專利名稱：：異種(人類)免疫球蛋白在克隆轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中的表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明為帶有或者部分或者整個(gè)異種抗體基因座的遺傳修飾有蹄類動物，所述基因座經(jīng)歷了重排并且表達(dá)一個(gè)趨異抗體分子群體。特別是，所述異種抗體基因可以來源于人類。另外，本發(fā)明提供其中所述內(nèi)源抗體基因的表達(dá)或者被減少或者被消除的有蹄類動物。運(yùn)用核轉(zhuǎn)移和分子技術(shù)的組合，制備所述有蹄類動物(例如牛)中的遺傳修飾。這些克隆轉(zhuǎn)基因有蹄類動物提供了一種可更新的、理論上無限的異種多克隆抗體(特別是人抗體)的供應(yīng)，所述異種多克隆抗體可具有例如作為治療藥、診斷藥的用途和可用于純化目的。
背景技術(shù)：
：1890年，ShibasaburoKitazato和EmilBehring報(bào)道了一個(gè)有著特別結(jié)果的實(shí)驗(yàn)；特別是，他們證明，通過從免疫動物取出血清，并將其注射到未免疫動物體內(nèi)，可以使免疫從一只動物轉(zhuǎn)移至另一只動物。這一里程碑性的實(shí)驗(yàn)成為將被動免疫引入臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)。今天，人免疫球蛋白(Ig)的制備及其在被動免疫方面的應(yīng)用是標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)實(shí)踐。僅在美國，人Ig每年的銷售額為$1,400,000,000，每年有16公制噸的人抗體用于抗體靜脈治療。在工業(yè)最發(fā)達(dá)國家的經(jīng)濟(jì)中有相當(dāng)水平的消耗，可以預(yù)期在發(fā)展中國家中其需求將快速增長。目前，用于被動免疫的人抗體得自人類供體的混合血清。這意味著在可用于治療和預(yù)防的人抗體的量存在固有的限制。其需求已經(jīng)超過了供應(yīng)，并且通常是嚴(yán)重短缺。為了解決與人Ig供應(yīng)不足相關(guān)的一些問題，已經(jīng)開發(fā)了各種技術(shù)。例如，通過重組方法在組織培養(yǎng)物中生產(chǎn)人Ig是常規(guī)技術(shù)。特別是，人Ig在CHO表達(dá)系統(tǒng)中的重組表達(dá)是眾所周知的，目前用來生產(chǎn)現(xiàn)在用于治療的幾種人免疫球蛋白(Ig)和嵌合抗體。已經(jīng)產(chǎn)生供生產(chǎn)人抗體(例如單克隆抗體)用的保留未經(jīng)重排的人免疫球蛋白基因的小鼠(參見例如WO98/24893；WO96/33735；WO97/13852；WO98/24884；WO97/07671(EP0843961)；美國專利5,877,397；美國專利5,874,299；美國專利5,814,318；美國專利5,789,650；美國專利5,770,429；美國專利5,661,016；美國專利5,633,425；美國專利5,625,126；美國專利5,569,825；和美國專利5,545,806)。另外，WO00/10383(EP1106061)描述了通過微細(xì)胞融合修飾人染色體片段并且將所述片段轉(zhuǎn)移到某些細(xì)胞中。此外，WO01/35735描述了牛IgM重鏈敲除。1998年12月15日授予Meade等的美國專利5,849,992以及1998年10月27日授予Meade等的美國專利5,827,690描述了在包括小鼠、綿羊、豬、牛和山羊在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因動物的乳中生產(chǎn)單克隆抗體，其中所述轉(zhuǎn)基因動物在保證人抗體在乳房上皮細(xì)胞中表達(dá)的啟動子控制之下表達(dá)所述人Ig基因。從本質(zhì)上講，這導(dǎo)致所述抗體在這類動物(例如牛)的乳中表達(dá)。然而，雖然先前已經(jīng)報(bào)道了這些，但非常需要在血流中產(chǎn)生所需物種的抗體(特別是多克隆抗體)、尤其是人Ig并且產(chǎn)生一系列不同的對所需抗原特異性的抗體的改進(jìn)方法和增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因動物，尤其是牛。更尤其是在有蹄類動物中生產(chǎn)人Ig將特別有益，因?yàn)?1)牛可以產(chǎn)生大量的抗體，(2)?？梢杂萌祟惒≡w或其它病原體免疫，并且(3)?？梢杂脕碇苽淇谷祟惪乖娜丝贵w。大量多克隆抗體的可得性對于傳染病的治療和預(yù)防、免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、人細(xì)胞例如癌細(xì)胞的清除以及特定人類分子的調(diào)節(jié)有利。雖然已經(jīng)在小鼠中表達(dá)了人Ig，但人Ig在牛中或是在其它有蹄類動物中是否部分重排和表達(dá)是不可預(yù)測的，因?yàn)樵诳贵w基因結(jié)構(gòu)、抗體產(chǎn)生機(jī)制和B細(xì)胞功能方面存在差異。