專利名稱：Dna表達(dá)載體及其應(yīng)用方法
本專利申請要求享有于2000年3月2日提出申請的序列號為60/186364和于2000年12月1日提出申請的序列號為60/251083的美國臨時(shí)申請的優(yōu)先權(quán)。
政府支持本說明書描述的工作有部分得到了國立衛(wèi)生研究院(授權(quán)號5 P01AI43045)和國立衛(wèi)生研究院/國家變態(tài)反應(yīng)和傳染病研究院(授權(quán)號R21 AI4432501)的支持。美國政府在此發(fā)明中可有一定的權(quán)利。
本發(fā)明的領(lǐng)域總的來說，本發(fā)明涉及分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域。更加具體地說，本發(fā)明描述了新的DNA表達(dá)載體，它是包含有編碼一種免疫蛋白質(zhì)的DNA的新載體；也描述了通過給予服用包含編碼一種免疫蛋白質(zhì)的DNA的新載體使動(dòng)物(包括人類)獲得免疫的新方法。
本發(fā)明的技術(shù)背景疫苗在全世界保健方面一直具有深刻的和持久的影響。天花已經(jīng)根除，脊髓灰質(zhì)炎也已接近消滅，白喉、麻疹、流行性腮腺炎、百日咳和破傷風(fēng)等一些疾病也已得到控制。然而，僅僅使用當(dāng)前針對一小部分人類及其家養(yǎng)動(dòng)物傳染病的疫苗，微生物仍然是主要的殺手。沒有疫苗的普通傳染病每年就花費(fèi)美國國家1200億美圓(Robinson等人，1997)。在第一世界國家出現(xiàn)了免疫缺陷病毒，象抗藥類型的結(jié)核病又重新出現(xiàn)，這對疫苗的發(fā)展構(gòu)成了新的威脅和挑戰(zhàn)。在第三世界國家，更加明顯需要新的和改善了的疫苗，在那里常常無法得到有效的疫苗或者花費(fèi)是無法承受的。最近，抗原表達(dá)DNA的直接注射顯示出啟動(dòng)了保護(hù)性免疫應(yīng)答。
以DNA為基礎(chǔ)的疫苗利用細(xì)菌質(zhì)粒在被接種宿主中表達(dá)蛋白質(zhì)免疫原。重組DNA技術(shù)被用于將編碼目的免疫原的cDNA克隆到真核生物的表達(dá)質(zhì)粒中。然后將疫苗質(zhì)粒在細(xì)菌中擴(kuò)增、提純，再將其直接接種進(jìn)被接種的宿主體內(nèi)。典型的方法是用針注射鹽水中的DNA來接種，或者用基因槍將以金包被的DNA彈丸(或稱為“珠”)傳送進(jìn)入皮膚。DNA質(zhì)粒被宿主細(xì)胞吸收，疫苗蛋白質(zhì)被表達(dá)、加工以及被自身主要組織相容性復(fù)合體(MHC)類型I分子和類型II分子提呈，產(chǎn)生了對編碼免疫原DNA的免疫應(yīng)答。
歷史上DNA疫苗(又名為“基因免疫接種”)是伴隨基因治療的研究和應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的研究而出現(xiàn)的。將DNA傳送入肌肉的基因療法的研究揭示出，在轉(zhuǎn)染骨骼肌肉細(xì)胞方面純凈的DNA同用脂質(zhì)體膠囊包被的DNA一樣有效(Wolff等人)。此沒有膠囊包被的DNA被命名為“裸露DNA”，這是一個(gè)有想象力的術(shù)語，它在描述用于核酸疫苗的純凈DNA時(shí)已眾所周知?；驑屢恢北话l(fā)展用于往植物細(xì)胞內(nèi)傳送DNA，在基因治療研究中它也被用于往皮膚中傳送DNA。在一系列測試表達(dá)人類生長激素質(zhì)粒改變小鼠生長的能力的實(shí)驗(yàn)中，認(rèn)識(shí)到?jīng)]能改變小鼠生長的質(zhì)粒接種激發(fā)了抗體的產(chǎn)生(Tang，De Vit和Johnston，1992)。這是第一次揭示出通過接種質(zhì)粒DNA可以產(chǎn)生免疫應(yīng)答。同時(shí)，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)驗(yàn)顯示，可以用很少的感染細(xì)胞(104-105)提高保護(hù)性免疫應(yīng)答。對用于產(chǎn)生疫苗接種的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的感染類型的質(zhì)粒DNA的直接測試在小雞流行性感冒模型中進(jìn)行，其結(jié)果是導(dǎo)致了保護(hù)性免疫作用(Robinson、Hunt和Webster，1993)。
至2000年底，明確顯示HIV-1(人免疫缺陷病毒-1)感染了世界1％的人口，由于這個(gè)最近的急迫原因，使得發(fā)展疫苗成為世界衛(wèi)生優(yōu)先考慮的事情。DNA疫苗的臨床前實(shí)驗(yàn)表明，在黑猩猩體內(nèi)單獨(dú)的DNA可對抗大大減毒的HIV-1的攻擊(Boyer等人，1997)，但是在恒河猴體內(nèi)不能對抗致病力更強(qiáng)的SIV的攻擊(Lu等人，1997)。用DNA進(jìn)行初始免疫再用衣殼糖蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫可提高與中和抗體有關(guān)的保護(hù)作用，以對抗非致病的SIV和HIV之間的嵌合體(SHIV-IIIb)的類似的攻擊(homologous challenge)(Letvin等人，1997)。更為最近，有人進(jìn)行了一組對比性實(shí)驗(yàn)測試了八個(gè)不同的方案對抗SHIV-s(猿和人免疫缺陷病毒嵌合體)一系列攻擊的能力，這些實(shí)驗(yàn)揭示出對感染攻擊有最大遏制能力的是包括以皮內(nèi)接種DNA引發(fā)和用重組家禽天花病毒載體加強(qiáng)的免疫接種方案(Robinson等人，1999)。這個(gè)對感染攻擊的遏制與對攻擊的病毒的中和抗體的存在無關(guān)。證明對遏制感染攻擊有較小效用的方案包括均通過皮內(nèi)或基因槍DNA接種進(jìn)行起始免疫和加強(qiáng)免疫的免疫接種、皮內(nèi)或基因槍DNA接種進(jìn)行起始免疫然后用蛋白質(zhì)亞單位加強(qiáng)免疫的免疫接種、通過基因槍DNA接種進(jìn)行起始免疫和用重組家禽天花病毒加強(qiáng)免疫的免疫接種、僅僅用蛋白質(zhì)的免疫接種和僅僅用重組家禽天花病毒的免疫接種(Robinson等人，1999)。早期的在人體的DNA疫苗的臨床實(shí)驗(yàn)證明沒有不利的影響(MacGregor等人，1996)，也證明了溶解細(xì)胞的T-細(xì)胞的增加(Calarota等人，1998)。一些研究對增加免疫接種效率的共轉(zhuǎn)染淋巴因子和共刺激分子的能力進(jìn)行了篩選(Robinson和Pertmer)。
DNA疫苗不利的方面包括DNA編碼的產(chǎn)物(例如，蛋白質(zhì))的免疫局限性和真核細(xì)胞對細(xì)菌和寄生物蛋白質(zhì)非典型加工的可能性。DNA疫苗存在的另一個(gè)重要問題是在細(xì)菌中DNA疫苗質(zhì)粒生長和擴(kuò)增期間一些疫苗插入片段序列的不穩(wěn)定性。不穩(wěn)定性的一個(gè)可能的原因是在質(zhì)粒生長期間在疫苗插入片段的次級結(jié)構(gòu)的暴露或質(zhì)粒骨架的暴露，它們可能被細(xì)菌內(nèi)切核酸酶識(shí)別。
因此，必需有可以顯示出在細(xì)菌宿主體內(nèi)有改善的穩(wěn)定性的DNA表達(dá)載體；其在用于動(dòng)物體(包括人)時(shí)是安全的；其作為抗擊各種各樣的傳染病(包括HIV-1)的疫苗，免疫原蛋白質(zhì)在真核生物中的表達(dá)是有效的。
本發(fā)明的概述本發(fā)明提供新的pGA構(gòu)建體。新的pGA構(gòu)建體被用于作為傳送DNA疫苗的載體。
本發(fā)明也提供了具有疫苗插入片段的新的pGA構(gòu)建體。病原疫苗插入片段可包括任何病毒、細(xì)菌、寄生蟲和(或)真菌的DNA轉(zhuǎn)錄單位。
本發(fā)明描述了通過給予包含病原疫苗插入片段的治療有效劑量的新pGA構(gòu)建體給患者進(jìn)行免疫接種的新方法。
本發(fā)明描述了免疫接種的新方法，其通過給予治療有效劑量的新pGA構(gòu)建體給患者進(jìn)行，此新pGA構(gòu)建體包含有病原疫苗插入片段，隨后用例如包含同樣疫苗插入片段的重組修飾的Ankara牛痘(MVA)載體那樣的活的載體疫苗進(jìn)行增強(qiáng)免疫作用。
本發(fā)明也描述了增強(qiáng)多抗原決定簇CD8 T-細(xì)胞應(yīng)答的方法，其通過給予包含病原疫苗插入片段的治療有效劑量的新型pGA構(gòu)建體，隨后用例如包含有同樣疫苗插入片段的重組修飾Ankara牛痘(MVA)載體那樣的活的載體疫苗增強(qiáng)免疫作用。
在下面將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
附圖簡要描述

圖1圖解本發(fā)明新的pGA構(gòu)建體。標(biāo)示給出了載體上各元件的名稱和位置。以斜體字標(biāo)示用于克隆進(jìn)載體的疫苗插入片段的限制性內(nèi)切核酸酶的位點(diǎn)。
圖2圖解圖1表明的新pGA1構(gòu)建體的DNA序列SEQ IDNO1。在核苷酸序列的下面表示出質(zhì)粒各元件的位置。
圖3圖解本發(fā)明的新pGA2構(gòu)建體。標(biāo)示給出了載體上各元件的名稱和位置。斜體字標(biāo)示用于克隆進(jìn)載體的疫苗插入片段的獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶的位點(diǎn)。
圖4圖解圖3表示的新型pGA2構(gòu)建體的DNA序列SEQ IDNO2。在核苷酸序列的下面表示出質(zhì)粒各元件的位置。
圖5圖解本發(fā)明的新pGA3構(gòu)建體。標(biāo)示給出了載體上各元件的名稱和位置。斜體字標(biāo)示用于克隆進(jìn)載體的疫苗插入片段的獨(dú)特的限制性內(nèi)切核酸酶的位點(diǎn)。
圖6圖解圖5表示的新型pGA2構(gòu)建體的DNA序列SEQ IDNO3。在核苷酸序列的下面表示出質(zhì)粒各元件的位置。
圖7比較通過pGA載體(pGA3/H1)和pJW4303研究載體(pJW4303/H1)表達(dá)的H1流感血凝素增強(qiáng)的抗HA IgG的水平。BALB/c小鼠被分別以低劑量(0.1μg)或高劑量(1μg)免疫接種和加強(qiáng)免疫用基因槍接種注入所述質(zhì)粒，起始接種后第4周進(jìn)行加強(qiáng)免疫接種。
圖8A提供了親本wt BH10前病毒的圖解，從這個(gè)前病毒中產(chǎn)生非感染的病毒類似顆粒(VLP)。點(diǎn)狀的區(qū)域表示在VLP構(gòu)建體中缺失的序列。在方形框中指出BH10前病毒各個(gè)區(qū)域的位置和名稱標(biāo)示。編碼長末端重復(fù)序列的U3RU5區(qū)域包含轉(zhuǎn)錄控制元件。所有其他的區(qū)域表示編碼蛋白質(zhì)。為了清晰起見，由pol(Prt，RT，Int)和env(SU和TM)表達(dá)的產(chǎn)物也表示出來。
圖8B描述JS2疫苗插入片段。這個(gè)6.7kb疫苗插入片段表達(dá)HIV-1-IIIb的BH10品系的Gag、Prt和RT序列，Tat和Vpu蛋白來自ADA，Rev和Env蛋白質(zhì)為ADA和BH10序列嵌合體。Gag序列包含限制病毒RNA包裝的鋅指結(jié)構(gòu)的突變。RT序列包括消除逆轉(zhuǎn)錄酶活性的三個(gè)點(diǎn)突變。與圖8A中的名稱標(biāo)示是相同的。括號內(nèi)的部分表示BH10區(qū)域，在此區(qū)域BH10序列被來自ADA的序列代替，以便于用Env引入CCR-5。x表示安全的突變。
圖8C描述JS5插入片段。JS5是6kb疫苗插入片段，它表達(dá)Gag、Prt、RT、Vpu，Tat和Rev。除了在Env的序列缺失外，JS5是由與JS2相同的序列組成的。缺失的序列在圖8B中以黑色的矩形表示。與圖8A和8B中的名稱標(biāo)示是相同的。在Env的3′區(qū)域內(nèi)Rev應(yīng)答元件(RRE)仍在構(gòu)建體中保留。
圖9A和9B表示分別作為JS2疫苗插入片段結(jié)構(gòu)中中間體的Gag和Env的表達(dá)。數(shù)據(jù)來自于在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)的轉(zhuǎn)染。與野生類型HIV-1 ADA或HIV-1 IIIb前病毒以及在先前的研究中應(yīng)用的產(chǎn)生VLP的DNA(dPol)相比，pGA1/JS1(ADA VLP)產(chǎn)生較高水平的Gag(圖9A)和Env(圖9B)。
圖10表示用疫苗載體在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中p24衣殼的表達(dá)，此疫苗載體表達(dá)沒有安全突變的插入片段(JS1和JS4)、具有在鋅指結(jié)構(gòu)和在RT中點(diǎn)突變的插入片段(JS2和JS5)和具有在鋅指結(jié)構(gòu)、RT和蛋白酶中的點(diǎn)突變的插入片段(JS3和JS6)。注意在鋅指結(jié)構(gòu)和RT中的安全突變支持有活性的VLP的表達(dá)，而在Prt中的安全突變不支持。JS2和JS5被選出來，以便用于在具有安全突變的高水平表達(dá)的基礎(chǔ)上該載體的繼續(xù)研發(fā)。
圖11A和11B表示分別為由具有和不具有內(nèi)含子A的pGA載體表達(dá)的新侯選疫苗構(gòu)建體的Gag和Env表達(dá)。PGA1含有內(nèi)含子A而PGA2不含有。pGA2/JS2和pGA1/JS5被選作在以良好表達(dá)水平為基礎(chǔ)的疫苗中應(yīng)用。
圖12A-12D 表示從293T細(xì)胞得來的細(xì)胞溶胞產(chǎn)物和組織培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)印跡，293T細(xì)胞分別用(1)模擬物、(2)pGA2/JS2和(3)pGA1/JS5轉(zhuǎn)染，其中一級抗體是分別從被感染患者的抗-HIVIg(圖A)，抗-p24(圖12B)、抗-gp120(圖12C)和抗-RT(圖12D)收集的。
圖13圖示pGA。
圖14比較在pGA2/89.6、pGA1/Gag-Pol和pGA2/JS2之間的Gag的表達(dá)水平。對表達(dá)的比較研究是在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上進(jìn)行的。
圖15A-15C表示Gag-專一性T細(xì)胞的瞬間頻率。圖15A由DNA起始和rMVA增強(qiáng)免疫的Gag-專一性CD8 T細(xì)胞的應(yīng)答。圖解提供在高劑量的DNA-被免疫接種動(dòng)物中產(chǎn)生的Gag-CM9-四聚體數(shù)據(jù)。圖15B在Mamu-A*01免疫接種的和對照的恒河猴中的攻擊前和攻擊后兩周的不同時(shí)間的Gag-CM9-Mamu-A*01四聚體-專一性T細(xì)胞。每個(gè)圖表右上角的數(shù)字表示作為CD8 T細(xì)胞總數(shù)的百分?jǐn)?shù)的四聚體-專一性CD8 T細(xì)胞的頻率。在圖表的每個(gè)柱形之上的數(shù)字表示動(dòng)物的個(gè)體編號。圖15C于攻擊前和攻擊后兩周的不同時(shí)間在A*01和非A*01(有陰影線的柱圖)免疫接種和未免疫接種的恒河猴中的Gag-專一性IFN-γELISPOT。大約10-13 Gag肽(有12個(gè)重疊的22聚體)的三個(gè)數(shù)據(jù)庫被用于分析。數(shù)據(jù)棒上面的數(shù)字代表在每個(gè)組內(nèi)ELISPOTs的算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。圖表頂端的數(shù)字表示動(dòng)物個(gè)體編號。*，沒有數(shù)據(jù)；#，＜20 ELISPOTs/1×106PBMC。
圖16A-16B表示在DNA/MVA記憶應(yīng)答中對抗Gag和Env的產(chǎn)生IFN-γ的ELISPOT的高度和寬度。圖16A對個(gè)體的Gag和Env肽庫的應(yīng)答。在一個(gè)組內(nèi)的動(dòng)物數(shù)據(jù)以同樣的符號標(biāo)示。圖16B對不同組應(yīng)答的ELISPOT的平均高度和寬度。高為每組動(dòng)物Gag和EnvELISPOT總和的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。寬為被每組動(dòng)物識(shí)別的Gag和Env庫的數(shù)目的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。ELISPOT應(yīng)答是在記憶狀態(tài)期間應(yīng)用代表Gag序列的大約70個(gè)氨基酸的Gag肽的7個(gè)庫(有12重疊的大約七個(gè)22聚體)和代表Env序列的大約40個(gè)氨基酸的Env肽(有11重疊的大約十個(gè)15聚體)的21個(gè)庫在rMVA加強(qiáng)免疫之后第25周(攻擊前四周)在PBMC中被測定的。
圖17表示包含有免疫插入片段的pGA2構(gòu)建體的DNA序列SEQID NO4。病原疫苗插入片段JS2表達(dá)分化體的B HIV-1 VLP。表明了SEQ ID NO4核苷酸序列和編碼的蛋白質(zhì)。
圖18表示包含有的病原疫苗插入片段的pGA1構(gòu)建體的DNA序列。病原疫苗插入片段JS5表達(dá)分化體的B HIV-1 Gag-pol插入片段。表明了序列和編碼蛋白質(zhì)。
圖19A-19E表示時(shí)間病毒負(fù)載、CD4計(jì)數(shù)和在被接種的和對照的動(dòng)物受到攻擊后的存活率。圖19A病毒負(fù)載的幾何平均值以及圖19B對在攻擊后不同周的疫苗和對照組CD4計(jì)數(shù)的幾何平均值。圖B中標(biāo)示出了各組所用的圖例。圖19C被接種的動(dòng)物和對照動(dòng)物的存活曲線。點(diǎn)狀線代表所有24只被接種動(dòng)物。圖19D病毒負(fù)載。圖19E對在被接種動(dòng)物和對照動(dòng)物組中動(dòng)物個(gè)體的CD4計(jì)數(shù)。動(dòng)物數(shù)目的圖例在圖19E中表示。在攻擊后第一個(gè)12周的測定每毫升血漿具有1000個(gè)RNA拷貝作為底數(shù)。負(fù)載在1000以下的動(dòng)物以負(fù)載500計(jì)數(shù)。在第16和20周內(nèi)測定的底數(shù)是每毫升具有300個(gè)RNA拷貝，負(fù)載在300以下的動(dòng)物以負(fù)載300計(jì)。
圖20A-20C表示于接種和對照組中在攻擊后T細(xì)胞的應(yīng)答。圖20A四聚體+細(xì)胞和病毒隨時(shí)間的負(fù)載。圖20B在攻擊后兩周產(chǎn)生對用Gag-CM9肽刺激的應(yīng)答，細(xì)胞內(nèi)IFN-γ細(xì)胞因子的測定。這個(gè)活體外測定可得以評定在圖15A所表示的高峰期激發(fā)后四聚體+細(xì)胞的功能狀態(tài)。圖20C攻擊后12周的增殖測定。由瞬間轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的Gag-Pol-Env(空白的棒)和Gag-Pol(有影線的棒)被用于刺激。轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的上清液作為對照抗原。大約每毫升1μg的p27Gag的蛋白質(zhì)用于刺激。刺激的指數(shù)是有病毒抗原存在時(shí)培養(yǎng)物的生長除以在模擬抗原存在時(shí)培養(yǎng)物的生長所得的值。
圖21A-21E表示在攻擊后12周的淋巴結(jié)組織形態(tài)學(xué)和病毒負(fù)載。圖21A被接種的恒河猴的典型的淋巴結(jié)，其顯示出泡狀增生的特征，它的特征為存在帶有膨脹的生發(fā)中心以及分散的暗和亮的帶狀的大量次生小泡。圖21B轉(zhuǎn)染對照動(dòng)物的典型淋巴結(jié)，其顯示小泡排空和副皮質(zhì)淋巴細(xì)胞的萎縮。圖21C來自于年齡相當(dāng)?shù)奈幢桓腥镜暮愫雍锏牡湫偷牧馨徒Y(jié)，顯示無反應(yīng)的生發(fā)中心。圖21D測量被生發(fā)中心所占據(jù)的所有淋巴結(jié)的區(qū)域的百分比，給出了小泡增生的非專一性的指示。未感染的對照組的數(shù)據(jù)來自4個(gè)年齡相適的恒河猴。圖21E通過原位雜交用與SHIV-89.6 gag和pol互補(bǔ)的反義核糖核酸探針混合劑測定了淋巴結(jié)病毒負(fù)載。所有被檢驗(yàn)的淋巴結(jié)都是腹股溝淋巴結(jié)。
圖22A-22D表示在攻擊之后的抗體隨時(shí)間的應(yīng)答。應(yīng)用酶的免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，所有Gag(圖22A)或Env(圖22B)抗體的微克數(shù)被測定。用MT-2細(xì)胞殺滅和中性紅染色，89.6(圖22C)和89.6P(圖22D)中和抗體的滴度被測定。滴度是血漿稀釋度的倒數(shù)，此稀釋度時(shí)使在人類PBMC中生長的被指明病毒有50％被中和。所使用的動(dòng)物符號與圖19相同。
圖23A-23E表示疫苗實(shí)驗(yàn)的相互關(guān)系和劑量應(yīng)答曲線(圖23A和B)。在由INF-γ ELISPOT產(chǎn)生的峰疫苗和攻擊之后兩周(圖23A)和三周(圖23B)的病毒負(fù)載為負(fù)相關(guān)。因?yàn)槭チ藙?dòng)物3(見圖15C)的峰DNA/MVA ELISPOT樣本，24個(gè)被接種的動(dòng)物中僅僅有23個(gè)包括在相關(guān)性分析中。圖23C在峰DNA-MVA應(yīng)答的Gag ELISPOT的平均高度的劑量應(yīng)答曲線(圖15C的數(shù)據(jù))。圖23DDNA/MVA記憶ELISPOT應(yīng)答的寬度劑量應(yīng)答曲線(圖16B數(shù)據(jù))。圖23E在MVA加強(qiáng)免疫后，峰抗Gag抗體應(yīng)答的劑量應(yīng)答曲線(圖22A數(shù)據(jù))。DNA的不同劑量產(chǎn)生了ELISPOT和抗體應(yīng)答的不同水平(P＜0.05)。DNA接種的途徑對抗體有顯著的影響(P＝0.02)，但對ELISPOT應(yīng)答沒有影響。
圖24表示抗HA IgG，它是由基因槍接種表達(dá)HA蛋白質(zhì)的DNA產(chǎn)生的。
圖25表示抗HA IgG的抗體的親合性，所述抗HA IgG抗體由三種不同的HA DNA疫苗刺激產(chǎn)生的。
圖26表示在病毒攻擊后的保護(hù)作用，免于體重?fù)p失。
圖27圖示在疫苗中包含Env的重要性。
圖28A-28D圖示在給予用SHIV-89.6P攻擊的動(dòng)物接種的疫苗中包含Env的重要性。
圖29是表示DNA疫苗構(gòu)建體載體的示意圖。
圖30表示蛋白質(zhì)印記結(jié)果，顯示活體外疫苗構(gòu)建體的表達(dá)。
圖31是麻疹病毒中和抗體的時(shí)間曲線。
本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明與新載體、包含病原疫苗插入片段的新載體和給病人進(jìn)行抗病原免疫接種的新方法有關(guān)。新的免疫方法激發(fā)了細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答，它們限制了病原的感染、擴(kuò)散或生長以及導(dǎo)致了保護(hù)免受隨后的病原的攻擊。
DNA疫苗的經(jīng)典的參考資料包括第一次對提高免疫應(yīng)答的論證(Tang，De Vit和JohnsT0n，1992)；第一次對細(xì)胞毒性T細(xì)胞(Tc)免疫的論證(Ulmer等人，1993)；第一次對皮內(nèi)的(i.d.)、肌肉內(nèi)的(i.m.)、靜脈內(nèi)的(i.v.)、鼻內(nèi)的(i.n.)和基因槍(g.g.)的免疫接種的論證(Fynan等人，1993；Robinson，Hunt和Webster，1993)；第一次應(yīng)用遺傳佐劑(Xiang和Ertl，1995)；第一次應(yīng)用文庫免疫(Barry，Lai和JohnsT0n，1995)和第一次對用傳遞DNA的方法調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞免疫應(yīng)答類型的能力的論證(Feltquate等人，1997)。收集DNA疫苗信息的非常有用的網(wǎng)站是http//www.genweb.com/Dnavax.html.
