn)基因事件的組合的可能協(xié)同作用。在如表2(A)所示的第一個試驗中，測定了對照種子、用殺蟲劑以兩個水平處理的種子以及具有單獨和組合的轉(zhuǎn)基因事件的種子的具有3-6破壞水平(Iowa 1-6等級)的試驗植物的百分比。使用下述公式計算“協(xié)同作用閾值”(Cry3Bb.11231的％對照)×(吡蟲啉處理的％對照)/100比較該閾值與處理組合(即Cry3Bb.11231與吡蟲啉@400g/100kg的組合)占對照的百分比。如果該處理組合占對照的百分比低于該閾值，則該組合有協(xié)同作用。如果該處理組合占對照的百分比高于該閾值，則該組合沒有表現(xiàn)出協(xié)同作用。
相信在較高破壞水平(即3-6的水平)測定食蟲破壞是與隨后的由于這種破壞引起的產(chǎn)量損失有關的有用指標。原因是在1和2水平的食蟲破壞很少引起玉米植物倒下和倒伏，并且我們不認為這樣的最小根部損失能減少每穗玉米的粒的數(shù)目或重量。然而，在3以及3以上水平的根部破壞可不斷地引起植物倒伏和產(chǎn)量損失。因此，相信3-6(在某些情況下4-6以及5和6)的總破壞水平提供了玉米食蟲破壞對隨后的玉米產(chǎn)量的影響的有用指示。
表2(B).單獨的或者與玉米轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231組合的吡蟲啉種子處理抗3-6水平(Iowa 1-6等級)的玉米食蟲破壞的效力。
該分析表明，玉米Cry3Bb.11231轉(zhuǎn)基因事件與用吡蟲啉以400g/100kg處理種子的組合表現(xiàn)出抗3-6水平的玉米食蟲破壞的協(xié)同且意想不到的效力。因此，可以推斷出，該轉(zhuǎn)基因事件與吡蟲啉種子處理的組合提供了顯著優(yōu)于單獨使用任一種方法的優(yōu)點，并且這樣的保護在抗玉米食蟲的嚴重破壞方面具有意想不到的優(yōu)良效力。
相信還值得注目的是，吡蟲啉與轉(zhuǎn)基因事件的組合提供的抗玉米食蟲嚴重破壞的保護作用遠好于作為表面條帶施用的FORCE或LORSBAN提供的保護作用。
實施例4測定玉米種子中的轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與七氟菊酯殺蟲劑種子處理的組合抗西部和北部玉米食蟲的效力的大田試驗。
測定玉米種子中轉(zhuǎn)基因事件Cry3Bb.11231與用七氟菊酯(作為RAZE得自Wilbur-E1lis Company)處理的組合的效力的大田試驗可依據(jù)實施例3中描述的相同方案來進行，但是在其中吡蟲啉以預計能有效地抗玉米食蟲的水平使用(例如以高于60g/100kg種子的水平使用)的每一情況下用七氟菊酯代替吡蟲啉。如果需要的話，可繼續(xù)以60g/100kg或更低的水平使用吡蟲啉以進行抗金針蟲保護。
可以預計，七氟菊酯種子處理與玉米種子中具有抗玉米食蟲的有效性的轉(zhuǎn)基因事件的組合將提供類似于實施例3所示的吡蟲啉與Cry3Bb.11231的組合的協(xié)同保護作用。
關于本文所引用的參考文獻的討論僅是為了概括總結其作者的宣稱，決不是承認構成現(xiàn)有技術的任何參考文獻。本申請人保留對所引用文獻的正確性和有關性懷疑的權利。
從上面可以看出，實現(xiàn)了本發(fā)明的幾個優(yōu)點，并獲得了其它有利結果。
在不背離本發(fā)明范圍的情況下，可對上述方法和組合物作各種改變，但是應當理解，包含在上述說明中的所有方案都是為了說明而不是限制。
權利要求
1.保護轉(zhuǎn)基因玉米植物抗一種或多種害蟲噬食性破壞的方法，所述方法包括提供轉(zhuǎn)基因玉米植物的種子，所述種子包含具有抗一種或多種害蟲當中至少一種的活性的轉(zhuǎn)基因事件；和用有效量的殺蟲劑處理種子。
2.權利要求1的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3蛋白的能力。
3.權利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3*蛋白的能力。
4.權利要求3的方法，其中所述Cry3*蛋白是Cry3B*蛋白。
5.權利要求4的方法，其中所述Cry3B*蛋白選自Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb.11098。
6.權利要求5的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11231。
7.權利要求5的方法，其中所述Cry3B*蛋白是Cry3Bb.11098。
8.權利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠減輕玉米食蟲引起的破壞，以使得在相同條件下對轉(zhuǎn)基因玉米的破壞是對非轉(zhuǎn)基因玉米的破壞的約5％-約50％，其中這樣的破壞是以具有通過Iowa CornRootworm 1-6等級測定的4-6級的玉米植物的百分比表示的。
9.權利要求8的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠減輕玉米食蟲引起的破壞，以使得在相同條件下對轉(zhuǎn)基因玉米的破壞是對非轉(zhuǎn)基因玉米的破壞的約10％-約40％，其中這樣的破壞是以具有通過Iowa CornRootworm 1-6等級測定的4-6級的玉米植物的百分比表示的。
