專利名稱：重組體bmp-2的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于獲得具有生物活性的drBMP-2(dr移動(dòng)數(shù)字)和同源蛋白質(zhì)的方法，該方法通過變性的無生物活性的proBMP-2的復(fù)性和視需要前肽的隨后切除，其中復(fù)性的蛋白質(zhì)前體形式已經(jīng)具有生物活性，proBMP-2作為新產(chǎn)物，本發(fā)明還涉及該產(chǎn)物用于生產(chǎn)促進(jìn)骨生長(zhǎng)的組合物的用途。
BMP-2屬于骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)家族。這些蛋白質(zhì)是骨生長(zhǎng)因子，在1988年首次完成了它們的克隆和鑒定。這些蛋白質(zhì)的特有性質(zhì)是能夠引起軟骨內(nèi)的骨新生[Wozney等人，Science 242(1988)，1528-1534]。
在結(jié)構(gòu)上，BMP-2和超過30種其他蛋白質(zhì)一同屬于TGF-β超家族，該超家族成員相互之間顯示出非常高度的結(jié)構(gòu)相似性，盡管它們的序列同一性有時(shí)低于30％[Griffith等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，878-883]。這些蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)特征是所謂的“胱氨酸結(jié)”結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)是由4條反平行的β折疊鏈所形成，其中每?jī)蓷l鏈通過二硫鍵相互連接。在此兩個(gè)胱氨酸和肽鏈骨架一起形成一個(gè)環(huán)，通過該環(huán)第三個(gè)二硫橋伸展開來。
在這些蛋白質(zhì)中，β折疊是占主導(dǎo)地位的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件?？墒?，它們?cè)谶@些蛋白質(zhì)中比在其他富含β折疊的蛋白質(zhì)中更長(zhǎng)且纏繞得更緊密。由于TGF-β家族蛋白質(zhì)相互之間的結(jié)構(gòu)相關(guān)性，我們假定這些蛋白質(zhì)也以相似的方式形成它們折疊的天然構(gòu)象。
BMP和相關(guān)蛋白質(zhì)，如DPP(decapentaplegic，果蠅)，在高等生物的胚胎發(fā)育中起著重要的作用。BMP基因或BMP受體基因的缺陷，或者它們調(diào)節(jié)的缺陷有時(shí)可導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育失調(diào)，如進(jìn)行性骨化性纖維發(fā)育不良[Kaplan等人，Calcif.Tissue Int.47(1990)，117-125；Rao等人，Hum.Genet.90(1992)，299-302；Shafritz等人，N.Engl.J.Med.335(1996)，555-561]和牙本質(zhì)生長(zhǎng)不全[Tabas等人，Clin.Orthop.293(1993)，310-316]。BMP缺失的小鼠突變體早在胚胎時(shí)期或出生后不久死亡，它們顯示出骨骼和很多種器官(如心、腎和眼)的畸形[Dudley等人，Genes Dev.9(1995)，2795-2807；Zhang和Bradley，Development 122(1996)，2977-2986]。
BMP和相似的生長(zhǎng)因子只在某種條件下適合用于治療全身性疾病，如骨質(zhì)疏松癥，因?yàn)樗鼈兡軌蛞鸩豢扇淌艿母弊饔茫缒[瘤誘發(fā)。BMP尤其是BMP-2更多地用于局部受限制的應(yīng)用。這些施用包括與脊柱退化性疾病相關(guān)的脊柱融合術(shù)、顱骨新生、上頜外科和面外科手術(shù)，以及手足復(fù)雜骨折的治療。就這些應(yīng)用而言，rhBMP-2(rh-重組體，人)對(duì)于骨新生和由此對(duì)于愈合過程的有效性已經(jīng)在多個(gè)動(dòng)物模型中有令人印象深刻的表現(xiàn)[Lane等人，Clin.Orthop.361(1999)，216-227；Marden等人，J.Biomed.Mat.Res.28(1994)，1127-1138；Mayer等人，Plast.Recontr.Surg.98(1996)，247-259；Sandhu和Boden，Orthop.Clin.North Am.29(1998)，621-631；Toriumi等人，Arch.Otolyryngol.Head Neck Surg.117(1991)，1101-1112；Yasko等人，J.Bone Joint Surg.(Am.)74(1992)，659-670]。就脊柱融合術(shù)而言，已有了第一次臨床研究[Boyne等人，Int.J.Periodontics Restorative Dent.17(1997)，11-25；Howell等人，Int.J.Periodontics RestorativeDent 17(1997)，124-139]。同樣地，rhBMP-2也適合用于固定人造關(guān)節(jié)或在周圍的骨組織中螺釘固定，例如用于穩(wěn)定骨折。
除了不足的研究之外，這些研究本身，尤其是獲得蛋白質(zhì)的高額成本，阻礙了在臨床實(shí)踐中常規(guī)使用BMP。通過在本發(fā)明中所描述的方法能夠以低的技術(shù)消耗和至今不可能獲取的產(chǎn)率經(jīng)濟(jì)地以高純度重組體的形式制備有生物活性的BMP-2以及相關(guān)的BMP，該方法只需較少的技術(shù)投入但產(chǎn)率卻是以前所不能想象的。
人的BMP-2在身體中以396個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的前體蛋白質(zhì)形式進(jìn)行合成。信號(hào)肽(前序列)在體內(nèi)用于將新生多肽鏈轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中。當(dāng)其輸入進(jìn)ER中后，蛋白質(zhì)折疊成其天然構(gòu)象，形成了0二硫橋(Cys296-Cys361，Cys325-Cys393，Cys329-Cys395，分子間Cys360-Cys360)，并發(fā)生翻譯后修飾。后者包括天冬酰胺殘基的糖基化和部分前肽的不完全切除[Israel等人，Growth Factors 7(1992)，139-150]。前體蛋白質(zhì)的114個(gè)C末端氨基酸(Gln283-Arg396)形成成熟的BMP-2，其生物活性形式為具有二硫橋(Cys360-Cys360)的同型二聚體。
從骨組織中分離BMP-2需要巨大的投入，但只得到很低的產(chǎn)率(從40kg牛骨粉中得到40μg BMP混和物)[Wozney等人，Science242(1988)，1528-1534]。此外，從人的骨材料中分離在倫理上令人質(zhì)疑，而且還有著病原體(朊病毒、HCV等)污染的危險(xiǎn)。來自豬或牛的同源蛋白質(zhì)的應(yīng)用從免疫學(xué)的觀點(diǎn)來看同樣是危險(xiǎn)的。
因此優(yōu)先地選擇重組地制備BMP-2。對(duì)此有兩個(gè)主要的可能性。首先，蛋白質(zhì)可以在真核表達(dá)系統(tǒng)中獲得[Wang等人，Proc.Natl.Acda.Sci.USA 87(1990)，2220-2224]。這種方法的缺點(diǎn)為相對(duì)較低的重組蛋白質(zhì)的數(shù)量(每1L培養(yǎng)基產(chǎn)25μg部分純化的BMP-2[Wozney等人，Science 242(1988)，1528-1534])，以及相對(duì)高度的技術(shù)投入和由此產(chǎn)生的高成本。
第二條路線包括使用原核表達(dá)系統(tǒng)。它們的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單的技術(shù)操作、低成本和可分離得到非常高數(shù)量的蛋白質(zhì)?？墒?，和真核生物相比較，細(xì)菌不能正確地加工前體蛋白質(zhì)。由此至今該方法的使用在BMP-2成熟區(qū)域(Gln283-Arg396)的表達(dá)方面是受到限制的。該區(qū)域在細(xì)菌內(nèi)以不溶的且無生物活性的形式出現(xiàn)，除此之外由于細(xì)胞溶膠中的還原條件，其不可能形成蛋白質(zhì)的二硫橋。這些不溶蛋白質(zhì)的聚集體稱為包含體(IB)，其分離和純化已經(jīng)由如Marston[Biochem.J.240(1986)，1-12]進(jìn)行了描述。
