專利名稱：：合成改性淀粉的單子葉植物細胞和植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及遺傳修飾的單子葉植物細胞和植物，其中該遺傳修飾包括導入編碼具有R1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子。本發(fā)明還涉及其生產(chǎn)手段和方法。這類植物細胞和植物合成一種改性淀粉，其特征在于與來自未遺傳修飾的相應單子葉植物的淀粉相比，其磷酸含量升高，和/或磷酸化模式改變，和/或在RVA圖中的終粘度提高，和/或在DSC分析中的峰值溫度降低，和/或在結(jié)構(gòu)分析中的凝膠強度提高。因此，本發(fā)明也涉及由根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物合成的淀粉，和生產(chǎn)這種淀粉的方法。本發(fā)明還涉及含有這種改性淀粉的小麥粉，以及含有這種小麥粉和/或淀粉的食品和焙烤食品。
背景技術(shù)：
：最近，隨著作為原料可再生來源的植物內(nèi)容物的重要性越來越高，生物技術(shù)研究的任務之一是努力使這些植物原料適應加工工業(yè)的需要。為了促進可再生原料在盡可能多的領(lǐng)域中應用，也必須提供相當多的物質(zhì)。除了油類、脂肪和蛋白質(zhì)外，多糖也是來自植物的重要可再生原料。除纖維素之外，淀粉(高等植物中最重要的貯存物質(zhì)之一)可能在多糖中占據(jù)中心地位。多糖淀粉是化學均一的基本成分(即葡萄糖分子)的多聚體。然而，它是不同分子形式的極其復雜的混合物，在聚合程度和在葡萄糖鏈中出現(xiàn)分支區(qū)方面不同。因此淀粉不是一種均一的原料。兩種化學上不同的淀粉成分——直鏈淀粉和支鏈淀粉之間存在差別。在用于生產(chǎn)淀粉的典型植物中，如玉米、小麥或馬鈴薯，合成的淀粉含有可達約20％-30％的直鏈淀粉和可達約70％-80％的支鏈淀粉。有很長一段時間認為直鏈淀粉是由α-1，4-糖苷鍵合的α-D-葡萄糖單體組成的線性多聚體。然而，在最近的研究中，檢測到存在大約0.1％的α-1，6糖苷分支位點(Hizukuri和Takagi，Carbohydr.Res.134，(1984)，1-10；Takeda等人，CarbohydrRes.132，(1984)，83-92)。然而，完全分離直鏈淀粉與支鏈淀粉實際上非常困難，因此，直鏈淀粉的質(zhì)量強烈依賴于所選擇的分離方法的類型。與直鏈淀粉不同，支鏈淀粉分支更多，大約含有4％的分支位點，它們是由于存在其它α-1，6糖苷鍵而形成的。支鏈淀粉是不同分支的葡萄糖鏈的復合混合物。這兩種分子的另一個顯著差異是它們的分子量。根據(jù)淀粉來源，直鏈淀粉的分子量為5×105-106Da，而支鏈淀粉為107-108Da。這兩種大分子能根據(jù)其分子量和不同的物理化學性質(zhì)區(qū)分，最易表現(xiàn)在不同的碘鍵合性質(zhì)。直鏈淀粉與支鏈淀粉的另一個顯著差異在于可與這些大分子結(jié)合存在的痕量物質(zhì)的相對含量。直鏈淀粉對疏水性分子有高親和力。尤其在谷類中，直鏈淀粉能與含量相對較高的脂類復合(Morrison，CerealFoodsWorld40，(1995)，437-446)。另一方面，支鏈淀粉能以淀粉磷酸單酯的形式含有共價鍵合的無機磷酸，這對于直鏈淀粉迄今尚未有描述。特別是在由塊莖獲得的淀粉中發(fā)現(xiàn)有高含量的磷酸單酯。在市售淀粉中，馬鈴薯淀粉磷酸含量最高，為10-30nmolmg-1淀粉。在姜黃屬(Curcuma)的某些種類中，磷酸含量甚至高2-4倍(Bay-Smidt等人，第5屆ISPMP會議論文集，(1997)，741)，而在谷類中大約低100倍(Kasemsuwan和Jane，CerealChem.73，(1996)，702-707)。與來自塊莖、根和莢的淀粉不同，谷類淀粉(單子葉植物)中可檢測到的磷酸很少是淀粉單酯衍生物的形式，而主要是磷脂的形式(Jane等人，CerealFoodsWorld41，(1996)，827-832)。除了直鏈淀粉/支鏈淀粉比和磷酸含量之外，淀粉的功能性質(zhì)也受其分子量、側(cè)鏈分布模式、離子含量、脂類和蛋白質(zhì)含量等的影響。在此應當提到的重要功能性質(zhì)有溶解度、退化行為、吸水性、薄膜形成特性、粘度、膠固特性、凍融穩(wěn)定性、酸穩(wěn)定性、凝膠強度等。淀粉顆粒大小對于不同的用途也可能是重要的。原則上能通過遺傳工程方法或通過天然淀粉隨后的化學磷酸化改變磷酸含量(參見，例如《淀粉化學和技術(shù)》，R.L.Whistler，J.N.BeMiller和E.F.Paschall編著，AcademicPress，NewYork，1988，349-364)。然而，化學修飾通常昂貴且耗時，而且產(chǎn)生的淀粉的理化性質(zhì)可能與體內(nèi)修飾的淀粉不同。由于來源于單子葉野生型植物，特別是來源于谷類植物(小麥、水稻、玉米、燕麥、粟、黑麥)的淀粉，只含有極少量的淀粉磷酸單酯形式的磷酸(Lim等人，CerealChem.71，(1994)，488)，因此，本發(fā)明的一個目的在于提供單子葉植物，它們與相應的野生型植物細胞和植物相比，能合成磷酸含量(淀粉磷酸單酯含量)提高且理化性質(zhì)改變的淀粉。
發(fā)明內(nèi)容因此本發(fā)明的主要目的在于提供遺傳修飾的單子葉植物細胞和植物，與未遺傳修飾的相應野生型植物細胞和植物相比，它們能合成結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)發(fā)生改變的淀粉，本發(fā)明目的還在于提供淀粉，其結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)不同于來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞和植物的淀粉和化學修飾的淀粉，因而更適于普通和/或特殊的工業(yè)用途。此目的通過權(quán)利要求書所述的實施方案實現(xiàn)，因為已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，向單子葉植物細胞和植物的基因組中導入外源核酸分子使得該單子葉植物細胞和植物中合成的淀粉的結(jié)構(gòu)和/或功能性質(zhì)改變。外源核酸分子的表達主要在單子葉植物(特別是小麥植物)的淀粉貯藏器官中有利，而且使得自淀粉貯藏器官分離的淀粉與自未遺傳修飾的相應野生型植物(特別是小麥植物)的淀粉貯藏器官分離的淀粉相比，磷酸含量提高，粘性改變。而且，根據(jù)本發(fā)明的淀粉與化學磷酸化的淀粉的區(qū)別在于改變的磷酸化模式和改變的粘性，在淀粉膠固和凝膠形成之后，區(qū)別還在于改變的凝膠強度。因此，本發(fā)明涉及遺傳修飾的單子葉植物細胞，其中該遺傳修飾包括至少一種外源核酸分子的導入，該外源核酸分子選自a)含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)的核酸分子；b)編碼具有SeqIDNo.2所示氨基酸序列的馬鈴薯(Solanumtuberosum)R1蛋白的核酸分子；c)是SeqIDNo.1所示核苷酸序列的衍生物的核酸分子；和d)是(a)、(b)或(c)所述核酸分子的片段的核酸分子。在本發(fā)明中，術(shù)語“遺傳修飾的”是指由于導入外源核酸分子，植物細胞的遺傳信息改變，以及外源核酸分子的存在或表達導致表型改變。術(shù)語“表型改變”優(yōu)選地是指細胞一種或多種功能的可測量的改變。例如，根據(jù)本發(fā)明的遺傳修飾的植物細胞顯示改變的表達模式。在本發(fā)明中，術(shù)語“遺傳修飾”是指根據(jù)本發(fā)明的單子葉植物細胞至少含有一種以適當方式整合于基因組中的外源核酸分子。在本發(fā)明中，可以認為術(shù)語“外源核酸分子”是指這樣一種核酸分子，其編碼一種具有R1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地來自馬鈴薯的R1蛋白，并且不在未遺傳修飾的相應野生型植物細胞中天然存在。外源核酸分子優(yōu)選地是由不同成分組成的重組分子，其組合或特異性空間排列不在植物細胞中天然存在。根據(jù)本發(fā)明的單子葉植物細胞至少含有一種外源核酸分子，其中后者優(yōu)選地與確保在植物細胞中轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)DNA元件(特別是啟動子)連接。編碼馬鈴薯R1蛋白的外源核酸分子的一個例子如SEQIDNo.1所示。WO97/11188A1和Lorberth等人(NatureBiotech.16，(1998)，473-477)也描述了編碼馬鈴薯R1蛋白的核苷酸序列。馬鈴薯R1蛋白的重要特征包括i)其氨基酸序列(例如，見SEQIDNo.2)；ii)它們在植物細胞質(zhì)體基質(zhì)中的位置，它們能以與淀粉粒結(jié)合的形式和可溶形式存在；和iii)它們影響植物中淀粉磷酸化程度的能力。例如，在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中編碼馬鈴薯R1蛋白的R1基因的抑制導致可從馬鈴薯塊莖中分離的淀粉磷酸含量減少。此外，Lorberth等人表示，如果在大腸桿菌中表達相應的R1cDNA，馬鈴薯R1蛋白能磷酸化細菌糖原(Lorberth等人，NatureBiotech.16，(1998)，473-477)。Ritte等人(PlantJ.21，(2000)，387-391)表示，馬鈴薯R1蛋白與馬鈴薯植物中的淀粉?？赡娼Y(jié)合，其中與淀粉粒的結(jié)合強度取決于植物的代謝狀態(tài)。對于淀粉粒結(jié)合形式，馬鈴薯植物中的蛋白質(zhì)主要存在于置于暗處的葉子中。然而，對葉子進行光照后，該蛋白質(zhì)主要以不與淀粉粒結(jié)合的可溶形式存在。而且，抑制馬鈴薯R1基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物中表達產(chǎn)生“淀粉過量”表型，即相應植物的葉子淀粉含量升高(Lorberth等人，NatureBiotech.16，(1998)，473-477)。除此之外，這類馬鈴薯植物的塊莖的區(qū)別還在于，它們在冷藏后顯示“冷誘導的甜化”降低(Lorberth等人，NatureBiotech.16，(1998)，473-477)。原則上，編碼R1蛋白的外源核酸分子能來源于任何種類的馬鈴薯或馬鈴薯植物，優(yōu)選地來源于Tomensa、Desiree、Tempora和Thomana品種的馬鈴薯。在一個優(yōu)選實施方案中，外源核酸分子含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明包括SEQIDNo.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)的外源核酸分子。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，外源核酸分子編碼一種來自馬鈴薯的R1蛋白，該蛋白具有SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一個實施方案中，外源核酸分子包含成熟(不含質(zhì)體信號肽)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)(SEQIDNo.1所示核苷酸序列的bp447-bp4607)。在本發(fā)明該實施方案中，外源核酸分子包含一種異源質(zhì)體信號序列，即不天然存在與成熟R1蛋白結(jié)合的信號序列，代替馬鈴薯R1蛋白的質(zhì)體N-端信號肽(由SEQIDNo.1所示核苷酸序列的核苷酸216-446編碼的氨基酸1-77)。質(zhì)體信號序列本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。例如，來自spinate的鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶(FNR)的信號序列能用作質(zhì)體信號序列。該序列包含spinate質(zhì)體蛋白鐵氧還蛋白NADP+氧化還原酶的cDNA的5′-非翻譯區(qū)及側(cè)翼轉(zhuǎn)運肽序列(核苷酸-171到+165；Jansen等人，CurrentGenetics13，(1988)，517-522)。另外，例如，玉米蠟樣蛋白的轉(zhuǎn)運肽加成熟蠟樣蛋白的前34個氨基酸能用作信號序列(Klsgen等人，Mol.Gen.Genet.217，(1989)，155-161)。此外，也能應用不含成熟蠟樣蛋白前34個氨基酸的玉米蠟樣蛋白的轉(zhuǎn)運肽。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，外源核酸分子是SEQIDNo.1所示核苷酸序列的一種衍生物。在本發(fā)明中，表述“衍生物”是指這些分子的序列與SEQIDNo.1所示的核苷酸序列在一個或多個位點上不同，并且顯示與SEQIDNo.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)有高度同源性。