為了便利，在詳細(xì)說明、實(shí)施例和所附的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語收集于此。
定義術(shù)語“核酸”在此是指任何天然的和合成的核苷酸和核苷的直鏈和連續(xù)的排列，例如cDNA、基因組DNA、mRNA、tRNA、寡核苷酸、寡核苷及其衍生物。為了便于討論，在此這樣的核酸可以被共同指為“構(gòu)建體”、“質(zhì)?！被颉拜d體”。本發(fā)明核酸的代表性的例子包括包含表達(dá)、克隆、粘粒和轉(zhuǎn)化載體的細(xì)菌質(zhì)粒載體，例如(也不限于此)pBR322；動(dòng)物病毒載體，例如(也不限于此)修飾的腺病毒、感冒病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、天花病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、從噬菌體核酸衍生的載體以及象化學(xué)合成DNA或RNA的合成寡核苷酸。術(shù)語“核酸”進(jìn)而包括修飾的或衍生的核苷酸和核苷，例如(也不限于此)，鹵化核苷酸(如5-嗅尿嘧啶)和衍生核苷酸(如生物素標(biāo)記核苷酸)。
術(shù)語“人工分離的核酸”在此指有著這樣結(jié)構(gòu)的核酸(a)不等同于任何天然存在的核酸或(b)不等同于任何天然存在的全長長于三個(gè)獨(dú)立的基因的基因組核酸的片段，以及包括DNA、RNA或其衍生物和變異體。此術(shù)語包括(但不限于此)下列(a)具有部分天然存在的基因組分子序列的DNA，但其兩側(cè)至少有一側(cè)不是位于在天然存在物種的基因組中該分子部分的側(cè)翼的編碼序列；(b)摻入到載體或原核生物或真核生物基因組核酸中的核酸，其摻入方式是產(chǎn)生的分子不等同于任何載體或天然存在的基因組DNA；(c)作為cDNA、基因組片段、由聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)或化學(xué)合成產(chǎn)生的片段、限制性片段；(d)是雜交基因部分(即編碼融合蛋白質(zhì)基因)的重組核苷酸序列和(e)是非天然存在的雜交序列部分的重組核苷酸序列。
已提純形式的核苷酸序列在有些方面是有益的。關(guān)于核酸的術(shù)語“純凈的”表示序列具有與自然環(huán)境相比而增加的純度。
在此應(yīng)用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”是指通過肽鍵連接的三個(gè)或更多氨基酸連續(xù)排列的氨基酸聚合物。術(shù)語“多肽”包括蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)類似物、寡肽等等。術(shù)語“多肽”更主要指由重組技術(shù)產(chǎn)生的、從適當(dāng)來源中分離的或合成的核酸編碼的上述定義中的多肽。術(shù)語“多肽”更進(jìn)一步指包括化學(xué)修飾氨基酸、共價(jià)或非共價(jià)與標(biāo)記配體連接的氨基酸的上述定義中的多肽。
在此應(yīng)用的術(shù)語“片段”是指一個(gè)核酸(例如cDNA)，指人工構(gòu)建(例如化學(xué)合成)的或用限制性內(nèi)切核酸酶(或機(jī)械剪切)將天然產(chǎn)物剪切成許多碎片的核酸的分離部分，或者指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、DNA聚合酶或在本領(lǐng)域中熟知的任何的其他聚合技術(shù)合成的或通過在本領(lǐng)域熟知的重組核酸技術(shù)在宿主細(xì)胞表達(dá)的核酸的部分，在此應(yīng)用的術(shù)語“片段”也可指多肽的分離部分，其中多肽部分是被通過用起碼一個(gè)蛋白酶進(jìn)行蛋白質(zhì)剪切從自然產(chǎn)生的多肽剪切的；或者是指通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)方法合成的自然產(chǎn)生的多肽部分。
在此應(yīng)用的術(shù)語“基因”指編碼遺傳信息的核酸序列(包括RNA或DNA)，其用于整個(gè)RNA、整個(gè)蛋白質(zhì)或此整個(gè)RNA或整個(gè)蛋白質(zhì)的任何部分的合成。特定的有機(jī)體基因組的非自然發(fā)生的基因是指外來基因、異種基因或外源基因，特定有機(jī)體基因組天然部分的基因被指稱為“內(nèi)源基因”。
在此應(yīng)用的術(shù)語“被表達(dá)”或“表達(dá)”是指從基因到RNA核酸分子的轉(zhuǎn)錄，此RNA核酸分子至少部分與基因的雙鏈中的一條鏈的某區(qū)域互補(bǔ)。在此應(yīng)用的術(shù)語“被表達(dá)的”或“表達(dá)”也指從RNA核酸分子到蛋白質(zhì)或多肽或其部分的翻譯。
在此應(yīng)用的術(shù)語“座位”是指基因在染色體上的位點(diǎn)。控制遺傳性狀的成對基因，每一個(gè)都在成對染色體上的相同位置。這些基因?qū)虻任换蛟诒磉_(dá)性狀上可以是顯性的或隱性的。在兩種情況的任何一種，對于這個(gè)基因?qū)λ刂频男誀?，個(gè)體都被稱為純合子。如果基因?qū)?等位基因)由一個(gè)顯性的和一個(gè)隱性的組成，對于這個(gè)基因?qū)λ刂菩誀?，個(gè)體是雜合子。基因或核酸分子的自然變異(例如由重組引起的或由突變導(dǎo)致的)引起帶有相似的但不等同的核苷酸序列的等位基因的變異。由于自然選擇典型上都是逆著改變功能的變異而選擇的，這樣的等位基因變異典型上編碼蛋白質(zhì)與同它們相對照的基因編碼蛋白質(zhì)的活動(dòng)類似。等位基因的變異也包含在基因的非翻譯區(qū)域的變化(例如3′或5′非翻譯區(qū)域)或可能涉及新生的轉(zhuǎn)錄本的替換剪接，其導(dǎo)致位置鄰近替換的外顯子。
在此應(yīng)用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”是指與基因核酸序列有聯(lián)系的和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的核苷酸序列?！稗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”可以被分離和合并入一個(gè)載體核酸，使之能夠調(diào)節(jié)在載體DNA部分的適當(dāng)細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄?！稗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”可以在一核酸序列區(qū)域之先(但不限于此)，此核酸序列區(qū)域在可以被轉(zhuǎn)錄為mRNA蛋白質(zhì)編碼序列的末端的5′區(qū)域。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域也可在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域內(nèi)，在與內(nèi)含子區(qū)域等同的基因區(qū)域中或可以在核酸區(qū)域的核酸序列區(qū)域。
在此應(yīng)用的術(shù)語“編碼區(qū)”是指可翻譯成蛋白質(zhì)的連續(xù)的線狀排列的核苷酸。全長的編碼區(qū)可以被翻譯成全長的蛋白質(zhì)；也就是說，在自然狀態(tài)下，沒有任何翻譯后的修飾，一完整的蛋白質(zhì)將被翻譯出。全長的編碼區(qū)也可包括前導(dǎo)蛋白質(zhì)序列或可能從被翻譯蛋白質(zhì)自然切除的蛋白質(zhì)的任何其他區(qū)域。
在此應(yīng)用的術(shù)語“探針”在涉及到核酸時(shí)是指某一核苷酸序列，其可用于雜交，用來鑒定互補(bǔ)序列的存在或互補(bǔ)序列與探針序列區(qū)別，但不能鑒定在在雜交的嚴(yán)格條件下防止雜交的程度。探針也可被標(biāo)記修飾，例如(但不僅僅如此)用放射性基團(tuán)、生物素或任何在本領(lǐng)域中熟知的其他標(biāo)記。
在此應(yīng)用的術(shù)語“核酸載體”是指自然的或合成的單鏈或雙鏈的質(zhì)?；蛘卟《竞怂岱肿?，其可被轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化進(jìn)入到細(xì)胞并在宿主細(xì)胞基因組外或內(nèi)獨(dú)立復(fù)制。根據(jù)質(zhì)粒載體的核苷酸序列，環(huán)狀的雙鏈質(zhì)粒通過用適當(dāng)?shù)南拗泼柑幚砜沙蔀橹辨湣Ｍㄟ^用限制酶剪切載體和再將片段連接在一起，核酸可被插入進(jìn)載體。核酸分子可以是RNA或DNA。
在此應(yīng)用的術(shù)語“表達(dá)載體”是指這樣的核酸載體，其可進(jìn)一步包括至少一個(gè)可被操縱連接于用于Mago蛋白質(zhì)編碼核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列在本領(lǐng)域是熟知的，無需進(jìn)行任何不適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可將其選擇出來以用于保證連接的核苷酸序列的很好的表達(dá)。在此應(yīng)用的術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和可控制表達(dá)的其他元件。在標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)教科書[例如，Sambrook等人著《分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊》第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)]可查閱到設(shè)計(jì)適合的表達(dá)載體、啟動(dòng)子和其他表達(dá)控制元件的內(nèi)容。但是現(xiàn)已公認(rèn)，選擇適合的表達(dá)載體依賴于多種因素，包括被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和(或)被表達(dá)的蛋白質(zhì)類型的選擇。
在此應(yīng)用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指向宿主內(nèi)插入核酸的過程。許多技術(shù)在本領(lǐng)域已被熟知，它們使將核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到原核生物或真核生物有機(jī)體內(nèi)變得容易。這些方法涉及各種各樣的技術(shù)，例如，用高濃度鹽(例如，但不僅是，鈣鹽或鎂鹽)、電場、去污劑或脂質(zhì)體為媒介的轉(zhuǎn)染來處理細(xì)胞，這樣使宿主細(xì)胞有能力吸收核酸分子。
術(shù)語“重組細(xì)胞”是指具有核酸片段新組合的細(xì)胞，在自然界這些片段不是共價(jià)互相連接的。應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員可掌握的各種核酸排列操縱技術(shù)，可將核酸片段的新組合導(dǎo)入到有機(jī)體內(nèi)。重組細(xì)胞可以是單個(gè)的真核生物細(xì)胞、單個(gè)的原核生物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。重組細(xì)胞可以將基因組外的載體包含其內(nèi)?；蚪M外的核酸載體不插入到細(xì)胞基因組內(nèi)。重組細(xì)胞可進(jìn)而將載體或其基因組內(nèi)的部分包含其內(nèi)。術(shù)語“基因組內(nèi)”定義為并入重組細(xì)胞基因組的核酸構(gòu)建體。
在此應(yīng)用的術(shù)語“重組核酸”是指在真核生物或原核生物細(xì)胞中沒有自然發(fā)現(xiàn)的至少兩個(gè)核酸序列。核酸序列可以包括(但不限于此)核酸載體、基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件、復(fù)制起點(diǎn)、在表達(dá)時(shí)賦予抗體抗性的序列以及蛋白質(zhì)編碼序列。術(shù)語“重組體多肽”包括通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，它們與自然發(fā)生的多肽在位置、純度或結(jié)構(gòu)上都是有明顯不同的。一般情況，這樣的重組體多肽以與在自然中正常觀察到的不同的量存在于細(xì)胞內(nèi)。
在此應(yīng)用的術(shù)語“患者”是指動(dòng)物，尤其指哺乳動(dòng)物，更尤其指人。
在此應(yīng)用的術(shù)語“免疫”或“免疫作用”是指在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，它保護(hù)患者(部分地或全部地)使其不顯露由病原引起的感染(即疾病)。用本發(fā)明進(jìn)行免疫接種的患者將不被病原感染或與未被免疫接種的相比有較少程度的感染。免疫接種在性質(zhì)上可是預(yù)防性的或治療性的。這就是說從前未感染的和感染的患者都可以用本發(fā)明進(jìn)行免疫接種。
在此應(yīng)用的術(shù)語“DNA轉(zhuǎn)錄單位”是指聚核苷酸序列，其至少包括兩個(gè)成分編碼抗原的DNA和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子元件。一個(gè)DNA轉(zhuǎn)錄單位可包括(任選的)另外的序列，例如，增強(qiáng)子元件、剪接信號、終止和多腺苷酸化信號、病毒復(fù)制子和(或)細(xì)菌質(zhì)粒序列。可通過若干已知的方法產(chǎn)生DNA轉(zhuǎn)錄單位。例如，編碼想要得到的抗原的DNA可被插入到表達(dá)載體內(nèi)構(gòu)建DNA轉(zhuǎn)錄單位，在《Maniatis等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)》已對此有所描述，其公開內(nèi)容通過引證被全面并入本文。
在此應(yīng)用的術(shù)語“疫苗插入片段”是指病原體的DNA轉(zhuǎn)錄單位。尤其指，疫苗插入片段是可在患者體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的DNA轉(zhuǎn)錄單位。例如，疫苗插入片段是這樣的病原疫苗插入片段，其編碼由病毒、細(xì)菌、寄生蟲和(或)真菌衍生的抗原。典型的病毒包括皰疹病毒、正粘病毒、鼻病毒、小核糖核酸病毒、腺病毒、副粘病毒、冠狀病毒、彈狀病毒、披膜病毒、黃病毒、本雅病毒、風(fēng)疹病毒、呼吸道腸道孤兒病毒、麻疹病毒、肝DNA病毒、埃博拉病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括人免疫缺陷病毒)等等。典型的細(xì)菌包括結(jié)核菌、分支桿菌、螺旋體、立克次體、衣原體、支原體等等。典型的寄生蟲包括瘧原蟲等等。典型的真菌包括酵母菌、霉菌等等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)意識(shí)到這個(gè)列表沒有包括所有可用在此描述的方法產(chǎn)生的保護(hù)性免疫應(yīng)答與之對抗的潛在病原體。
在此應(yīng)用的術(shù)語“抗原”是指任何蛋白質(zhì)、糖類或由病原所表達(dá)的其他部分，其能夠激發(fā)針對病原體的保護(hù)性應(yīng)答。抗原可能是也可能不是病原體的結(jié)構(gòu)成分?？梢允欠g產(chǎn)物或各種長度的多肽的編碼抗原也在術(shù)語“抗原”之列?？乖?jīng)過一般的宿主細(xì)胞修飾，例如，糖基化、肉豆蔻?；蛄姿峄?。除此之外，它們可被設(shè)計(jì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外或細(xì)胞表面的表達(dá)。進(jìn)一步，它們可被設(shè)計(jì)進(jìn)行裝配和從細(xì)胞中釋放。
在此應(yīng)用的術(shù)語“佐劑”是指加入到疫苗中以增加免疫效率的物質(zhì)。佐劑如何運(yùn)作的機(jī)理還未完全搞清。一些佐劑被認(rèn)為通過緩慢釋放抗原來增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而另一些佐劑本身就是強(qiáng)免疫原性的，據(jù)認(rèn)為具有協(xié)同功能。已知的疫苗佐劑包括(但不限于此)油和水的乳劑(例如，完全的分支桿菌佐劑和不完全的分支桿菌佐劑)、棒狀桿菌parvum、芽孢桿菌Calmette Guerin、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、藻酸鈉、Bacto佐劑、某種合成聚合物(例如，聚合氨基酸和氨基酸的共聚物)、皂角苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga)、“AVRIDINE”[N，N-二(十八烷基)-N，N-雙(2-羥乙基)丙烷二胺]、石蠟油和胞壁酰二肽。佐劑也包含遺傳佐劑(例如，在共接種的DNA中被編碼的免疫調(diào)變劑分子)。共接種的DNA可以在作為疫苗免疫原的相同的疫苗構(gòu)建體中或在另外的DNA載體中。
在此應(yīng)用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指容納可被注射入牛宿主并且無副作用疫苗的載體。在本領(lǐng)域熟知的適合的藥學(xué)上可接受的的載體包括(但不限于此)無菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖液。載體也可包括輔劑，其包括(但不限于此)稀釋劑、穩(wěn)定劑(即糖和氨基酸)、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、pH緩沖劑、增強(qiáng)黏度添加劑、染料等等。
在此應(yīng)用的術(shù)語“選擇性標(biāo)記基因”是指一種表達(dá)基因，它能用作從沒有表達(dá)可選擇的標(biāo)記基因的細(xì)胞群中選擇出包含可選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞群。例如，“選擇性標(biāo)記基因”可以是“抗生素抗性基因”，它可能使對于微生物專門的抗生素有耐受力，這是先前藥物的不利影響。這樣的抗性可是由突變導(dǎo)致的或者由于包含有轉(zhuǎn)染微生物的抗性基因的質(zhì)粒而獲得的抗性。
在此應(yīng)用的術(shù)語“終止子序列”或“終止子”是指功能為停止轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。在此應(yīng)用的術(shù)語“轉(zhuǎn)錄”是指這樣的過程，在此過程中以DNA為模板通過堿基互補(bǔ)配對形成RNA分子。此過程是由RNA聚合酶調(diào)節(jié)的。
在此應(yīng)用的術(shù)語“VLP”是指病毒類似顆粒，也指病毒蛋白的聚集體。
以DNA為基礎(chǔ)的免疫接種的主要免疫學(xué)優(yōu)點(diǎn)是由MHC類型I和MHC類型II分子提呈的免疫原的能力。內(nèi)源合成蛋白質(zhì)容易進(jìn)入加工途徑，用以在MHC類型I和MHC II類型分子表面負(fù)載肽抗原決定簇。MHC I提呈的抗原決定簇提高細(xì)胞毒性T-細(xì)胞(Tc)的應(yīng)答，而MHC II提呈的抗原決定簇增強(qiáng)輔助T-細(xì)胞(Th)的應(yīng)答。相反，非細(xì)胞內(nèi)合成的免疫原很大程度上局限于負(fù)載MHC II抗原決定簇并因而提高Th而非Tc的應(yīng)答。當(dāng)將活的減毒疫苗或能在細(xì)胞中產(chǎn)生免疫原并對Th和Tc都有增強(qiáng)的重組體病毒載體作比較時(shí)，DNA疫苗有不是感染性的優(yōu)點(diǎn)和將免疫應(yīng)答僅集中于免疫所要求的抗原上的優(yōu)點(diǎn)。由于DNA疫苗對增強(qiáng)類型1或類型2T-細(xì)胞的輔助比較容易操作，因此它們也是很有優(yōu)點(diǎn)的。這使得疫苗對于將動(dòng)員與感染戰(zhàn)斗的免疫應(yīng)答來說是特制的。由于用重組DNA技術(shù)容易構(gòu)建DNA質(zhì)粒、疫苗生產(chǎn)(質(zhì)粒DNA的生長和提純)中應(yīng)用遺傳方法的能力和在廣泛的溫度范圍內(nèi)DNA的穩(wěn)定性，DNA疫苗的花費(fèi)也較小。