Ruppert等人[Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]用于復(fù)性成熟BMP-2的方法基于US專利5,650,494[Cerletti等人，1997]，該方法涉及類TGF-β蛋白質(zhì)，BMP-2也屬于這些蛋白質(zhì)。該方法包括將類TGF-β蛋白質(zhì)單體的且變性的成熟形式在溫和去污劑存在下復(fù)性，從而得到具有生物活性的構(gòu)象。就BMP-2而言，每1g這樣的細(xì)胞中只獲得0.2mg活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率[Ruppert等人，Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]。
使用本發(fā)明以受誘導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)量計(jì)則可能獲得超過25倍的更高產(chǎn)率。該產(chǎn)率甚至比在真核細(xì)胞中表達(dá)時(shí)所獲得的產(chǎn)率高大約3個(gè)數(shù)量級(jí)。
由于復(fù)雜的二硫模式(胱氨酸結(jié))，復(fù)性大腸桿菌(E.coli)重組細(xì)胞中表達(dá)的成熟BMP的復(fù)性產(chǎn)率非常的低。本發(fā)明是基于以下的假設(shè)BMP-2前肽和同源蛋白質(zhì)的前肽一樣在對(duì)于成熟區(qū)域的正確折疊負(fù)責(zé)。
根據(jù)本發(fā)明用于重組體制備TGF-β超家族的生物活性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于(a)一種蛋白質(zhì)，其氨末端由一種TGF-β超家族蛋白質(zhì)的前序列或部分所述前序列組成，所述氨末端與此種或另一種TGF-β超家族蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域連接，該蛋白質(zhì)與成熟BMP-2具有至少35％同源性。在至少部分蛋白質(zhì)能以包含體的形式而獲得的條件下將所述蛋白質(zhì)于原核生物中進(jìn)行表達(dá)；(b)分離包含體并在變性條件下溶解；(c)將包含體中溶解的、變性的、單體的和無生物活性的蛋白質(zhì)復(fù)性，以此使其能夠折疊和二聚體化形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象；和(d)如果必要，在復(fù)性之后經(jīng)蛋白質(zhì)水解將成熟蛋白質(zhì)從其前體形式中釋放出來。
我們的體外復(fù)性實(shí)驗(yàn)表明，根據(jù)本發(fā)明，甚至在缺少去污劑的條件下也有可能相對(duì)容易地通過用假定的BMP-2前體形式(Gly20-Arg396)以及隨后切除前肽(Gly20-Arg282)的方法來獲得大量的具有生物活性的drBMP-2。對(duì)于drBMP-2的理解是從Lys290、Arg291或Leu292(見實(shí)施例2.2.1)至Arg396的BMP-2的C末端區(qū)域，其生物活性已經(jīng)由Koenig等人[Mol.Cell Biol.14(1994)，5961-5974]進(jìn)行了描述。氨基酸序列(Gln283至Arg289、Lys290或Arg291)介導(dǎo)BMP-2與肝素的結(jié)合。
盡管這一非特異性的相互作用調(diào)節(jié)了BMP-2的效用，但是其對(duì)于BMP-2的生物活性不是必需的[Ruppert等人，Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]。
根據(jù)本發(fā)明，完整的前序列(Gly20-Arg282)或者其部分可以用作前序列或前肽。
為了增加probmp-2在原核生物中的表達(dá)率，根據(jù)本發(fā)明可以將標(biāo)簽序列(例如編碼組氨酸標(biāo)簽)連接到編碼該基因序列的5′末端，或者采用誘變來優(yōu)化用于原核表達(dá)的probmp-2密碼子。還有可以用US專利5,336,602[Brinkmann等人，1993]中所描述的方法來增加表達(dá)，或者采用這些方法的聯(lián)合。
當(dāng)重組的probmp-2在原核生物細(xì)胞質(zhì)中過量表達(dá)時(shí)，蛋白質(zhì)就以無活性的且不溶的聚集體(包含體-IB)形式在細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)。為了分離它們，在發(fā)酵之后首先要采用一種或多種常規(guī)方法(例如，高壓分散、酶裂解或超聲破碎)將細(xì)胞破碎，該過程優(yōu)選地在中性至弱酸性緩沖溶液(例如0.1M Tris/HCl pH 7.0)中進(jìn)行。
通過機(jī)械的、化學(xué)的或者優(yōu)選酶的處理將細(xì)胞DNA降解成不會(huì)與IB共沉降的片段。不溶的細(xì)胞組分(包括IB)以任意的方式與可溶的組分分離，優(yōu)選地通過離心來分離。用溶液洗滌沉淀，由于它們的組成或添加到它們中的物質(zhì)(如去污劑)從而使得該溶液能夠從IB中溶解出干擾的細(xì)胞蛋白質(zhì)和膜成分而不是重組體proBMP-2。隨后根據(jù)本發(fā)明將剩下的、不溶的并含有proBMP-2的部分進(jìn)行溶解、復(fù)性和用酶加工。
在復(fù)性之前，將IB溶解，該過程使用常用的變性試劑(離液序列高的物質(zhì))或這些試劑的聯(lián)合物。除此之外，這些試劑包括胍鹽如GdmCl或GdmSCN，以及尿素與其衍生物。在此變性試劑或其混和物的濃度是如此調(diào)整的，以便將重組的難于溶解的蛋白質(zhì)完全地溶解。在氯化胍的情況下，濃度為3-8M；在尿素的情況下，濃度為6-10M。為了完全單體化經(jīng)如此變性的、可溶的并含有胱氨酸的蛋白質(zhì)，優(yōu)選添加還原試劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇或者還原試劑的聯(lián)合物，溶解緩沖液的pH優(yōu)選地調(diào)整至8-9。在溶解之后，或與之同時(shí)，也可以共價(jià)修飾游離的半胱氨酸，例如用氧化型谷胱甘肽。在溶解或者可選的半胱氨酸共價(jià)修飾之后，IB溶解液的pH優(yōu)選地調(diào)整至5或稍低；再次可選地，通過透析除去過量的氧化還原當(dāng)量物，若不考慮還原試劑，該透析緩沖液適當(dāng)?shù)鼐哂泻腿芙饩彌_液同樣的組成。最后，將經(jīng)過溶解程序后仍然不溶的組分分離出來(離心或過濾)并丟棄?？蛇x的修飾步驟和過量還原試劑的去除能夠使IB溶解液通過固定化金屬親和層析(IMAC)得到預(yù)純化，只要proBMP-2的表達(dá)使用N末端組氨酸標(biāo)簽。
根據(jù)本發(fā)明用于復(fù)性rh-proBMP-2的方法包括降低變性試劑的濃度至無變性作用或只有弱變性作用的水平(如≤0.5M GdmCl)。該過程優(yōu)選通過用復(fù)性緩沖液緩慢地連續(xù)或逐步稀釋溶解液來實(shí)現(xiàn)。為了使生物活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)率最大化，必需注意在此的混和盡可能快速和徹底地進(jìn)行，其例如通過劇烈攪拌得以保證。
用于稀釋的另一種方法為用復(fù)性緩沖液來透析溶解液。每次的條件應(yīng)如此選擇從而使得形成的蛋白質(zhì)聚集體最少。蛋白質(zhì)的復(fù)性在變性試劑的最初稀釋期間可能已經(jīng)發(fā)生了。在稀釋或透析之后，復(fù)性緩沖液中rh-proBMP-2的最終濃度為10-1000μg/ml，優(yōu)選的為50-250μg/ml。
當(dāng)不正確折疊的多肽鏈和折疊中間體(≥二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程[Kiefhaber等人，Biotechnology(N.Y.)9(1991)，825-829])的非生產(chǎn)性聚集進(jìn)行得明顯慢于多肽單鏈的折疊成天然的構(gòu)象(一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程)時(shí)，則保證了最佳的蛋白質(zhì)濃度。