10.權利要求9的方法，其中其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠減輕玉米食蟲引起的破壞，以使得在相同條件下對轉(zhuǎn)基因玉米的破壞是對非轉(zhuǎn)基因玉米的破壞的約15％-約30％，其中這樣的破壞是以具有通過IowaCorn Rootworm 1-6等級測定的4-6級的玉米植物的百分比表示的。
11.權利要求10的方法，其中其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠減輕玉米食蟲引起的破壞，以使得在相同條件下對轉(zhuǎn)基因玉米的破壞是對非轉(zhuǎn)基因玉米的破壞的約20％-約30％，其中這樣的破壞是以具有通過Iowa Corn Rootworm 1-6等級測定的4-6級的玉米植物的百分比表示的。
12.權利要求2的方法，其中所述具有表達Cry3蛋白的能力的種子還具有表達至少一種不同于Cry3蛋白的其它殺昆蟲蛋白的能力。
13.權利要求2的方法，其中所述具有表達Cry3蛋白的能力的種子還具有提供除草劑耐受性的轉(zhuǎn)基因事件。
14.權利要求13的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件提供抗草甘膦的除草劑耐受性。
15.權利要求2的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件具有抗昆蟲的活性。
16.權利要求15的方法，其中所述昆蟲選自鱗翅目、鞘翅目和半翅目昆蟲。
17.權利要求16的方法，其中所述昆蟲是鞘翅目昆蟲。
18.權利要求17的方法，其中所述昆蟲是條葉甲屬昆蟲。
19.權利要求18的方法，其中所述昆蟲包括至少一種選自下列的昆蟲玉米幼芽根葉甲、Diabrotica barberi和十一星瓜葉甲。
20.權利要求2的方法，其中所述殺蟲劑選自殺昆蟲劑、殺螨劑、殺線蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑和除草劑。
21.權利要求20的方法，其中所述殺蟲劑是殺昆蟲劑。
22.權利要求21的方法，其中所述殺蟲劑選自除蟲菊酯和合成擬除蟲菊酯、噁二嗪衍生物類、chloronicotinyls類、硝基胍衍生物類、三唑類、有機磷酸酯類、吡咯類、吡唑類、苯基吡唑類、二?；骂?、生物/發(fā)酵產(chǎn)物和氨基甲酸酯類。
23.權利要求22的方法，其中所述殺蟲劑選自除蟲菊酯，包括2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)-環(huán)丙烷甲酸的2-烯丙基-4-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮酯，和/或(2-甲基-1-丙烯基)-2-甲氧基-4-氧代-3-(2-丙烯基)-2-環(huán)戊烯-1-基酯及其順式和反式異構體的混合物；合成擬除蟲菊酯，包括(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(殺滅菊酯)、(S)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(S)-4-氯-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(高氰戊菊酯)、(3-苯氧基苯基)-甲基(+)順式-反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氯菊酯)、(±)α-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基(+)-順式，反式-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氯氰菊酯)、乙體氯氰菊酯、辛體氯氰菊酯、S-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)順式/反式3-(2，2-二氯乙烯基)2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(己體氯氰菊酯)、(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基(1R，3R)-3-(2，2-二溴乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(溴氰菊酯)、α-氰基-3-苯氧基芐基2，2，3，3，-四甲基環(huán)丙烷甲酸酯(甲氰菊酯)、(RS)-α-氰基-3-苯氧基芐基(R)-2-[2-氯-4-(三氟甲基)苯氨基]-3-甲基丁酸酯(氟胺氰菊酯)、(2，3，5，6-四氟-4-甲基苯基)-甲基-(1α，3α)-(Z)-(±)-3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(七氟菊酯)、(±)-氰基(3-苯氧基苯基)甲基(±)-4-(二氟甲氧基)-α-(1-甲基乙基)苯乙