另外，衍生物的區(qū)別還在于它們編碼一種具有R1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)，優(yōu)選地來自馬鈴薯的R1蛋白。在本發(fā)明中，“同源性”是指至少65％，特別是至少85％，更特別地至少90％，優(yōu)選地高于95％，最優(yōu)選地高于98％的核苷酸序列的序列同一性。與上述核酸分子的不同可能是由于缺失、添加、置換、插入或重組。同源性程度優(yōu)選地如下確定將各自的核苷酸序列與SEQIDNo.1的編碼區(qū)相比較，特別是與編碼SEQIDNo.1所示核苷酸序列的成熟蛋白質(zhì)的SEQIDNo.1區(qū)(bp447-bp4607)相比較。如果將要比較的序列長度不同，同源性程度優(yōu)選地是指較短核苷酸序列中與較長序列的核苷酸相同的核苷酸的百分數(shù)，也就是說，對各自的核苷酸序列重疊的區(qū)域測定序列同一性。序列比較能用周知的計算機程序進行，如ClustalW程序(Thompson等人，NucleicAcidsResearch22，(1994)，4673-4680)，該程序由JulieThompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE；歐洲分子生物學實驗室，Meyerhofstrasse1，D69117Heidelberg，德國)開發(fā)。ClustalW也能從不同的因特網(wǎng)站點下載，例如IGBMC(InstitutdeGénétiqueetdeBiologieMoléculaireetCellulaire，B.P.163，67404IllkirchCedex，法國；ftp//ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI(歐洲生物信息學研究所)(ftp//ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)，以及與EBI鏈接的因特網(wǎng)站點(歐洲生物信息學研究所，WellcomeTrustGenomeCampus，Hinxton，CambridgeCB101SD，UK)。當采用ClustalW程序(1.8版)時，各種參數(shù)使用缺省值。對于DNA序列比較，這些參數(shù)的值如下KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIXIUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，轉(zhuǎn)換未加權(quán)。對于蛋白質(zhì)序列的比較，ClustalW程序的參數(shù)同樣使用缺省值。這些參數(shù)的值如下KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。例如，同源性程度能用眾所周知的計算機程序確定，如Mview(http//www.sacseeucsf.edu/documentation/seqsoftware/mview；Brown，N.P.，LeroyC.，SanderC.(1998).Mview一個Web兼容的數(shù)據(jù)庫搜索或多次比對瀏覽器。Bioinformatics，14(4)380-381)。在本發(fā)明中，“同源性”也指在各自的核酸分子或它們編碼的蛋白質(zhì)之間具有功能和/或結(jié)構(gòu)相當。與SEQIDNo.1所示核酸分子同源，并且是這些分子的衍生物的核酸分子，是這些分子的變體，它們具有行使相同生物功能的修飾，在體內(nèi)也能提高單子葉植物中淀粉的磷酸含量。它們可能是天然存在的變體，例如來自其他種類馬鈴薯的序列，或突變，其中該突變可自然形成或者可通過定向誘變導入。在本發(fā)明的另一個實施方案中，SEQIDNo.1的衍生物包括SEQIDNo.1所示核酸分子的等位變體。這些等位變體是天然存在的變體，能提高淀粉的磷酸含量。在本發(fā)明的另一個實施方案中，外源核酸分子是根據(jù)本發(fā)明定義的外源核酸分子的片段。在本發(fā)明中，術(shù)語“片段”是指外源核酸分子的部分，其編碼具有生物活性，優(yōu)選地酶活性的R1蛋白的部分。R1蛋白生物活性部分的區(qū)別在于由于外源核酸分子超表達，它在植物中能使磷酸含量提高，和/或在大腸桿菌中表達后促進糖原的磷酸化(見WO97/11188A1，實施例9)。由外源核酸分子的不同變體(片段、衍生物、等位變體)編碼的蛋白質(zhì)顯示明確的一般特征。后者的例子包括生物活性、酶活性或能利用上述蛋白質(zhì)同源性比較方法研究的相似的一級結(jié)構(gòu)。這些蛋白質(zhì)的氨基酸序列顯示至少60％、優(yōu)選地至少85％、特別地至少95％、最優(yōu)選地至少97％的相互同源性。除了上述特征外，外源核酸分子的特征還在于它們編碼具有R1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)至少含有1種、優(yōu)選地至少5種、特別地至少10種、最優(yōu)選地全部下列特有肽基序DKAAET(SEQIDNo.3)，IADME(SEQIDNo.4)，VWMRFM(SEQIDNo.5)，MQEWHQ(SEQIDNo.6)，LGHYM(SEQIDNo.7)，ERGYEE(SEQIDNo.No.8)，KAVLDR(SEQIDNo.9)，LSSLL(SEQIDNo.10)，IPDGAV(SEQIDNo.No.11)，KVCFAT(SEQIDNo.12)，ISADEF(SEQIDNo.13)，PFGVFE(SEQIDNo.14)，SSGDD(SEQIDNo.15)，SFICKK(SEQIDNo.16)。在其它差別中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞與天然存在的植物細胞的區(qū)別還在于它們含有不在這些細胞中天然存在的外源核酸分子，或者如此所述的一種分子整合到細胞基因組中一個不天然存在的位置，即不同的基因組環(huán)境中。而且，根據(jù)本發(fā)明的這類轉(zhuǎn)基因植物細胞與天然存在的植物細胞的區(qū)別還在于除了任選地如在細胞中天然存在的分子拷貝外，它們還含有以穩(wěn)定方式整合到基因組中的至少一個拷貝的外源核酸分子。如果導入細胞中的核酸分子是細胞中天然存在的分子的其它拷貝，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞與天然存在的植物細胞的區(qū)別尤其在于這些拷貝位于基因組中不天然存在的位點。例如，隨后能利用Southern印跡分析檢測。此外，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞與天然存在的植物細胞的區(qū)別優(yōu)選地在于至少下列特征之一如果導入的核酸分子對于植物是異源的，根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細胞含有導入的核酸分子的轉(zhuǎn)錄物，實際上甚至在野生型植物中檢測不到轉(zhuǎn)錄物的器官中。根據(jù)本發(fā)明的植物細胞優(yōu)選地含有外源核酸分子的轉(zhuǎn)錄物。例如，它們能通過Northern印跡分析檢測。根據(jù)本發(fā)明的植物細胞優(yōu)選地含有由導入的外源核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。例如，這種添加的蛋白質(zhì)能用免疫學方法檢測，特別是通過Western印跡分析檢測。在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物顯示比未遺傳修飾的相應野生型植物細胞和野生型植物提高的R1蛋白生物活性。對于本發(fā)明，例如，能通過測定在根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物中合成的淀粉的磷酸含量確定“提高的R1蛋白生物活性”。與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，來自根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的淀粉顯示提高的R1蛋白生物活性，其區(qū)別在于，它們合成一種磷酸含量提高的淀粉，優(yōu)選地，在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高。而且，提高的R1蛋白生物活性也能如下測定測定R1-轉(zhuǎn)錄物的量，例如利用Northern印跡分析測定，與未遺傳修飾的相應野生型植物中R1-轉(zhuǎn)錄物的量相比較。此外，提高的RI蛋白生物活性也能如下測定測定R1蛋白的量，例如利用Western印跡分析測定，與未遺傳修飾的相應野生型植物中RI蛋白的量相比較。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明的單子葉植物細胞合成一種淀粉，該淀粉與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或粘性改變。因此，本發(fā)明優(yōu)選地涉及根據(jù)本發(fā)明的植物細胞，其合成一種淀粉，該淀粉與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或粘性改變。在本發(fā)明中，術(shù)語“磷酸含量”是指以淀粉磷酸單酯形式共價鍵合的磷酸的含量。在本發(fā)明中，術(shù)語“C6位”是指磷酸基團，它在碳原子位點“6”處與淀粉的葡萄糖單體鍵合。對于本發(fā)明，表述“提高的C6位的磷酸含量”是指利用光學-酶試驗能在C6位檢測到的葡萄糖單體磷酸基團(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117，見方法)。表述“提高的C6位的磷酸含量”優(yōu)選地是指，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉的磷酸含量相比，淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少提高20％，優(yōu)選地至少50％，最優(yōu)選地至少100％。原則上，淀粉中葡萄糖單位的C2、C3和C6位能在體內(nèi)磷酸化。對于本發(fā)明，C6位的磷酸含量(＝C6P含量)能利用光學-酶試驗通過葡萄糖-6-磷酸測定法測定(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117)(見方法)。在本發(fā)明中，術(shù)語“改變的磷酸化模式”是指相對于由來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉產(chǎn)生的化學磷酸化淀粉，與淀粉粒不同層內(nèi)的淀粉共價鍵合的磷酸基團的總磷酸含量改變?；瘜W磷酸化淀粉的區(qū)別在于淀粉粒內(nèi)的磷酸梯度，其中外層一般比內(nèi)層更強烈地磷酸化。相反，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的區(qū)別在于，磷酸基團在淀粉粒不同層上分布不同，即，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征可能在于，它們不含化學磷酸化淀粉特有的從外到內(nèi)的梯度。研究淀粉磷酸化模式的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知(例如，見Jane和Shen，CarbohydrateResearch247，(1993)，279-290；Gough和Pybus，Staerke25，(1973)，123-130)。這些方法基于淀粉粒不同層的逐步化學膠固，在這些步驟中機械去除淀粉粒的膠固層。在此去殼步驟之后，利用標準方法測定不同淀粉粒層的總磷酸含量。在本發(fā)明中，術(shù)語“化學磷酸化淀粉”是指通過來自未遺傳修飾的相應植物細胞和/或植物的天然淀粉的化學磷酸產(chǎn)生的淀粉。對于本發(fā)明，化學磷酸化淀粉的區(qū)別優(yōu)選地在于，與根據(jù)本發(fā)明的淀粉的直鏈淀粉含量相當?shù)闹辨湹矸酆?。在天然淀粉的化學磷酸化過程中，通過選擇適當?shù)脑囼灄l件調(diào)節(jié)C6位的磷酸含量，使得化學磷酸化淀粉C6位的磷酸含量與根據(jù)本發(fā)明的淀粉的葡萄糖單體C6位的磷酸含量相同和/或相當。對于本發(fā)明，術(shù)語“改變的粘性”特別是指RVA圖中終粘度的提高和/或DSC分析中峰值溫度的降低。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞合成一種淀粉，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉相比，其終粘度提高。對于本發(fā)明，術(shù)語“終粘度”是指能根據(jù)粘度分布圖(見圖1)確定的粘度，表示為“終粘度＝Fin”。