所用復(fù)性緩沖液的pH為6.5-10，理想的為8-9。因此合適的緩沖液為任何具有中性至堿性pKa的緩沖液，優(yōu)選的為Tris緩沖液和磷酸緩沖液以及這些緩沖液的綜合。此外，向復(fù)性緩沖液中加入能夠增加復(fù)性產(chǎn)率的低分子量輔助試劑[US專利5,593,865，Rudolph等人，1995]是有利的。特別適合的是在L-精氨酸(濃度為0.2-2.0M，優(yōu)選的為0.5-1.5M L-精氨酸)存在下進(jìn)行復(fù)性。根據(jù)本發(fā)明，復(fù)性緩沖液的另一種成分為一種或多種硫醇化合物的還原和氧化形式的集合物。這樣的集合物的例子為還原型(GSH)與氧化型(GSSG)谷胱甘肽、半胱氨酸與胱氨酸、半胱胺與胱胺以及β-巰基乙醇與2，2′-羥乙基二硫。借助這種人工氧化還原系統(tǒng)使蛋白質(zhì)的復(fù)性在熱力學(xué)上得以控制。通過硫醇成分氧化形式的存在來確保必要的形成二硫橋的可能性[Creighton，Biochemistry 378(1997)，731-744]，通過硫醇成分還原形式的存在來確保重新打斷不正確形成的胱氨酸(改組)的可能性[Creighton等人，Trends Biotechnol.13(1995)，18-23]，是對(duì)于多肽鏈的正確折疊所必需的。
優(yōu)選以還原(GSH)和氧化(GSSG)形式使用谷胱甘肽，其濃度分別可達(dá)10mM，且理想的比例為5mM GSSG2mM GSH。
根據(jù)本發(fā)明，復(fù)性緩沖液優(yōu)選地含有一種或多種絡(luò)合試劑，如EDTA(乙二胺四乙酸)，其濃度可達(dá)20mM(優(yōu)選的為大約5mM)。這一方面是為了阻止還原性硫醇成分通過金屬離子發(fā)生不受控制的加速的氧化；另一方面是為了抑制可能污染復(fù)性物的金屬蛋白酶。
根據(jù)本發(fā)明，復(fù)性可以適當(dāng)?shù)赜?-20℃的溫度經(jīng)歷1-21天來進(jìn)行，優(yōu)選5-10℃和5-10天。
相對(duì)較長(zhǎng)的復(fù)性時(shí)間可以用proBMP-2多肽鏈的共價(jià)二聚體化來解釋。我們的實(shí)驗(yàn)表明，在本發(fā)明的條件下，游離硫醇基的氧化而不是蛋白質(zhì)濃度決定了該過程的速率。
在復(fù)性過程結(jié)束之后，根據(jù)本發(fā)明將復(fù)性混和物優(yōu)選地用酸性(pH≤5)緩沖液進(jìn)行透析，該緩沖液不含有任何在本發(fā)明含義內(nèi)的低分子量輔助試劑。當(dāng)透析以最大可能的程度聚集不正確折疊的多肽鏈和折疊中間體而使之可以通過離心、過濾或其他常規(guī)方法來分離時(shí)，透析緩沖液則符合根據(jù)本發(fā)明的方法。在透析之前，最好先濃縮復(fù)性混和物(如采用交叉流過濾)，隨后可以在復(fù)性條件下附加以孵育時(shí)間。向緩沖液中通氣，也可以在濃縮過程中進(jìn)行，其可加速游離硫醇基的氧化從而可具有縮短復(fù)性時(shí)間的效用。這也可以通過加入具有氧化作用的物質(zhì)來完成。
根據(jù)本發(fā)明，層析分離方法能夠用于將單體的、不正確折疊的或非二聚體的、正確折疊的從復(fù)性rh-proBMP-2的天然二聚體形式分離開，優(yōu)選地采用反相HPLC。對(duì)于此目的，合適的柱材料尤其為基于二氧化硅的C4-基質(zhì)或者具有同等或更強(qiáng)疏水性的基于多聚體的顆粒，由于蛋白質(zhì)的大小而采用≥300的孔徑是恰當(dāng)?shù)?。合適的洗脫劑為那些在RP-HPLC中常用的試劑，如乙腈、2-丙醇或乙醇。根據(jù)本發(fā)明，在這方面可使用離子對(duì)形成劑，優(yōu)選地以常規(guī)濃度使用三氟乙酸或全氟丁酸。
用于純化二聚體的且天然折疊的proBMP-2的另一個(gè)可能性為使用肝素親和層析。關(guān)于這方面，為了增加蛋白質(zhì)的溶解性和避免proBMP-2與柱材料之間非特異性相互作用，應(yīng)當(dāng)使用濃度為2-8mol/L，優(yōu)選的為5mol/L的尿素作為緩沖液的添加物。HiTrap肝素-瓊脂糖(Amersham Phamracia Biotech)是在此特別合適作為柱材料。然后proBMP-2的單體形式在低于300mol NaCl/L的濃度下從基質(zhì)上洗脫下來，同時(shí)二聚體形式在更高的鹽濃度下洗脫。
WO 00/22119[Rattenholl等人，2000]已經(jīng)描述了不屬于TGF-β家族的神經(jīng)生長(zhǎng)因子β-NGF的生物活性蛋白質(zhì)從其失活的變性前體形式中獲取的方法。β-NGF與BMP-2的區(qū)別尤其在于它們前序列的長(zhǎng)度(β-NGF-103氨基酸；BMP-2-263氨基酸)。在三級(jí)結(jié)構(gòu)上也有著重要的差異[McDonald和Hendrickson，Cell 73(1993)，421-424]。因此本發(fā)明在基本觀點(diǎn)上不同于WO 00/22119是不令人驚訝的。
對(duì)于正確折疊的rh-proBMP-2的最大產(chǎn)率所需的復(fù)性時(shí)間(1-21天)明顯長(zhǎng)于用于rh-proNGF的復(fù)性時(shí)間(3小時(shí))。在體內(nèi)，BMP-2的前體形式與β-NGF的一樣由弗林蛋白酶類型的激素原轉(zhuǎn)變酶進(jìn)行加工。這種轉(zhuǎn)變酶識(shí)別前序列末端的成對(duì)堿性序列基元。它們的最后一個(gè)氨基酸為Arg282。在體外，具有同樣底物特異性的蛋白酶能夠切除BMP-2前肽或β-NGF前肽。
可是，復(fù)性rh-proBMP-2的加工需要完全不同于那些用于切割proNGF的條件。雖然根據(jù)本發(fā)明使用的BMP-2前序列具有263個(gè)氨基酸比成熟蛋白質(zhì)(114個(gè)氨基酸)長(zhǎng)許多，但是在我們的實(shí)驗(yàn)中驚訝地發(fā)現(xiàn)proBMP-2的溶解特性是由其成熟區(qū)域決定的。因此與BMP-2前肽(Gly20-Arg282)相反，proBMP-2在無任何增溶劑時(shí)只在≤5的pH下以高濃度可溶。在酸性pH，不可能用蛋白酶(胰蛋白酶，PACE(成對(duì)堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶；在成對(duì)堿性基元之后切割的真核生物內(nèi)肽酶))來有效地加工前體形式。可是，為了使得蛋白水解切割能夠發(fā)生，根據(jù)本發(fā)明可使用任何非抑制性增溶劑，尤其是分別為1-5M和0.1-2M的濃度使用尿素或三羥甲基氨基甲烷(Tris)，它們可以單獨(dú)或者聯(lián)合使用(優(yōu)選的為2-4M尿素與0.1-1M Tris聯(lián)合)。使用這些添加劑，就有可能將proBMP-2以≥1mg/ml的濃度甚至在使用蛋白酶的最佳pH(7-8)條件下保持在溶液之中。
透析適合用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水解的緩沖條件。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用類胰蛋白酶的蛋白酶，其使用的質(zhì)量比為1∶10-1∶1000(胰蛋白酶，rh-proBMP-2)，優(yōu)選的為1∶20-1∶100。將混和物孵育1分鐘至24小時(shí)，優(yōu)選為30分鐘至6小時(shí)，其溫度為0-37℃，優(yōu)選10-25℃。在Tris的情況下，增溶劑本身作為緩沖物質(zhì)起作用，且在尿素的情況下，以指定的濃度附加Tris緩沖液作為緩沖物質(zhì)起作用。此外，高濃度的Tris，例如0.5M，可防止通過可能是由尿素形成的異氰酸鹽所引起的氨基酸側(cè)鏈的共價(jià)修飾。
將pH調(diào)整至對(duì)于相關(guān)蛋白酶有利的值，優(yōu)選的為7-8。為了抑制由金屬蛋白酶所引起的非特異性的蛋白水解性降解，根據(jù)本發(fā)明加入絡(luò)合試劑如1-20mM EDTA是適宜的。通過加入一種或多種蛋白酶抑制劑或者通過用酸調(diào)整pH≤5來終止蛋白水解，蛋白酶抑制劑優(yōu)選1-5mM苯甲基磺酰氟(PMSF)或者相對(duì)于胰蛋白酶過量2-20倍摩爾的獲自牛胰腺或大豆的胰蛋白酶抑制劑(BPTI/SBTI)[Rudolph等人，蛋白質(zhì)折疊(Folding proteins)，in Protein FunctionA PracticalApproach，T.E.Creighton(編者)，第二版，(1997)，57-99]。