用高度活性的表達(dá)載體制作模型以生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，可得到最好的免疫應(yīng)答(Robinson和Pertmer，1998)。最頻繁使用的轉(zhuǎn)錄控制元件包括強(qiáng)啟動(dòng)子。雖然在DNA疫苗中可能應(yīng)用的其他啟動(dòng)子也未離開本發(fā)明的范圍，一個(gè)適合應(yīng)用的這樣的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)，它是立即早期啟動(dòng)子。在本發(fā)明中用到的其他轉(zhuǎn)錄控制元件包括強(qiáng)多腺苷酸化信號，例如，從牛生長激素編碼基因衍生的或兔β球蛋白多腺苷酸化信號(Bohm等人，1996；Chapman等人，1991；Hartikka等人，1996；Manthorpe等人，1993；Montgomery等人，1993)。CMV立即早期啟動(dòng)子可以在有內(nèi)含子或無內(nèi)含子A的情況下應(yīng)用(Chapman等人，1991)。內(nèi)含子A的存在增強(qiáng)了RNA病毒、細(xì)菌和寄生蟲中的許多抗原的表達(dá)，可能通過以支持加工和起真核生物mRNA功能的序列提供給被表達(dá)RNA來進(jìn)行的。也將會(huì)意識(shí)到，用本領(lǐng)域已知的其他方法也可增強(qiáng)表達(dá)，其包括(但不限于此)盡可能完善地使原核生物mRNA密碼子使用于真核生物細(xì)胞(Andre等人，1998；Uchijima等人，1998)。多順反子載體可被用于表達(dá)超過一個(gè)的免疫原或一個(gè)免疫原與一個(gè)免疫刺激蛋白(Iwasaki等人，1997a；Wild等人，1998)。
通過將表達(dá)抗原靶向特定的細(xì)胞區(qū)室，可使免疫原對刺激產(chǎn)生抗體或Tc細(xì)胞應(yīng)答更加有效或有較低的效果。例如，用位于細(xì)胞的質(zhì)膜或從其分泌的抗原比用位于細(xì)胞內(nèi)部的抗原對增強(qiáng)抗體應(yīng)答更有效(Boyle，Koniaras，和Lew，1997；Inchauspe等人，1997)。用N-端遍在蛋白化信號，將DNA編碼蛋白質(zhì)靶向可引起細(xì)胞質(zhì)快速降解和更有效地負(fù)載肽于MHC I途徑的蛋白酶體，可以增強(qiáng)Tc應(yīng)答(Rodriguez，Zhang，和Whitton，1997；Tobery和Siliciano，1997；Wu和Kipps，1997)。為了回顧DNA提高免疫應(yīng)答的機(jī)理基礎(chǔ)，可參考Robinson和Pertmer，《病毒研究進(jìn)展》，vol 53，Academic Press(2000)，其中的發(fā)現(xiàn)在此通過全部引證被并入本文。
蛋白質(zhì)的不同構(gòu)造類型對抗體應(yīng)答的效用、一系列MHC I抗原決定簇(微小基因)增強(qiáng)Tc應(yīng)答的能力和抗原與免疫靶蛋白融合的效果都可用規(guī)定的插入片段來定值。有序的結(jié)構(gòu)(例如，病毒類似顆粒)看起來比無序結(jié)構(gòu)在增強(qiáng)抗體上更有效。(Fomsgaard等人，1998)。這似乎反映出免疫原的規(guī)律排列比抗原單體在交叉連接球蛋白受體和向B-細(xì)胞發(fā)出增殖和產(chǎn)生抗體信號方面更有效。編碼不同病原的一系列MHC抗原決定簇的重組DNA分子可以激發(fā)對許多病原的Tc應(yīng)答(Hanke等人，1998b)。如果它們也包含Th決定簇，這些系列的Tc決定簇是最有效的(Maecker等人，1998；Thomson等人，1998)。
操縱免疫應(yīng)答的另外的方法是將免疫原與免疫靶分子或免疫刺激分子融合。根據(jù)資料，這個(gè)融合的最成功的是將分泌的免疫原靶向抗原提呈細(xì)胞(APC)或淋巴結(jié)(Boyle，Brady，和Lew，1998)。人IgG的分泌形態(tài)與CTLA-4的融合增加了對IgG的抗體應(yīng)答，它的增加大大多于1000倍，并且改變了從完全(C′-)依賴到C′-獨(dú)立抗體的傾向。
人IgG與L-selectin的融合也增加了抗體應(yīng)答，但不改變被增強(qiáng)抗體的C′-結(jié)合特征。與L-selectin融合的免疫原可能通過作為門戶的內(nèi)皮小靜脈被傳遞到淋巴結(jié)?？乖c細(xì)胞素cDNAs的融合引起抗體、Th、和Tc應(yīng)答的適度增強(qiáng)(Hakim，Levy，和Levy，1996；Maecker等人，1997)。IL-4-融合增強(qiáng)了抗體應(yīng)答，而IL-12和IL-1β增強(qiáng)了T-細(xì)胞應(yīng)答。
DNA傳遞的兩種方法是用皮下組織針注射溶于鹽水中的DNA或基因槍傳遞包被金衣的DNA彈丸。鹽水注射將DNA傳遞入細(xì)胞外的空間，而基因槍將DNA直接轟擊到細(xì)胞中。鹽水注射比基因槍需要更大量的DNA(多100-1000倍)(Fynan等人，1993)。這兩種類型的傳遞的不同還在于，鹽水注射傾向于對類型1T-細(xì)胞輔助的應(yīng)答，而基因槍傳遞傾向于對類型2T-細(xì)胞輔助的應(yīng)答(Feltquatate等人，1997；Pertmer，Roberts，和Haynes，1996)。DNA鹽水注射能快速在整個(gè)體內(nèi)散布。用基因槍傳遞DNA更局限于靶部位。使用任何一種接種方法，細(xì)胞外質(zhì)粒DNA只有短暫的半衰期，大約10分鐘(Kawabata，Takaura，和Hashida，1995；Lew等人，1995)。鹽水注射疫苗也可肌肉內(nèi)(i.m.)注射或皮內(nèi)(i.d.)注射(Fynan等人，1993)。
雖然靜脈內(nèi)和皮下的注射對不同的質(zhì)粒都有不同程度的成功(Bohm等人，1998；Fynan等人，1993)，但腹膜內(nèi)注射還沒有得到過成功(Bohm等人，1998；Fynan等人，1993)。基因槍傳遞可通過給予皮膚或外科手術(shù)后露出的肌肉來進(jìn)行。在小鼠體內(nèi)對增強(qiáng)免疫應(yīng)答有效的DNA傳遞方法和路線在其他種類也是有效的。
通過粘膜傳遞DNA的免疫接種比用非腸道的接種途徑進(jìn)行的免疫更少成功。通過鼻內(nèi)給服鹽水DNA有兩個(gè)好的(Asakura等人，1997；Sasaki等人，1998b)和有限的(Fynan等人，1993)成功。通過把DNA傳遞到陰道粘膜，基因槍成功地增強(qiáng)了IgG(LivingsT0n等人，1995)。用類脂體(McCluskie等人，1998)、微球(Chen等人，1998a；Jones等人，1997)和重組Shigella載體(Sizemore，Branstrom，和Sadoff，1995；Sizemore，Branstrom，和Sadoff，1997)將DNA傳遞到粘膜表面也獲得了一些成功。
對增強(qiáng)免疫應(yīng)答的DNA劑量依賴于傳遞方法、宿主、載體和被編碼抗原。對劑量影響最大的是傳遞方法。鹽水注射DNA一般用10μg到1mg DNA，而用基因槍傳遞DNA一般用0.2μg到20μg DNA。一般情況，對小鼠用低劑量的DNA(10-100μg鹽水注射和0.2-20μg基因槍傳遞)，而對靈長類動(dòng)物用高劑量的DNA(100μg-1mg鹽水注射和2μg-20μg基因槍傳遞)?；驑寕鬟f需要較低劑量的DNA反映出金彈丸是直接將DNA傳遞到細(xì)胞內(nèi)的。
抗原在增強(qiáng)應(yīng)答上的明顯效果的實(shí)例可以在這樣的研究中找到，它比較了在兔子體中對表達(dá)流感血凝集素的DNA或表達(dá)免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白(Env)的DNA的抗體應(yīng)答的增強(qiáng)(Richmond等人，1998)。在類似情況下，表達(dá)血凝集素的DNA增強(qiáng)了長而持久的高抗體親抗原性的和高效價(jià)的抗體(～100μg/ml專一性抗體)，而表達(dá)Env的DNA只增強(qiáng)了瞬間的低抗體親抗原性的和低效價(jià)的抗體應(yīng)答(小于10μg/ml的專一性抗體)。在增強(qiáng)抗體上的區(qū)別可被假設(shè)為反映出了作為T-依賴性抗原的血凝集素和作為T-非依賴性抗原的高糖基化免疫缺陷病毒Env。
蛋白質(zhì)和重組體病毒都被用于加強(qiáng)經(jīng)DNA引發(fā)的免疫應(yīng)答。蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫被應(yīng)用于增強(qiáng)對HIV-1 Env的中和抗體應(yīng)答。重組天花病毒增強(qiáng)也被應(yīng)用于增強(qiáng)體液的和細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
對于弱免疫原，例如，免疫缺陷病毒Env，用DNA增強(qiáng)抗體應(yīng)答僅僅是在自然感染動(dòng)物體內(nèi)抗體應(yīng)答的一部分，已用蛋白質(zhì)促進(jìn)提供了增強(qiáng)低效價(jià)抗體應(yīng)答的手段(Letvin等人，1997；Richmond等人，1998)。在對兔的研究中，用蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫提高了抗體效價(jià)、抗體親抗原性和抗體應(yīng)答的持久性(Richmond等人，1998)。同對用蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫的次級免疫應(yīng)答一致，與只接受蛋白質(zhì)的動(dòng)物相比，在用蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫之后，經(jīng)DNA引發(fā)的動(dòng)物顯示出抗體的更快速的增加和更高的抗體效價(jià)。但是，第二次蛋白質(zhì)免疫接種時(shí)，在曾接受和未曾接受DNA引發(fā)的免疫的動(dòng)物中抗體應(yīng)答的動(dòng)力和效價(jià)是相似的。
用重組天花病毒加強(qiáng)免疫被證明是促進(jìn)經(jīng)DNA引發(fā)的CD8+細(xì)胞應(yīng)答的高度成功的方法(Hanke等人，1998a；Kent等人，1998；Schneider等人，1998)。在用天花病毒加強(qiáng)免疫后，抗原專一性CD8+細(xì)胞在經(jīng)DNA引發(fā)的小鼠或恒河猴中增加了10倍之多。研究測定的免疫接種的順序揭示，DNA必須被首先遞入(Schneider等人，1998)。這被假定為，它反映出集中于對所要求免疫原的免疫應(yīng)答的DNA。在用天花病毒加強(qiáng)免疫后，CD8+細(xì)胞應(yīng)答的較大的增加被假設(shè)為反映出較大量的由天花病毒載體表達(dá)的抗原，也反映出天花病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子增強(qiáng)了免疫應(yīng)答(Kent等人，1998；Schneider等人，1998)。
許多不同的天花病毒可被用于天花的加強(qiáng)免疫上。一種被定名為修飾疫苗Ankara(MVA)的疫苗病毒在小鼠模型中特別有效(Schneider等人，1998)。這也可反映出在哺乳動(dòng)物模型中不完全復(fù)制的MVA規(guī)避宿主免疫應(yīng)答的能力被減弱了。
通過經(jīng)DNA引發(fā)后由天花病毒加強(qiáng)免疫而提高的應(yīng)答對提高保護(hù)性細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是高度有效的。給小鼠肌內(nèi)注射DNA，然后用重組天花病毒加強(qiáng)免疫可保護(hù)小鼠免受瘧疾的攻擊(Schneider等人，1998)。在恒河猴體內(nèi)，用皮內(nèi)注射(但非基因槍傳遞)DNA引發(fā)，然后用重組天花病毒加強(qiáng)免疫，以此抑制了猿和人免疫缺陷病毒嵌合體的攻擊(Robinson等人，1999)。
免疫缺陷病毒(例如，HIV-1)的DNA疫苗遇到足夠有限的進(jìn)入的感染的攻擊，這樣使導(dǎo)致艾滋病(AIDS)的無法制止的長期的感染得到了預(yù)防。使此變得復(fù)雜的是中和抗體難于產(chǎn)生并難于對特別的病毒品系有專一性。(Burton和Montefiori，1997；Moore和Ho，1995)。對于增強(qiáng)中和抗體的問題，許多努力都集中于增強(qiáng)對幾個(gè)特定感染的足夠強(qiáng)度的細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。根據(jù)資料，增強(qiáng)Tc高效價(jià)的最成功的實(shí)例是來自于用經(jīng)DNA引發(fā)的然后用重組天花病毒加強(qiáng)免疫的方案。通過用測定溶解細(xì)胞的活性來測定專一性Tc的水平(Kent等人，1998)、通過用MHC-專一性四聚體對專一性SIV Gag抗原決定簇染色和通過用SIV或SHIV激發(fā)(Hanke，1999)，評價(jià)了這個(gè)方案的效果。
用DNA引發(fā)和用重組天花病毒加強(qiáng)免疫，許多顯著的發(fā)現(xiàn)從臨床前期的試驗(yàn)中出現(xiàn)。首先，攻擊感染可被抑制在用對質(zhì)粒病毒RNA進(jìn)行定量的RT-PCR分析可檢出的水平以下(Robinson等人，1999)。第二，這個(gè)保護(hù)是長期持久的并不需要有中和抗體存在(Robinson等人，1999)。第三，用DNA鹽水注射的皮內(nèi)的DNA引發(fā)對于增強(qiáng)保護(hù)性免疫優(yōu)于用基因槍的引發(fā)(P＝0.01，F(xiàn)isher′s exact test)(Robinson等人，1999)。
本發(fā)明的新pGA載體有原核生物復(fù)制起點(diǎn)、對質(zhì)粒選擇的選擇性標(biāo)記基因和對真核生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄盒。本發(fā)明的pGA載體的獨(dú)到之處是包括與轉(zhuǎn)錄同向的λ終止子和選擇標(biāo)記基因。在質(zhì)粒于細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生時(shí)，終止子序列防止從卡那霉素盒(kanamycin cassette)到疫苗的序列的通讀。通過限制暴露可被細(xì)菌內(nèi)切核酸酶識(shí)別的次級結(jié)構(gòu)，防止轉(zhuǎn)錄的通讀穩(wěn)定了疫苗插入片段序列。
已并入到本發(fā)明pGA載體的轉(zhuǎn)錄盒應(yīng)用了來自巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子序列(CMVIE)和來自牛生長素多腺苷酸化的序列(BGHpA)的序列以控制轉(zhuǎn)錄。組織溶酶原激活劑基因前導(dǎo)序列(tPA)的合成同系物作為前導(dǎo)序列在轉(zhuǎn)錄盒中是可有可無的。本發(fā)明的載體在對接受疫苗插入片段可應(yīng)用的位點(diǎn)上有所不同，在轉(zhuǎn)錄盒是否包括CMVIE啟動(dòng)子中的內(nèi)含子A序列上也有所不同。內(nèi)含子A和tPA前導(dǎo)序列在某些例子中顯示出對疫苗插入片段的強(qiáng)表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)(Chapman等人，1991)。
pGA1是一個(gè)3894bp大小的質(zhì)粒。pGA1包含啟動(dòng)子(bp1-690)、CMV-內(nèi)含子A(bp691-1638)、tPA前導(dǎo)序列合成模仿物(bp1659-1721)、牛生長激素多腺苷酸化序列(bp1761-1983)、λT0終止子(bp1984-2018)、卡那霉素抗性基因(bp2037-2830)和ColE1復(fù)制子(bp2831-3890)。在圖2中表示pGA1構(gòu)建體的DNA序列(SEQ IDNO1)。在圖1中，所指示的限制性位點(diǎn)是用于疫苗插入片段克隆的單個(gè)切點(diǎn)。在疫苗插入片段5′端被克隆在tPA前導(dǎo)序列上游區(qū)時(shí)，應(yīng)用ClaI或BspD1位點(diǎn)。NheI位點(diǎn)用于克隆在tPA前導(dǎo)序列框架中的序列。在于SmaI和BlnI之間的位點(diǎn)用于克隆疫苗插入片段的3′端。
pGA2是一個(gè)2947bp大小的質(zhì)粒，其缺少在pGA1中存在的947bp內(nèi)含子A序列。除了內(nèi)含子A序列缺失，pGA2與pGA1相同。對于克隆不需要有效表達(dá)所需的上游區(qū)內(nèi)含子的序列或克隆上游區(qū)內(nèi)含子可能與需要良好表達(dá)的剪接類型產(chǎn)生干擾的序列，pGA2是有價(jià)值的。圖3提供了具有有用的克隆疫苗插入片段限制性位點(diǎn)的圖，圖4表示SEQ ID NO2的DNA序列。將疫苗插入片段克隆進(jìn)入pGA2的限制性位點(diǎn)的應(yīng)用與克隆片段進(jìn)入pGA1的應(yīng)用相同。
pGA3是包含內(nèi)含子A的3893bp的質(zhì)粒。除了可被用于導(dǎo)入疫苗插入片段的克隆位點(diǎn)外，pGA3與pGA1相同。在pGA3，將插入片段克隆到tPA前導(dǎo)序列上游區(qū)用HindIII位點(diǎn)。將序列克隆到tPA前導(dǎo)序列下游區(qū)用SmaI和BlnI位點(diǎn)之間的位點(diǎn)。在pGA3，這些位點(diǎn)包括BamHI位點(diǎn)。圖5表示pGA3的圖譜，圖6表示SEQ ID NO3的DNA序列。
從此處的技術(shù)看來，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，任何本領(lǐng)域已知的疫苗插入片段都可被應(yīng)用于在此描述的新pGA構(gòu)建體，其包括(但不限于)象HIV、流感、麻疹、皰疹、埃博拉等等病毒病原體。
例如，本發(fā)明包括來自于下列的一些插入片段免疫缺陷病毒特別是HIV(包括HIV-1和HIV-2的分化體及其修飾體)、流感病毒基因(包括所有亞型和修飾體)和從麻疹基因衍生的疫苗插入片段。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識(shí)到，關(guān)于從免疫缺陷病毒、流感病毒、麻疹病毒及其修飾體衍生的插入片段的討論是自然的舉例，僅僅為了說明緣故而提供的。
本發(fā)明的免疫缺陷病毒疫苗插入片段被設(shè)計(jì)為表達(dá)來自于單一DNA的非感染病毒類似顆粒(VLP)。這是用亞基因組剪接元件得到的，此元件一般應(yīng)用于免疫缺陷病毒從單個(gè)病毒RNA表達(dá)多基因產(chǎn)物。對于亞基因組剪接模式而言重要的是(i)剪接位點(diǎn)和全長病毒RNA中存在的受體(ii)Rev應(yīng)答元件(RRE)和(iii)Rev蛋白質(zhì)。逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的剪接位點(diǎn)用真核生物RNA剪接位點(diǎn)的規(guī)范序列。RRE是一個(gè)大約200bp RNA的結(jié)構(gòu)，其與Rev蛋白質(zhì)相互作用使病毒RNA從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)運(yùn)送。在沒有Rev的情況下，免疫缺陷病毒的～10kb RNA對調(diào)節(jié)基因Tat、Rev和Nef的mRNA進(jìn)行剪接。這些基因被在RT與Env之間和在基因組3′端存在的外顯子編碼。除了Tat、Rev和Nef的被多重剪接的mRNA之外，在Rev存在的情況下單個(gè)被剪接的Env的mRNA和未被剪接的Gag與Pol的mRNA得到了表達(dá)。
由單個(gè)DNA對非感染性的VLP的表達(dá)使免疫缺陷病毒疫苗具有了許多優(yōu)勢特征。單個(gè)DNA對許多蛋白質(zhì)的表達(dá)給被接種的宿主提供了對這些蛋白質(zhì)包含的廣泛T-細(xì)胞和B-細(xì)胞抗原決定簇作出應(yīng)答的機(jī)會(huì)。包含多樣抗原決定簇的蛋白質(zhì)的表達(dá)給由多樣組織相容性類型對抗原決定簇的提呈提供了機(jī)會(huì)。通過使用所有蛋白質(zhì)，給不同組織相容性類型的宿主提供了產(chǎn)生有廣泛基礎(chǔ)的T-細(xì)胞應(yīng)答的機(jī)會(huì)。這可能對有效抑制免疫缺陷病毒感染(它的高度突變率使之容易逃脫免疫應(yīng)答)是必需的(Evans等人，1999)(Poignard等人，1999；Evans等人，1995)。正如在藥物治療時(shí)，需要多個(gè)逃避突變的多抗原決定簇T-細(xì)胞應(yīng)答將比僅需要單一逃避突變的單個(gè)抗原決定簇T-細(xì)胞應(yīng)答提供更好的保護(hù)。
抗體應(yīng)答常常被多價(jià)疫苗最好的引發(fā)，多價(jià)疫苗給應(yīng)答B(yǎng)-細(xì)胞提呈了抗原決定簇的有序排列(Bachmanm，Zinkernagel，1997)。通過病毒顆粒膜上Env的多價(jià)性的效用，病毒類似顆粒將有利于增強(qiáng)抗Env抗體應(yīng)答。這些顆粒也給免疫系統(tǒng)提呈非變性的和正常的Env形態(tài)。