粘度分布圖能用快速粘度分析儀(RVA)(NewportScientificPtyLtd，InvestmentSupportGroup，Warriewood，NSW2102，澳大利亞)獲得。在小麥淀粉的分析中，粘度分布圖通過下列步驟獲得2.5g淀粉(干物質(zhì))吸收于25mlH2O中，用快速粘度分析儀(NewportScientificPtyLtd，InvestmentSupportGroup，Warriewood，NSW2102，澳大利亞)分析。儀器按照使用說明書操作。完整的溫度程序在圖1中示意說明。下文詳述了如何進行RVA分析(見方法)。在本發(fā)明中，術(shù)語“提高的終粘度”是指與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，終粘度至少提高10％，優(yōu)選地至少30％，特別地至少50％，最優(yōu)選地至少80％，其中與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，終粘度最多能提高1000％，優(yōu)選地最多500％，特別地最多250％。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞合成一種淀粉，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉相比，和/或與化學磷酸化淀粉相比，該淀粉在葡萄糖單體C6位有相同或相當?shù)牧姿岷?，?或峰值溫度降低。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“峰值溫度”應當是指溫度Tp，它能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的差示掃描量熱法(DSC)測量。峰值溫度是通常賦予DSC曲線第一峰最大值的溫度。例如，能用大體積容器，用PerkinElmer的儀器(儀器名稱DSC-7)測量，其中所研究的樣品的淀粉與總含水量之比約為1∶4，以10℃/min的加熱速度在10℃-160℃溫度范圍內(nèi)進行測量(見實施例4)。術(shù)語“降低的峰值溫度”Tp是指與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，峰值溫度Tp至少降低1.5℃，優(yōu)選地至少2.5℃，特別地至少4℃，最優(yōu)選地至少6℃，最多降低5℃、12℃或9℃。在另一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的植物細胞，其合成一種淀粉，在膠固后形成凝膠，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉形成的凝膠相比，凝膠強度提高。在本發(fā)明中，術(shù)語“提高的凝膠強度”是指與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉的凝膠強度相比，凝膠強度至少提高20％，特別地至少50％，優(yōu)選地至少80％，最優(yōu)選地至少100％，最大值最多降低500％，或最多250％。對于本發(fā)明，能在下述條件下利用結(jié)構(gòu)分析儀測定凝膠強度(見方法)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，淀粉磷酸含量的提高可能與淀粉的支鏈淀粉成分有關(guān)。因此，本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的植物細胞，它們合成一種淀粉，其支鏈淀粉成分磷酸化，與在葡萄糖單體C6位具有相同淀粉磷酸含量的相應化學磷酸化淀粉的直鏈淀粉成分相比，其直鏈淀粉成分的總磷酸含量降低。因此，與在葡萄糖單體C6位具有相同淀粉磷酸含量的化學磷酸化淀粉不同，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的淀粉的區(qū)別在于與化學磷酸化淀粉(在葡萄糖單體C6位具有相同磷酸含量，由來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉產(chǎn)生，優(yōu)選地具有相當?shù)闹辨湹矸酆?的直鏈淀粉成分相比，來自根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的淀粉的直鏈淀粉成分總磷酸含量降低，和/或葡萄糖單體C6位的磷酸含量降低。對于本發(fā)明，術(shù)語“總磷酸含量”是指在葡萄糖單位C2、C3和C6位以淀粉磷酸單酯形式共價結(jié)合的磷酸的含量。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“總磷酸含量”不包括磷酸化的非葡聚糖(如磷脂)的含量。因此，在測定總磷酸含量之前必須定量分離磷酸化的非葡聚糖。從淀粉中分離磷酸化的非葡聚糖(例如磷脂)的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。在本發(fā)明中，術(shù)語“降低的總磷酸含量”是指，與化學磷酸化淀粉(由來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉產(chǎn)生，具有相同的C6磷酸含量)直鏈淀粉成分的總磷酸含量相比，總磷酸含量至少降低5％，特別地至少20％，優(yōu)選地至少50％，最優(yōu)選地至少80％。測定總磷酸含量的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，如下所述(見方法)。在本發(fā)明中，可以認為術(shù)語“降低的葡萄糖單體C6位磷酸含量”是指，與化學磷酸化淀粉(由來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉產(chǎn)生，具有相同的C6磷酸含量)直鏈淀粉成分的總磷酸含量相比，直鏈淀粉成分的葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少降低10％，特別地至少20％，優(yōu)選地至少50％，最優(yōu)選地至少80％。測定葡萄糖單體C6位磷酸含量的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，如下所述(見方法)。在本發(fā)明中，術(shù)語“支鏈淀粉成分”是指淀粉的支鏈淀粉。在本發(fā)明中，術(shù)語“直鏈淀粉成分”是指淀粉的直鏈淀粉。分離直鏈淀粉與支鏈淀粉的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。例如，直鏈淀粉成分能通過淀粉的水浸析獲得，如Roger和Colonna所述(InternationalJournalofBiologicalMacromolecules19，(1996)，51-61)。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征還在于直鏈淀粉成分C6位上葡萄糖單體的C6磷酸含量與淀粉C6位上葡萄糖單體的C6磷酸含量之比小于0.75，特別是小于0.5，優(yōu)選地小于0.25，最優(yōu)選地小于0.20。與化學磷酸化的淀粉不同，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的區(qū)別在于，在淀粉的支鏈淀粉成分中檢測到大部分葡萄糖單體C6位的磷酸，而在直鏈淀粉成分中未檢測到。根據(jù)本發(fā)明的植物細胞來源于單子葉植物。它們優(yōu)選地是來自農(nóng)業(yè)植物的植物細胞，即來自為了營養(yǎng)目的或技術(shù)目的，特別是工業(yè)目的人工培育的植物。因此，本發(fā)明優(yōu)選地涉及來自淀粉合成或淀粉貯藏植物的植物細胞，例如黑麥、大麥、燕麥、小麥、粟、水稻或玉米。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞來源于選自下列的植物小麥、水稻、大麥、燕麥、黑麥和玉米。優(yōu)選來自小麥、水稻和玉米植物的植物細胞；特別優(yōu)選來自小麥植物的植物細胞。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為0.1nmolC6Pmg-1淀粉，特別地至少0.5nmolC6Pmg-1，優(yōu)選地至少1nmolC6Pmg-1淀粉，更優(yōu)選地至少2nmolC6Pmg-1淀粉，最優(yōu)選地至少5nmolC6Pmg-1淀粉，最特別優(yōu)選地至少10nmolC6Pmg-1淀粉，其中根據(jù)本發(fā)明的植物細胞合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，最特別地最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞能合成一種在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為15nmolC6Pmg-1淀粉的淀粉，其中根據(jù)本發(fā)明的植物細胞合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，最特別地最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的方法，其中遺傳修飾單子葉植物細胞，此遺傳修飾包括至少一種外源核酸分子的導入。有多種技術(shù)可用于向植物宿主細胞中轉(zhuǎn)移DNA。這些技術(shù)包括用根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑，用T-DNA轉(zhuǎn)化植物細胞，原生質(zhì)體融合，注射，DNA的電穿孔，利用biolistic技術(shù)和其它可能的技術(shù)導入DNA。已經(jīng)廣泛研究了農(nóng)桿菌介導的植物細胞轉(zhuǎn)化的應用，在下列文獻中描述，例如EP120516；Hoekema，《二元植物載體系統(tǒng)》，OffsetdrukkerijKantersB.V.，Alblasserdam(1985)，第V章；Fraley等人，Crit.Rev.PlantSci.4，146，An等人，EMBOJ.4，(1985)，277-287。關(guān)于馬鈴薯的轉(zhuǎn)化，例如見Rocha-Sosa等人，EMBOJ.8，(1989)，29-33)。單子葉植物的轉(zhuǎn)化同時用biolistic技術(shù)并利用農(nóng)桿菌常規(guī)進行(Komari等人，(1998)，谷類基因轉(zhuǎn)移進展；《現(xiàn)代植物生物技術(shù)觀點》，第161頁；Bilang等人，(1999)，谷類的轉(zhuǎn)化，《基因工程》，12，第113-148頁，編者JKSetlow，KluwerAcademic/PlenumPublisher，紐約)。基于農(nóng)桿菌的載體已經(jīng)描述(Chan等人，PlantMol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等人，PlantJ.6，(1994)271-282；Deng等人，ScienceinChina33，(1990)，28-34；Wilmink等人，PlantCellReports11，(1992)，76-80；May等人，Bio/Technology13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.PlantSci.153(1992)，550-555；Ritchie等人，TransgenicRes.2，(1993)，252-265)。用于單子葉植物轉(zhuǎn)化的備選系統(tǒng)包括利用biolistic技術(shù)轉(zhuǎn)化(Wan和Lemaux，PlantPhysiol.104，(1994)，37-48；Vasil等人，Bio/Technology11(1993)，1553-1558；Ritala等人，PlantMol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等人，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，部分透化細胞的電穿孔，利用玻璃纖維導入DNA。特別是，玉米的轉(zhuǎn)化已在文獻中多次描述(例如WO95/06128，EP0513849，EO0465875，EP292435；Fromm等人，Biotechnology8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等人，PlantCell2，(1990)，603-618；Koziel等人，Biotechnology11(1993)，194-200；Moroc等人，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。