成熟BMP-2(Gln283-Arg291)的N末端是松散的，因此其對(duì)于蛋白酶敏感。另外，其含有一些精氨酸和賴氨酸殘基(Arg289，291，Lys285，287，290)。用優(yōu)選在這些堿性氨基酸之后切割的胰蛋白酶進(jìn)行限制性蛋白水解，因此也導(dǎo)致成熟BMP-2易變形的N末端的切除。結(jié)果產(chǎn)生的drBMP-2的生物活性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了證實(shí)。根據(jù)本發(fā)明，視需要也有可能通過蛋白質(zhì)工程來引入附加的二硫橋以用于固定和穩(wěn)定成熟BMP-2的N末端，如在相關(guān)的TGF-β中存在的一樣，這樣做是為了保護(hù)BMP-2的肝素結(jié)合位點(diǎn)不被蛋白水解性降解。我們對(duì)于rh-proBMP-2限制性蛋白水解的實(shí)驗(yàn)在缺少根據(jù)本發(fā)明的增溶劑濃度而相應(yīng)較低的蛋白質(zhì)濃度情況下進(jìn)行，其表明前肽由至少一個(gè)從成熟蛋白質(zhì)切除后仍具有大部分蛋白酶抗性的區(qū)域組成。所使用的一些增溶劑本身在其使用濃度下具有部分弱的變性作用。其結(jié)果是，沒有通過鏈內(nèi)二硫橋來穩(wěn)定的BMP-2前肽的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易受蛋白酶影響并因此能夠在根據(jù)本發(fā)明的限制性蛋白水解的條件下降解。
由于天然BMP-2的極端疏水性[Scheufler等人，J.Mol.Biol.287(1999)，103-115]，通過疏水相互作用的純化作為純化蛋白水解產(chǎn)物的方法。根據(jù)本發(fā)明，為此目的優(yōu)選地使用與已獲得的drBMP-2牢固結(jié)合的柱材料，而其他降解產(chǎn)物和所用蛋白酶和/或抑制劑只與該材料發(fā)生弱的相互作用。依照本發(fā)明，可以在蛋白水解之后改變緩沖條件，以使drBMP-2沉淀出來，而其他降解產(chǎn)物、蛋白酶和/或其抑制劑繼續(xù)存在于溶液之中。在drBMP-2與上清液分離之后，沉淀的drBMP-2接著可以在合適的緩沖液或溶劑中再次溶解。在合適的柱材料存在的情況下，這種對(duì)于沉淀?xiàng)l件的改變優(yōu)選地通過透析來實(shí)現(xiàn)，合適的柱材料尤其為“Fractogel EMD苯基S”(Merck)或可相比的材料如苯基瓊脂糖(Pharmacia)。如果該材料以極過量的方式使用，就有可能獲得這樣的情形，即在蛋白質(zhì)聚集之前其就已經(jīng)結(jié)合到該材料上去了。在以這樣的方式將蛋白質(zhì)裝載到柱材料上之后，不希望的成分可以通過適當(dāng)?shù)南礈觳襟E來去除。將drBMP-2在由溫和至強(qiáng)的變性(但絕不是還原)條件下適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行洗脫。根據(jù)柱材料，合適的洗脫劑相應(yīng)地為精氨酸、尿素或胍鹽，它們?cè)诘蜐舛认乱部捎糜谙礈熘牧?。視需要，在洗脫之后，將含有drBMP-2的組分合并，且特別優(yōu)選地用0.1％三氟乙酸(TFA)或乙酸銨進(jìn)行透析，它們是對(duì)于BMP-2的最終應(yīng)用非常合適的溶劑。根據(jù)本發(fā)明，還可以用反相材料(優(yōu)選的為C4-RP-HPLC)分離蛋白水解產(chǎn)物，該洗脫優(yōu)選地在乙腈梯度中使用0.1％TFA來進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明復(fù)性的且在切除前序列之后獲得的成熟BMP-2可以用于促進(jìn)骨生長(zhǎng)，該應(yīng)用以為此目的所常用的方式進(jìn)行。可是，令人驚訝的是，仍含有完整的前序列或截短的前序列的復(fù)性proBMP-2具有和成熟BMP-2相等的生物活性，其可以像成熟BMP-2一樣使用。因此本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)還涉及含有作為活性化合物的proBMP-2用于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的藥物。其可以含有完整的前序列或截短的前序列。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用proBMP-2和各種醫(yī)用植入材料的聯(lián)合物用于發(fā)生于創(chuàng)傷、矯形、耳、鼻、喉外科和口腔與上頜面外科以及神經(jīng)外科之中的臨時(shí)性骨替代(骨替代材料)和永久性骨與關(guān)節(jié)替代(金屬植入物，如髖和膝關(guān)節(jié)內(nèi)用假體)。在此proBMP-2一方面可用作后加的植入物涂層，以薄的蛋白質(zhì)膜的形式，用或不用粘合劑(如硅烷)粘附于所有的內(nèi)和外表面。另一方面proBMP-2可用作植入物的整合組分，這是通過將其加入到通過化學(xué)聚合或固化作用制備的固體終產(chǎn)物的非固體前體(例如磷酸鈣膠結(jié)材料，如Norian SRS、Ostim及其他)之中來實(shí)現(xiàn)的。
天然或人工來源的無機(jī)和有機(jī)材料以及這兩種材料的混和形式均適合作為植入物用于短暫的骨替代。無機(jī)骨替代材料的實(shí)例為由羥磷灰石構(gòu)成的陶瓷材料、β-磷酸三鈣、α-磷酸三鈣、玻璃陶瓷材料、生物玻璃、碳酸鈣、硫酸鈣和其他未列出的以結(jié)晶和無定形形式(包括基于磷酸鈣的注射用骨膠結(jié)劑)存在的鈣鹽。合適的有機(jī)材料為膠原蛋白、骨組織、去礦物質(zhì)的骨基質(zhì)、可凝膠多糖(如透明質(zhì)酸)、生物耐受的合成材料(如聚乳酸、聚丙烯酸甲酯、聚乙二醇)以及其他等等，其采用不同的混和形式和處理形式。內(nèi)用假體和其他金屬植入物(如那些用于脊柱固定的金屬)適合用于永久性骨替代。通常在此涉及由各種不銹鋼和鈦合金組成的產(chǎn)物，其中的一些也可以擬定使用羥磷灰石涂層。
因此，本發(fā)明的其他目標(biāo)為在成熟BMP-2上連接有完整或截短前序列的proBMP-2，含有該物質(zhì)的藥物以及如專利權(quán)利要求中所定義的用于生產(chǎn)促進(jìn)骨生長(zhǎng)藥物的方法。proBMP-2的完整序列Gly20-Arg396，包含20個(gè)氨基酸的His標(biāo)簽和起始密碼子Met，在表2中顯示。氨基酸Met1至His20為pET-15b所編碼的His標(biāo)簽的組成部分。BMP-2的前序列開始于Gly22。附加的甲硫氨酸位于His標(biāo)簽和前序列之間。這里描述的序列中的Gly22-Arg398相應(yīng)于人類preproBMP-2cDNA的主要翻譯產(chǎn)物之中的Gly20-Arg396，本文中的序列數(shù)據(jù)就是引入該cDNA的序列。
下面的實(shí)施例結(jié)合圖示闡明了本發(fā)明。在這些圖示中

圖1 SDS-PAGE電泳圖譜。
圖2 UV-CD光譜。
圖3 各種情況下proBMP-2的發(fā)射光譜。
圖4 SDS-PAGE電泳圖譜。
圖5 RP-HPLC層析譜。
圖6 UV-CD光譜。
圖7 各種情況下drBMP-2的MALDI-TOF質(zhì)譜圖。
圖8 rh-proBMP-2的RP-HPLC圖解。
圖9 rh-proBMP-2植入物的組織切片。陶瓷的內(nèi)和外表面都被骨物質(zhì)所覆蓋?？椎膬?nèi)部包含著含有許多脂肪細(xì)胞的骨髓(植入材料-深暗色，骨-亮藍(lán)色)。在左下部可以看到一些肌肉纖維(暗藍(lán)色)和結(jié)締組織。
圖10 rh-proBMP-2植入物在高放大率下的組織切片。骨物質(zhì)(左上部至右下部，亮藍(lán)色)和它所覆蓋的陶瓷材料(右邊，灰色)非常緊密地接觸。活性成骨細(xì)胞成排地存在于骨物質(zhì)和造血組織之間。
圖11 在植入物中AP活性的比較。
實(shí)施例實(shí)施例1制備proBMP-2將probmp-2 cDNA克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)載體中由Novagen所提供的T7表達(dá)系統(tǒng)[Studier和Moffat，J.Mol.Biol.189(1986)，113-130]用于克隆probmp-2 cDNA。
將含有插入的preprobmp-2-cDNA的pcDNA3載體(Boehringer-Mannheim GmbH)用作為起始DNA。編碼BMP-2的氨基酸Gly20-Arg396的DNA通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來獲得。在此，使用誘變引物從而在5′-末端插入一個(gè)甲硫氨酸密碼子作為翻譯起始點(diǎn)，并且將3′-末端終止密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榇竽c桿菌典型性終止密碼子以及用第二終止密碼子來補(bǔ)充之。此外引物含有NdeI切割位點(diǎn)(5′-末端)和BamHI切割位點(diǎn)(3′-末端)。這使得隨后在表達(dá)載體pET-15b(Novagen)中的克隆成為可能。該載體還編碼了N末端6個(gè)組氨酸標(biāo)簽，其能夠大幅提高在大腸桿菌中的表達(dá)率。
在克隆結(jié)束之后，通過DNA測(cè)序檢查核苷酸序列[Sanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977)，5463-5467]。