酸酯(氟氰戊菊酯)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-[2-氯-2-(4-氯苯基)乙烯基]-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯苯菊酯)、氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲基3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯氰菊酯)、β-氟氯氰菊酯、四氟菊酯、(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基(Z)-(1R-順式)-2，2-二甲基-3-[2-(2，2，2-三氟-三氟甲基-乙氧基羰基)乙烯基]環(huán)丙烷甲酸酯(氟酯菊酯)、α-氰基-3-苯氧基芐基-3-(2，2-二氯乙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯的(1R順式)S和(1S順式)R對映異構體對(甲體氯氰菊酯)、[1R，3S)3(1′RS)(1′，2′，2′，2′-四溴乙基)]-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸(S)-α-氰基-3-苯氧基芐基酯(四溴菊酯)、氰基-(3-苯氧基苯基)甲基2，2-二氯-1-(4-乙氧基苯基)環(huán)丙烷甲酸酯(乙氰菊酯)、[1α，3α(Z)]-(±)-氰基-(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯((RS)氯氟氰菊酯)、[1α(S)，3α(Z)]-氰基(3-苯氧基苯基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯(氯氟氰菊酯)、(2-甲基[1，1′-聯(lián)苯]-3-基)甲基3-(2-氯-3，3，3-三氟-1-丙烯基)-2，2-二甲基-環(huán)丙烷甲酸酯(氟氯菊酯)、5-1-芐基-3-呋喃基甲基-d-順式(1R，3S，E)2，2-二甲基-3-(2-氧代，-2，2，4，5-四氫亞噻吩基甲基)環(huán)丙烷甲酸酯(噻嗯菊酯)、[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]-3-呋喃基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(芐呋菊酯)、(1R-反式)-[5-(苯基甲基)-3-呋喃基]甲基2，2-二甲基-3-(2-甲基-1-丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(右旋反滅蟲菊酯)、3，4，5，6-四氫鄰苯二甲酰亞氨基甲基(1RS)-順式-反式-菊酸酯(胺菊酯)、3-苯氧基芐基d，1-順式，反式2，2-二甲基-3-(2-甲基丙烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(苯醚菊酯)、烯炔菊酯、苯醚氰菊酯、烯酮菊酯、咪炔菊酯、(RS)-3-烯丙基-2-甲基-4-氧代環(huán)戊-2-烯基(1A，3R；1R，3S)-2，2-二甲基-3-(2-甲基丙-1-烯基)環(huán)丙烷甲酸酯(丙烯除蟲菊)、反丙烯除蟲菊和ZXI8901；噁二嗪衍生物類，包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亞氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氫化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪；chloronicotinyl類殺昆蟲劑，包括啶蟲清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒)、吡蟲啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亞胺)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺)；硝基胍類殺昆蟲劑；吡咯類；吡唑類，包括氟唑蟲清(4-溴-2-(4-氯苯基)-1-乙氧基甲基-5-三氟甲基吡咯-3-甲腈)、唑螨酯((E)-1，1-二甲基乙基酯)-4-[[[[(1，3-二甲基-5-苯氧基-1H-吡唑-4-基)亞甲基]氨基]氧基]甲基]苯甲酸和吡螨胺(4-氯-N-[[4-1，1-二甲基乙基)苯基]甲基]-3-乙基-1-甲基-1H-吡唑-5-甲酰胺)；苯基吡唑類，包括銳勁特(5-氨基-[2，6-二氯-4-(三氟甲基)苯基]-4-[(1R，S)-(三氟甲基)亞磺?；鵠-1H-吡唑-3-甲腈)；二?；骂悾ㄌ囟”锦ｋ?4-氯苯甲酸-2-苯甲酰基-2-(1，1-二甲基乙基)-酰肼)、甲氧苯酰肼(RH-2485；N-叔丁基-N′-(3-甲氧基-鄰甲苯甲酰基)-3，5-二甲苯酰肼)和雙苯酰肼(3，5-二甲基苯甲酸1-(1，1-二甲基乙基)-2，(4-乙基苯甲?；?酰肼)；三唑類，包括殺草強和唑蚜威；生物/發(fā)酵產(chǎn)物，包括齊墩螨素(阿維菌素)和艾克敵105(XDE-105)；有機磷酸酯類殺昆蟲劑，包括高滅磷、毒死蜱、甲基毒死蜱、二嗪農(nóng)、克線磷和馬拉松；和氨基甲酸酯類殺昆蟲劑，包括涕滅威、甲萘威、呋喃丹、甲氨叉威和硫雙威。