其它種類谷類的成功轉(zhuǎn)化也有描述，例如，對于大麥(Wan和Lemaux，見上文；Ritala等人，見上文；Krens等人，Nature296，(1982)，72-74)，對于小麥(Becker等人，PlantJ.5(2)，(1994)，229-307；Nehra等人，PlantJ.5，(1994)，285-297)。已經(jīng)描述了用于水稻的多種轉(zhuǎn)化方法，例如，農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化(Hiei等人，PlantJ.6(1994)，271-282；Hiei等人，PlantMol.Biol.35(1997)，205-218；Park等人，J.PlantBiol.38(1995)，365-371)，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Datta，《向植物中的基因轉(zhuǎn)移》，Potrykus，Spangenberg(編寫)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，66-75；Datta等人，PlantMol.Biol.20(1992)，619-629；Sadasivam等人，PlantCellRep.13(1994)，394-396)，用于植物轉(zhuǎn)化的biolistic技術(shù)(Li等人，PlantCellRep.12(1993)，250-255；Cao等人，PlantCellRep.11(1992)，586-591；Christou，PlantMol.Biol.(1997)，197-203)，電穿孔(Xu等人，《向植物中的基因轉(zhuǎn)移》，Potrykus，Spangenberg(編寫)，Springer-Verlag，Berlin，Heidelberg，1995，201-208)。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的植物和/或能通過根據(jù)本發(fā)明的植物細胞再生產(chǎn)生的植物。這些植物優(yōu)選地是有用的單子葉植物，例如黑麥、大麥、燕麥、小麥，粟、水稻和玉米。優(yōu)選小麥、水稻和玉米，特別優(yōu)選小麥。根據(jù)本發(fā)明的植物合成一種改性淀粉，其磷酸含量和/或磷酸化模式和/或粘性不同于來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉，如對于根據(jù)本發(fā)明的植物細胞所述。因此，本發(fā)明也涉及根據(jù)本發(fā)明的植物，其合成一種淀粉，與來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉相比，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或顯示改變的磷酸化模式和/或改變的粘性。對根據(jù)本發(fā)明的植物細胞所作的描述，在淀粉葡萄糖單體C6位磷酸含量的提高、磷酸化模式的改變和淀粉粘性的改變等方面是適用的。本發(fā)明優(yōu)選地涉及根據(jù)本發(fā)明的植物，其合成一種淀粉，在膠固后形成凝膠，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉形成的凝膠相比，凝膠強度提高。術(shù)語“提高的凝膠強度”對根據(jù)本發(fā)明的植物細胞定義。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物優(yōu)選地是小麥植物，其合成一種淀粉，優(yōu)選地小麥淀粉，在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為0.1nmolC6Pmg-1淀粉，特別地至少0.5nmolC6Pmg-1，優(yōu)選地至少1nmolC6Pmg-1淀粉，最優(yōu)選地至少2nmolC6Pmg-1淀粉，特別地至少5nmolC6Pmg-1淀粉，最優(yōu)選地至少10nmolC6Pmg-1淀粉，其中根據(jù)本發(fā)明的植物合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，或最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物能合成一種在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為15nmolC6Pmg-1淀粉的淀粉，其中根據(jù)本發(fā)明的植物合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體的C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，或最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物在根據(jù)本發(fā)明的植物的淀粉貯藏器官中合成根據(jù)本發(fā)明的淀粉。在一個最優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物在其淀粉貯藏器官中合成一種淀粉，與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉貯藏器官的淀粉相比，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或粘性改變。就此而言，表述“淀粉貯藏器官”是指與只暫時合成淀粉的器官(如葉子)不同，含有貯藏淀粉的那些器官，例如玉米、水稻、和小麥植物的谷粒。外源核酸分子的表達在單子葉植物(尤其小麥植物)的淀粉貯藏器官中特別有利，而且使得能從淀粉貯藏器官分離的淀粉與能從未遺傳修飾的相應野生型植物(特別是小麥植物)的淀粉貯藏器官分離的淀粉相比，磷酸含量提高。外源核酸分子在單子葉植物的淀粉貯藏器官中的表達首先能利用組成型啟動子實現(xiàn)，例如花椰菜花葉病毒35SRNA啟動子(參見例如US-A-5,352,605)和玉米遍在蛋白啟動子(參見例如US-A-5,614,399)。優(yōu)選地使用淀粉貯藏器官特異的啟動子，例如胚乳特異的啟動子，如谷蛋白啟動子(Leisy等人，PlantMol.Biol.14，(1990)，41-50；Zheng等人，PlantJ.4，(1993)，357-366；Yoshihara等人，F(xiàn)EBSLett.383，(1996)，213-218)，shrunken-1啟動子(Werr等人，EMBOJ.4，(1985)，1373-1380)，小麥HMW啟動子(AndersonAnderson，TheoreticalandAppliedGenetics96，(1998)，568-576，Thomas，PlantCell2(12)，(1990)，1171-1180)，USP啟動子，菜豆蛋白啟動子(Sengupta-Gopalan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82(1985)，3320-3324，Bustos，PlantCell1(9)(1989)，839-853)，或來自玉米的玉米醇溶蛋白基因啟動子(Pedersen等人，Cell29，(1982)，1015-1026；Quatroccio等人，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)，或小麥GBSSI(顆粒結(jié)合的淀粉合酶I)(DE10041861.9)和SSII(可溶性淀粉合酶II)的穎果特異性啟動子(DE10032379.0)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物在該植物的淀粉貯藏器官中顯示R1基因表達。R1基因的表達能如下測定，例如測定R1轉(zhuǎn)錄物的量，例如通過Northern印跡分析測定，與野生型植物的R1轉(zhuǎn)錄物的量相比較。而且，對于本發(fā)明，R1基因的表達能如下測定測定R1蛋白的量，例如通過Western印跡分析測定。優(yōu)選地利用從胚乳植物細胞分離的蛋白質(zhì)提取物測定R1蛋白的量。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物在該植物的淀粉貯藏器官中顯示R1基因表達，與未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉貯藏器官中的R1基因表達相比，優(yōu)選地至少提高50％，最優(yōu)選地至少100％，特別地至少250％，最特別地至少500％。在一個最優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物顯示外源核酸分子在根據(jù)本發(fā)明的植物的淀粉貯藏器官中器官特異的表達。在本發(fā)明中，術(shù)語“器官特異的”是指與成熟的葉子相比，選擇的啟動子更偏好在淀粉貯藏器官中表達外源核酸分子，并且導致表達程度顯著提高，如表達水平至少提高2-5倍，優(yōu)選地5-10倍，最優(yōu)選地10-100倍。在本發(fā)明該實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物的區(qū)別在于，由于外源核酸分子器官特異地表達，它們顯示R1基因在淀粉貯藏器官中的表達高于內(nèi)源R1基因在未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉貯藏器官中的基因表達。在本發(fā)明該實施方案中，R1基因在根據(jù)本發(fā)明的植物葉子中表達的提高不能與在淀粉貯藏器官中的表達同等檢測。R1基因表達的提高優(yōu)選地只與淀粉貯藏器官有關(guān)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的植物是選自小麥、水稻、大麥，粟、燕麥、黑麥和玉米的植物。優(yōu)選小麥、水稻和玉米植物；特別優(yōu)選小麥植物。本發(fā)明也涉及一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明定義的植物的方法，其中(a)遺傳修飾一種單子葉植物細胞，其中該遺傳修飾包括導入至少一種外源核酸分子；(b)由根據(jù)步驟(a)的細胞再生的一種植物；和任選地(c)由根據(jù)步驟(b)生產(chǎn)的植物生產(chǎn)的其它植物。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明定義的植物的方法，在該植物的淀粉貯藏器官中合成一種淀粉，與來自野生型植物淀粉貯藏器官的淀粉相比，該淀粉的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低，其中(a)遺傳修飾一種單子葉植物細胞，其中該遺傳修飾包括導入至少一種根據(jù)本發(fā)明定義的外源核酸分子；(b)由根據(jù)步驟(a)的細胞再生的一種植物；和任選地(c)由根據(jù)步驟(b)生產(chǎn)的植物生產(chǎn)的其它植物。同樣適用于根據(jù)步驟(a)導入的遺傳修飾，如上對于根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物所述。根據(jù)步驟(b)的植物再生能用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法完成。按照根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟(c)生產(chǎn)其它植物能如下完成，例如通過無性繁殖，例如通過插枝、塊莖或通過愈傷組織培育和完整植物的再生，或通過有性繁殖。有性繁殖優(yōu)選地以受控方式發(fā)生，即，具有確定特性的所選植物彼此雜交、繁殖。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的區(qū)別在于導入根據(jù)步驟(a)的植物細胞的外源核酸分子選自(i)含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)的核酸分子；(ii)編碼具有SeqIDNo.2所示氨基酸序列的馬鈴薯R1蛋白的核酸分子；(iii)作為SeqIDNo.1所示核苷酸序列的衍生物的核酸分子；和(iv)作為(i)、(ii)或(iii)所示核酸分子的片段的核酸分子。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法的區(qū)別在于外源核酸分子受控于一種啟動子，優(yōu)選地胚乳-特異和/或穎果-特異的啟動子，它器官特異性地促進R1基因在淀粉貯藏組織中的表達。這種類型的啟動子，如胚乳-特異和穎果-特異的啟動子，已在上文對于根據(jù)本發(fā)明的植物描述。在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法涉及有用的單子葉植物，例如黑麥、大麥、燕麥、小麥、粟、水稻和玉米。優(yōu)選小麥、水稻和玉米；特別優(yōu)選小麥。本發(fā)明也涉及能利用根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的植物。