使用下面的引物正向引物“PrimerFwProBMP”NdeI5′-cg gaa ttcca↓t atgggt gcg gct ggc ctc gtt cc-3′Met Gly Ala Ala Gly Leu ValH2N→反向引物“PrimerRevBMP”BamHI5′-ccg↓ga tcctta cta gcg aca ccc aca acc-3′Stp Stp Arg Cys Gly Cys GlyHOOC←
用大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌株。這些細(xì)菌中的染色體含有T7-RNA-聚合酶基因，其在lac-啟動(dòng)子的控制之下。因此，聚合酶的表達(dá)可用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)。probmp-2基因由T7啟動(dòng)子控制。用IPTG的誘導(dǎo)結(jié)果導(dǎo)致proBMP-2的形成。為了進(jìn)一步增加表達(dá)率，將細(xì)胞用pUBS520進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。該質(zhì)粒含有在大腸桿菌中稀少的精氨酸-tRNA(dnaY)基因。而該tRNA所識(shí)別的精氨酸密碼子(AGA和AGG)特別頻繁地出現(xiàn)在真核生物基因中，在probmp-2中也是如此。除此之外，這些基因在大腸桿菌中的表達(dá)率依賴于該tRNA的可供性[Brinkmann等人，Gene，85(1989)，109-114]。
人proBMP-2在大腸桿菌中的表達(dá)為了增殖重組體細(xì)菌菌株，向適當(dāng)體積(通常為1.5L)的2·YT培養(yǎng)基中加入100μg氨芐青霉素/ml和50μg卡那霉素/ml，該培養(yǎng)基用單克隆接種。
2·YT培養(yǎng)基(1L)17g胰蛋白胨10g酵母提取物5g NaCl培養(yǎng)物于37℃以160-200rpm進(jìn)行搖動(dòng)。用1mM 1PTG誘導(dǎo)培養(yǎng)物(OD600為1-1.3)。然后于相同的溫度再搖動(dòng)3-4小時(shí)，如此可重復(fù)的細(xì)胞密度在誘導(dǎo)后達(dá)到OD6003-3.5。通過在10,000g離心來收獲細(xì)胞。這樣，每1L培養(yǎng)基可以獲得3-3.5g細(xì)胞(濕重)。作為對(duì)于即刻的細(xì)胞分解的一種可選方法，首先將細(xì)胞在液氮中冷凍，然后在-20℃冷凍。
包含體(IB)的分離當(dāng)重組體probmp-2表達(dá)時(shí)，聚集體如包含體(IB)在細(xì)菌細(xì)胞中形成。這些IB按照Rudolph等人在“蛋白質(zhì)折疊”(“ProteinFunctionA Practical Approach”，T.E.Creighton(出版社)，第二版，(1997)，57-99)中所描述的方法進(jìn)行制備。
各將5g細(xì)胞沉淀再次懸浮于25ml的100mM Tris/HCl pH7.0、1mM EDTA溶液中。每1g濕重細(xì)胞加入1.5mg溶菌酶之后，將細(xì)胞懸浮液于4℃孵育30分鐘。最后，采用高壓分散(Gaulin勻漿器)將細(xì)胞破裂。加入3mM MgCl2和10μgDNA酶/ml之后，將勻漿在25℃下再孵育30分鐘。然后加入0.5體積的60mM EDTA、6％Triton X-100、1.5M NaCl pH7.0，再于4℃下繼續(xù)孵育30分鐘從而溶解不溶的細(xì)胞組分。在這些條件下，IB保持不溶并可通過于39,000g離心來分離。為了再次從IB中除去過量的去污劑，用100mM Tris/HClpH7.0、20mM EDTA再洗滌IB 5次，最后將其等分并貯存于-20℃。
這樣就可以可重復(fù)地從每1g經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌細(xì)胞中獲得180-210mg IB，其具有30-35％的蛋白含量并含有90-95％rh-pro-BMP-2。
IB的溶解將100-150mg IB沉淀在1ml的100mM Tris/HCl pH8.0、6MGdmCl、100mM DTT、1mM EDTA溶液中于25℃溶解4小時(shí)。隨后，用乙酸調(diào)整pH至3-4，通過于16,000g離心20分鐘將不溶組分沉淀出來。然后將上清液在超速離心機(jī)中于266,000g再次離心30分鐘，從而分離出微聚集體。蛋白質(zhì)濃度通過于λ＝280nm測(cè)量吸收來測(cè)定[Gill和von Hippel，Anal.Biochem.，182(1989)，319-326]，其為30-52mg/ml。
proBMP-2的純化在此回收率(大約70％)與分析規(guī)模相當(dāng)。
在1ml HiTrap肝素-瓊脂糖(Amersham Pharmacia Biotech)上的肝素親和層析用作第二個(gè)純化方法。所使用的緩沖系統(tǒng)為-0.1mol/L Tris pH7.56、6mol/L尿素(緩沖液A)，和-0.1mol/L Tris/HCl pH7.5、6mol/L尿素、1mol/L NaCl(緩沖液B)。
柱用超過10倍柱體積的緩沖液A平衡。用0-20％梯度的緩沖液B洗脫掉雜質(zhì)。用20-50％梯度的緩沖液B以每分鐘1毫升的流速在30分鐘內(nèi)分離開單體和二聚體proBMP-2。
以制備規(guī)模復(fù)性rh-proBMP-2將含有4M GdmCl pH4的proBMP-2-IB溶解液稀釋以便復(fù)性，從而溶解液經(jīng)過在折疊緩沖液中的完全稀釋之后，GdmCl的最終濃度達(dá)到50-60mM。proBMP-2的最終濃度為3-4μM(相當(dāng)于135-180μg/ml)。
折疊緩沖液100mM Tris/HCl，pH8.01M L-精氨酸5mM GSSG2mM GSH5mM EDTA折疊緩沖液經(jīng)過濾和脫氣之后，將溶解液在攪拌的同時(shí)緩慢加入(約20ml/小時(shí))，然后將混和物于5℃孵育7天。在此溶解液所帶有的DTT殘余物相當(dāng)于至多0.4mM GSH的濃度。
折疊混和物采用交叉流過濾進(jìn)行濃縮(Filtron Minisette，膜30kDa開放通道)。然后將濃縮液用20倍體積的50mM乙酸鈉(pH5.0)進(jìn)行透析5次，每次24小時(shí)，隨后聚集的蛋白質(zhì)于75,000g離心2小時(shí)而沉淀出來。留在溶液中的蛋白質(zhì)量通過λ＝280nm測(cè)量吸收來測(cè)定，根據(jù)最初所使用的IB溶解液的蛋白質(zhì)含量，其可重復(fù)地為大約50％。
proBMP-2的純化RP-HPLC用于分析性或半制備性分離(不正確或正確折疊的)單體rh-proBMP-2和天然二聚體rh-proBMP-2。當(dāng)分析規(guī)模時(shí)，使用蛋白質(zhì)RP柱(150×3.6mm，YMC)，并用0.1％全氟丁酸(HFBA)的水或ACN溶液作為流動(dòng)相(見圖8)。單體和二聚體的分離也通過用三氟乙酸作為離子對(duì)形成劑來完成。由于其更高的疏水性，與在成熟BMP-2的情況下一樣，二聚體在比單體或不正確折疊的單體在更晚的階段洗脫。當(dāng)半制備規(guī)模時(shí)，使用含有Source 15 RPC材料(Pharmacia)的柱。在此分離波形和回收率(大約70％)相似于分析規(guī)模。
rh-proBMP-2的鑒定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的純度分析和分子量測(cè)定SDS-PAGE分析表明根據(jù)本發(fā)明所制備的proBMP-2 IB具有高純度(≥90％；圖1，泳道2-5)，這意味著可以不經(jīng)任何預(yù)純化而將它們用于復(fù)性。
在非還原性條件(添加碘乙酰胺導(dǎo)致游離硫醇基不可逆的氧化性修飾)下進(jìn)行的SDS-PAGE顯示出經(jīng)復(fù)性的proBMP-2展現(xiàn)了高度的共價(jià)二聚體化(≥90％)，其表明正確地形成了二硫橋以及因此形成了蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)(圖1，泳道6)。
N末端序列分析在完成SDS-PAGE和PVDF膜上的蛋白質(zhì)印跡法之后，進(jìn)行N末端測(cè)序[Edman和Begg，Eur.J.Biochem.1(1967)，80-91]。在復(fù)性的proBMP-2的情況下，測(cè)序得到下列氨基酸序列Gly-Ser-Ser-His-His-。
這相當(dāng)于切除起始甲硫氨酸后具有組氨酸標(biāo)簽的重組體proBMP-2的N末端。