在有佐劑或其他物質(zhì)(這些物質(zhì)要有促進(jìn)DNA吸收或使免疫系統(tǒng)細(xì)胞恢復(fù)到接種位點(diǎn)的能力)的情況下，可給患者施用本發(fā)明的新載體。實(shí)施方案包括DNA疫苗與常規(guī)佐劑或基因佐劑的結(jié)合。常規(guī)佐劑包括有利于DNA穩(wěn)定和吸收的佐劑、可使免疫系統(tǒng)細(xì)胞恢復(fù)到接種位點(diǎn)的佐劑或有利于應(yīng)答淋巴細(xì)胞免疫激活的佐劑。常規(guī)佐劑包括(但不限于此)油劑和水劑(例如，完全的分支桿菌佐劑和不完全的分支桿菌佐劑)、棒狀桿菌parvum、芽孢桿菌Calmette Guerin、氫氧化鋁、葡聚糖、硫酸葡聚糖、氧化鐵、藻酸鈉、BacT0佐劑、某種合成聚合物(例如，聚合氨基酸和氨基酸的共聚物)、皂角苷、“REGRESSIN”(Vetrepharm，Athens，Ga)、“AVRIDINE”[N，N-二(十八烷基)-N，N-雙(2-羥乙基)丙烷二胺]、石蠟油和胞壁酰二肽。本發(fā)明也考慮應(yīng)用遺傳佐劑(例如，在共接種的DNA中被編碼的免疫調(diào)變劑分子)。共接種的DNA可以在作為疫苗免疫原的相同的疫苗構(gòu)建體中或在分離的DNA載體中。
本發(fā)明的疫苗可以以各種方式服用，包括非腸道的或典型的途徑。例如，可以通過靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮內(nèi)的、皮下的或肌內(nèi)的方法進(jìn)行接種。例如可以用皮下注射針、用象推動(dòng)液流進(jìn)入靶位點(diǎn)那樣的無針傳遞裝置或用將于金彈丸上的DNA轟擊入靶位點(diǎn)的基因槍?？赏ㄟ^各種方法將包含病原疫苗插入片段的載體給予粘膜表面，包括鼻內(nèi)服用即鼻滴劑或吸入劑，或者通過直腸內(nèi)或陰道內(nèi)給予溶液、凝膠、泡沫或栓劑服用。也可選擇口服包含疫苗插入片段的載體，形式可為片劑、膠囊、嚼片、糖漿、乳劑等等。在另一替代方案，可通過被動(dòng)的皮膚貼片、電離子滲入療法等方法經(jīng)過皮膚給予載體。任何生理學(xué)合格的適當(dāng)媒介對導(dǎo)入包含病原疫苗插入片段的載體都是適宜的。例如，在本領(lǐng)域已知的適宜的藥學(xué)上合格的載體包括(但不限于此)無菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖液。載體也可包括輔劑，其包括(但不限于此)稀釋劑、穩(wěn)定劑(即糖和氨基酸)、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、pH緩沖劑、增強(qiáng)黏度添加劑、染料等等。
通過下列實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行解釋，這些實(shí)施例是通過例證方式提供的并將不被局限地解釋。參考資料的內(nèi)容、出版專利和全部本申請書引用的專利在此通過引證被全部并入本文。
實(shí)施例1pGA1的結(jié)構(gòu)和序列在圖1和圖2中表示的pGA1包含ColE1復(fù)制起點(diǎn)、用于抗生素選擇的卡那霉素抗性基因、λT0終止子和包括上游區(qū)內(nèi)含子的真核生物表達(dá)盒。ColE1復(fù)制起點(diǎn)是600核苷酸的DNA片段，其包含復(fù)制起端(ori)，編碼RNA引物和編碼兩個(gè)復(fù)制起始的負(fù)調(diào)節(jié)基因。用于質(zhì)粒復(fù)制的所有的酶促功能都是由細(xì)菌宿主提供的。包含ColE1復(fù)制基因的起始構(gòu)建體質(zhì)粒是pBR322(Bolivar等人，1977；Sutcliffe等人，1978)。
卡那霉素抗性基因是用于在細(xì)菌中質(zhì)粒選擇的抗生素抗性基因。λT0終止子防止在原核生物質(zhì)粒生長期間從卡那霉素抗性基因到疫苗轉(zhuǎn)錄盒的通讀(Scholtisse和kGrosse，1987)。通過防止在疫苗表達(dá)盒中的通讀，終止子幫助穩(wěn)定在細(xì)菌中生長期間的質(zhì)粒插入片段。
真核生物表達(dá)盒是由包括內(nèi)含子A(CMVIE-IA)的CMV立即早期啟動(dòng)子和來自于牛生長素多腺苷酸化序列(BGHpA)的終止序列組成。組織溶酶原激活劑(tPA)的前導(dǎo)序列的合成模仿物轉(zhuǎn)錄盒內(nèi)的選擇性組份可被包括在內(nèi)。有這些元件的轉(zhuǎn)錄盒被證明對于表達(dá)在真核生物細(xì)胞中的外來基因是高度有效的(Chapman等人，1991)。在轉(zhuǎn)錄盒中的克隆位點(diǎn)包括位于tPA前導(dǎo)基因上游區(qū)的ClaI位點(diǎn)、用于與tPA前導(dǎo)基因以符合讀碼框克隆的的NheI克隆位點(diǎn)以及用于在BGHpA之前克隆的XmnI、SmaI、RsrII、AvrII和BlnI克隆位點(diǎn)。
用來自于商用載體pZErO-2(Invitrogen、Carlsbad、CA)和真核生物表達(dá)載體pJW4303的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)片段，將ColE1復(fù)制基因、卡那霉素抗性基因和用于真核生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄控制元件結(jié)合為一個(gè)質(zhì)粒。(Lu等人，1997)。
來自于從核苷酸1319到核苷酸3178的pZErO2的一個(gè)1853bp片段包含ColE1復(fù)制起點(diǎn)和卡那霉素抗性基因。來自于從核苷酸376到核苷酸2416的pJW4303的一個(gè)2040bp片段包含帶有內(nèi)含子A的CMVIE啟動(dòng)子、組織溶酶原激活劑前導(dǎo)基因(tPA)的合成同系物和牛生長素多腺苷酸化位點(diǎn)(BGHpA)。通過用包含有SalI位點(diǎn)的寡核苷酸引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，片段被擴(kuò)增。與來于pZeRO2的卡那霉素抗性轉(zhuǎn)錄盒和來于pJW4303的真核生物轉(zhuǎn)錄盒以相反的轉(zhuǎn)錄方向的連接產(chǎn)物被鑒定以用于進(jìn)一步的發(fā)展。對這pGA載體親本的核苷酸計(jì)數(shù)從CMV啟動(dòng)子5′端的第一個(gè)堿基對開始。
通過對帶有5′端BamH1限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)和3′端XbaI限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)的391bp片段的PCR擴(kuò)增，T0終止子被導(dǎo)入到這個(gè)pGA載體的親本。片段起始的355bp是在從pJW4303轉(zhuǎn)錄盒衍生的BGHpA序列中的序列，緊接其后的合成的寡核苷酸上的36個(gè)堿基導(dǎo)入了T0序列和XbaI位點(diǎn)。被導(dǎo)入的T0終止子序列包含下列核苷酸序列5′-ATAAAAAACGCCCGGCGGCAACCGAGCGTTCTGAA-3′(SEQ ID NO)包含BamH1-XbaI片段的T0終止子替代在來自于pXeRO2和pJW4303質(zhì)粒的沒有T0終止子的同系物片段。產(chǎn)物經(jīng)過測序被證實(shí)為T0方向的序列。
于1755-1845核苷酸之間的真核生物轉(zhuǎn)錄盒的區(qū)域包含SIV nef的讀碼框的最后30bp。此區(qū)域通過在pGA的核苷酸1858產(chǎn)生突變并產(chǎn)生AvrII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)而將之從pGA中去除。自然發(fā)生的AvrII位點(diǎn)位于核苷酸1755。用AvrII酶水解然后用T4 DNA連接酶重新連接使得在1755-1845核苷酸之間的DNA的SIV片段被去除。為了便于克隆HIV-1序列，用位點(diǎn)定點(diǎn)誘變在bp1645和在bp1743的RsrII位點(diǎn)上，ClaI位點(diǎn)被導(dǎo)入pGA載體內(nèi)。此構(gòu)建體被序列分析驗(yàn)證。
實(shí)施例2pGA2的結(jié)構(gòu)和序列如圖3和圖4所示，除了缺失了來自CMVIE啟動(dòng)子的內(nèi)含子A序列外，pGA2與pGA1是相同的。通過在CMVIE啟動(dòng)子中的mRNA帽子位點(diǎn)下游8bp的位置引入ClaI位點(diǎn)，從pGA1產(chǎn)生了pGA2。用互補(bǔ)引物5′-CCGTCAGATCGCATCGATACGCCATCCACG-3′(SEQ IDNO)和5′-CGTGGATGGCGTATCGATGCGATCTGACGG-3′(SEQ IDNO)用寡核苷酸定點(diǎn)誘變法使ClaI位點(diǎn)被導(dǎo)入。
在新ClaI位點(diǎn)插入之后，pGA1被ClaI水解并從pGA1切除946bpClaI片段，然后重新連接產(chǎn)生pGA2。
實(shí)施例3pGA3的結(jié)構(gòu)和序列如圖5和圖6所示pGA3除了導(dǎo)入HindIII位點(diǎn)代替在核苷酸1645的ClaI位點(diǎn)和導(dǎo)入BamHI位點(diǎn)代替在核苷酸1743的RsrII位點(diǎn)外，pGA3與pGA1相同。
實(shí)施例4pGA3和pJW4303的比較表達(dá)和免疫原性要測定pGA質(zhì)粒作為疫苗載體的功效，可將pGA質(zhì)粒與先前描述的疫苗載體pJW4303做比較。pJW4303質(zhì)粒被用作在小鼠、兔子和恒河猴體中的DNA疫苗接種(Robinson等人，1999；Robinson等人，1997；Pertmer等人，1995；Feltquate等人，1997；T0rres等人，1999)。比較是這樣做的用帶有編碼普通的A/PR/8/34(H1N1)流感病毒血凝集素的質(zhì)膜形式的疫苗插入片段的pGA3(pGA3/H1)與編碼同樣片段的pJW4303(pJW4303/H1)做比較。pGA3和pJW4303在流感病毒H1序列的上游包含內(nèi)含子A。
pGA3/H1和pJW4303/H1疫苗質(zhì)粒在真核生物細(xì)胞中對H1表達(dá)的水平類似，總結(jié)如下
表5HA質(zhì)粒的體外表達(dá)水平
用2μg的質(zhì)粒對人胚胎腎臟293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，應(yīng)用捕獲抗原的酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)對上清液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物的H1進(jìn)行測定。捕獲的抗體是抗H1多克隆兔血清、可檢測抗體和多克隆抗H1小鼠血清。pGA3/H1表達(dá)的H1稍稍多于pJW4303/H1的表達(dá)[5.8HA單位對5.1H1單位(表6)]。正如所預(yù)期的，90％的H1抗原在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中。用pGA3/H1和pJW4303/H1進(jìn)行的比較免疫的研究揭示出，pGA3/H1比pJW4303/H1有相當(dāng)?shù)幕蚋玫拿庖咴?圖7)。在BALB/c小鼠中測定免疫原性。在此例中使用基因槍給小鼠接種包被有金衣的DNA顆粒。小鼠被引發(fā)免疫，用低劑量(0.1μg)或高劑量(1μg)的質(zhì)粒DNA加強(qiáng)免疫。在引發(fā)免疫后四周給予免疫增強(qiáng)。用pGA3/H1免疫接種與用pJW4303/H1相比，在免疫應(yīng)答中提高的抗H1 IgG的量相同或較高(圖7)。已證實(shí)，在增強(qiáng)免疫應(yīng)答上，pGA載體與pJW4303載體一樣有效或更有效。
實(shí)施例5在pGA載體中的免疫缺陷病毒疫苗插入片段表達(dá)顆粒病毒的免疫缺陷病毒疫苗插入片段在pGA1和pGA2得到發(fā)展。VLP插入片段是用分化體B HIV-1序列設(shè)計(jì)的，這樣它與在美國流行的HIV-1序列相配。在分化體B內(nèi)不同的分離物顯示出簇的多樣性，每個(gè)分離物與分化體共有序列有總的類似的多樣性(Subbarao，Schochetman，1996)。任何分化體B分離物都可用做其他分化體B分離物的代表序列。HIV-1分離物用不同的趨化因子受體作為共受體。絕大多數(shù)經(jīng)過傳播的病毒用CCR-5作共受體(Berger，E.A.，1997)。因此使用EnV將疫苗插入片段設(shè)計(jì)為具有CCR-5。通過HIV-1 DNA疫苗表達(dá)帶有R5-Env的VLP也具有支持病毒顆粒的Env介導(dǎo)的進(jìn)入到專門的抗原提呈細(xì)胞(APC)如樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中去的優(yōu)點(diǎn)。樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)由CCR-5-向性(R5)HIV-1Envs應(yīng)用的CD4受體和CCR-5共受體。通過在疫苗中使用R5 Env，在被轉(zhuǎn)染的非專門的APC(例如，角化細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)中被表達(dá)的VLP可通過Env-介導(dǎo)的進(jìn)入而得以進(jìn)入到APC的細(xì)胞質(zhì)中。在進(jìn)入到APC細(xì)胞質(zhì)之后，VLP可進(jìn)行類型I組織相容性抗原的加工和提呈。以DNA為基礎(chǔ)的免疫依賴于用于抗原提呈的專門的APC(Corr等人，1996；Fu等人，1997；Iwasaki A等人，1997)。許多以DNA為基礎(chǔ)的免疫是通過直接轉(zhuǎn)染專門的APC來完成的(Condon等人，1996；Porgador等人，1998)。被轉(zhuǎn)染的肌肉細(xì)胞或角化細(xì)胞可作為抗原制造廠，但其不能直接增強(qiáng)免疫應(yīng)答(Torres等人，1997)。通過用從被轉(zhuǎn)染的角化細(xì)胞或肌肉細(xì)胞釋放和裝配的然后又有活性地進(jìn)入專門的APC中的被表達(dá)的抗原，免疫的效率可被增強(qiáng)。
構(gòu)建pGA2/JS2的目標(biāo)是(i)獲得高度表達(dá)的使用CCR-5的分化體B VLP，(ii)產(chǎn)生非感染性的VLP(iii)將疫苗質(zhì)粒的大小減到最小。在構(gòu)建使用CCR-5-的VLP(pGA2/JS2)之后，JS2的衍生物被制備出來，它表達(dá)Env-不完全的VLP。質(zhì)粒插入片段被標(biāo)示為JS5。雖然預(yù)期此序列與包含Env的JS2 VLP相比效用較小，但不含Env的VLP提供了某些優(yōu)勢。其包括能監(jiān)控被接種的群體，通過監(jiān)測血清表型轉(zhuǎn)化為Env來實(shí)現(xiàn)。Env序列的缺失也減小了疫苗質(zhì)粒的大小。pGA2/JS2的DNA序列在圖17中表示，pGA1/JS5的DNA序列在圖18中表示。
正如在下表中表示的，為了獲得高度表達(dá)的VLP質(zhì)粒，侯選疫苗可從7種不同的HIV-1序列中構(gòu)建。
表I侯選疫苗插入片段的比較
最初的構(gòu)建體-pBH10-VLP是從在細(xì)菌體內(nèi)穩(wěn)定的和在真核生物細(xì)胞中高度表達(dá)的IIIb序列制備的。BH10序列是從NIH-贊助的AIDS體藏庫(catalog #90)中獲得的。親本的pBH10被用作PCR反應(yīng)的模板構(gòu)建pBH10-VLP。
所用引物被設(shè)計(jì)為能產(chǎn)生一個(gè)Gag-Rt PCR產(chǎn)物(5′PCR產(chǎn)物)，此產(chǎn)物包含從5′到3′的105bp的5′不翻譯的前導(dǎo)序列以及從Gag起始密碼子到RT編碼序列末端的gag和pol序列。寡核苷酸引物將ClaI位點(diǎn)導(dǎo)入到PCR產(chǎn)物的5′端以及將EcoRI和NheI位點(diǎn)導(dǎo)入到PCR產(chǎn)物的3′端。正義的引物1(5′-GAGCTCTATCGATGCAGGACTCGGCTTGC-3′(SEQ ID NO)和反義引物2(5′-GGCAGGTTTTAATCGCTAGCCTATGCTCTCC-3′(SEQ IDNO)被用于擴(kuò)增5′PCR產(chǎn)物。
HIV-1的env區(qū)域的PCR產(chǎn)物(3′PCR產(chǎn)物)包含vpu、tat、rev以及env序列和對于它們各自的mRNA的適當(dāng)加工和表達(dá)所必需的剪接受體位點(diǎn)。一個(gè)EcoRI位點(diǎn)被導(dǎo)入到此產(chǎn)物的5′端以及NheI和RsrII位點(diǎn)被導(dǎo)入到3′端。正義引物3(5′-GGGCAGGAGTGCTAGCC-3′(SEQID NO)和反義引物4(5′-CCACACTACTTTCGGACCGCTAGCCACCC-3′(SEQ ID NO)被用于擴(kuò)增3′PCR產(chǎn)物。
5′PCR產(chǎn)物在ClaI和NheI位點(diǎn)被克隆進(jìn)入pGA1，通過序列分析進(jìn)一步證實(shí)了構(gòu)建體的身份。3′PCR產(chǎn)物然后被插入到5′克隆體中的EcoRI和NheI位點(diǎn)產(chǎn)生了pBH10-VLP。此VLP的構(gòu)建結(jié)果產(chǎn)生缺少LTR、整合酶、vif和vpr序列的前病毒序列(見圖8A)。
由于BH10-VLP有X4而不是R5 Env，編碼六個(gè)不同的R5 Env的序列代替了在BH10-VLP中的env序列。這是通過將包含有來自不同的病毒基因組的tat、rev、vpu和env編碼序列的EcoRI至BamHI片段克隆進(jìn)入pBH10-VLP的而完成的。得到的env和rev序列是上述被代替序列和BH10序列的嵌合體(例見圖8B)。在ADA被膜的情況下，BamHI位點(diǎn)被導(dǎo)入到ADA序列以便用EcoRI到BamHI的片段代替BH10-VLP中的EcoRI到BamHI的區(qū)域(圖8)。在表1中總結(jié)了這些構(gòu)建的結(jié)果。六個(gè)被測定序列中的一個(gè)即6A-VLP被發(fā)現(xiàn)與在轉(zhuǎn)化細(xì)菌中質(zhì)粒生長不良有關(guān)。此質(zhì)粒不能在進(jìn)一步的疫苗發(fā)展中使用(表1)。
在于細(xì)菌中顯示生長良好的質(zhì)粒中，對VLP表達(dá)最好的是在ADA-VLP被發(fā)現(xiàn)的(表1)。在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中，與野生型前病毒對ADA或IIIb的表達(dá)相比，ADA-VLP的表達(dá)較高。表達(dá)也比以前的VLP-疫苗(dpol)的表達(dá)高，此VLP-疫苗曾成功地在恒河猴體內(nèi)引發(fā)了細(xì)胞毒性T-細(xì)胞應(yīng)答(Kent等人，1998)。
實(shí)施例6安全突變ADA-VLP一旦被鑒定為進(jìn)一步發(fā)展疫苗的良好侯選者，這個(gè)質(zhì)粒就要被突變以增加它在人體應(yīng)用的安全性。進(jìn)一步的突變使在NC的鋅指結(jié)構(gòu)無效，此鋅指結(jié)構(gòu)在被病毒衣殼包裹的病毒RNA中是有活性的；增加點(diǎn)突變還使病毒逆轉(zhuǎn)錄酶和蛋白酶失去活性(圖8)。下表概括總結(jié)了安全點(diǎn)突變的位置。
表2在pGA/JS2和pGA/JS5上的安全點(diǎn)突變的位置，點(diǎn)突變抑制病毒RNA的包裝和使逆轉(zhuǎn)錄酶在疫苗構(gòu)建體中失去活性
1氨基酸編號與在HIV-1 BH10序列中的個(gè)體基因相一致；2在野生型HIV-1 BH10序列中核苷酸編號依照生產(chǎn)廠商的操作規(guī)程使用定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene)進(jìn)行突變。所有突變已被序列分析所證實(shí)。誘變使用的引物對是(A)C15S ZN15′-GGTTAAGAGCTTCAATAGCGGCAAAGAAGGGC-3′(SEQ IDNO)C15S ZN2 5′-GCCCTTCTTTGCCGCTATTGAAGCTCTTAACC-3′(SEQ ID NO)(B)C36S ZN3 5′-GGGCAGCTGGAAAAGCGGAAAGGAAGG-3′(SEQ ID NO)C36S ZN4 5′-CCTTCCTTTCCGCTTTTCCAGCTGCCC-3′(SEQ IDNO)(C)D185N RT15′-CCAGACATAGTTATCTATCAATACATGAACGATTTGTATGTAGG-3′(SEQ ID NO)D185N RT25′-
CCTACATACAAATAGTTCATGTATTGATAGATAACTATGTCTGG-3′(SEQ ID NO)(D)W266T RT35′-GGGGAAATTGAATACCGCAAGTCAGATTTACCC-3′(SEQ IDNO)W266T RT4 5′-GGGTAAACTGACTTGCGGTATTCAATTTCCCC-3′(SEQ ID NO)(E)E478Q RT55′-CCCTAACTAACACAACAAATCAGAAAACTCAGTTACAAGC-3′(SEQ ID NO)E478Q RT65′-GCTTGTAACTGAGTTTTCTGATTTGTTGTGTTAGTTAGGG-3′(SEQ ID NO)(F)D25A Prt15′-GGCAACTAAAGGAAGCTCTATTAGCCACAGGAGC-3′(SEQID NO)D25Aprt2 5′-GCTCCTGTGGCTAATAGAGCTTCCTTTAGTTGCC-3′(SEQ ID NO)人們發(fā)現(xiàn)有鋅指結(jié)構(gòu)和RT突變的ADA-VLP對Gag和Env的表達(dá)比沒有突變的VLP質(zhì)粒更有效(圖10)。使蛋白酶基因失去活性的突變明顯降低了VLP的表達(dá)(圖10)，其未被選入用作疫苗質(zhì)粒的進(jìn)一步發(fā)展。沒有突變的ADA-VLP被標(biāo)示為JS1，帶有突變的ADA-VLP被標(biāo)示為JS2。