本發(fā)明也涉及含有根據(jù)本發(fā)明的植物細胞的植物的繁殖材料，和利用根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的植物。在本發(fā)明中，術(shù)語“繁殖材料”包括適于通過無性或生殖途徑生產(chǎn)或繁殖的植物的任何成分。例如，插條、愈傷組織培養(yǎng)物、根莖或塊莖適于無性繁殖。其它繁殖材料包括，例如果實、種子、幼苗、原生質(zhì)體、細胞培養(yǎng)物等。種子是優(yōu)選的繁殖材料。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及玉米粒。在一個最優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及小麥粒。根據(jù)本發(fā)明的玉米和小麥粒特別適于飼料和食品的生產(chǎn)。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明定義的外源核酸分子在生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的植物，優(yōu)選地小麥、玉米和水稻植物，最優(yōu)選地小麥植物，或在生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的單子葉植物細胞中的用途。根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物合成，特別是在淀粉貯藏器官中合成一種淀粉，與在野生型植物中合成的淀粉相比，以及與化學磷酸化的淀粉相比，其理化性質(zhì)，特別是磷酸含量和/或粘性行為和/或磷酸化模式改變。因此，本發(fā)明也涉及能從根據(jù)本發(fā)明的植物細胞、植物和/或繁殖材料獲得的淀粉。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉相比，其在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低。本發(fā)明也涉及如下淀粉，其特征在于與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉相比，其在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或磷酸化模式改變，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低。對于根據(jù)本發(fā)明的植物細胞所做的描述適用于C6位磷酸含量的提高、磷酸化模式的改變和粘性(終粘度、峰值溫度)的改變。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及淀粉，優(yōu)選地小麥淀粉，其特征在于在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為0.1nmolC6Pmg-1淀粉，特別地至少0.5nmolC6Pmg-1淀粉，優(yōu)選地至少1nmolC6Pmg-1淀粉，最優(yōu)選地至少2nmolC6Pmg-1淀粉，最特別地至少5nmolC6Pmg-1淀粉，最優(yōu)選地至少10nmolC6Pmg-1淀粉，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低，其中根據(jù)本發(fā)明的淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，或最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為15nmolC6Pmg-1淀粉，其中根據(jù)本發(fā)明的淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量最多為100nmolC6Pmg-1淀粉，特別地最多50nmolC6Pmg-1淀粉，或最多25nmolC6Pmg-1淀粉。在另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉，優(yōu)選地小麥淀粉，其特征在于根據(jù)本發(fā)明的淀粉在膠固后形成凝膠，與具有相同磷酸含量的相應化學磷酸化淀粉的凝膠相比，和/或與來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉的凝膠相比，凝膠強度提高。在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于大部分磷酸基團與淀粉的支鏈淀粉成分鍵合，而直鏈淀粉只含有極少量的共價鍵合的淀粉單磷酸酯。與具有相似C-6磷酸含量的化學磷酸化淀粉相比，根據(jù)本發(fā)明的植物細胞產(chǎn)生的根據(jù)本發(fā)明的淀粉的區(qū)別在于，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的直鏈淀粉比支鏈淀粉成分磷酸化強度低。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于，與優(yōu)選地在葡萄糖單體C6位具有相同磷酸含量的化學磷酸化淀粉的直鏈淀粉成分相比，該淀粉的直鏈淀粉成分的總磷酸含量降低?？偭姿岷康臏y定方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，如下所述(見方法)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于與化學磷酸化淀粉(由未遺傳修飾的相應植物的淀粉產(chǎn)生，在葡萄糖單體C6位磷酸含量相同)的直鏈淀粉成分相比，能用31PNMR(Kasemsuwan和Jane(CerealChemistry73(6)，(1996)，702-707)檢測的淀粉直鏈淀粉成分的總磷酸含量至少減少5％，優(yōu)選地至少20％，特別地至少50％，最優(yōu)選地至少80％。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的特征在于，與化學磷酸化淀粉相比，它們顯示改變的磷酸化模式。術(shù)語“改變的磷酸化模式”已經(jīng)對根據(jù)本發(fā)明的植物細胞定義。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，淀粉是來自有用單子葉植物的淀粉，如黑麥、大麥、燕麥、小麥、粟、水稻和玉米淀粉。優(yōu)選小麥、水稻和玉米淀粉；特別優(yōu)選小麥淀粉。本發(fā)明進一步涉及一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的淀粉的方法，包括從如上所述的植物或植物細胞中，和/或從所述植物的淀粉貯藏部分中，和/或從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料中提取淀粉的步驟。如此所述的一種方法優(yōu)選地也包括在提取淀粉之前收獲培育的植物和/或該植物的淀粉貯藏部分的步驟，最優(yōu)選地還包括在收獲之前培育根據(jù)本發(fā)明的植物和/或根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料的步驟。從植物或植物的淀粉貯藏部分提取淀粉的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。從不同淀粉貯藏植物提取淀粉的方法也在下列文獻中描述，例如《淀粉化學與技術(shù)》(編者Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二版，AcademicPressInc.LondonLtd；ISBN0-12-746270-8；見第XII章，第412-468頁，例如“玉米和高粱淀粉生產(chǎn)”；Watson；第XIII章，第469-479頁“木薯、竹芋和西米淀粉生產(chǎn)”；Corbishley和Miller；第XIV章，第479-490頁“馬鈴薯淀粉生產(chǎn)和用途”；Mitch；第XV章，第491-506頁“小麥淀粉生產(chǎn)、修飾和用途”；Knight和Oson；第XVI章，第507-528頁“水稻淀粉生產(chǎn)和用途”；Rohmer和Klem；參見“玉米淀粉”Eckhoff等人，CerealChem.73(1996)54-57。工業(yè)規(guī)模的玉米淀粉提取通常用被稱為“濕磨”的方法實現(xiàn)。常用于從植物材料中提取淀粉的裝置包括磨粉機、分離器、傾析器、水力旋流器、噴霧干燥機和液化床干燥機。本發(fā)明也涉及能用上述根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的根據(jù)本發(fā)明的淀粉。隨后能用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法修飾根據(jù)本發(fā)明的淀粉，其未修飾或修飾的形式適于食品或非食品部門的不同用途。因此，本發(fā)明也涉及隨后經(jīng)化學和/或物理修飾的根據(jù)本發(fā)明定義的淀粉。能用于化學和/或物理修飾的不同選項在下文詳述。通過對植物進行基因工程操作生產(chǎn)改性淀粉首先能改變從植物獲得的淀粉的性質(zhì)，從而似乎不再需要用化學或物理方法進一步修飾。其次，利用基因工程方法修飾的淀粉能進一步進行化學和/或物理修飾，進一步提高質(zhì)量，用于上述某些應用領(lǐng)域。這些化學和物理修飾基本已知。具體而言，包括用下列方法修飾-熱處理，-酸處理，-淀粉醚的生產(chǎn)，淀粉烷基醚，O-烯丙醚，羥烷基醚，O-羧甲基醚，含氮淀粉醚，含磷淀粉醚，含硫淀粉醚，-交聯(lián)淀粉的生產(chǎn)，-淀粉接枝聚合物的生產(chǎn)，-氧化，和-用于生產(chǎn)磷酸、硝酸、硫酸、黃原酸、醋酸和檸檬酸淀粉的酯化操作。其它有機酸也能用于酯化。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的淀粉在工業(yè)，優(yōu)選地在食品生產(chǎn)中的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有根據(jù)本發(fā)明的淀粉的小麥粉。在其他特性中，根據(jù)本發(fā)明的小麥粉與普通小麥粉的區(qū)別在于焙烤特性改變。由小麥粒生產(chǎn)小麥粉的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知。通過這些方法，能從根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物以及從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料中分離根據(jù)本發(fā)明的小麥粉。因此，本發(fā)明也涉及能從根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物以及從根據(jù)本發(fā)明的繁殖材料中獲得的小麥粉。與來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉相比，根據(jù)本發(fā)明的面粉的區(qū)別尤其在于它們的吸水性提高。測定吸水性的方法本領(lǐng)域技術(shù)人員周知，在下文詳述(見方法)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，與來自未遺傳修飾的相應小麥植物的小麥粉相比，該小麥粉顯示吸水性至少提高5％，特別地至少15％，優(yōu)選地至少20％，最優(yōu)選地至少25％。由于具有強吸水性，根據(jù)本發(fā)明的面粉在生面團的工業(yè)生產(chǎn)中具有在生面團生產(chǎn)期間只需向面粉中添加少量水的優(yōu)點。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的小麥粉和/或根據(jù)本發(fā)明的淀粉在生產(chǎn)焙烤混合物和/或生產(chǎn)食品中的用途。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的小麥粉和/或根據(jù)本發(fā)明的淀粉在包裝的包衣中的用途。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種含有根據(jù)本發(fā)明的小麥粉和/或根據(jù)本發(fā)明的淀粉的焙烤混合物。就此而言，術(shù)語“焙烤混合物”是指能用于生產(chǎn)生面團(例如酵母生面團、干面食生面團、酥皮糕點、酸生面團等)和/或焙烤食品的任何混合物(例如面包、蛋糕、面卷、新月形面包等)。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種食品，優(yōu)選地焙烤食品和發(fā)面食品(例如干面食)，它是用根據(jù)本發(fā)明的小麥粉和/或根據(jù)本發(fā)明的焙烤混合物和/或根據(jù)本發(fā)明的淀粉生產(chǎn)的。