24.權利要求20的方法，其中所述殺蟲劑包括噁二嗪衍生物類。
25.權利要求24的方法，其中所述噁二嗪衍生物類包括5-(2-氯吡啶-5-基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪、3-甲基-4-硝基亞氨基-5-(1-氧化-3-吡啶基甲基)全氫化-1，3，5-噁二嗪、5-(2-氯-1-氧化-5-吡啶基甲基)-3-甲基-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪和3-甲基-5-(2-甲基吡啶-5-基甲基)-4-硝基亞氨基全氫化-1，3，5-噁二嗪。
26.權利要求20的方法，其中所述殺蟲劑包括chloronicotinyl類殺昆蟲劑。
27.權利要求26的方法，其中所述chloronicotinyl類殺昆蟲劑包括啶蟲清((E)-N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N′-氰基-N-甲基乙脒)、吡蟲啉(1-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-硝基-2-咪唑烷亞胺)和硝胺烯啶(N-[(6-氯-3-吡啶基)甲基]-N-乙基-N′-甲基-2-硝基-1，1-乙二胺)。
28.權利要求20的方法，其中所述殺蟲劑包括硝基胍類殺昆蟲劑。
29.權利要求20的方法，其中所述殺蟲劑是草甘膦。
30.權利要求22的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達選自下列的蛋白的能力Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242和Cry3Bb。
31.權利要求30的方法，其中所述殺蟲劑選自吡蟲啉和七氟菊酯。
32.權利要求31的方法，其中所述殺蟲劑包括吡蟲啉。
33.權利要求32的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3Bb.11231蛋白的能力。
34.權利要求32的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3Bb.11098蛋白的能力。
35.權利要求31的方法，其中所述殺蟲劑是七氟菊酯。
36.權利要求35的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3Bb.11231蛋白的能力。
37.權利要求35的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因事件包含表達Cry3Bb.11098蛋白的能力。
38.權利要求22的方法，其中所述殺蟲劑的有效量為至少約10克至約2000克殺蟲劑活性組分/100千克種子。
39.權利要求38的方法，其中所述殺蟲劑的有效量為至少約70克至約1000克殺蟲劑活性組分/100千克種子。
40.權利要求39的方法，其中所述殺蟲劑的有效量為至少約100克至約600克殺蟲劑活性組分/100千克種子。
41.權利要求40的方法，其中所述殺蟲劑的有效量為至少約200克至約500克殺蟲劑活性組分/100千克種子。
42.轉(zhuǎn)基因玉米植物種子，所述種子給所生長出的玉米植物提供了增強的抗一種或多種害蟲噬食性破壞的抵抗性，其中所述種子包含具有抗一種或多種害蟲當中至少一種的活性的轉(zhuǎn)基因事件，并且所述種子已經(jīng)用有效量的殺蟲劑處理過。
43.權利要求42的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠表達源自蘇云金芽孢桿菌的Cry3蛋白。
44.權利要求43的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠表達源自蘇云金芽孢桿菌的Cry3Bb蛋白。
45.權利要求43的種子，其中所述轉(zhuǎn)基因事件能夠表達源自蘇云金芽孢桿菌的Cry3Bb.11230、Cry3Bb.11231、Cry3Bb.11232、Cry3Bb.11233、Cry3Bb.11234、Cry3Bb.11235、Cry3Bb.11236、Cry3Bb.11237、Cry3Bb.11238、Cry3Bb.11239、Cry3Bb.11241、Cry3Bb.11242或Cry3Bb.11098蛋白。
46.已經(jīng)通過權利要求22的方法處理過的轉(zhuǎn)基因玉米種子。
全文摘要
保護玉米植物抵抗一種或多種害蟲噬食性破壞的方法，包括將具有抗至少一種害蟲的轉(zhuǎn)基因事件的玉米種子用抗相同或另外一種或多種害蟲的有效量的殺蟲劑處理。還公開了具有這樣的保護作用的種子。
文檔編號C12N15/29GK1476295SQ01816991
公開日2004年2月18日 申請日期2001年10月2日 優(yōu)先權日2000年10月6日
發(fā)明者J·阿薩, F·C·科恩, E·F·桑德斯, J 阿薩, 桑德斯, 科恩 申請人:孟山都技術有限公司