實(shí)施例7JS5疫苗插入片段的構(gòu)建JS5插入片段是表達(dá)Gag、RT、Tat和Rev的質(zhì)粒，其是通過缺失在ADA Env中的Bg1II片段由JS2構(gòu)建的(圖8)。此缺失從pGA2/JS2序列中除去了核苷酸4906-5486，其結(jié)果在env基因產(chǎn)生了早生的終止密碼子，這導(dǎo)致在Env的854個(gè)氨基酸當(dāng)中的269個(gè)被表達(dá)同時(shí)完整留下編碼RRE區(qū)域的tat、rev和vpu和剪接受體位點(diǎn)。在圖18表示出pGA1/JS5的DNA序列。
實(shí)施例8JS2和JS5疫苗質(zhì)粒體積的最小化JS2和JS5疫苗插入片段最初是在pGA1構(gòu)建的，pGA1是一在疫苗插入片段的上游包含CMVIE啟動(dòng)子的～1kb內(nèi)含子A的載體。為測定此內(nèi)含子對于疫苗的高水平表達(dá)是否必需，構(gòu)建了缺少內(nèi)含子A的pGA2載體來表達(dá)JS2和JS5疫苗插入片段。在表達(dá)測試中證明了pGA2有著與pGA1一樣好的對JS2的表達(dá)模式(圖11)。與此結(jié)果對照，pGA1對JS5的表達(dá)比pGA2有更大效力(圖11)。對于JS5插入片段，沒有內(nèi)含子A比有內(nèi)含子A的表達(dá)水平低2-3倍。
實(shí)施例9對在疫苗插入片段JS2和JS5中的安全突變效率的測試在RT(表2)的三個(gè)點(diǎn)突變完全消除了對JS2和JS5的逆轉(zhuǎn)錄酶活性的可測查水平。在逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被PCR擴(kuò)增的情況下，應(yīng)用高度敏感的逆轉(zhuǎn)錄酶測定(Yamamoto，F(xiàn)olks，Heneine，1996)。此測定可測查象10個(gè)那樣少的病毒顆粒中的逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶的測定可在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物上清液進(jìn)行。在JS1疫苗中對于10個(gè)那樣少的顆粒(p24的4×10-3pg)也容易測查出逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，但是對于JS2或JS5插入片段就不能測查出來。
在JS2和JS5疫苗插入片段中的缺失和鋅指結(jié)構(gòu)突變(表2)減少顆粒中病毒RNA水平至少1000倍。從瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液形成的顆粒被用來測定其病毒RNA的包裝效率。用DNase處理VLP，提取RNA并在RT PCR之前以p24水平標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)RNA的量。在RT PCR反應(yīng)之后用對病毒序列的專門引物進(jìn)行嵌套式PCR。VLP RNA的終點(diǎn)稀釋度與從在野生型HIV-1 Bal病毒中包裝的RNA獲得的信號進(jìn)行比較。
對JS2和JS5的包裝被在質(zhì)粒中的缺失限制達(dá)500-1000倍，概括如下表3在pGA2/JS2和pGA1/JS5 VLP中，病毒RNA的包裝被減少
鋅指結(jié)構(gòu)的突變將對JS2顆粒的包裝效率降低20倍，但是不進(jìn)一步影響對JS5顆粒的包裝效率。對獨(dú)立轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的顆?？稍佻F(xiàn)性地以這種模式包裝。
實(shí)施例10蛋白質(zhì)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析在圖12A-D中表示的蛋白質(zhì)印跡分析揭示了預(yù)期的pGA2/JS2和pGA1/JS5的表達(dá)模式。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中都可觀察到未成熟的和已成熟的蛋白質(zhì)，而僅僅Gag和Env的成熟形態(tài)可以在包含VLP的溶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)(圖12B和12C)。在細(xì)胞溶解產(chǎn)物中很容易探測出逆轉(zhuǎn)錄酶(圖12D)。
實(shí)施例11pGA2/89.6SHIV載體構(gòu)建最初的免疫原性實(shí)驗(yàn)是用表達(dá)SHIV的VLP來進(jìn)行的，而不是用表達(dá)HIV-1的疫苗質(zhì)粒。SHIV是猿和人免疫原性病毒序列的雜合體，它在恒河猴體內(nèi)生長很好(Li等人，1992)。通過用SHIV，可測定至少部分來源于HIV-1的疫苗在恒河猴模型中的效能。
pGA2/89.6(也標(biāo)示為pGA2/M2)表達(dá)來于SHIV-89.6的序列(Reimann、Li、Veazey等人，1996)。89.6Env代表一個(gè)患者的分離物(Collman等人，1992)。作為SHIV-89.6的高度病原性毒株，被定名為SHIV-89.6P病毒(Reimann、Li、Voss等人，1996；Reimann、Li、Veazey等人，1996)，SHIV-89.6P能使疫苗效能快速測定?？赏ㄟ^直腸和靜脈內(nèi)途徑給予SHIV-89.6P的攻擊。SHIV-89.6和SHIV-89.6P不能產(chǎn)生交叉中和抗體。
pGA2/89.6(圖13)有許多pGA2/JS2的設(shè)計(jì)特征。二者都能表達(dá)免疫缺陷病毒VLP由pGA2/89.6表達(dá)的VLP是SHIV VLP，而pGA2/JS2則為HIV-1VLP。在pGA2/89.6中的gag-pol序列來自于SIV239，而tat、rev和env序列來自于HIV-1-89.6。pGA2/89.6與pGA2/JS2的不同也在于，整合酶、vif和vpr序列沒有缺失以及逆轉(zhuǎn)錄酶基因沒有通過點(diǎn)突變失去活性。最后，在NC的鋅指結(jié)構(gòu)由于缺失而不是由于點(diǎn)突變才失去活性。
pGA1/Gag-Pol的構(gòu)建也使得Gag-Pol表達(dá)載體和Gag-Pol-Env表達(dá)性pGA2/89.6的保護(hù)效能可被評估。此載體是由pGA1/JS5和pGA2/89.6構(gòu)建的(圖13)。
實(shí)施例12pGA2/89.6SHIV質(zhì)粒的表達(dá)與pGA2/JS2表達(dá)的比較pGA2/89.6和pGA1/Gag-Pol表達(dá)Gag的水平與pGA2/JS2類似。對表達(dá)的比較研究在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞上進(jìn)行。對瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物和上清液的分析揭示，兩種質(zhì)粒對殼體抗原的表達(dá)水平類似(圖14)。用針對HIV-1p24和SIVp27的商用抗原捕獲ELISA試劑盒對殼體蛋白質(zhì)定量。
實(shí)施例13pGA2/89.6SHIV疫苗的實(shí)驗(yàn)方案恒河猴被用于調(diào)查系統(tǒng)DNA引發(fā)免疫然后用重組體MVA(rMVA)加強(qiáng)免疫對抗用SHIV-89.6P攻擊珠對粘膜攻擊的保護(hù)能力(Amara等人，2001)。
疫苗(pGA2/89.6)的DNA成分是如實(shí)施例11所描述的那樣制成的，其應(yīng)用免疫缺陷病毒的亞基因組剪接機(jī)制從單個(gè)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)了八個(gè)免疫缺陷病毒蛋白(SIV、Gag、Pol、Vif、Vpx、Vpr與HIV Env、Tat和Rev)。rMVA加強(qiáng)免疫劑(89.6-MVA)是由Dr.Bernard Moss(NIH)提供的，在疫苗病毒早/遲啟動(dòng)子的控制下其表達(dá)HIV89.6Env和SIV239Gag-Pol，并分別插入到MVA的缺失II和缺失III內(nèi)(Wyatt和Moss，未發(fā)表的結(jié)果)。89.6Env蛋白質(zhì)被截?cái)酁間p41的C-末端115氨基酸。經(jīng)修飾的H5啟動(dòng)子控制兩個(gè)外來基因的表達(dá)。
接種試驗(yàn)比較了DNA疫苗的皮內(nèi)和肌肉內(nèi)的施用，也比較了基因佐劑的效力；表達(dá)恒河猴GM-CSF的質(zhì)粒增強(qiáng)了疫苗插入片段引發(fā)的免疫應(yīng)答。在0和8周用DNA引發(fā)以及在第24周用rMVA加強(qiáng)免疫而完成了接種。為了進(jìn)行表達(dá)GM-CSF質(zhì)粒的共傳遞，用包含2.5mg的pGA2/89.6和2.5mg/ml的pGM-CSF的溶液進(jìn)行1-100μl的皮內(nèi)接種。
以兩種劑量(2.5mg和250μg的DNA)比較通過皮內(nèi)的和肌肉內(nèi)的對DNA的傳遞。通過皮內(nèi)或肌肉內(nèi)途徑用無針噴射注射器(Bioject，Portland OR)，六只恒河猴為一組的四個(gè)疫苗組由2.5mg(高劑量)或250μg(低劑量)的DNA引發(fā)。通過用針在皮內(nèi)和肌肉內(nèi)注射進(jìn)行89.6-MVA加強(qiáng)免疫接種(2×108pfu)。對照組包括兩個(gè)模擬免疫接種的動(dòng)物和兩個(gè)首次用來做實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物。接種的方案概括如下
表4接種試驗(yàn)
除了Nef被截?cái)嗟腖TR、2ndZN++鋅指結(jié)構(gòu)和被突變表達(dá)細(xì)胞表面Env，VLP DNA表達(dá)所有SHIV-89.6蛋白質(zhì)；gag-pol DNA表達(dá)SIVmac 239 gag-pol；MVA gag-pol-env表達(dá)89.6被截?cái)嗟膃nV和SIV mac239 gag-pol；MVA gag-pol表達(dá)SIV mac 239 gag-pol；MVA劑量是1×108pfu。
在用rMVA加強(qiáng)免疫后七個(gè)月，動(dòng)物被攻擊以測試是否疫苗產(chǎn)生了長期的免疫性。因?yàn)榇蟛糠諬IV-1感染是通過粘膜表面?zhèn)鲗?dǎo)的，直腸內(nèi)攻擊用以測試是否疫苗能控制粘膜免疫缺陷病毒的攻擊。簡言之，攻擊(病毒RNA的5.7×109拷貝/ml)是通過一次i.v.，隨后對經(jīng)過初次SHIv-89.6P攻擊的恒河猴直腸內(nèi)攻擊進(jìn)行的。淋巴細(xì)胞是從高峰時(shí)期的病毒血癥感染動(dòng)物直腸中取得的，排除CD8的和用分裂素刺激生產(chǎn)的。在進(jìn)行直腸內(nèi)攻擊之前，將禁食動(dòng)物麻醉(鹽酸氯胺酮，10mg/kg)，然后將其胃朝下骨盆區(qū)域稍稍抬高放置。將喂食管[8Fr(2.7mm)×16英寸(41cm)，Sherwood Medical，St.Louis，MO]插入到直腸15-20cm的距離。插入喂食管后，將注射器[其中裝有在2mlRPMI-1640加10％胎牛血清(FBS)中的20倍直腸感染劑量]系在喂食管上，接種物緩緩注入到直腸內(nèi)。在傳遞了接種物之后，用沒有胎牛血清的3.0ml RPMI沖洗喂食管，然后慢慢將其拔出。在接種后10分鐘內(nèi)將骨盆區(qū)域緩緩抬起，再將動(dòng)物挪開。
實(shí)施例14疫苗增強(qiáng)的T-細(xì)胞應(yīng)答在DNA引發(fā)后再用rMVA加強(qiáng)免疫產(chǎn)生了高頻率的對病毒的專一性T細(xì)胞，如圖15所示，其在使用rMVA加強(qiáng)免疫后一周達(dá)到高峰。用Mamu-A*01-四聚體測定識(shí)別Gag-CM9抗原決定簇的T細(xì)胞頻率；用重疊Gag和Env肽和酶聯(lián)免疫點(diǎn)(ELISPOT)測定識(shí)別全部Gag和Env抗原決定簇的T細(xì)胞頻率。
對于四聚體的分析，大約1×106PBMC是抗體進(jìn)行了表面染色，這些抗體是分別與FITC、PerCP和APC結(jié)合的抗CD3(FN-18，BiosourceInternational，Camarillo，CA)、抗CD8(SK1，Becton Dickinson、SanJose，CA)和抗Gag-CM9(CTPYDINQM)-Mamu-A*01四聚體的抗體(染色容積100μl，溫度8-10℃，30分鐘)。用冷的包含2％FBS的PBS沖洗細(xì)胞兩次，用在PBS中的1％多聚甲醛對其固定，在24小時(shí)內(nèi)以FACScaliber(Becton Dickinson，San Jose，CA)獲得分析結(jié)果。用前擴(kuò)散器和側(cè)擴(kuò)散器使細(xì)胞最初分離出淋巴細(xì)胞群，然后再分離出CD3細(xì)胞。然后分析CD3細(xì)胞以找出CD8和四聚體結(jié)合細(xì)胞。每個(gè)樣本大約獲得150000淋巴細(xì)胞。用FloJo軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析(Tree Star，Inc.San Carlos，CA)。
對于IFN-γ ELISPOT，于8-10℃下，以碳酸氫鈉緩沖液(pH9.6)中濃度為2μg/ml的抗人IFN-γ抗體(Clone B27，Pharmingen，SanDiego，CA)對MULTISCREEN 96孔過濾板(Millipore Inc.Bedford，MA)包被過夜。用RPMI培養(yǎng)液沖洗過濾板兩次，然后用完全培養(yǎng)基(包含10％FBS的RPMI)在37℃下封閉一小時(shí)。用純RPMI培養(yǎng)液沖洗過濾板五次以上，細(xì)胞被接種于100μl完全培養(yǎng)基上，其數(shù)目從每孔2×104到每孔5×105個(gè)細(xì)胞，每板設(shè)一重復(fù)。將肽庫加入到每個(gè)孔使最終濃度為在100μl容積的完全培養(yǎng)基中每肽2μg/ml。在37℃與5％CO2條件下細(xì)胞被培養(yǎng)36小時(shí)。用沖洗緩沖液(含0.05％Tween-20的PBS)沖洗過濾板六次，然后將其與用包含2％FBS沖洗緩沖液稀釋的每毫升1μg的生物素化的抗人IFN-γ抗體(clone 7-86-1，Diapharma Group Inc.，West Chester，OH)一起保溫。在37℃下板被保溫2小時(shí)，后用沖洗緩沖液沖洗六次。在每個(gè)孔中加入親合素-HRP(Vector Laboratories Inc，Burlingame，CA)并在37℃下保溫30-60分鐘。將板用沖洗緩沖液沖洗六次，用穩(wěn)定的DAB作為底物使樣點(diǎn)擴(kuò)展(Research Genetics Inc，Huntsville，AL)。用立體解剖顯微鏡對樣點(diǎn)計(jì)數(shù)。在每個(gè)分析中包括作為對照的卵清白蛋白肽(SIINFEKL)。卵清白蛋白肽的本底樣點(diǎn)一般每5×105PBMC小于5。當(dāng)用1×106PBMC標(biāo)準(zhǔn)化時(shí)本底小于10。只有兩次本底的ELISPOT計(jì)數(shù)(≥20)才被認(rèn)為是有效的。因?yàn)樵跊]有飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下(34)細(xì)胞的不同稀釋有不同的樣點(diǎn)形成效率，ELISPOT的頻率是大約數(shù)。細(xì)胞的相同稀釋被用于給定時(shí)間點(diǎn)的所有動(dòng)物，但是不同的稀釋被用于探測記憶和高峰期的效應(yīng)應(yīng)答。
簡單的線形回歸被用于估計(jì)加強(qiáng)免疫后和攻擊后ELISPOT應(yīng)答之間，記憶和攻擊后ELISPOT應(yīng)答之間和對數(shù)病毒負(fù)載和接種組內(nèi)ELISPOT頻率之間的相關(guān)性。用對數(shù)病毒負(fù)載和對數(shù)ELISPOT應(yīng)答，通過2-樣本t-檢驗(yàn)進(jìn)行疫苗組和對照組之間的比較。用2-樣本t-檢驗(yàn)，進(jìn)行了A*01和無A*01恒河猴之間的ELISPOT或?qū)?shù)病毒負(fù)載的比較。根據(jù)高峰期DNA/MVA ELISPOT，記憶DNA/MVA ELISPOT，和對數(shù)轉(zhuǎn)化的Gag抗體數(shù)據(jù)，用雙因素方差分析的方法檢測所給予劑量和途徑的效力。
Gag-CM9四聚體分析僅限于恒河猴，它表達(dá)Mamu-A*01組織相容性類型，而ELISPOT應(yīng)答不依賴專一性的組織相容性類型。T細(xì)胞隨時(shí)間的變化的測定用作記錄T細(xì)胞應(yīng)答的急性狀態(tài)(效應(yīng)細(xì)胞高峰)和長期(記憶)狀態(tài)(圖15A)。正如所預(yù)期的，DNA免疫接種產(chǎn)生了了低水平的記憶細(xì)胞，其在用rMVA加強(qiáng)免疫后一周內(nèi)增加為高頻率(圖15)。在Mamu-A*01恒河猴中，對Gag-CM9抗原決定簇的專一性細(xì)胞增加到高達(dá)CD8 T細(xì)胞總數(shù)的19％的比率(見圖15B動(dòng)物2)。專一性細(xì)胞的峰值經(jīng)過一次＞10倍的收縮變成DNA/MVA記憶庫(圖15A和B)。在收縮成DNA/MVA記憶應(yīng)答之前，三個(gè)Gag肽庫的ELISPOT也經(jīng)過大量的膨脹(頻率達(dá)到每1×106PBMC為4000點(diǎn))(圖15C)。在有和沒有A*01的組織相容性類型的恒河猴體中ELISPOT的頻率是相同的(p＞0.2)。在疫苗應(yīng)答的高峰和記憶狀態(tài)在不同疫苗組的ELISPOT高度的排列順序是2.5mg i.d.＞2.5mgi.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.(圖15C)。IFN-γELISPOT包括CD4和CD8細(xì)胞(工作在進(jìn)行中)。在用肽再刺激之后，Gag-CM9-專一性CD8細(xì)胞具有良好的溶胞活性(沒有顯示數(shù)據(jù))。
給人印象深刻的是，在動(dòng)物遠(yuǎn)系交配的種群中所有Gag和Env肽均刺激IFN-γELISPOT反應(yīng)(圖16A)。在用rMVA加強(qiáng)免疫后25周，疫苗免疫產(chǎn)生的T細(xì)胞處于記憶中時(shí)，對細(xì)胞應(yīng)答的寬度進(jìn)行測試。七個(gè)Gag肽庫中的7個(gè)和21個(gè)Env肽庫中的16個(gè)可被被接種動(dòng)物體中的T細(xì)胞識(shí)別。5個(gè)Env庫不被識(shí)別，其中2個(gè)于美國疾病控制中心在恒河猴DNA/MVA疫苗試驗(yàn)中被識(shí)別(未顯示數(shù)據(jù))。其余的三個(gè)(19-21庫)在我們的免疫原中被截?cái)?Amara等人，2001，已提供)，其作為陰性對照。Gag和Env ELISPOT在DNA/MVA記憶應(yīng)答中全都具有類似的頻率(圖16B)。應(yīng)答的最大的寬度是在高劑量i.d.DNA引發(fā)免疫的動(dòng)物中，在那里平均10個(gè)肽庫(4.5Gag和5.3Env)被識(shí)別。疫苗組的應(yīng)答寬度排列順序與DNA/MVA應(yīng)答高度排列順序相同2.5mg i.d.＞2.5mg i.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.(圖16B)。
實(shí)施例15AIDS的攻擊和對抗保護(hù)在用rMVA加強(qiáng)免疫后當(dāng)疫苗免疫產(chǎn)生的T細(xì)胞已記憶時(shí)，通過直腸給予高病原性SHIV-89.6P攻擊(圖15)。
SHIV拷貝數(shù)目的測定用QIAamp病毒RNA試劑盒(Qiagen)直接提取150μl ACD抗凝血血漿中的病毒RNA，將其在60μl AVE緩沖液中洗脫，在-80℃下冰凍直到對SHIV RNA進(jìn)行定量。在包含有50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，4mM MgCl2，1mM各dNTP，2.5μM隨機(jī)六聚物，20單位MultiScribe RT和8單位RNA酶抑制劑的20μl的體積中，將5μl提純的血漿RNA逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)在25℃保溫10分鐘，在然后在42℃保溫20分鐘99℃下將逆轉(zhuǎn)錄酶去活性5分鐘。將反應(yīng)混合物最后調(diào)節(jié)到50μl容積，其中包含50mM KCl，10mM Tris-HCl，pH8.3，4mM MgCl2，0.4mM各dNTP，0.2μM正向引物，0.2μM反向引物，0.1μM探針和5單位AmpliTaq Gold DNA聚合酶(所有試劑來源于Perkin Elmer Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)。在SIV gag基因的保守區(qū)內(nèi)的引物序列與以前描述的相同(Staprans，S，等人，1996)。