特別是，與小鼠不同，牛和羊在其免疫生理學(xué)方面與人類有所不同(Lucier等，J.Immunol.1615438，1998；Parng等，J.Immunol.1575478，1996；和Butler，Rev.Sci.Tech.1743，2000)。例如，與抗體基因的多樣化在人類和小鼠中依賴于基因重排相比，抗體基因的多樣化在牛和羊中更多地依賴于基因轉(zhuǎn)變。此外，在人類和小鼠中B細(xì)胞的主要位置是在骨髓中，而在牛和羊中B細(xì)胞位于回腸淋巴集結(jié)中。因此，預(yù)測在牛(或其它有蹄類動物)的B細(xì)胞譜系中是否發(fā)生人免疫球蛋白基因座的免疫球蛋白重排和多樣化，在本發(fā)明之前即使并非是不可能的，也是困難的。另外，也一直難以預(yù)測牛在無其內(nèi)源Ig的情況下或者在人抗體的干擾下是否能夠生存，即誘發(fā)其正常的免疫功能。例如，不能確定表達(dá)人Ig的牛B細(xì)胞是否正確地遷移至牛的回腸淋巴集結(jié)中，因?yàn)檫@在人類中是不發(fā)生的。也不清楚介導(dǎo)補(bǔ)體激活、細(xì)胞因子釋放的誘導(dǎo)以及抗原清除的人Fc受體功能在牛系統(tǒng)中是否正常。發(fā)明簡述本發(fā)明的一個(gè)目的是產(chǎn)生重排并表達(dá)人類或其它物種Ig基因座的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如轉(zhuǎn)基因牛)。優(yōu)選通過穩(wěn)定地導(dǎo)入含有人Ig基因的人染色體片段以產(chǎn)生除內(nèi)源Ig之外或者代替內(nèi)源Ig而具有人Ig或另一種物種Ig的B細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如牛)來實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。這也可以通過將編碼異種免疫球蛋白鏈或異種抗體的核酸整合到有蹄類動物的染色體中來實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是產(chǎn)生其內(nèi)源Ig的表達(dá)已被減少或敲除的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如轉(zhuǎn)基因牛)。例如，可以將無義突變或缺失突變引入編碼內(nèi)源免疫球蛋白鏈或抗體的核酸中。本發(fā)明的一個(gè)更具體的目的是產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如轉(zhuǎn)基因牛)，其中輕鏈基因座的恒定區(qū)外顯子和/或μ恒定區(qū)外顯子已被敲除，并且已經(jīng)穩(wěn)定地?fù)饺肓撕芯幋a另一物種(優(yōu)選人類)免疫球蛋白的基因座的人工染色體。本發(fā)明的一個(gè)更具體的目的是利用核轉(zhuǎn)移和同源重組方法產(chǎn)生克隆有蹄類動物(例如克隆牛)，其中輕鏈基因座的內(nèi)源恒定區(qū)外顯子和/或重鏈基因座的μ恒定區(qū)外顯子已被敲除，并且穩(wěn)定地導(dǎo)入了包含異種重鏈和輕鏈Ig基因的人工染色體，優(yōu)選含有人重鏈和輕鏈Ig基因座的人類人工染色體，產(chǎn)生了產(chǎn)生另一種物種(優(yōu)選人類)的Ig、而不產(chǎn)生其內(nèi)源Ig的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。本發(fā)明的另一目的是產(chǎn)生有蹄類動物(例如牛)的體細(xì)胞或胚胎干(ES)細(xì)胞，優(yōu)選成纖維細(xì)胞或B細(xì)胞，更優(yōu)選雄性體細(xì)胞，其中內(nèi)源IgM重鏈基因中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)目的是產(chǎn)生克隆有蹄類動物(例如牛)胎兒和后代，其中所述IgM重鏈基因座中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的再一目的是產(chǎn)生有蹄類動物(例如牛)的體細(xì)胞或ES細(xì)胞，優(yōu)選成纖維細(xì)胞或B細(xì)胞，例如雌性或雄性體細(xì)胞，其中所述IgM重鏈基因中的一個(gè)等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的一個(gè)相關(guān)目的是產(chǎn)生克隆有蹄類動物(例如牛)胎兒或后代，其中所述內(nèi)源重鏈IgM基因中的一個(gè)等位基因已被突變，例如通過同源重組被破壞。本發(fā)明的又一目的是通過讓分別帶有突變例如內(nèi)源IgM中的一個(gè)等位基因被破壞或Ig輕鏈中的一個(gè)等位基因被破壞的雄性和雌性有蹄類動物(例如牛)交配，或者通過連續(xù)同源重組，產(chǎn)生雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)胎兒和有蹄類動物幼仔。本發(fā)明的另一目的是產(chǎn)生純合敲除(Homo(同)H/L)胎兒，其中IgM基因的兩個(gè)重鏈等位基因以及所述Ig輕鏈的兩個(gè)等位基因都通過連續(xù)同源重組或者通過讓上述雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者(M和FHemiH/L)交配而被破壞。