圓二色譜法和熒光光譜法對(duì)于復(fù)性的proBMP-2和再次變性的proBMP-2所進(jìn)行的熒光光譜和CD光譜分析清晰地表明二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的存在。通過復(fù)性的和變性的proBMP-2在遠(yuǎn)UV-CD光譜中大約λ＝220nm區(qū)域內(nèi)橢圓率之間的明顯差異，可以推斷在根據(jù)本發(fā)明的復(fù)性過程中形成了二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。和變性蛋白質(zhì)相比較，復(fù)性proBMP-2的熒光發(fā)射最大值向更低波長(zhǎng)偏移(圖3)，這對(duì)于天然三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成是典型的特征。在此蛋白質(zhì)的色氨酸殘基(每個(gè)proBMP-2多肽鏈有5個(gè)色氨酸)經(jīng)過溶劑的極性環(huán)境進(jìn)入折疊蛋白質(zhì)的非極性中心，在那里它們?cè)诳臻g上也是固定的。這樣就減少了激發(fā)能的損失，從而導(dǎo)致發(fā)射出更高頻率的光[Schmid“光學(xué)光譜學(xué)用于鑒定蛋白質(zhì)構(gòu)象和構(gòu)象改變(Optical spectroscopy to characterize protein conformationand conformational changes)”，Protein StructureAPractical Approach，T.E.Creighton(出版社)，第二版，(1996)，261-297頁]。從熒光光譜中還清晰地顯示出在低pH中proBMP-2結(jié)構(gòu)經(jīng)歷的變化，即為成熟BMP-2和proBMP-2具有高度溶解性的區(qū)域。根據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)所表明的，這可能歸因于部分地未折疊的前肽(未顯示數(shù)據(jù))。
MALDI-TOF質(zhì)譜分析法和N末端序列分析-表觀分子量89803.0078Da-見圖7-計(jì)算的分子量(不包括起始甲硫氨酸)89801.2Darh-proBMP-2和rh-drBMP-2的生物活性經(jīng)修飾的rh-proBMP-2和rh-drBMP-2蛋白質(zhì)的骨誘導(dǎo)活性在使用小實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的異位骨誘導(dǎo)模型中進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)此，將規(guī)定數(shù)量的用于測(cè)試的指定因子在經(jīng)過過濾滅菌之后(40-200μg；drBMP-2或proBMP-2)應(yīng)用于無菌的、立方形的、在化學(xué)和藥理學(xué)上惰性的β-TCP陶瓷植入基體上。
植入物規(guī)格廠商 -Fa.Mathys，Bettlach，Switzerland商品名-chronOs相純度-＞95％β-TCP孔體積份額-72+/-6％孔大小-80-650μm孔結(jié)構(gòu)-互相連接硬度 -7.7+/-1.2MPa將包覆有因子的植入物和沒有包覆因子但在其他方面同樣處理的對(duì)照植入物移植入8只完全長(zhǎng)大的實(shí)驗(yàn)室大鼠的前腹壁肌肉組織中。對(duì)此，將大鼠麻醉之后，在皮膚內(nèi)制造幾個(gè)大約1cm長(zhǎng)的外科切口，最上面的肌肉層位于其下。通過無出血性手術(shù)在腹部肌肉層的兩個(gè)斜肌之間產(chǎn)生一個(gè)空腔，隨后將植入物放入該空腔內(nèi)并用外科縫合線縫合傷口。30天放置期后，處死動(dòng)物，然后將植入物連同周圍組織一起切除，并用顯微鏡和組織學(xué)手段檢查骨新生狀況。在所有包覆有因子的植入物的情況下，在組織學(xué)上可以清楚地觀察到骨新生，同時(shí)伴隨著具有造血活性的骨髓的形成(見圖8和9)。因此，在二者因子的情況下(在proBMP-2情況下為16/16；在drBMP-2情況下為8/8)，生物活性分別為100％。所以，可以通過通常不能形成骨的肌肉組織中骨組織的形成明確地提供骨誘導(dǎo)活性的證據(jù)。在組織學(xué)結(jié)果中不能觀察到proBMP-2和成熟drBMP-2之間任何性質(zhì)上的差異。對(duì)照植入物絕沒有導(dǎo)致任何骨新生。相反地，它們只是被包圍于結(jié)締組織之中。
通過測(cè)量植入物中堿性磷酸酶(AP)的活性提供了在rh-proBMP-2或rh-drBMP-2的影響下新生活性骨組織的進(jìn)一步證據(jù)。為了進(jìn)行此程序，每個(gè)植入物的一半在取出之后立即進(jìn)行深度冷凍，并貯存于-80℃。為了提取堿性磷酸酶和測(cè)定其酶活性，將植入物解凍，并于pH7.4的0.1M Tris/HCl、1％Triton X-100(4℃)中用Potter S勻漿器(B.Braun Biotech)將其破碎，然后將不溶解的組分通過離心分離除去。隨后將澄清的上清液用于測(cè)定堿性磷酸酶活性，該測(cè)定使用Ecoline 25(Merck)測(cè)試試劑盒。對(duì)于在該測(cè)試中釋放的4-硝基酚的濃度于25℃和λ＝405nm進(jìn)行5分鐘監(jiān)測(cè)，并用等式1計(jì)算酶活性Akt:=Vb+Vsϵ·Vs·d·ΔEt·1000----(1)]]>其中Vb為緩沖液的體積(1ml)，Vs為樣品體積(25ml)。依照廠商的說明，4-硝基酚的摩爾吸收系數(shù)采用ε＝18,518 L×mol-1×cm-1。結(jié)果所得活性的單位為μmol×min-1×ml-1。測(cè)試結(jié)果總結(jié)在表1和圖10中。雖然含有rh-pro/drBMP-2樣品中的酶活性與(-)對(duì)照相比有顯著的增加，但是rh-drBMP-2樣品的酶活性與含有rh-proBMP-2的樣品相比只是略有增加，不是每種情況下都如此(例外動(dòng)物4、6和8)?？紤]到rh-proBMP-2(大約45kDa)和rh-drBMP-2(大約12kDa)不同的分子量以及這樣的事實(shí)，即rh-proBMP-2樣品不是以純化的形式使用，因此仍然以可達(dá)10％的比例含有不正確折疊的單體種類，所以可以作出以下結(jié)論，在該動(dòng)物模型中，rh-proBMP-2具有可與蛋白質(zhì)(截短)成熟形式相比的誘導(dǎo)骨新生的活性。表1在用drBMP-2或proBMP-2包覆的β-TCP植入物中堿性磷酸酶活性(U)的比較
實(shí)施例2生物活性drBMP-2的獲得rh-proBMP-2的限制性蛋白水解用于制備型蛋白水解rh-proBMP-2，將50ml復(fù)性的蛋白質(zhì)用0.1M Tris/HCl pH7.0、4M尿素、1mM EDTA進(jìn)行透析。聚集體通過離心(75,000g，1小時(shí))分離，并用分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(1.3mg/ml)。歸因于透析的損失總計(jì)為13％。胰蛋白酶(RocheDiagnostics)以1∶100(胰蛋白酶proBMP-2；w/w)的比例使用，并將混和物于5-7℃孵育4小時(shí)。用8倍摩爾過量的大豆胰蛋白酶抑制劑(SBTI；Sigma)將胰蛋白酶失活。將全部混和物在疏水性柱材料(20ml Fractogel-苯基，Merck)存在的條件下用無尿素緩沖液(0.1M Tris/HCl，pH7.0)進(jìn)行透析。將按照此法裝載了drBMP-2的柱材料裝填進(jìn)空柱子(XK-16，Pharmacia)中，然后用下列溶液洗滌·5CV(柱體積)的低鹽緩沖液(透析緩沖液)，
·5 CV的50mM乙酸鈉，pH5.0，·2 CV的50mM乙酸鈉，pH5.0，4M尿素，和·2 CV的50mM乙酸鈉，pH5.0，1M L-精氨酸。
柱子用6M GdmCl、0.2M乙酸洗脫。將含有drBMP-2的部分合并，然后用0.1％TFA進(jìn)行透析。不可能觀察到任何聚集體的形成。透析液通過過濾滅菌，并用分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度(1.3mg/ml)。以這種方法所獲得的BMP-2的產(chǎn)率基于用于限制性蛋白水解的復(fù)性液為大約50％。因此，從1L大腸桿菌培養(yǎng)物中可獲得17mg具有生物活性的drBMP-2，或者從1g(濕重)經(jīng)誘導(dǎo)的大腸桿菌細(xì)胞中獲得5.2mgdrBMP-2(相當(dāng)于5.6mg包含N末端肝素結(jié)合位點(diǎn)的成熟BMP-2)。相反地，使用Ruppert等人[Eur.J.Biochem.237(1996)，295-302]所描述的方法，每1g細(xì)胞只能獲得0.2mg BMP-2。