將Perkin Elmer Applied Biosystems 7700型序列探測器與PCR程序一起應(yīng)用95℃下10分鐘，然后在93℃下30秒，59.5℃下1分鐘，40個(gè)循環(huán)。用7700序列探測器和針對內(nèi)部保守的gag基因序列的探針檢測PCR產(chǎn)物，在此處FAM和Tamra表示報(bào)告和猝滅染料。SHIVRNA拷貝數(shù)目是通過對由病毒體衍生的用SIV bDNA方法定量的SIVmac239 RNA組成的外部標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來測定的(BayerDiagnostics，Emeryville，CA)。所有樣品的提取和擴(kuò)增都設(shè)有重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用平均結(jié)果報(bào)告的。血漿輸入量為0.15ml，測定的敏感性為每毫升血漿103拷貝RNA，線形動(dòng)力學(xué)范圍是103到108RNA拷貝(R2＝0.995)。對每毫升包含大于104SHIV RNA拷貝的樣本，內(nèi)測定變異系數(shù)小于20％；對每毫升包含103-104SHIV RNA拷貝的樣本則小于25％。為了更準(zhǔn)確地對在被接種16和20周的動(dòng)物中低SHIV RNA拷貝數(shù)目定量，可以進(jìn)行下列調(diào)整以增加SHIV RNA測定敏感性1)用離心方法(23000g，10℃，150分鐘)將來源于小于或等于1毫升的血漿的病毒顆粒濃縮，提取病毒RNA；2)應(yīng)用一步RT-PCR方法。通過與相同的SIVmac239標(biāo)準(zhǔn)比較，SHIV RNA拷貝的絕對數(shù)被測定。這些改變提供了每毫升300SHIV RNA拷貝的可靠定量限度并給出了SHIV RNA值，其與通過應(yīng)用第一種方法獲得的值高度相關(guān)(r＝0.91，p＜0.0001)。
攻擊結(jié)果攻擊感染了所有被接種的和對照組動(dòng)物。但是，在攻擊后兩周疫苗組(幾何平均數(shù)1×107到5×107)比對照組動(dòng)物(幾何平均數(shù)4×108)的血漿病毒RNA的效價(jià)至少低10倍(圖19A)。在攻擊后8周高劑量DNA引發(fā)組和低劑量i.d.DNA引發(fā)組幾何平均數(shù)負(fù)載減少到大約每毫升1000病毒RNA拷貝。在這時(shí)低劑量i.m.DNA引發(fā)組的幾何平均數(shù)為6×103病毒RNA拷貝，沒接種的對照組幾何平均數(shù)為2×106。在攻擊后20周即使低劑量的i.m.組的平均數(shù)也減少到了1000病毒RNA拷貝。在這時(shí)，未接種的對照組死于艾滋病。在24個(gè)被接種動(dòng)物中僅有一個(gè)動(dòng)物(低劑量i.m.組)出現(xiàn)間歇性的病毒負(fù)載達(dá)每毫升1×104拷貝以上(圖19D)。
病毒負(fù)載的迅速減少保護(hù)被接種的恒河猴避免CD4細(xì)胞的損失和艾滋病的的迅速發(fā)作(圖19B、19C、19E)。攻擊后5周所有未接種的對照組經(jīng)受了CD4細(xì)胞的大量損耗，這是SHIV-89.6P感染的特征(圖19B)。除了動(dòng)物22(見上面)經(jīng)受CD4的緩慢下降外，所有被接種動(dòng)物都保持了它們的CD4細(xì)胞(圖19E)。在攻擊后23周，四個(gè)對照動(dòng)物中的三個(gè)死于艾滋病(圖19C)。這些動(dòng)物不同程度上患有伴有腹瀉的小腸結(jié)腸炎、隱孢子蟲病、大腸桿菌性膀胱炎、小腸彎曲菌感染、淋巴結(jié)病和與SIV相關(guān)的巨細(xì)胞肺炎。與此對照的是，所有24個(gè)被接種動(dòng)物都保持健康。
細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的測定大約1×106PBMC在37℃下被刺激一小時(shí)，其置于5ml聚丙烯試管中，其中有在體積為100μl的RPMI中的每毫升100μg的Gag-CM9肽(CTPYDINQM)，并包含0.1％BSA和抗人CD28和抗人CD49d(Pharmingen，Inc.San Diego，CA)共刺激抗體(1μg/ml)。加入包含10％FBS和莫能菌素(10μg/ml)的900μlRPMI，細(xì)胞于37℃，5％CO2下，于5°角被再培養(yǎng)5小時(shí)。在8-10℃下用偶聯(lián)于PerCP(clone SK1，Becton Dickinson)的抗CD8的抗體對細(xì)胞表面染色30分鐘，用包含2％FBS的冷PBS沖洗兩次，用Cytofix/Cytoperm(Pharmingen，Inc.)溶液固定和透化。然后將細(xì)胞與分別連接于FITC和PE的抗人CD3(clone FN-18，BiosourceInternational，Camarillo，CA)和抗IFN-γ(Clone B27，Pharmingen)的抗體一起置于Perm沖洗液(Pharmingen)于4℃保溫30分鐘。將細(xì)胞用Perm沖洗兩次，用純PBS沖洗一次，并重懸浮于PBS中的1％多聚甲醛中。用FACS caliber獲得大約150000個(gè)淋巴細(xì)胞，用FloJo軟件分析。
增殖測定用適當(dāng)抗原刺激大約20萬PBMC，一式三份，于37℃，在5％CO2下，于200μl的包含10％FCS的RPMI中5天。來自于由表達(dá)SHIV-89.6Gag和Pol或表達(dá)SHIV-89.6Gag、Pol和Env的DNA轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞的懸浮液被直接用作抗原。來自于模擬DNA(僅為載體)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的懸浮液被用作陰性對照。在第6天，每孔用1μCi的氚標(biāo)記胸苷脈沖細(xì)胞16-20小時(shí)。用自動(dòng)細(xì)胞采集器(TOMTEC，Harvester 96，Model 1010，Hamden，CT)采集細(xì)胞，再用Wallac 1450MICROBETA閃爍計(jì)數(shù)器(Gaithersburg，MD)計(jì)數(shù)。刺激指數(shù)是摻入到受89.6抗原刺激的PBMC的氚標(biāo)記胸苷的計(jì)數(shù)除以摻入到受模擬抗原刺激的同樣PBNC的氚標(biāo)記胸苷的計(jì)數(shù)。
攻擊后T細(xì)胞結(jié)果病毒攻擊的抑制與抗病毒的T細(xì)胞發(fā)生有關(guān)(圖15；圖20A)。攻擊后一周外周血的四聚體+細(xì)胞的頻率降低，有可能反映出對感染位點(diǎn)的專一性T細(xì)胞得到補(bǔ)充(圖20A)。但是，在攻擊后兩周外周血的細(xì)胞迅速擴(kuò)增，其頻率同用MVA加強(qiáng)免疫后一樣高甚至更高(圖15，20A)。大多數(shù)四聚體+細(xì)胞產(chǎn)生了IFN-γ以應(yīng)答用肽Gag-CM9的6小時(shí)的刺激(圖20B)，它們沒有有時(shí)在慢性病毒感染中觀察到的“被震暈”的IFN-γ負(fù)表型。攻擊后T細(xì)胞的發(fā)生伴隨著病毒負(fù)載的下降。攻擊后12周呈現(xiàn)的病毒專一性T細(xì)胞約為它們高峰時(shí)的十分之一(圖15A、20A以及未表示的數(shù)據(jù))。DNA/MVA誘導(dǎo)的ELISPOT峰值的高度預(yù)示了如用ELISPOT(r＝+0.79，P＜0.0001)測量的一樣的攻擊后T細(xì)胞應(yīng)答的高度。與在被接種動(dòng)物中強(qiáng)有力的次級應(yīng)答相對照，在首次用來作實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物中，只是初級應(yīng)答有了少量增長(圖15B、15C和20A)。四聚體+細(xì)胞的峰值比所有CD8細(xì)胞的1％還少(圖20A)，產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞呈現(xiàn)出大約300的平均頻率，而在被接種組中呈現(xiàn)出1000到6000的高得多的頻率(圖15C)(P＜0.05)。在用Gag-CM9肽刺激后，對照組的大部份細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，這與被接種組的相同(圖20B)。在攻擊后12周，4個(gè)對照動(dòng)物中的三個(gè)已測查不出產(chǎn)生IFN-γ的T細(xì)胞(數(shù)據(jù)未表示)。在存在高病毒負(fù)載的情況下，抗病毒的CD8細(xì)胞的迅速丟失可反映出缺少CD4的幫助。
T細(xì)胞增殖性應(yīng)答顯示，病毒專一性CD4細(xì)胞在攻擊后存活下來，并能夠支持抗病毒免疫應(yīng)答(圖20C)。在攻擊后12周，Gag-Pol-Env或Gag-Pol蛋白的平均刺激指數(shù)在被接種組為從35到14，但在對照組是探測不出的。與增殖測定一致，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子測定也顯示，在被接種動(dòng)物有病毒專一性CD4細(xì)胞但在對照組沒有(未顯示數(shù)據(jù))。增殖性應(yīng)答量在所有被接種疫苗組的排列順序是2.5mg i.d.＞2.5mgi.m.＞250μg i.d.＞250μg i.m.
淋巴結(jié)的保持在攻擊后12周，被接種動(dòng)物的淋巴結(jié)在形態(tài)上是完整的，其對感染是有應(yīng)答的；而被感染的對照動(dòng)物的淋巴結(jié)功能已被破壞(圖5)。被接種動(dòng)物的淋巴結(jié)包含大量反應(yīng)性次級囊泡，膨大的生發(fā)中心和分散的暗帶與亮帶(圖5A)。與此對照，未被接種的對照動(dòng)物的淋巴結(jié)顯示囊泡和副皮質(zhì)的缺失(圖5B)，而未被接種也未被攻擊的動(dòng)物的淋巴結(jié)顯示了最低限度反應(yīng)性生發(fā)中心的正常數(shù)目(圖5C)。在感染的對照動(dòng)物中，生發(fā)中心占據(jù)的淋巴結(jié)區(qū)域小于0.05％，在未感染的動(dòng)物中占據(jù)2％，在被接種動(dòng)物組中可高達(dá)18％(圖5D)。被生發(fā)中心占據(jù)的淋巴結(jié)區(qū)域在接受低劑量DNA引發(fā)的動(dòng)物中比接受高劑量引發(fā)的動(dòng)物高兩倍，這一點(diǎn)提示在低劑量動(dòng)物中有更強(qiáng)有力的免疫反應(yīng)性(圖5D)。在攻擊后12周，在24個(gè)被接種的恒河猴中有3個(gè)其淋巴結(jié)中，病毒RNA原位雜交發(fā)現(xiàn)少量的病毒表達(dá)細(xì)胞，而在每一個(gè)被感染對照動(dòng)物的淋巴結(jié)中都很容易檢測出病毒表達(dá)細(xì)胞(圖5E)。在CD4 T細(xì)胞大量損耗的對照組中，被感染淋巴結(jié)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)與巨噬細(xì)胞的表型是一致的(未表示數(shù)據(jù))。
抗體隨時(shí)間的應(yīng)答總的抗Gag抗體的ELISA采用細(xì)菌產(chǎn)生的SIV gag p27來包被孔(于碳酸氫鹽緩沖液中，2μg/ml)?？笶nv抗體的ELISA采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞產(chǎn)生的89.6Env，其可用抗Env綿羊抗體捕獲(產(chǎn)品目錄號6205；International Enzymes，F(xiàn)airbrookCA)。采用SHIV-89.6感染的恒河猴的血清和已知量的抗Gag和抗Env免疫球蛋白，產(chǎn)生了Gag和Env的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。用山羊抗恒河猴IgG-PO(產(chǎn)品編號# YNGMOIGGFCP，Accurate Chemical，Westbury，NY)和TMB底物(產(chǎn)品編號# T3405，Sigma，St.Louis，MO)可測查結(jié)合的抗體。在一式兩份的孔中血清被3倍稀釋，測定。在乳清緩沖液(4％乳清和0.1％Tween20于1X PBS中)中將測試的血清進(jìn)行稀釋。封閉緩沖液由乳清緩沖液加0.5％無脂肪干奶組成。用2MH2SO4使反應(yīng)停止，光密度讀數(shù)在450nm。用SOFTmax 2.3軟件(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每毫升血清的抗體量(μg)作為樣本濃度插入圖中。
結(jié)果顯示，引發(fā)/加強(qiáng)免疫的方法產(chǎn)生了低水平的抗Gag抗體和幾乎檢則不到的抗Env抗體的水平(圖22)。但是在攻擊后對Env和Gag的抗體經(jīng)過了回憶應(yīng)答，Gag抗體總量達(dá)到接近每毫升1mg，Env抗體總量高達(dá)每毫升100μg(圖22A和B)。
攻擊后兩周，在高劑量DNA引發(fā)免疫組，對89.6免疫原的中和抗體顯示為(幾何平均效價(jià)在i.d.組為352，在i.m.組為303)(圖22C)出現(xiàn)，而SHIV-89.6P攻擊組沒有出現(xiàn)。攻擊后5周對89.6P的中和抗體產(chǎn)生了(在高劑量i.d.組幾何平均效價(jià)為200，在高劑量i.m.組為126)(圖22D)，對89.6的中和抗體開始下降。這樣，抗89.6的抗體應(yīng)答的引發(fā)沒有阻礙導(dǎo)致抗SHIV-89.6P的中和抗體的B細(xì)胞應(yīng)答。在攻擊后16到20周，抗Gag和Env的抗體在大多數(shù)動(dòng)物中下降了(圖22A和B)。這和對病毒感染的對照是一致的。
與保護(hù)相關(guān)的T細(xì)胞。在攻擊后兩周和三周血漿病毒RNA水平與攻擊前DNA/MVA-產(chǎn)生的IFN-γ ELISPOT的峰頻率負(fù)相關(guān)(分別為r＝-0.53，P＝0.008和r＝-0.70，P＝0.0002)(圖23A)。
重要的是，這些相關(guān)性是在免疫應(yīng)答正有效減少病毒血癥水平的時(shí)候觀察到的。在攻擊后的較后時(shí)間，在檢測水平或之下的病毒負(fù)載組排除了相關(guān)性。也尋找了在病毒負(fù)載與攻擊后的ELISPOT、增殖性應(yīng)答和中和性抗體應(yīng)答之間的相關(guān)性。在攻擊后兩周，IFN-γ ELISPOT水平與攻擊后三周的病毒負(fù)載相關(guān)(r＝-0.51，P＝0.009)(數(shù)據(jù)未表示)。攻擊后的增殖性和中和性抗體應(yīng)答與病毒負(fù)載無關(guān)。
劑量和途徑對于細(xì)胞和體液應(yīng)答DNA的劑量有顯著影響(P＜0.05)，而DNA的施用途徑僅對體液應(yīng)答有顯著影響(圖23C-E)。在產(chǎn)生抗Gag抗體方面，DNA的皮內(nèi)傳遞途徑比肌肉內(nèi)傳遞途徑的效果大約強(qiáng)10倍(P＝0.02)(圖23E)。在我們所給的數(shù)據(jù)中，i.d.DNA注射在引發(fā)病毒專一性T細(xì)胞的高度和寬度上大約有效3倍多(圖23C和D)。但這些不同并不顯著(高度，P＝0.2；寬度，P＝0.08)。有趣的是，DNA的途徑和劑量對保護(hù)水平無重要影響。在攻擊后20周，高劑量DNA引發(fā)的動(dòng)物(7×102和5×102)比低劑量DNA引發(fā)的動(dòng)物的病毒RNA(9×102和1×103)的幾何平均水平稍低。有最高間歇性病毒負(fù)載的動(dòng)物(恒河猴22)是在低劑量i.m.引發(fā)組(圖19D)。這樣，緩慢控制病毒血癥的低劑量i.m.引發(fā)組(圖19A)可能有較差的長期保護(hù)。應(yīng)答的寬度對抑制病毒負(fù)載沒有立即的影響，但隨著時(shí)間，也可能影響到病毒逃避的頻率。
這些結(jié)果清楚地顯示，多蛋白DNA/MVA疫苗可以增強(qiáng)記憶免疫應(yīng)答，其能控制高毒性粘膜免疫缺陷病毒攻擊。其對病毒控制的優(yōu)良水平比迄今為止僅用DNA或rMVA疫苗(Egan等人，2000；I.Ourmanov等人，2000)達(dá)到的水平要更高，這也與用白細(xì)胞介素-2輔助的DNA免疫(Barouch等人，2000)所獲得的水平不相上下。所有這些以前的研究都用到三次以上疫苗的接種，沒有應(yīng)用粘膜攻擊并且大部分是在高峰期效應(yīng)物應(yīng)答時(shí)進(jìn)行攻擊，而沒考慮到如我們的研究中所做的那樣延長接種后的測試時(shí)期以測定長期效用。我們的結(jié)果也第一次證明，如用IFN-γ ELISPOT所度量的，疫苗免疫產(chǎn)生的T細(xì)胞與控制病毒血癥相關(guān)?，F(xiàn)在這個(gè)比較簡單的測定可應(yīng)用于HIV-1的DNA和MVA免疫原臨床前期的評估，也能用于作為人類臨床試驗(yàn)功效的標(biāo)記。
DNA/MVA疫苗不能預(yù)防感染。然而疫苗迅速地減少病毒負(fù)載到接近每毫升血液有1000個(gè)病毒RNA拷貝或在其以下，因而控制了感染。抑制而非預(yù)防感染使病毒有機(jī)會(huì)建立慢性感染(Chun等人，1998)。然而通過迅速減少病毒負(fù)載，多蛋白DNA/MVA疫苗可長期抑制病毒感染的進(jìn)展并限制HIV傳染。
實(shí)施例16Gag-Pol疫苗試驗(yàn)用表達(dá)Gag-Pol而非Gag-Pol-Env的免疫原對在疫苗中包含Env的重要性進(jìn)行測定(見圖27的構(gòu)建體)。不包括Env的疫苗在某方面(例如，篩選作為感染標(biāo)記的抗Env抗體的能力)有一定的優(yōu)勢。此試驗(yàn)應(yīng)用pGA1/Gag-Pol和表達(dá)SIV239的Gag-Pol序列的rMVA(MVA/Gag-Pol)(由Dr.Bernard Moss提供)(NIH-NIAID)。
按上面實(shí)施例13中描述的針對“Gag-Pol-Env”(pGA2/89.6MVA89.6)免疫原的方案施用“Gag-Pol”免疫原(見表4中的5和6組)。以同樣的DNA劑量(2.5mg和250μg)用于引發(fā)高劑量和低劑量組，通過皮內(nèi)途徑施用。如前面實(shí)施例13-15中描述的疫苗試驗(yàn)，在每個(gè)試驗(yàn)組中包括2-3只mamu A*01恒河猴。如上文實(shí)施例所描述的，用pllc-m四聚體和被重疊肽庫刺激的ELISPOT，對那些對plle-m抗原決定簇有專一性的T細(xì)胞產(chǎn)生了T細(xì)胞應(yīng)答。
免疫接種后，疫苗受體顯示了類似于在Gag-Pol-Env疫苗試驗(yàn)中觀察到的抗Gag T細(xì)胞應(yīng)答。在用rMVA加強(qiáng)免疫之后7.5月，將動(dòng)物用SHIV-89.6P直腸內(nèi)攻擊(圖28)。與保護(hù)動(dòng)物免受CD4細(xì)胞快速丟失的Gag-Pol-Env疫苗的方案不同，Gag-Pol動(dòng)物全都丟失CD4細(xì)胞(圖28B和28D)。在接受低劑量i.d.DNA引發(fā)的組中，丟失是最明顯的。與CD4細(xì)胞的丟失一致，與Gag-Pol-Env組相比，Gag-PolDNA接種組在減少它們病毒負(fù)載上也效力不高(圖28A和28C)。這些組的幾何平均病毒負(fù)載在攻擊后3周高10-100倍，在攻擊后5周高10倍。這些結(jié)果證明，在被攻擊動(dòng)物體中，Env基因在保護(hù)CD4細(xì)胞和減少病毒RNA水平方面起著重要作用。結(jié)果也顯示，在保護(hù)受體對抗病毒攻擊上Gag-Pol-Env DNA/MVA疫苗比Gag-PolDNA/MVA疫苗更有效。
實(shí)施例17麻疹插入片段表達(dá)麻疹H和C3d補(bǔ)體成分融合蛋白的DNA疫苗被用于測定接種是否能夠獲得更早的和更有效的抗H抗體應(yīng)答。在以前Dempsey等人所做的小鼠研究中，兩個(gè)或三個(gè)拷貝的C3d與模型抗原雞卵溶菌酶的融合體增強(qiáng)了免疫效率1000多倍(Dempsey等人，1996)。這導(dǎo)致了更快出現(xiàn)血凝反應(yīng)的抑制(HI)活性和保護(hù)性免疫(Ross等人，2000和Ross等人，2001)。
在人免疫系統(tǒng)中，補(bǔ)體活化的一個(gè)結(jié)果是第三補(bǔ)體蛋白C3d片段與對活化蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合。C3d轉(zhuǎn)而結(jié)合B淋巴細(xì)胞上的CD21，它是具有能擴(kuò)大B淋巴細(xì)胞活性的B細(xì)胞刺激功能的分子。在麻疹H-C3d融合蛋白中，融合體的H部分將結(jié)合于B細(xì)胞上的抗H Ig受體和通過B細(xì)胞受體傳遞信號，而融合體的C3d部分將結(jié)合于CD21并通過CD19傳遞信號。在這個(gè)假說中，對H-C3d融合蛋白的B細(xì)胞應(yīng)答將比僅僅對單獨(dú)H的B細(xì)胞應(yīng)答更有效。用表達(dá)結(jié)合三個(gè)C3d拷貝的分泌型H融合蛋白(sH-3C3d)的DNA疫苗接種的小鼠比僅表達(dá)sH的DNA疫苗接種的小鼠產(chǎn)生了更快的和更高水平的中和抗體活性。