本發(fā)明的另一具體目的是插入含有非有蹄類動物Ig或其重鏈或輕鏈的功能表達(dá)所必需的基因的核酸(例如人工染色體)。這些Ig最好是通過將編碼這些Ig或Ig鏈的核酸導(dǎo)入Homo或HemiH/L有蹄類動物(例如牛)體細(xì)胞(優(yōu)選成纖維細(xì)胞)并且產(chǎn)生克隆有蹄類動物(例如克隆牛)而產(chǎn)生的人Ig，其中所述核酸(例如人類人工染色體DNA)被傳遞至種系中。本發(fā)明的再一目的是通過核轉(zhuǎn)移將含有保證Ig表達(dá)的基因的人工染色體(優(yōu)選人類人工染色體(HAC))導(dǎo)入上述純合敲除者(HomoH/L)細(xì)胞中，并且產(chǎn)生對免疫應(yīng)答而表達(dá)非有蹄類動物Ig(優(yōu)選人Ig)并且經(jīng)歷親和性成熟的有蹄類動物(例如牛)。本文所用的“人工染色體”是指具有人工修飾諸如加入選擇標(biāo)記、加入克隆位點(diǎn)、缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸、取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸等的哺乳動物染色體或其片段。“人類人工染色體(HAC)”是指由一個(gè)或多個(gè)人染色體產(chǎn)生的人工染色體。人工染色體可以獨(dú)立于宿主細(xì)胞的內(nèi)源染色體而在宿主細(xì)胞中保持。在這種情況下，HAC可以與內(nèi)源染色體一道穩(wěn)定地復(fù)制和分離?；蛘撸赡鼙灰孜换虿迦氲剿拗骷?xì)胞的內(nèi)源染色體中?？梢酝瑫r(shí)或順序?qū)蓚€(gè)或兩個(gè)以上的人工染色體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。例如，可以導(dǎo)入來源于人類14號染色體(包含所述Ig重鏈基因)、人類2號染色體(包含所述Igκ鏈基因)和人類22號染色體(包含所述Igλ鏈基因)的人工染色體。或者，可以導(dǎo)入既包含異種Ig重鏈基因又包含Ig輕鏈基因的人工染色體，例如ΔHAC或ΔΔHAC。所述重鏈基因座和輕鏈基因座最好位于不同的染色體臂(即位于中心粒的不同側(cè))。在再一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HAC的總大小小于或等于大約10、9、8或7兆堿基。本發(fā)明的又一目的是提供來源于轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如轉(zhuǎn)基因牛)的供被動免疫用的人Ig或其它Ig源，所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物含有并表達(dá)在所導(dǎo)入的含有人Ig重鏈和輕鏈基因的核酸(例如人工染色體，優(yōu)選人類人工染色體(HAC))上攜帶的Ig基因。在本發(fā)明中，這些核酸(例如HAC)包括人染色體(人染色體片段)的天然排列的區(qū)段或者包含人工工程化人染色體片段(即它們相對于人類基因組而言可以是重排的)的人工染色體。本發(fā)明的另一目的是用來源于上述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(例如轉(zhuǎn)基因牛)的B細(xì)胞生產(chǎn)雜交瘤和單克隆抗體。本發(fā)明的再一目的是生產(chǎn)包含多克隆人Ig的有蹄類動物抗血清或乳。這類人Ig、優(yōu)選人IgG可以用作靜脈免疫球蛋白(IVIG)以治療或預(yù)防人類疾病。所述多克隆人Ig最好對感興趣的抗原具有反應(yīng)性。本發(fā)明的又一目的是產(chǎn)生在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源基因中具有一個(gè)或多個(gè)突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物通過將細(xì)胞、得自細(xì)胞的染色質(zhì)或得自細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中而產(chǎn)生。所述細(xì)胞在內(nèi)源基因中具有一個(gè)所述細(xì)胞天然不表達(dá)的第一突變。將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，通過將包含一個(gè)盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述盒包含與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種或多種與待突變內(nèi)源基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子，從而將所述盒整合到所述基因的一個(gè)內(nèi)源等位基因中，而導(dǎo)入所述第一突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，通過將包含第一盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與待突變內(nèi)源基因有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子，從而將所述第一盒整合到所述基因的第一內(nèi)源等位基因中，而導(dǎo)入所述突變，產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與所述基因有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。