與使用未遺傳修飾的相應野生型小麥植物的小麥粉生產(chǎn)的焙烤食品相比，根據(jù)本發(fā)明的焙烤食品和/或食品在貯藏上的區(qū)別在于焙烤食品經(jīng)歷的陳化(ageing)過程減緩。焙烤食品的陳化過程與淀粉的支鏈淀粉成分的退化(再結(jié)晶)緊密相關(guān)。假定隨著焙烤食品和/或食品的陳化過程進行，支鏈淀粉成分的退化程度越高。能用DSC測定的支鏈淀粉的熔解焓提供了關(guān)于支鏈淀粉退化程度的信息。因此，通過用DSC(＝差示掃描量熱法)分析測定特定時間點上支鏈淀粉的熔解焓，能測定焙烤食品的陳化程度(見方法)。如果在貯藏3天和/或7天和/或13天后測定根據(jù)本發(fā)明的焙烤食品和/或食品的支鏈淀粉的熔解焓，例如，一般發(fā)現(xiàn)，與儲存相同時間、基于未遺傳修飾的相應野生型植物的小麥粉的焙烤食品和/或食品的支鏈淀粉相比，該支鏈淀粉的熔解焓減少。圖1RVA圖的示意圖；圖2載體pUbi2afp的質(zhì)粒圖譜圖3載體pUbiR1的質(zhì)粒圖譜圖4載體p35SAcS的質(zhì)粒圖譜(pUC18的一種衍生物(PietrzakM.等人，NucleicAcidsRes.14，(1986)，5857-5868)含有在CaMV35S啟動子控制下的綠色產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomycesviridochromogenes)pat基因(Wohlleben等人，Gene70，(1988)，25-37)。圖5載體pAct1-Fneo/CaIgus的質(zhì)粒圖譜(pUC19-衍生物(Yannish-Perron等人，1985，Gene33103-119)由pAct1-Fneo(Müller等人，PlantScience114，(1996)，71-82)和pCaIgus形成，含有CaMV35S啟動子(參見例如US-A-5,352,605)、玉米AdhI內(nèi)含子(GenesDev1987Dec；1(10)1183-200)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因(GUS報道系統(tǒng)，作為研究植物基因表達的工具，《GUS方案使用GUS基因作為基因表達報道基因》，AcademicPress(1992)，23-43)。圖6顯示貯藏1、3、7、13天后面包屑的焓。方法淀粉葡萄糖單體C6位磷酸含量(＝C6P含量)的測定(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117)為了測定淀粉的C6P含量，50mg淀粉在500μl0.7MHCl中95℃水解4小時。隨后以15500g離心該批10分鐘，吸出上清液。7μl上清液與193μl咪唑緩沖液(100mM咪唑，pH7.4；5mMMgCl2，1mMEDTA和0.4mMNAD)混合。在340nm下用光度計進行測量。在建立基線吸光度后，通過加入2U葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(來自腸膜樣明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，BoehringerMannheim)啟動酶促反應。吸光度的改變與淀粉的C-6P含量的濃度成正比。淀粉總磷酸含量的測定在測定淀粉的總磷酸含量之前，必須從磷酸化的非葡聚糖(如磷脂)中完全分離淀粉。總磷酸含量的測定通過Ames的方法進行(MethodsinEnzymologyVIII，(1966)，115-118)，如下約50mg淀粉用30μl10％乙醇硝酸鎂溶液處理，在馬弗爐中燃燒3小時。殘余物用500μl0.5M鹽酸處理，在60℃下溫育30分鐘。然后加入0.5M鹽酸使20μl等份至300μl，加至100μl10％抗環(huán)血酸和600μl0.42％鉬酸銨的混合物中，在45℃下溫育20分鐘。之后用磷酸校準系列作為標準，在820nm下進行光度測量。凝膠強度的測定(結(jié)構(gòu)分析儀)2.5g淀粉(TS)在RVA儀器(參見利用RapidVisco分析儀(RVA)測定粘性)中在25mlH2O中膠固，之后在室溫下貯存24小時。樣品在StableMicroSystems(Surrey，UK)的TA-XT2結(jié)構(gòu)分析儀的傳感器(具有一個平面的圓柱形活塞)下固定，用下列儀器設(shè)置測量凝膠強度-測試速度0.5mm/s-刺入深度7mm-接觸面積113mm2-壓力2g利用RapidVisco分析儀(RVA)測定粘性(例如終粘度)2.5g淀粉(干重)吸收25mlH2O，用于在RapidVisco分析儀(NewportScientificPtyLtd.，InvestmentSupportGroup，WarriewodNSW2102，澳大利亞)中分析。儀器按照使用說明書操作。為了測定淀粉水溶液的粘度，首先加熱淀粉懸液1分鐘至50℃，然后以每分鐘12℃的速度從50℃加熱到95℃。在95℃下保溫2.5分鐘。之后，溶液以每分鐘12℃的速度從95℃冷卻到50℃。最后，在50℃下再保溫6分鐘。在整個試驗期間測定粘度。通過水浸析分離淀粉的直鏈淀粉成分眾所周知，通過水浸析(Roger和Colonna(InternationalJournalofBiologicalMacromolecules19，(1996)，51-61)能從淀粉中獲得直鏈淀粉。為了分離淀粉的直鏈淀粉成分，制備25ml淀粉水懸液(10％w/v)，隨著攪拌在RVA(NewportScientific)中加熱，使用下列參數(shù)時間[min]類型值[℃]或[rpm]0溫度30℃0速度960rpm0.5速度300rpm10溫度95℃在懸液或溶液的粘度超過200cP之后，立即終止程序，并將淀粉懸液或溶液轉(zhuǎn)移到一個預冷的50ml反應管中，與25ml冷水混合，并在冰浴中冷卻10分鐘至大約室溫(RT)。之后，未溶解的葡聚糖經(jīng)離心(20min，2300g，RT)形成沉淀，澄清的上清液用10mgNaCl/ml處理。然后在冰上用80％乙醇沉淀溶解的葡聚糖，再次用乙醇洗滌，在37℃下干燥3天。隨后研磨沉淀(15s30Hz，在德國Retsch的振動磨中使用碳化鎢球)，將25mg沉淀懸浮于500μl0.7MHCl中，在95℃下水解4小時。然后離心去除未溶解的顆粒，酶學測定葡萄糖-6P的含量(見上文“葡萄糖單體C6位磷酸含量的測定”)。對小麥粉進行的小規(guī)模吸水試驗程序材料來自Sarsted的帶有螺帽的Eppendorf管(2ml)。Eppendorf離心機(Sigma202)振蕩器(Wilten)分析天平(Mettler)方法用分析天平稱量Eppendorf管重量，保留小數(shù)點后四位。向Eppendorf管中填充100-110mg面粉，注意精確的重量。將帶有面粉的管置于振蕩渦旋器上，邊振蕩邊加入1.0ml水。持續(xù)振蕩10秒鐘。加入0.9ml水，用螺帽擰緊Eppendorf管，等待10分鐘。將Eppendorf管放入離心機的6*10轉(zhuǎn)子中(轉(zhuǎn)位式)。以10000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘(約8600*g)。從管中倒出水。用濾紙吸干管的內(nèi)部，不干擾濕殘余物。用分析天平稱量帶有濕面粉的Eppendorf管的重量，保留小數(shù)點后四位。計算吸收的水的重量。測量每種面粉的吸水量10次，計算平均值。差示掃描量熱法差示掃描量熱法(DSC)是一種研究熱轉(zhuǎn)化的技術(shù)，此處研究面包屑。利用該技術(shù)以連續(xù)(相對較低)的加熱速度測量流入樣品中的熱量。基線的峰值(距基線的偏移(內(nèi)熱))或梯級(玻璃轉(zhuǎn)換)決定轉(zhuǎn)換。相對于基線的峰面積取積分產(chǎn)生轉(zhuǎn)換的焓。對于面包屑，通常觀察到40-70℃(60℃峰值)的支鏈淀粉熔解熱和大約120℃的直鏈淀粉-脂質(zhì)解絡合。不同面粉樣品之間支鏈淀粉熔解熱的不同表明退化行為的不同，因而表明面包已變得不新鮮。支鏈淀粉晶體的熔解焓隨著焙烤后貯藏時間的延長而升高。貯藏期間熔解焓的升高是再結(jié)晶的支鏈淀粉的量隨時間增加的量度。為了根據(jù)含濕量不同進行修正，以干物質(zhì)為基礎(chǔ)計算焓(j/g)。DSC測量用配有LNCA冷卻單元的TAInstrumentsType2920熱量計進行。這個冷卻單元使用液氮在實驗后快速冷卻。樣品(40-50mg面包屑)置于DSC鍋中，用指甲手工壓縮。用壓縮單位密封DSC鍋后，將樣品置于DSC-裝置中。樣品(40-50mg面包屑)在密封的不銹鋼鍋(PerkinElmer)中以7.5℃/min的速度從20℃加熱到160℃。以填充100mg鋁的中壓鍋(120μl體積)作為參照。在貯藏1、3、7、14天后單次測量小面包碎屑的焓。下列實施例用來解釋本發(fā)明，而不在任何方面進行限制實施例1用于小麥植物轉(zhuǎn)化的載體pUbiR1的制備為了制備載體pUbiR1，首先如下制備載體pUbi.cas載體pUbi2afp(見圖2)用限制酶PstI/EcoRI部分酶切。產(chǎn)生的4.19Kb片段包含pUC19載體(Yannish-Perron等人，1985，Gene33103-119)、1.5Kb遍在蛋白啟動子和ubi基因的第一個外顯子和縮短的遍在蛋白1內(nèi)含子(ClaI缺失)(Christensen等人，PlantMol.Biol.18，(1992)，675-689)，在凝膠洗脫后使用。nos終止子作為PstI/EcoRI片段從載體pAct.cas(產(chǎn)品號CambiaTG0063，Cambia，GPOBox3200，CanberraACT2601，澳大利亞)上分離，連接兩個片段產(chǎn)生載體pUbi.cas。隨后，馬鈴薯R1基因的cDNA(SEQIDNo.1)作為部分消化物(SmaI/Asp718片段)從載體pRL2(WO97/11188，實施例4，在德國微生物保藏中心保藏號為DSM10225)上分離，整合到載體pUbi.cas(用SmaI/Asp718限制酶切)上。產(chǎn)生的構(gòu)建體命名為pUbiR1(見圖3)。該構(gòu)建體包含馬鈴薯R1cDNA的編碼區(qū)，它受遍在蛋白啟動子控制(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18675-689)，也包含ubi基因的第一個外顯子(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18675-689)和縮短的第一個內(nèi)含子(Christensen等人，1992，PlantMol.Biol.18675-689)，內(nèi)部ClaI片段缺失)作為另外的調(diào)節(jié)單位。實施例2表達馬鈴薯R1基因的小麥植物的生產(chǎn)，和這些植物的淀粉的磷酸含量分析用biolistic轉(zhuǎn)化法進行小麥的轉(zhuǎn)化(Becker等人，PlantJ.5(2)，(1994)，229-307)。用于biolistic共轉(zhuǎn)化的載體pUbiR1和載體p35SacS(見圖4)或pAct1-Fneo/CaIgus(Müller等人，PlantScience114，(1996)，71-82，見圖5)在DNA顆粒沉淀批次中以相同摩爾比使用。載體p35SAcS如下制備綠色產(chǎn)色鏈霉菌的pat基因(Wohlleben等人，Gene70，(1988)，25-37)通過聚合酶鏈反應擴增。設(shè)計使用的引物，使得在擴增物兩側(cè)產(chǎn)生BamHI酶切位點。隨后將BamHI片段克隆到置于載體pDH51(Pietzrak等人，NucleicAcidsRes.14，(1986)，5857-5868)的35S啟動子與35S終止子之間的BamHI酶切位點。將含有35S啟動子、pat基因和35S終止子的盒切割為EcoRI片段，克隆到載體pUC18的EcoRI酶切位點(Pietzrak等人，NucleicAcidsRes.14，(1986)，5857-5868)。用來自小麥植物的14天的不成熟胚芽的盾片作為轉(zhuǎn)化的靶細胞。轉(zhuǎn)化后在含有2mg/l2，4-D(＝2，4二氯苯氧乙酸)的MS-培養(yǎng)基(PCT/EP97/02793)上進行體外培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化兩周后，在已添加2mg/l膦絲菌素或150mg/l硫酸卡那霉素的相同培養(yǎng)基上進行傳代培養(yǎng)。再兩周后，將發(fā)育的愈傷組織移植到再生培養(yǎng)基上(含有0.1mg/l2，4-D和2mg/lPPT或150mg/l卡那霉素的MS-培養(yǎng)基)。將發(fā)育的幼芽轉(zhuǎn)移到不含2，4-D和膦絲菌素或卡那霉素的半濃縮MS-培養(yǎng)基中，然后轉(zhuǎn)移到土壤中。在土壤中生長約14天后，噴灑分別含有150和200mg/l膦絲菌素、0.1％Tween20(ICIAmerica，相當于聚山梨醇酯20)的水溶液兩次，或噴灑2.5％硫酸卡那霉素、0.1％Tween20兩次，鑒定轉(zhuǎn)基因植物。