質(zhì)粒DNApTR600，一個(gè)真核生物表達(dá)載體，被構(gòu)建成包含加上內(nèi)含子A(IA)的兩個(gè)拷貝的巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)予(CMV-IE)用以起始真核生物插入片段的轉(zhuǎn)錄，還包含牛生長素多腺苷酸信號序列(BGH poly A)用以終止轉(zhuǎn)錄。載體包含用以容易插入基因片段的多克隆位點(diǎn)，也包含用以原核復(fù)制的Col E1復(fù)制起點(diǎn)和用以在抗生素介質(zhì)中篩選的卡那霉素抗性基因(Kanr)(圖29A)。
來于Edmonton品系的血凝集素(H)cDNA序列和C3d序列如前所描述地被克隆和用單一的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)被轉(zhuǎn)移到pTR600疫苗載體內(nèi)(圖29B)。通過去除H的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生了分泌型版本。應(yīng)用PCR將H基因片段與組織纖溶酶原激活物(tpA)前導(dǎo)序列(Torres等人，2000)的N端合成模仿物以符合讀框的方式克隆而完成這些。
正如以前描述的，通過在sH基因3′端以符合讀框的方式克隆三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的小鼠同源性C3d基因而產(chǎn)生了表達(dá)sH-C3d融合蛋白的載體(Dempsey，1996；Ross等人，2000和Ross等人，2001)。構(gòu)建體的設(shè)計(jì)依據(jù)Dempsey等人的資料，用了來自于pSLG-C3d的序列。由4個(gè)甘氨酸和1個(gè)絲氨酸的兩次重復(fù){(G4S)2}組成的連接物在H和C3d結(jié)合點(diǎn)和在每個(gè)C3d重復(fù)之間融合。通過用導(dǎo)致精氨酸密碼子突變?yōu)楦拾彼崦艽a子的BamHI和BglII融合，在C3d接點(diǎn)和sH與C3d接點(diǎn)之間潛在的蛋白水解酶剪切位點(diǎn)發(fā)生了突變。
在大腸桿菌菌株，DH5a中擴(kuò)增質(zhì)粒，用陰離子交換樹脂柱(Qiagen，Valencia，CA)提純，在-20℃于dH2O下保存。通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶湍z體電泳檢驗(yàn)質(zhì)粒。在260nm和280nm通過光密度讀數(shù)測定DNA制備物的純度。
小鼠和DNA免疫6-8周年齡的BALB/c小鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)被用于接種。簡言之，用0.03-0.04ml混合液[5ml鹽酸氯胺酮(100mg/ml)和1ml鹽酸塞拉嗪(20mg/ml)混合]麻醉小鼠。在400psi氦壓力下用每0.5mg含有0.5μg DNA的大約1-μm金彈丸(DeGussa-Huls Corp，Ridgefield Park，NJ)的兩個(gè)基因槍劑量給小鼠進(jìn)行免疫接種。
轉(zhuǎn)染和表達(dá)分析依據(jù)操作規(guī)程(Life Technologies，Grand Island，NY)，用12％脂轉(zhuǎn)染劑以2μg的DNA轉(zhuǎn)染人胚胎腎臟細(xì)胞系293T(5×105細(xì)胞/轉(zhuǎn)染)。收集上清液并保存在-20℃。如以前描述的，用捕獲抗原H的ELISA進(jìn)行計(jì)量(Cardoso等人，1998)。
為了進(jìn)行蛋白質(zhì)雜交分析，將15μl上清液或細(xì)胞溶解產(chǎn)物以1∶2比例稀釋于SDS樣本緩沖液(Bio-Rad，Hercules，CA)中，并將其置于10％聚丙烯酰胺/SDS凝膠上。解離的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)并與以1∶1000的多克隆兔抗HA抗血清稀釋液保溫于包含0.1％Tween 20和1％無脂干牛奶的PBS中。在徹底沖洗后，用以1∶2000稀釋的與辣根過氧化物酶結(jié)合的山羊抗兔抗血清和增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(Amersham，Bucknghamshire，UK)探測出結(jié)合的兔抗體。
抗體測定進(jìn)行計(jì)量ELISA，以測定抗H專一性IgG水平。簡言之，將組成型表達(dá)MV(24)的H蛋白質(zhì)的Ltk-細(xì)胞置于96孔板中生長?？寡逑♂屢号c表達(dá)H抗原的完整細(xì)胞一起保溫保存。使抗H抗體結(jié)合于細(xì)胞上30分鐘，在此后將細(xì)胞固定于丙酮(80％)中。用生物素?；目剐∈驣gG抗體和鏈霉抗生物素磷酸酯酶堿性系統(tǒng)(Sigma)探測專一性抗體應(yīng)答。結(jié)合于不表達(dá)H抗原的Ltk-細(xì)胞的抗體被應(yīng)用于使系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果以終點(diǎn)稀釋滴定度表達(dá)出。
中和性測定中和性測定在于六孔板(25)中生長的Vero細(xì)胞上進(jìn)行。簡言之，將100-200p.f.u.的麻疹病毒Edmonton株與一系列血清稀釋液混合，在37℃保溫1小時(shí)，然后在板上保溫。將板置于37℃保溫48小時(shí)并對斑塊計(jì)數(shù)。中和效價(jià)定義為減少斑塊形成50％或90％需要的血清相應(yīng)的稀釋度。免疫前血清作為陰性對照。
結(jié)果兩種表達(dá)血凝素的疫苗質(zhì)粒被構(gòu)建于PTR600載體以表達(dá)來于Edmonston株的分泌類型H(sH)或分泌類型H的C3d融合蛋白(sH-3C3d)(圖29)。sH代表H的全部胞外域，但不包括跨膜和胞質(zhì)區(qū)。該克隆使H序列與組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tPA)前導(dǎo)序列的N-端合成模擬物符合讀框。tPA前導(dǎo)基因和H序列融合于H跨膜區(qū)3′端。通過將小鼠同源的三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C3D序列與分泌型H基因以符合讀框的方式克隆，產(chǎn)生了sH-3C3d融合蛋白(圖29B)。在每個(gè)C3d分子之間結(jié)合處和H蛋白和第一個(gè)C3d編碼區(qū)域之間結(jié)合處發(fā)現(xiàn)的蛋白水解剪切位點(diǎn)被誘變破壞。
蛋白印跡分析揭示了預(yù)期大小的sH和sH-3C3d蛋白質(zhì)。應(yīng)用抗MV H抗血清的兔多克隆抗體的蛋白印記分析顯示出與在被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中H的分泌類型相符的～70kD的寬闊帶?！?90kD的高分子量帶是與sH-3C3d融合蛋白反映的大小是一致的(圖30)。通過蛋白分析沒有發(fā)現(xiàn)sH-C3d融合蛋白的蛋白水解剪切證據(jù)。
與抗原的跨膜相關(guān)類型相比，麻疹病毒H通過包含sH或sH-3C3d的質(zhì)粒以稍稍較低的水平被表達(dá)。用2μg質(zhì)粒對人293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，用抗原捕獲ELISA測定上清液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的H。大約75％的H蛋白被分泌進(jìn)入sH-DNA和sH-3C3d-DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液。正如所預(yù)期的，在用表達(dá)H跨膜類型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞溶解產(chǎn)物中可探測出～99％的H抗原。
對麻疹H DNA免疫的抗體應(yīng)答表達(dá)sH-3C3d DNA質(zhì)粒比sHDNA產(chǎn)生了更高的ELISA抗體效價(jià)。用DNA包被的金粒通過基因槍以0.1μg或1ug接種物給BALB/c小鼠接種。接種后4周和26周，用在第一次免疫接種時(shí)所給的同樣DNA劑量對小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。抗H抗體呈現(xiàn)的時(shí)間圖形顯示，與用sH DNA接種的小鼠比較，免疫應(yīng)答在用表達(dá)C3d融合蛋白的DNA接種的小鼠體內(nèi)能更快啟動(dòng)。通過第一次免疫接種產(chǎn)生了抗體的良好效價(jià)。通過第二次和第三次免疫接種得到進(jìn)一步增強(qiáng)。在第三次免疫接種之后，用sH-3C3D接種的小鼠比用sH DNA接種的小鼠其體內(nèi)效價(jià)高5-6倍。
中和作用測定對MV中和的血清檢測顯示，在第二次接種0.1μg表達(dá)sH-3C3d的DNA后效價(jià)高達(dá)1700。對Vero細(xì)胞的中和抗體研究探測出，與用sH DNA接種的小鼠血清相比，在用sH-3C3d構(gòu)建體激發(fā)的小鼠血清中，抗MV Edmonton模型的中和活性的效價(jià)更高。用sH-3C3d質(zhì)粒接種的小鼠在中和抗體水平上有急劇上升，在14周其達(dá)到一高平頂。與此對照的是，用sH DNA進(jìn)行第三次接種后只激發(fā)出中和抗體的可探測水平。接種28周后，用sH-3C3d-DNA接種的小鼠血清具有的中和效價(jià)(＞250)可減少M(fèi)V感染形成的斑塊90％。
與用僅僅表達(dá)sH的DNA接種的小鼠相比，在用表達(dá)C3d蛋白構(gòu)建體接種的小鼠體內(nèi)對H的抗體應(yīng)答的高度增加7-15倍。表達(dá)sH-3C3d的DNA增加的抗體應(yīng)答更引起人們興趣，因?yàn)檫@個(gè)質(zhì)粒僅表達(dá)～60％表達(dá)sH的質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白質(zhì)。
除了整個(gè)抗體水平的增加外，在體外感染測定中，專門中和MV的抗體能更快產(chǎn)生。在第二次免疫接種后，在用sH-3C3d的DNA免疫接種的小鼠體內(nèi)能觀測到可探察水平的中和抗體。在14周中和抗體的效價(jià)達(dá)到高峰(1700，對于50％斑塊減少)，它實(shí)際上在與保護(hù)相關(guān)的最低量(＞120，對于50％斑塊減少)之上。與此對照，用表達(dá)sH的DNA接種的小鼠甚至在第三次接種后，其中和抗體的水平仍然低(180，對于50％斑塊減少)(圖31)。
實(shí)施例18具有和沒有-C3d的流感插入片段質(zhì)粒載體構(gòu)建和提純的過程在以前針對JW4303已有所描述(Torres等人，1999；Pertmer等人，1995；Feltquate等人，1997)。簡言之，用單一的限制位點(diǎn)將來自于A/PR/8/34(H1N1)的流感血凝素(HA)序列克隆于pJW4303或pGA真核表達(dá)載體內(nèi)。
HA的兩種形式，一個(gè)分泌(s)型和一個(gè)跨膜(tm)型，在以前已有所描述(Torres等人，1999；Feltquate等人，1997)。在pJW4303中表達(dá)sHA或tmHA的載體分別被標(biāo)示為pJW/sHA和pJW/tmHA，在pGA中表達(dá)sHA、tmHA或sHA-3C3d的載體分別被標(biāo)示為pGA/sHA、pGA/tmHA和pGA/sHA-3C3d。
通過克隆小鼠同源的三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C3d以及使三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C3d與分泌型HA基因符合讀框，產(chǎn)生了表達(dá)HA-C3d融合蛋白的載體。構(gòu)建體的設(shè)計(jì)依據(jù)Dempsey等人的資料(1996)。由4個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸的兩個(gè)重復(fù)體[(G4S)2]組成的連接物于每個(gè)C3d重復(fù)連接處融合。pGA/sHA-3C3d質(zhì)粒表達(dá)大約50％由pGA/sHA載體表達(dá)的蛋白質(zhì)。但是在上清液與細(xì)胞溶解物中發(fā)現(xiàn)的sHA-3C3d的比率與由pGA/sHA表達(dá)的抗原的比率相似。80％多的蛋白質(zhì)被分泌入上清液。在蛋白質(zhì)分析中，較高的分子量帶120kDa被探測到，其代表了sHA-3C3d融合蛋白。因此，sHA-3C3d融合蛋白象sHA抗原一樣有效地被分泌進(jìn)入上清液。
小鼠和DNA免疫接種6-8周齡的BALB/c小鼠(Harlan SpragueDawley，Indianapolis，IN)被用于接種。小鼠被關(guān)在一個(gè)小隔離室，自由進(jìn)食和飲水，并按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的USDA準(zhǔn)則照料小鼠。用5ml鹽酸氯胺酮(100mg/ml)和1ml鹽酸塞拉嗪(20mg/ml)的混合物0.03-0.04ml對小鼠進(jìn)行麻醉。用手握Accell基因運(yùn)送系統(tǒng)在刮凈的腹部皮膚上進(jìn)行基因槍免疫接種，用每0.5mg約1μm金彈丸(DeGussa-HulsCorp.，Ridgefield Park，NJ)含0.5μg DNA的兩基因槍劑量在400psi氦壓力下進(jìn)行免疫接種。
流感病毒的攻擊通過鼻內(nèi)滴注法以活的適于小鼠的流感病毒進(jìn)行攻擊，鼻內(nèi)滴注法是將稀釋于PBS中包含3份致死劑量病毒的50μl尿囊液注入到鹽酸氯胺酮麻醉的小鼠的鼻孔中。這種方法導(dǎo)致肺部的迅速感染，其對于未經(jīng)免疫接種的小鼠是100％的致死。在免疫接種后8或14周對小鼠個(gè)體進(jìn)行攻擊以及對其體重?fù)p失和存活情況進(jìn)行監(jiān)測。標(biāo)繪的數(shù)據(jù)是指每一個(gè)實(shí)驗(yàn)組中個(gè)體平均攻擊后體重與攻擊前重量的百分比與攻擊后天數(shù)的對應(yīng)關(guān)系。
對HA DNA免疫接種的抗體應(yīng)答與sHA DNA比較，tmHA和sHA-3C3d DNA質(zhì)粒產(chǎn)生了較高的ELISA抗體的效價(jià)。用基因槍以0.1μg或1μg劑量的DNA包被的金粒對BALB/c小鼠進(jìn)行接種。在接種后4周，將每個(gè)組一半的小鼠用與第一次免疫接種中所給劑量相同的劑量的DNA進(jìn)行加強(qiáng)免疫。用sHA-3C3d-和tmHA-表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)的所有抗HA IgG在不同小鼠試驗(yàn)組中是類似的并且比用sHA表達(dá)質(zhì)粒產(chǎn)生的量高3-5倍(圖24)。除此之外，被激發(fā)的抗HA抗體的量以劑量依賴方式隨接種的DNA量而增加(圖24E-24F)?？偠灾?，劑量應(yīng)答曲線和抗HA抗體呈現(xiàn)的時(shí)間圖形在用tmHA-DNA或sHA-3C3d-DNA接種的小鼠中是類似的，但是在用sHA-DNA接種的小鼠中它是較低和較緩慢的。如所預(yù)期的，加強(qiáng)免疫促進(jìn)和增加了HA抗體的效價(jià)。
小鼠HA抗血清的親和力硫氰酸鈉(NaSCN)置換ELISA證明，用表達(dá)sHA-3C3d的DNA產(chǎn)生的HA專一性抗體的親和力比來自于sHA-DNA或tmHA-DNA接種的小鼠的抗體的更高(圖25)。用梯度濃度的硫氰酸鈉即一種破壞抗原抗體相互作用的離液劑對HA專一性抗體的親和力進(jìn)行比較。同對抗原有較大親和力的抗體比較，對抗原有較小親和力的抗體的結(jié)合在較低的硫氰酸鈉濃度下就被破壞。釋放50％抗血清的硫氰酸鈉的有效濃度(ED50)是～1.20M，其中抗血清是在接種后8周從sHA-DNA或tm-DNA加強(qiáng)免疫的小鼠(0.1μg劑量或1μg劑量)中采集的(圖25A)。與此對照，來于用sHA-3C3d-DNA接種和加強(qiáng)免疫的小鼠的抗血清具有～1.75M的ED50(圖25B)。在攻擊時(shí)(接種后14周)，來于用sHA-DNA和tmHA-DNA接種小鼠抗體的ED50增加到～1.8M(圖25C)。來于用sHA-3C3d-DNA接種小鼠的抗體的ED50增加到～2.0M(圖25D)。此結(jié)果提示，與來于用sHA-DNA和tmHA-DNA接種小鼠的抗體相比，來于用sHA-3C3d-DNA接種小鼠的抗體的親和力成熟更迅速。在sHA-3C3d和tmHA的抗體親和力隨時(shí)間成熟之間的區(qū)別是對產(chǎn)生的抗體水平的非依賴性。這兩種質(zhì)粒有類似的抗體出現(xiàn)隨時(shí)間變化的圖形和產(chǎn)生抗體的能力的劑量應(yīng)答曲線(圖25)。
血凝素抑制(HI)效價(jià)進(jìn)行血凝素抑制測定(HI)用來評定所產(chǎn)生抗體阻止A/PR/8/34(H1N1)結(jié)合硅鋁酸的能力。用從接種后8周和14周小鼠采集的血清樣本測定HI效價(jià)。不考慮劑量或所給予的疫苗，所有被加強(qiáng)免疫的小鼠在第14周都有可被測定的HI效價(jià)。sHA-3C3d-DNA接種小鼠有最高效價(jià)(高達(dá)1∶1200)的記錄。未被加強(qiáng)免疫的小鼠顯示出HI效價(jià)的更多變化。用0.1μg劑量的sHA-DNA或tmHA-DNA表達(dá)質(zhì)粒接種的未被加強(qiáng)免疫的小鼠具有1∶10的低HI效價(jià)。與此對照，用sHA-3C3d-DNA接種小鼠具有高于1∶640的效價(jià)。在8周有可測定HI效價(jià)(1∶160)的被接種小鼠僅僅是用1μg劑量sHA-3C3d-DNA接種并加強(qiáng)免疫的小鼠。這些結(jié)果指出，當(dāng)融合于sHA時(shí)C3d能刺激專一性B細(xì)胞增強(qiáng)抗體的親和活性的成熟從而產(chǎn)生對HA的中和抗體。
對流感攻擊的保護(hù)功效與激發(fā)HI抗體最高效價(jià)相一致，sHA-3C3d DNA比sHA或tmHA DNA能提供更有效的保護(hù)。用致死劑量的A/PR/8/34流感病毒(H1N1)攻擊小鼠，然后對其發(fā)病率(通過體重減少來度量)和死亡率進(jìn)行每日的監(jiān)測，以此來測定各種HA-DNA疫苗的保護(hù)效率。以相對于攻擊前平均重量的百分比與攻擊后天數(shù)的關(guān)系標(biāo)繪每個(gè)動(dòng)物重量減少圖(圖26)。第一次被病毒攻擊的小鼠和僅用pGA載體接種的小鼠顯示出重量的急劇下降，在攻擊后8天所有小鼠體重都下降＞20％(圖26)。與此對照，PBS模擬攻擊的小鼠在觀察14天后體重仍未下降。不考慮所給予的DNA質(zhì)粒的劑量，在接種后14周所有被加強(qiáng)免疫的小鼠都在攻擊后存活下來。但是，用0.1μg劑量的sHA-DNA接種的被加強(qiáng)免疫的小鼠在復(fù)原前在接種后第8天其體重下降到它們起始的體重的92％(圖26)。與此對照，使用1μg劑量，在接種后8周攻擊被加強(qiáng)免疫的小鼠，在攻擊下存活的小鼠只有sHA-3C3d-和tmHA-DNA接種的小鼠，盡管在接種后14周觀察到它們的體重有很大的下降。用0.1μg劑量加強(qiáng)免疫接種的小鼠在接種后8周在攻擊后存活的只有sHA-3C3d接種小鼠(圖26)。
在未加強(qiáng)免疫的0.1μg劑量免疫接種組中，只有sHA-3C3d-DNA接種小鼠于接種后14周在攻擊下存活(圖26)。所有只給予單獨(dú)DNA接種的小鼠的體重下降。但是，在這些中sHA-3C3d-DNA接種小鼠體重下降最少，也只有它們是唯一在致死的攻擊下存活下來的小鼠(圖26)。這些結(jié)果證明，3C3d蛋白在與HA融合時(shí)加強(qiáng)了DNA疫苗的效率，以此可考慮減少DNA劑量和接種次數(shù)來提供抵抗致死流感病毒攻擊的保護(hù)。
實(shí)施例19HIV gp120-C3d融合構(gòu)建體在這項(xiàng)研究中，與實(shí)施例18所述相似之處是也應(yīng)用三個(gè)鼠C3d拷貝并將其融合于HIV Env gp120亞單位的羧基端。用DNA接種法給BALB/c小鼠接種并測定增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。與野生類型gp120序列相比，融合構(gòu)建體誘導(dǎo)較高的對Env的抗體應(yīng)答和親和活性成熟較快發(fā)生。此結(jié)果提示，增強(qiáng)抗體的DNA疫苗功效可通過與C3d的融合蛋白被極大改善。