第二選擇標(biāo)記不同于第一選擇標(biāo)記，將所述第二盒整合到所述基因的第二內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，從所述胚胎、胎兒或者從所述胎兒產(chǎn)生的后代分離出細(xì)胞，并且將另一突變引入所述細(xì)胞的基因中。然后用所得的細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核，進(jìn)行第二輪核轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生具有兩個(gè)或兩個(gè)以上突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。所述突變位于基因的相同或不同等位基因中，或者位于不同基因中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，被突變的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞(例如胎成纖維細(xì)胞)。被突變的內(nèi)源基因最好與在成纖維細(xì)胞中無活性的內(nèi)源啟動子操作上連接。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，與所述被突變的內(nèi)源基因操作上連接的內(nèi)源啟動子的活性比與內(nèi)源管家基因例如GAPDH操作上連接的內(nèi)源啟動子活性低80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％。啟動子活性可以用任何標(biāo)準(zhǔn)測定來測量，所述測定例如測量所述基因所編碼的mRNA或蛋白的水平(參見例如Ausubel等CurrentProtocolsinMolecularBiology，volume2，第11.13.1-11.13.3頁，JohnWiley&Sons，1995)。這種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法的優(yōu)點(diǎn)是使得在供體細(xì)胞(即作為核轉(zhuǎn)移所用的遺傳材料來源的細(xì)胞)中不表達(dá)的基因可以被突變。因此，要求保護(hù)的本發(fā)明的特征在于具有一種或多種編碼整個(gè)或部分異種免疫球蛋白(Ig)基因的核酸的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，所述基因經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸基本上是人類核酸。所述核酸最好編碼異種抗體，例如人抗體或多克隆抗體。在各種實(shí)施方案中，所述Ig鏈或抗體在血清和/或乳中表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。在其它實(shí)施方案中，所述核酸包括未經(jīng)重排的抗體輕鏈核酸區(qū)段，其中編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸包括未經(jīng)重排的抗體重鏈核酸區(qū)段，其中或者(i)編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸，和/或(ii)編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物在內(nèi)源Ig基因、α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因、朊病毒基因和/或J鏈基因中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于具有減少內(nèi)源抗體表達(dá)的突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。所述突變最好減少功能性IgM重鏈的表達(dá)，或者基本上消除功能性IgM重鏈的表達(dá)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達(dá)，或者基本上消除功能性Ig輕鏈的表達(dá)。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述突變減少功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達(dá)，或者所述突變基本上消除功能性IgM重鏈和功能性IgM輕鏈的表達(dá)。