馬鈴薯R1基因在T0植物中的表達馬鈴薯R1基因在轉(zhuǎn)基因小麥T0植物中的表達通過Nortern和Western印跡分析檢測，并酶學測定穎果淀粉葡萄糖單體C6位的磷酸含量(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117)。利用抗馬鈴薯R1蛋白抗體檢測轉(zhuǎn)基因小麥植物中的R1蛋白(Ritte等人，PlantJ.21(4)，(2000)，387-391)。用來自約20天的不成熟穎果的胚芽的蛋白質(zhì)提取物篩選轉(zhuǎn)基因植物。為了測定C6磷酸，從不成熟和成熟的小麥穎果中分離來自轉(zhuǎn)基因T0植物的淀粉。穎果在研缽中磨碎，形成粉末。在加入15ml100mMTris緩沖液(pH8.0)后，懸液通過100μm篩過濾，離心沉淀淀粉(2600g，5min，4℃)。棄去上清液。然后將淀粉沉淀重懸浮于2ml100mMTris緩沖液(pH8.0)中，轉(zhuǎn)移到8mlPercoll梯度中。在4℃下以170g離心15分鐘沉淀淀粉。用10ml100Tris緩沖液(pH8.0)洗滌淀粉沉淀三次。最后，通過丙酮溫育使淀粉脫脂并干燥。以上述方法利用光學-酶試驗(Nielsen等人，PlantPhysiol.105，(1994)，111-117)通過葡萄糖-6-磷酸測定法測定C6P含量。試驗表明，在Southern印跡分析中產(chǎn)生陽性結(jié)果的小麥T0植物中，有大約50％的系在穎果中合成一種淀粉，它與來自未遺傳修飾的相應Florida品種野生型植物的淀粉相比，在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高。表1給出了選擇的某些系的數(shù)據(jù)。自然子代的分析播種從表達R1的親代系自然獲得的種子，確定分離比。通過Southern和Northern印跡分析能檢測R1基因在不同系的T1子代中的整合和表達。測定這些系在淀粉C6位的磷酸含量。表1顯示選擇的某些系的數(shù)據(jù)。表1系編號C6P基因-分配標準差nmol/mg野生型Florida品種不可檢測-0.0192.8T00.220-256.7T10.2371.4T00.340A-11-810.7T20.7實施例3來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的植物淀粉的RVA分析，和凝膠強度的研究來自實施例1和2所述小麥植物的淀粉進行RVA分析。RVA分析結(jié)果(實驗見方法)表明，與來自未遺傳修飾的相應野生型小麥植物(Florida品種)的淀粉相比，來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉的粘性行為顯著改變(見表2)。表2系編號RVARVARVARVARVAMaxMinFinSetT(％)(％)(％)(％)(％)野生型(Florida)10010010010010019(T0)98.7113.8116.8120.710220-25(T1)155.3190193.8198.89937(T0)143.8156.2148.813910140-11-8(T2)156.2185.5187.7190.697圖例RVA＝RapidVisco分析儀Max＝見圖1Min＝見圖1Fin＝終粘度，見圖1Set＝Setback＝Min與Fin之差，見圖1T＝膠固溫度，見圖1百分比相對于野生型(＝100％)。來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉的凝膠強度(凝膠強度的測定見方法)不同于隨后化學磷酸化的來自未遺傳修飾的相應野生型小麥植物(Florida品種)的淀粉和野生型淀粉(Florida品種)(見表3)。與在葡萄糖單體C6位有相似磷酸含量的化學磷酸化淀粉不同，在膠固后，根據(jù)本發(fā)明的淀粉的凝膠顯示凝膠強度高于野生型植物的淀粉的凝膠。與此不同，將利用Lim所述方法生產(chǎn)的化學磷酸化淀粉與野生型植物的淀粉的凝膠相比較。表3系編號凝膠強度(TA)(％)C6位的磷酸含量μmol磷酸/g淀粉野生型(Florida)100不可檢測19(T0)1672.820-25(T1)1926.737(T0)1681.440-11-8(T2)22410.7化學磷酸化的野生型(Florida)淀粉STMP1842.1STMP6756.5STMP86711.5TA＝結(jié)構(gòu)分析儀百分比相對于野生型(＝100％)。實施例4來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的植物淀粉的DSC分析來自實施例1和2所述小麥植物的淀粉進行DSC分析。用PerkinElmer的儀器(儀器名稱DSC-7)用大體積容器測量峰值溫度，其中所研究的樣品的淀粉與總含水量之比約為1∶4，并且以10℃/min的加熱速度在10℃-160℃溫度范圍內(nèi)進行測量。DSC分析結(jié)果(表4)顯示，與來自未遺傳修飾的相應野生型小麥植物(Florida品種)的淀粉相比，與隨后化學磷酸化的、在葡萄糖單體C6位有相似磷酸含量的淀粉相比，來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉的峰值溫度Tp降低。表4樣品樣品的含水淀粉(干重)峰值溫度其它峰最大值量(％)水(總含水量)℃(第一峰最大值)℃野生型16.61∶4.0161101(Florida)19(T0)10.51∶3.995810020-25(T1)16.91∶4.055510040-11-8(T2)16.91∶3.9856100STMP2*10.91∶4.0060101STMP610.71∶4.0061101*化學磷酸化淀粉STMP2在C6位的磷酸含量為3.0μmol磷酸/g淀粉。表3列出了其它所有磷酸數(shù)據(jù)。實施例5不同淀粉的直鏈淀粉成分的C6P含量測定除了來自表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉之外，還研究了兩種化學磷酸化淀粉(STMP3和STPP4)?；瘜W磷酸化用Lim和Seib(CerealChem.70(2)，(1993)，137-144)所述的方法實現(xiàn)，其中淀粉在pH6下反應2小時產(chǎn)生STMP3，而在pH8下反應30分鐘產(chǎn)生STPP4。縮寫STMP代表選擇的磷酸化試劑，即三間磷酸鈉；STPP代表三聚磷酸鈉。不同淀粉的直鏈淀粉成分如上所述分離(淀粉的直鏈淀粉成分通過水浸析分離)。C6位的磷酸含量如上所述測定(葡萄糖單體C6位磷酸含量的測定)。表5樣品C6P含量C6P含量直鏈淀粉的C6P含μmol磷酸/g淀粉μmol磷酸/g直鏈淀粉量/淀粉的C6P含量40-11-8(T2)10.71.90.18STPP420.520.40.99STMP36.05.10.85可以看出，在化學磷酸化淀粉中，直鏈淀粉的C6P含量與淀粉的C6P含量之比大大高于來自超表達馬鈴薯R1基因的轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉?；瘜W磷酸化淀粉中磷酸化直鏈淀粉的含量高于來自轉(zhuǎn)基因小麥植物的淀粉。實施例6由不同來源的面粉生產(chǎn)的小面包面包屑的DSC分析用來自野生型小麥植物(Florida品種)和超表達馬鈴薯R1基因的遺傳修飾小麥植物的小麥粉生產(chǎn)小面包，采用下列食譜小麥粉10.00g酵母0.25g鹽0.20g葡萄糖0.10g抗壞血酸20ppm水在吸水試驗中確定并且根據(jù)稠度修正的水量(見方法“對小麥粉進行的小規(guī)模吸水試驗程序”)遺傳修飾的小麥植物的生面團在混合過程中變得非常粘。為了獲得具有正確操作特性的生面團，使用少量的水。根據(jù)生面團硬度的技術(shù)感官知覺修正生面團的稠度。生面團在驗證箱中驗證45分鐘(28℃)，手工操作，第二次驗證15分鐘(28℃)，形成并置于烤罐中。隨后對生面團進行60分鐘的最后驗證(28℃)。面包在烤箱中焙烤15分鐘(200℃)，罐嵌入潮濕的木框中。這樣嵌入的目的是為烤罐遮擋輻射出的大量熱量。最后，在沒有木框的情況下烘焙面包5分鐘，使面包皮變?yōu)樽厣?。利用差示掃描量熱?DSC)(見方法)測定面包屑的熱轉(zhuǎn)化。在貯藏1、3、7、14天后測量面包屑的焓(圖6)。圖6顯示貯藏的面包屑在貯藏1、3、7、13天后支鏈淀粉熔解峰的焓(40℃-70℃)，表示陳化作用。用野生型(Florida)面粉制成的面包屑的焓高于由超表達馬鈴薯R1基因的兩種不同遺傳修飾小麥植物系(GMO1和GMO2)的面粉制成的相同時間長度的面包屑。這表明，面包含有較低水平的再結(jié)晶淀粉，較少的淀粉退化和較少的陳化。序列表SEQIDNo.1(R1cDNA馬鈴薯，核苷酸序列5061bp，編碼區(qū)bp216-bp4607)gaattgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggccccccctcgaggtcgacggtatcgataagcttgatatcgaattcgcggccgcttttgcttcgtgaattcatcttcatcgaatttctcgacgcttcttcgctaatttcctcgttacttcactagaaatcgacgtttctagctgaacttgagtgaattaagccagtgggaggatatgagtaattccttagggaataacttgctgtaccagggattcctaacctcaacagtgttggaacataaaagtagaatcagtcctccttgtgttggaggcaattctttgtttcaacaacaagtgatctcgaaatcacctttatcaactgagtttcgaggtaacaggttaaaggtgcagaaaaagaaaatacctatgggaaagaaccgtgctttttctagttctcctcatgctgtacttaccactgatacctcttctgagctagcagaaaagttcagtctagaagggaatattgagctacaggttgatgttaggcctcccacttcaggtgatgtgtcctttgtggattttcaagctacaaatggtagtgataaactgtttttgcactggggggcagtaaagttcggaaaagaaacatggtctcttcctaatgatcgtccagatgggaccaaagtgtacaagaacaaagcacttagaactccatttgttaaatctggctctaactccatcctgagactggagatacgggacactgctatcgaagctattgagtttctcatatacgatgaagcctacgataaatggataaagaataatggtggcaattttcgtgtcaaattgtcaagaaaagagatacgaggcccagatgtttcagttcctgaggagcttgtacagatccaatcatatttgaggtgggagaggaagggaaaacagaattacacccctgagaaagagaaggaggaatatgaggctgctcgaactgagctacaggaggaaatagctcgtggtgcttccatacaggacattcgagcaaggctaacaaaaactaatgataaaagtcaaagcaaagaagagcctcttcgccgaactatcctccagaaaagcaaattgaagaactcgaagaagcaagaagagaattgcaacttgagcttgagaaaggcattacccttgatgagttgcggaaaaagattacaaaaggggagataaaaactaaggcggaaaagcacgtgaaaagaagctcttttgccgttgaaagaatccaaagaaagaagagagactttgggcagcttattaataagtatccttccagtcctgcagtacaagtacaaaaggtcttggaagaaccaccagccttatctaaaattaagctgtatgccaaggagaaggaggagcagattgatgatccgatccttaataaaaagatctttaaggtcgatgatggggagctactggtactggtagcaaagtcctctgggaagacaaaagtacatatagctacagatctgaatcagccaattactcttcactgggcattatccaaaagtcgtggagagtggatggtaccaccttcaagcatattgcctcctggatcaattattttagacaaggctgccgaaacacctttttccgccagttcttctgatggtctaacttctaaggtacaatctttggatatagtaattgaagatggcaattttgtggggatgccatttgttcttttgtctggtgaaaaatggattaagaaccaagggtcggatttctatgttgacttcagtgctgcatccaaattagcactcaaggctgctggggatggcagtggaactgcaaagtctttactggataaaatagcagatatggaaagtgaggctcagaagtcatttatgcaccggtttaatattgctgctgacttgatagaagatgccactagtgctggtgaacttggttttactggaattcttgtatggatgaggttcatggctacaaggcaactgatatggaacaaaaactataacgtaaaaccacgtgaaataagcaaggctcaggacagacttacagacttgttgcagaatgctttcaccagtcaccctcaataccgtgaaattttgcggatgattatgtcaactgttggacgtggaggtgaaggggatgtaggacagcgaattagggatgaaattttggtcatccagaggaaaaatgactgcaagggtggtatgatggaagaatggcatcagaaattgcataataatactagtcctgatgatgttgtgatctgtcaggcattgattgactacatcaagagtgattttgatcttggtgtttattggaaaaccctgaatgagaacggaataacaaaagagcgtcttttgagttatgaccgtgctatccattctgaaccgaattttagaggagatcaaaagaatggtcttttgcgtgatttaggtcactatatgagaacattgaaggctgttcattcaggtgcagatcttgagtctgctattgcaaactgcatgggctacaaaactgagggagaaggctttatggttggagtccagataaatcctgtatcaggcttgccatctggctttcagggcctcctccattttgtcttagaccatgtggaagataaaaatgtggaaactcttcttgagggattgctagaggctcgtgaggagcttaggcccttgcttctcaaaccaaacaaccgtctaaaggatctgctgtttttggacatagcacttgattctacagttagaacagcagtagaaaggggatatgaagaattgaacaacgctaatcctgagaaaatcatgtacttcatctccctcgttcttgaaaatctcgcactctctgtggacgataatgaagatcttgtttattgcttgaagggatggaatcaagctctttcaatgtccaatggtggagacaaccattgggctttatttgcaaaagctgtacttgacagaatccgtcttgcacttgcaagcaaggcagagtggtaccatcacttattgcagccatctgccgaatatctaggatcaatccttggggtggaccaatgggctttgaacatatttactgaagaaattatacgtgctggatcagcagcttcattatcctctcttcttaatagactcgatcccgtgcttcggaaaactgcaaatctaggaagttggcagattatcagtccagttgaagccgttggatatgttgtcgttgtggatgagttgctttcagttcagaatgaaatctacaagaagcccacgatcttagtagcaaactctgttaaaggagaggaggaaattcctgatggtgctgttgccctgataacaccagacatgccagatgttctttcacatgtttctgttcgagctagaaatgggaaggtttgctttgctacatgctttgatcccaatatattggctgacctccaagcaaaggaaggaaggattttgctcttaaagcctacaccttcagacataatctatagtgaggtgaatgagattgagctccaaagttcaagtaacttggtagaagctgaaacatggttggagctaaatcacgtaatattgcatatctgaaaggaaaagtgccttcctcggtgggaattcctacgtcagtagctcttccatttggag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列描述部分序列<400>14ProPheGlyValPheGlu15<210>15<211>5<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述部分序列<400>15SerSerGlyAspAsp15<210>16<211>6<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述部分序列<400>16SerPheIleCysLysLys1權(quán)利要求1.一種遺傳修飾的單子葉植物細胞，其中該遺傳修飾包括至少一種外源核酸分子的導入，該外源核酸分子選自a)含有SeqIDNo.1所示核苷酸序列的編碼區(qū)的核酸分子；b)編碼具有SeqIDNo.2所示氨基酸序列的馬鈴薯(Solanumtuberosum)R1蛋白的核酸分子；c)是SeqIDNo.1所示核苷酸序列的衍生物的核酸分子；和d)是(a)、(b)或(c)所述核酸分子的片段的核酸分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1的一種植物細胞，相對于未遺傳修飾的相應野生型植物細胞其顯示增加的R1蛋白生物活性。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2之一或兩者的一種植物細胞，它合成一種淀粉，相對于來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量增加。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3之一或多項的一種植物細胞，它合成一種淀粉，該淀粉與來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉相比，終粘度升高，和/或峰值溫度降低。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4之一或多項的一種植物細胞，它合成一種淀粉，該淀粉在膠固后形成一種凝膠，相對于來自未遺傳修飾的相應野生型植物細胞的淀粉的凝膠其凝膠強度增加。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一或多項的一種植物細胞，其來源于選自小麥、水稻、大麥、燕麥、粟、黑麥和玉米的植物。7.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一或多項的一種植物細胞，其來源于小麥植物。8.根據(jù)權(quán)利要求7的一種植物細胞，其合成在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為0.1nmolC6Pmg-1淀粉的淀粉。9.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的植物細胞的方法，其中遺傳修飾一種單子葉植物細胞，該遺傳修飾包括至少一種外源核酸分子的導入。10.一種含有根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的植物細胞的植物。11.根據(jù)權(quán)利要求10的一種植物，它在淀粉貯藏器官中合成一種淀粉，該淀粉在葡萄糖單體C6位的磷酸含量高于來自未遺傳修飾的相應野生型植物的淀粉貯藏器官的淀粉。12.根據(jù)權(quán)利要求10-11之一或兩者的一種植物，它是水稻、小麥或玉米植物。13.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的植物的方法，其中(a)遺傳修飾一種單子葉植物細胞，其中該遺傳修飾包括至少一種外源核酸分子的導入；(b)由根據(jù)步驟(a)的細胞再生的一種植物；和任選地14.根據(jù)權(quán)利要求13的一種方法，其中外源核酸分子受一種器官特異地促進R1基因在淀粉貯藏組織中表達的啟動子控制。15.根據(jù)權(quán)利要求13-14之一或多項的一種方法，其涉及小麥植物。16.根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的植物的繁殖材料，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的植物細胞。17.如權(quán)利要求1所述的核酸分子在生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的單子葉植物或根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的單子葉植物細胞中的用途。18.一種可從根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的植物細胞或從根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的植物獲得的淀粉。19.根據(jù)權(quán)利要求18的一種淀粉，其特征在于，與來自相應野生型植物的淀粉相比，它在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低。20.一種淀粉，其特征在于，與來自相應野生型植物的淀粉相比，它在葡萄糖單體C6位的磷酸含量提高，和/或終粘度提高，和/或峰值溫度降低。21.一種淀粉，其特征在于它在葡萄糖單體C6位的磷酸含量至少為0.1nmolC6Pmg-1淀粉。22.根據(jù)權(quán)利要求21的一種淀粉，其特征在于它的終粘度至少提高50％，和/或峰值溫度至少降低1.5℃。23.根據(jù)權(quán)利要求18-22之一或多項的一種淀粉，其特征在于該淀粉在膠固后形成凝膠，凝膠強度高于在葡萄糖單體C6位有相同磷酸含量的相應化學磷酸化淀粉的凝膠，和/或來自未遺傳修飾的相應植物的淀粉的凝膠。24.根據(jù)權(quán)利要求18-23之一或多項的一種淀粉，其特征在于該淀粉中直鏈淀粉成分的總磷酸含量低于化學磷酸化淀粉的直鏈淀粉成分。25.根據(jù)權(quán)利要求18-24之一或多項的一種淀粉，其特征在于它顯示不同于化學磷酸化淀粉的磷酸化模式。26.根據(jù)權(quán)利要求18-25之一或多項的一種淀粉，其特征在于它是一種小麥淀粉。27.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉的方法，包括從根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的植物中提取淀粉。28.根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉在工業(yè)領(lǐng)域，優(yōu)選地在食品生產(chǎn)中的用途。29.小麥粉，其含有根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉。30.可從根據(jù)權(quán)利要求1-8之一或多項的植物細胞，或從根據(jù)權(quán)利要求10-12之一或多項的植物，或從根據(jù)權(quán)利要求16的繁殖材料獲得的小麥粉。31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的小麥粉或根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉在生產(chǎn)焙烤混合物和/或生產(chǎn)食品中的用途。32.一種焙烤混合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求29或30的小麥粉或根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉。33.利用根據(jù)權(quán)利要求29或30的小麥粉，和/或利用根據(jù)權(quán)利要求32的焙烤混合物，和/或利用根據(jù)權(quán)利要求18-26之一或多項的淀粉生產(chǎn)的一種食品。全文摘要本發(fā)明涉及遺傳修飾的單子葉植物細胞和植物，其中該遺傳修飾包括導入編碼具有R1蛋白生物活性的蛋白質(zhì)的外源核酸分子。本發(fā)明還涉及其生產(chǎn)手段和方法。這類植物細胞和植物合成一種改性淀粉，其特征在于與來自未遺傳修飾的相應單子葉植物的淀粉相比，其磷酸含量升高，和/或磷酸化模式改變，和/或在RVA圖中的終粘度提高，和/或在DSC分析中的峰值溫度降低，和/或在結(jié)構(gòu)分析中的凝膠強度提高。因此，本發(fā)明也涉及由根據(jù)本發(fā)明的植物細胞和植物合成的淀粉，和生產(chǎn)這種淀粉的方法。本發(fā)明還涉及含有這種改性淀粉的小麥粉，以及含有這種小麥粉和/或淀粉的食品和焙烤食品。文檔編號C12N15/54GK1541273SQ01817799公開日2004年10月27日申請日期2001年10月22日優(yōu)先權(quán)日2000年10月23日發(fā)明者G·舍韋,G舍韋,P·克尼斯,崴,S·F·阿瑪?shù)?阿瑪?shù)?H·洛茨,碩,D·貝克爾,灤澩,V·蘭德許茨,J·皮林申請人:拜爾作物科學有限公司