質(zhì)粒DNA如上面實(shí)施例1所述，pGA的構(gòu)建包含起始真核插入片段轉(zhuǎn)錄的巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMV-IE)加上內(nèi)含子A(IA)以及終止轉(zhuǎn)錄的牛生長素多腺苷酸信號(BGH poly A)。應(yīng)用單一的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)，將來自于分離的ADA的HIV包膜序列、IIIB和編碼幾乎全部gp120區(qū)域的89.6與C3d序列克隆進(jìn)入pGA疫苗載體。gp120片段編碼從氨基酸32到465的區(qū)域，并以氨基酸序列VAPTRA結(jié)束。前32個(gè)氨基酸從每個(gè)sgp120 N端缺失而由組織纖維蛋白溶酶原激活劑(tpA)的前導(dǎo)序列代替。通過與表達(dá)sgp120的DNA以符合讀框的方式克隆小鼠同源的三個(gè)串聯(lián)重復(fù)的C3d，產(chǎn)生表達(dá)sgp120-C3d融合蛋白的載體。構(gòu)建體的設(shè)計(jì)依據(jù)Dempsey等人(1996)資料。由4個(gè)甘氨酸和1個(gè)絲氨酸的二次重復(fù)體{(G4S)2}組成的連接物在HA與C3d結(jié)合處和每個(gè)C3d重復(fù)體之間融合。通過連接Bam HI和Bgl II限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)使Arg密碼子突變?yōu)镚ly密碼子，潛在的在C3d結(jié)合處和3C3d結(jié)合處之間的蛋白質(zhì)水解剪切位點(diǎn)發(fā)生了突變。
在大腸桿菌菌株，DH5a中擴(kuò)增質(zhì)粒，用陰離子交換樹脂柱(Qiagen，Valencia，CA)提純，在-20℃于dH2O下保存。通過適當(dāng)?shù)南拗菩悦赶湍z體電泳檢驗(yàn)質(zhì)粒。通過260nm和280nm光密度測定DNA制備物的純度。
小鼠和DNA免疫如在上面實(shí)施例17中所描述的，6-8周齡的BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)被用于接種。簡言之，在400psi氦壓力下用每0.5mg包含有0.5μgDNA的大約1-μm金彈丸(DeGussa-Huls Corp，Ridgefield Park，NJ)的兩個(gè)基因槍劑量給小鼠進(jìn)行免疫接種。
如實(shí)施例17所述進(jìn)行轉(zhuǎn)染與表達(dá)分析和蛋白質(zhì)雜交實(shí)驗(yàn)，除了將硝化纖維素膜與1∶1000的多克隆HIV感染病人的抗血清稀釋液保溫于包含0.1％Tween 20和1％無脂干牛奶的PBS中。在徹底的沖洗后，用辣根過氧化物酶結(jié)合山羊抗人抗血清的1∶2000稀釋液和增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光劑(Amersham，Bucknghamshire，UK)探測出結(jié)合的人抗體。
ELISA和親和力測定用提純的HIV-1-IIIB gp120 CHO表達(dá)的蛋白質(zhì)(Intracell)包被板，進(jìn)行終點(diǎn)ELISA以測定在免疫血清中的抗Env IgG的效價(jià)(如Richmond等人，1998所述)。可以替代的是，板被綿羊抗Env抗體(International Enzymes Inc.，F(xiàn)allbrook，CA)包被并用于捕獲在以sgp120表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中產(chǎn)生的sgp120。來于被接種小鼠的血清結(jié)合并隨后通過結(jié)合于辣根過氧化物酶的抗小鼠IgG被探測。終點(diǎn)效價(jià)比底數(shù)高兩倍被認(rèn)為是陽性。進(jìn)行親和力ELISA，根據(jù)樣本和標(biāo)準(zhǔn)的加入親和力ELISA與血清抗體ELISA測定類似。根據(jù)O.D.值，將樣本稀釋到與專一性IgG同樣的濃度。用0.05％PBS-Tween 20沖洗板三次。然后加入不同濃度的離液劑一于PBS中的硫氰酸鈉(0M、1M、1.5M、2M、2.5M和3M NaSCN)。將板放置于室溫中15分鐘然后用PBS-Tween 20洗滌6次。以下幾步類似血清抗體ELISA測定，相對于起始IgG的百分比被計(jì)算為相對于起始的O.D.百分比。所有測定都一式三份。
中和抗體測定如前所述，HIV-1 IIIB和89.6的抗體介導(dǎo)的中和作用在MT-2細(xì)胞殺死測定中測量(Montefiori等人，1988)。簡言之，將無細(xì)胞病毒(50μl包含108TCID50病毒)加入到在以多聚賴氨酸包被的96孔微滴定板的一式三份小孔中的100μl生長培養(yǎng)基里的血清樣本多倍稀釋液中，并在37℃保溫1小時(shí)，然后加入MT-2細(xì)胞(每孔加入在100□1內(nèi)的105細(xì)胞)。有必要時(shí)在三天后降低細(xì)胞密度并置換培養(yǎng)基。當(dāng)對照孔中細(xì)胞病變效果大于70％但小于100％時(shí)，通過用Finters中性紅給存活細(xì)胞染色測定中和作用。通過計(jì)算在測試孔(細(xì)胞+病毒)之間吸收作用(A540)的差并將該結(jié)果除以在細(xì)胞對照孔(只有細(xì)胞)和病毒對照孔的吸收作用差來測定保護(hù)的百分率。根據(jù)需要保護(hù)至少50％細(xì)胞免于病毒誘導(dǎo)殺滅的原生質(zhì)稀釋度的倒數(shù)來表示中和效價(jià)。
結(jié)果包含任一種分泌類型抗原的質(zhì)粒在類似的總水平上表達(dá)Env，但sgp120-C3d表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)水平低2-4倍。用2μg質(zhì)粒對人293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，并用抗原捕獲ELISA測定上清液和細(xì)胞溶解產(chǎn)物的gp120。sgp120構(gòu)建物表達(dá)量為每毫升450到800ng，而3C3d融合物表達(dá)量為每毫升140到250ng。在sgp120和sgp120-3C3d-DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中存在大約90％Env蛋白質(zhì)(數(shù)據(jù)未表示)。不同的sgp120表達(dá)水平的區(qū)別大約為兩倍，這似乎反映出Env基因的區(qū)別以及對不同Env識(shí)別的抗體的捕獲與探測效率的區(qū)別。
蛋白質(zhì)印記分析揭示出預(yù)期大小的sgp120和sgp120-3C3d蛋白質(zhì)。應(yīng)用病人多克隆抗血清，蛋白質(zhì)印記分析顯示，預(yù)期的115-120kD寬帶與gp120相符。在～240kD的更高的分子量帶與sgp120-3C3d融合蛋白預(yù)期的大小一致。與抗原捕獲測定一致，在sgp120-DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液中存在了高強(qiáng)度蛋白質(zhì)帶，而在sgp120-3C3d-DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中存在的是較少強(qiáng)度的蛋白質(zhì)帶(未表示數(shù)據(jù))。在蛋白質(zhì)分析中未見sgp120-C3d融合蛋白的蛋白質(zhì)水解剪切證據(jù)。
對Env gp120 DNA免疫接種的抗體應(yīng)答sgp120-3C3d表達(dá)DNA質(zhì)粒所產(chǎn)生的ELISA抗體效價(jià)比sgp120 DNA更高。通過基因槍以1μg劑量DNA包被金的顆粒給BAIB/c小鼠接種。在第一天給小鼠接種，然后在第4、14和26周用與第一次接種所給予的同樣DNA進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在gp120-IIIB包被板上測定血清，與sgp120表達(dá)質(zhì)粒增強(qiáng)的抗體量相比，用表達(dá)C3d融合蛋白的DNA接種的小鼠具有高出3-7倍的抗Env抗體。在C3d構(gòu)建體中，用sgp120-(IIIB)-3C3d接種的小鼠具有最高水平的抗體，而用sgp120-(ADA)-3C3d表達(dá)DNA接種的小鼠具有最低水平的抗Env抗體?？笶nv抗體出現(xiàn)隨時(shí)間變化的圖形揭示出對于所有被測試的構(gòu)建體每個(gè)接種中均增強(qiáng)了效價(jià)。
用不同Env產(chǎn)生的抗體水平的區(qū)別似乎是由所產(chǎn)生抗體的專一性來決定的。在可替換的ELISA方案里(其中，在Env同源物上捕獲抗體)所有C3d融合物增強(qiáng)抗體的水平似乎是類似的。在這項(xiàng)測定中，綿羊抗Env抗體被用于捕獲瞬間產(chǎn)生的sgp120蛋白質(zhì)。此測定揭示出由每個(gè)sgp120-3C3d構(gòu)建物增強(qiáng)的抗體水平低但類似。在這個(gè)測定中探測出的較低的抗體水平似乎反映出，用于捕獲抗體的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的Env水平比用商業(yè)生產(chǎn)的IIIB gp120包被板所做的測定值要低。正如應(yīng)用ELISA方法預(yù)期的，加強(qiáng)免疫接種對于達(dá)到最適宜的抗體應(yīng)答是必要的。
小鼠Env抗血清的親和力硫氰酸鈉(NaSCN)置換ELISA證明，用表達(dá)sgp120-3C3d DNA產(chǎn)生的抗體的親和力持續(xù)高于由sgp120-DNA接種小鼠產(chǎn)生的。因?yàn)樗a(chǎn)生的抗血清的類型專一性和用于捕獲抗原的IIIB蛋白質(zhì)(不是其他蛋白質(zhì))可商業(yè)購得，親和力測定是在用sgp120-(IIIB)和sgp120-(IIIB)-3C3d免疫產(chǎn)生的血清上進(jìn)行的。用梯度濃度的硫氰酸鈉，一種破壞抗原抗體相互作用的離液劑，對Env的專一性抗體的親和力進(jìn)行比較。結(jié)果指出，來自于sgp120-3C3d-DNA接種小鼠的抗體比來自于sgp120-DNA接種小鼠的抗體親和活性成熟更快。
Env-3C3d表達(dá)質(zhì)粒激發(fā)適量中和抗體在MT-2細(xì)胞進(jìn)行的中和抗體研究在由gp120-3C3d構(gòu)建體產(chǎn)生的血清中探測出比在由sgp120構(gòu)建體產(chǎn)生的血清中更高的中和活性效價(jià)。用血清對兩種包括IIIB(X4)和89.6(X4R5)病毒的合胞體進(jìn)行測定。用sgp120-3C3d表達(dá)質(zhì)粒接種的小鼠具有非常適量的對HIV同源毒株的中和抗體水平，這是通過以中性紅攝取度量的對MT-2細(xì)胞免受病毒誘導(dǎo)殺滅的保護(hù)來測試的。由表達(dá)gp120的DNA產(chǎn)生的中和抗體效價(jià)作為測定的底數(shù)。
此研究結(jié)果顯示，HIV-1 Env和三個(gè)小鼠C3d副本的融合增強(qiáng)了對被接種小鼠Env的抗體應(yīng)答。在第4次接種后(引發(fā)后28周)，用三種表達(dá)sgp120序列的DNA質(zhì)粒的任何一種接種的小鼠具有低的或不可探測水平的抗體。與此對照，用表達(dá)sgp120和3C3d融合蛋白的DNA接種的小鼠激發(fā)抗體更快地發(fā)生(第三次接種)也具有更高的抗體水平。
與抗體效價(jià)增強(qiáng)和抗體對Env親和活性成熟相對照，被接種小鼠被激發(fā)的中和抗體量是低的。用表達(dá)sgp120的質(zhì)粒接種的小鼠具有低的中和抗體水平，它在用sp120-3C3d表達(dá)質(zhì)粒接種的小鼠體中僅有少量增加。但是中和抗體水平在第四次接種后有明顯增加。中和抗體的不良效價(jià)可能反映出，因?yàn)闆]有將中和抗原決定簇充分暴露于應(yīng)答B(yǎng)細(xì)胞造成sgp120-3C3d融合蛋白對增強(qiáng)中和抗體的內(nèi)在的低劣能力。在小鼠血清中對HIV-1中和測定的固有的高底數(shù)也可能造成低劣的中和效價(jià)。
結(jié)果證明了C3d融合物作為增加抗體產(chǎn)生和增進(jìn)抗體成熟的分子佐劑的效用。除此之外，對Env的中和抗體應(yīng)答在用C3d融合疫苗接種的小鼠中有少量增加。與在使用了來自于麻疹和流感病毒的HA分泌型版本的實(shí)施例17和18中所看到的結(jié)果類似，僅僅應(yīng)用表達(dá)相當(dāng)于那些表達(dá)非融合sgp120的質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白質(zhì)一半量的蛋白質(zhì)的質(zhì)粒，就可以獲得C3d-增強(qiáng)的抗體應(yīng)答。
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權(quán)利要求
1.一種載體，其包含用于λT0終止子的編碼終止序列；原核生物復(fù)制起點(diǎn)；可選擇的標(biāo)記基因；和包含編碼一個(gè)或多個(gè)從病原體衍生的免疫原的疫苗插入片段的真核生物轉(zhuǎn)錄盒。
2.權(quán)利要求1的載體，其中所述病原體是病毒病原體。
3.權(quán)利要求1的載體，其中所述病毒病原體是從由HIV、麻疹、流感、脊髓灰質(zhì)炎和風(fēng)疹組成的組群中挑選的。
4.權(quán)利要求1的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
5.權(quán)利要求1的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是進(jìn)一步從由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
6.權(quán)利要求1的載體，其中所述編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段進(jìn)一步包含至少一個(gè)C3d基因。
7.一種免疫接種或治療患者的方法，包含給予治療有效劑量的生理學(xué)上可接受的組合物的步驟，所述組合物包含權(quán)利要求1的載體。
8.權(quán)利要求7的方法，進(jìn)一步包含隨后給予治療有效劑量的組合物的步驟，所述組合物包含表達(dá)一個(gè)或多個(gè)免疫原的重組天花病毒載體，其中免疫原是從由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
10.權(quán)利要求7的方法，進(jìn)一步包含隨后給予治療有效劑量的表達(dá)一個(gè)或多個(gè)免疫原的重組天花病毒載體，其中免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述載體表達(dá)一個(gè)或多個(gè)從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的免疫原。
12.包含SEQ ID NO1的DNA序列的載體。
13.權(quán)利要求12的載體，其中該載體進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是從由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感選擇血凝素、流感跨膜血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
14.權(quán)利要求12的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
15.包含SEQ ID NO2的DNA序列的載體。
16.權(quán)利要求15的載體，其中該載體進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是從由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感選擇血凝素、流感跨膜血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
17.權(quán)利要求15的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
18.包含SEQ ID NO3的DNA序列的載體。
19.權(quán)利要求18的載體，其中該載體進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是從由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感選擇血凝素、流感跨膜血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
20.權(quán)利要求18的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
21.包含SEQ ID NO4的DNA序列的載體。
22.權(quán)利要求21的載體，其中該載體進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是從由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感選擇血凝素、流感跨膜血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
23.權(quán)利要求21的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
24.包含SEQ ID NO5的DNA序列的載體。
25.權(quán)利要求24的載體，其中該載體進(jìn)一步包含編碼一個(gè)或多個(gè)免疫原的疫苗插入片段，所述免疫原是從由HIV Gag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感選擇血凝素、流感跨膜血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
26.權(quán)利要求24的載體，其中所述一個(gè)或多個(gè)免疫原是從由HIVGag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
27.一種免疫接種或治療患者的方法，包含給予治療有效量的生理學(xué)上可接受的組合物，其中該組合物包含一種載體，該載體是包含從SEQ ID NOS1、2、3、4和5中挑選出的序列的核酸，以及其中所述治療有效量的組合物是通過肌肉內(nèi)或皮內(nèi)途徑給予的。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體表達(dá)一個(gè)或多個(gè)從由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的免疫原；并且該載體可任選地包括至少一個(gè)C3d基因。
29.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體表達(dá)一個(gè)或多個(gè)從由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的免疫原。
30.權(quán)利要求27的方法，進(jìn)一步包含隨后給予治療有效劑量的表達(dá)一個(gè)或多個(gè)免疫原的重組天花病毒載體，其中所述免疫原是從由HIV Gag、HIVgp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、麻疹融合蛋白、麻疹血凝素、麻疹核蛋白、流感血凝素、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體表達(dá)一個(gè)或多個(gè)從由HIVGag、HIV gp120、HIV Pol、HIV Env、HIV VLP、它們的突變體及其子序列組成的組群中挑選的免疫原。
32.一種免疫接種和治療患者的方法，包括對需要的患者給予治療有效劑量的包含權(quán)利要求29的載體的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的pGA構(gòu)建體，它用于作為傳送DNA疫苗插入片段的載體。此疫苗插入片段可包含各種病毒、細(xì)菌、寄生蟲和(或)真菌的DNA轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明也描述了這樣的方法，它是通過給予治療有效劑量的包含病原體疫苗插入片段的新的pGA構(gòu)建體，隨后通過提高與活的包含同樣疫苗插入片段的載體疫苗的免疫作用來提高多抗原決定簇CD8T－細(xì)胞應(yīng)答的方法。
文檔編號C12N15/70GK1523999SQ01818162
公開日2004年8月25日 申請日期2001年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月2日
發(fā)明者哈麗雅特·L·魯賓遜, 詹姆斯·M·史密斯, 泰德·M·羅斯, 里克·阿瑟·布賴特, 華建, 丹尼斯·埃倫伯格, M 史密斯, 埃倫伯格, M 羅斯, 哈麗雅特 L 魯賓遜, 阿瑟 布賴特 申請人:愛莫里大學(xué)