drBMP-2的鑒定通過N末端測(cè)序來分析蛋白水解產(chǎn)物在完成SDS-PAGE和PVDF膜上的蛋白質(zhì)印跡法之后，進(jìn)行N末端測(cè)序[Edman和Begg，Eur.J.Biochem.1(1967)，80-91]。測(cè)序提供了下列根據(jù)本發(fā)明所產(chǎn)生的drBMP-2的氨基酸序列a)Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-Arg-b)Lys-Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-c)Arg-Leu-Lys-Ser-Ser-Cys-Lys-不同種類相互間的比例為大約3∶2∶1(a∶b∶c)。雖然不能檢測(cè)半胱氨酸，但是可以檢測(cè)跟隨其后的氨基酸?？墒?，該序列是在DNA水平上完全驗(yàn)證的。其相當(dāng)于無肝素結(jié)合位點(diǎn)的成熟BMP-2的N末端。drBMP-2以還原形式和非還原形式用于測(cè)序。非還原形式只可能測(cè)序至第二個(gè)絲氨酸，這暗示了隨后的殘基為胱氨酸，其為二硫橋的組分。綜上所述，蛋白水解產(chǎn)物因此相當(dāng)于在N末端被截短了7-9個(gè)氨基酸從而缺少肝素結(jié)合位點(diǎn)的成熟BMP-2。
在這里所描述的限制性蛋白水解條件下，未形成二硫橋的肽鏈被降解，這意味著，最終只獲得了100％共價(jià)二聚體化的drBMP-2。
用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和HPLC來分析drBMP-2的純度根據(jù)本發(fā)明所獲得的drBMP-2的大小和純度的檢測(cè)方法為，在還原和非還原條件下進(jìn)行SDS-PAGE，然后進(jìn)行銀染(圖4中的泳道6和11)。其為100％的二聚體化和超過95％的純度。
另外，用反相高效液相層析(RP-HPLC；Vydac C4)來檢查drBMP-2的純度和同質(zhì)性。在該實(shí)驗(yàn)中，drBMP-2在46.57％乙腈和0.1％TFA的同一峰中洗脫下來(圖5)，這為蛋白質(zhì)具有相同的結(jié)構(gòu)(尤其是二硫橋)提供了支持。
圓二色譜法由于復(fù)性的和變性的drBMP-2，尤其是還原的和變性的成熟BMP-2(IB溶解液)，在遠(yuǎn)UV CD光譜中210-230nm區(qū)域內(nèi)的橢圓率之間存在明顯的差異(圖6)，因此可以作出以下結(jié)論，在根據(jù)本發(fā)明用于復(fù)性前體蛋白質(zhì)的方法中，在蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域內(nèi)也形成了二級(jí)結(jié)構(gòu)元件。
表2涉及3字母密碼子的proBMP(包括20AA的His標(biāo)簽)MetGlySerSerHisHisHisHisHisHisSerSerGlyLeuValProArgGlySerHisMetGlyAlaAlaGlyLeuValProGluLeuGlyArgArgLysPheAlaAlaAlaSerSerGlyArgProSerSerGlnProSerAspGluValLeuSerGluPheGluLeuArgLeuLeuSerMetPheGlyLeuLysGlnArgProThrProSerArgAspAlaValValProProTyrMetLeuAspLeuTyrArgArgHisSerGlyGlnProGlySerProAlaProAspHisArgLeuGluArgAlaAlaSerArgAlaAsnThrValArgSerPheHisHisGluGluSerLeuGluGluLeuProGluThrSerGlyLysThrThrArgArgPhePhePheAsnLeuSerSerIleProThrGluGluPheIleThrSerAlaGluLeuGlnValPheArgGluGlnMetGlnAspAlaLeuGlyAsnAsnSerSerPheHisHisArgIleAsnIleTyrGluIleIleLysProAlaThrAlaAsnSerLysPheProValThrArgLeuLeuAspThrArgLeuValAsnGlnAsnAlaSerArgTrpGluSerPheAspValThrProAlaValMetArgTrpThrAlaGlnGlyHisAlaAsnHisGlyPheValValGluValAlaHisLeuGluGluLysGlnGltValSerLysArgHisValArgIleSerArgSerLeuHisGlnAspGluHisSerTrpSerGlnIleArgProLeuLeuValThrPheGlyHisAspGlyLysGlyHisProLeuHisLysArgGluLysArgGlnAlaLysHisLysGlnArgLysArgLeuLysSerSerCysLysArgHisProLeuTyrValAspPheSerAspValGlyTrpAsnAspTrpIleValAlaProProGlyTyrHisAlaPheTyrCysHisGlyGluCysProPheProLeuAlaAspHisLeuAsnSerThrAsnHisAlaIleValGlnThrLeuValAsnSerValAsnSerLysIleProLysAlaCysCysValProThrGluLeuSerAlaIleSerMetLeuTyrLeuAspGluAsnGluLysValValLeuLysAsnTyrGlnAspMetValValGluGlyCysGlyCysArg
權(quán)利要求
1.重組地制備TGF-β超家族的生物活性蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，(a)一種蛋白質(zhì)，其氨末端由一種TGF-β超家族蛋白質(zhì)的前序列或部分所述前序列組成，該氨末端與此種或另一種TGF-β超家族蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域連接，該蛋白質(zhì)與成熟BMP-2至少有35％同源性，在至少部分蛋白質(zhì)能以包含體的形式而獲得的條件下將所述蛋白質(zhì)于原核生物中進(jìn)行表達(dá)；(b)分離包含體并在變性條件下溶解；(c)將從包含體中溶解的、變性的、單體的和無生物活性的蛋白質(zhì)復(fù)性，使之通過折疊和二聚體化能夠形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象；和(d)如果必要，在復(fù)性之后經(jīng)蛋白質(zhì)水解將成熟蛋白質(zhì)從其前體形式中釋放出來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制備了drBMP-2。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，為了在原核生物中增加表達(dá)的目的，前體蛋白質(zhì)用氨末端親和標(biāo)簽尤其是聚組氨酸序列加以修飾。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，pET載體尤其是pET-15b用作表達(dá)載體。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，優(yōu)化表達(dá)構(gòu)建體中密碼子的選擇以適于在宿主生物中的翻譯。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，宿主生物中稀少的并對(duì)于翻譯表達(dá)構(gòu)建體所需的tRNA也是過量表達(dá)的。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，過量表達(dá)用BL21(DE3)中的T7表達(dá)系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，以及大腸桿菌中稀少的精氨酸t(yī)RNA(dnaY)基因與該表達(dá)構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，采用高壓分散、酶裂解或超聲波將細(xì)胞破碎。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過用含有去污劑的溶液洗滌來純化包含體，去污劑的濃度經(jīng)過選擇因此能夠溶解干擾的細(xì)胞蛋白質(zhì)和膜成分而不溶解包含體。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，去污劑為Triton X100。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，離液序列高的物質(zhì)或者離液序列高的物質(zhì)的聯(lián)合物用于溶解包含體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所使用的離液序列高的物質(zhì)為3-8M濃度的氯化胍或者6-10M濃度的尿素。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，溶解在還原條件下進(jìn)行。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所使用的還原試劑為二硫蘇糖醇和/或β-巰基乙醇。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，溶解之后共價(jià)修飾游離的半胱氨酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，溶解之后除去還原試劑。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，溶解之后在變性條件下進(jìn)行預(yù)純化。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過降低變性試劑的濃度至無變性作用或只有弱變性作用的水平來復(fù)性前體蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，通過緩慢地連續(xù)或逐步在復(fù)性緩沖液中稀釋溶解液來降低變性試劑的濃度。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，稀釋期間進(jìn)行盡可能徹底的混和，如通過攪拌。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，通過用復(fù)性緩沖液透析溶解液來降低變性試劑的濃度。
22.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用具有中性至堿性pH的復(fù)性緩沖液。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，復(fù)性緩沖液含有L-精氨酸。
24.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，復(fù)性緩沖液含有至少一種還原和氧化形式的硫醇成分。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于，硫醇成分為GSH/GSSH。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，結(jié)束復(fù)性程序之后，將樣品用酸性緩沖液進(jìn)行透析。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于，透析之前，將樣品在透析前用酸性緩沖液濃縮。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27所述的方法，其特征在于，將不溶于酸的組分分離。
29.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用層析法純化前體形式。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，采用RP-HPLC來進(jìn)行純化。
31.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，采用肝素親和層析來進(jìn)行純化。
32.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用蛋白酶切割前體形式從而形成生物活性形式。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所使用的蛋白酶為激素原轉(zhuǎn)化酶。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，使用識(shí)別成對(duì)堿性序列基元的蛋白酶。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，優(yōu)選使用在P1位點(diǎn)(直接在切割位點(diǎn)的氨末端)為堿性殘基的蛋白酶。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，用胰蛋白酶進(jìn)行切割。
37.根據(jù)權(quán)利要求32-36中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，添加至少一種蛋白酶抑制劑以限制蛋白水解。
38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在發(fā)生切割的pH下使用不抑制酶的增溶劑來增加釋放出的蛋白質(zhì)的溶解性。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所使用的增溶劑為三羥甲基氨基甲烷和/或尿素。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，使用0.1-2摩爾的三羥甲基氨基甲烷和/或1-5摩爾的尿素。
41.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，采用沉淀和/或疏水性層析來純化成熟或截短的成熟蛋白質(zhì)。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，進(jìn)行等電沉淀，并將沉淀下來的蛋白質(zhì)再次溶解在酸性溶液中。
43.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，通過降低增溶劑的濃度來進(jìn)行沉淀。
44.根據(jù)權(quán)利要求41-43中任何一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，沉淀?xiàng)l件設(shè)定在層析材料存在的情況下。
45.根據(jù)權(quán)利要求1中a至c所獲得的BMP-2前體形式對(duì)于生產(chǎn)藥物的用途。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的用途，用于生產(chǎn)促進(jìn)骨愈合過程和骨新生過程的藥物。
47.使用權(quán)利要求1的方法可以獲得proBMP-2，其具有表2中氨基酸序列Gly20-Arg396和同樣的但缺少部分前序列Gly20-Arg282的序列。
48.用于促進(jìn)骨生長(zhǎng)的組合物，其特征在于，含有根據(jù)表2具有完整的或截短的前序列Gly20-Arg282的proBMP-2作為活性化合物。
49.用于生產(chǎn)可促進(jìn)骨生長(zhǎng)的組合物的方法，其特征在于，將根據(jù)表2具有完整的或截短的前序列Gly20-Arg282的proBMP-2在適于施用的制劑之中配制。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，包括含有生理耐受的載體材料的制備，該材料用proBMP-2活性物質(zhì)包覆或浸漬。
全文摘要
為了重組生產(chǎn)一種TGF－β超家族的生物活性蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)在原核生物中表達(dá)。該被表達(dá)蛋白質(zhì)的氨末端由一種TGF－β超家族蛋白質(zhì)的前序列或其部分組成，將該蛋白質(zhì)或另一種TGF－β超家族蛋白質(zhì)的成熟區(qū)域連接到該蛋白質(zhì)上，所連接上的蛋白質(zhì)具有和成熟BMP－2至少35％的同源性。蛋白質(zhì)的表達(dá)在至少有一部分蛋白質(zhì)以包含體的形式而獲得。分離出包含體，并在變性條件下溶解。從包含體中溶解的、變性的、單體的和無生物活性的蛋白質(zhì)經(jīng)過折疊和二聚體化變性形成可溶的、有生物活性的構(gòu)象，必要時(shí)，在復(fù)性之后將成熟蛋白質(zhì)從其前體形式中經(jīng)蛋白水解而釋放出來。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1484651SQ01821777
公開日2004年3月24日 申請(qǐng)日期2001年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月29日
發(fā)明者R·魯?shù)婪? E·施沃茨, G·赫爾, F·希爾格, , R 魯?shù)婪? 執(zhí) 申請(qǐng)人:斯?fàn)柕鞍踪|(zhì)有限公司