所述有蹄類動物最好在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中也有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，所述基因經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子。所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸基本上是人類核酸。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸編碼異種抗體，例如得自另一屬的抗體(例如人抗體)或者多克隆抗體。在各種實(shí)施方案中，所述Ig鏈或抗體在血清中表達(dá)。在其它實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。本發(fā)明也提供得自任何本發(fā)明有蹄類動物的細(xì)胞或者可用于產(chǎn)生任何本發(fā)明有蹄類動物的細(xì)胞。因此，另一方面，本發(fā)明的特征在于具有一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸的有蹄類動物體細(xì)胞，所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸編碼一種異種抗體。在各種實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或者ΔΔHAC中。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。在另一實(shí)施方案中，所述核酸基本上是人類核酸。所述異種抗體優(yōu)選為得自另一屬的抗體，例如人抗體。所述細(xì)胞最好在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。示例性的有蹄類動物細(xì)胞包括胎成纖維細(xì)胞和B細(xì)胞。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于在編碼Ig重鏈和/或輕鏈的核酸中有突變的有蹄類動物體細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞在IgM重鏈或所述Ig輕鏈中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。示例性的突變包括無義突變和缺失突變。所述細(xì)胞最好在在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞也具有一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸優(yōu)選基本上為人類核酸和/或編碼異種抗體，例如得自另一屬的抗體(例如人抗體)。在各種實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段中，從而使所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。優(yōu)選的染色體片段包括ΔHAC和ΔΔHAC。在另外的實(shí)施方案中，所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。示例性的有蹄類動物細(xì)胞包括胎成纖維細(xì)胞和B細(xì)胞。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。另一方面，本發(fā)明的特征在于通過本發(fā)明的有蹄類動物B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的雜交瘤。所述雜交瘤最好分泌外源抗體，例如人抗體。本發(fā)明也提供用本發(fā)明的有蹄類動物生產(chǎn)抗體的方法。一種這樣的方法涉及給予具有一種或多種編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物一種或多種感興趣的抗原。所述基因座中的所述核酸區(qū)段經(jīng)歷重排，導(dǎo)致產(chǎn)生對所述抗原特異性的抗體，然后從所述有蹄類動物回收所述抗體。在各種實(shí)施方案中，編碼所述異種抗體基因座的核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。所述染色體片段優(yōu)選獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體的輕鏈和/或所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。所述抗體可以為單克隆抗體或者為多克隆抗體。針對特定抗原的單克隆抗體和多克隆抗體有各種各樣的用途；例如，它們可以用作針對致病微生物例如細(xì)菌或病毒感染的預(yù)防或治療組合物中的組分。在各種實(shí)施方案中，從所述有蹄類動物的血清或乳中回收所述抗體。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有減少內(nèi)源抗體表達(dá)、減少功能性IgM重鏈表達(dá)、或者減少功能性Ig輕鏈表達(dá)的突變。所述有蹄類動物優(yōu)選在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在一個(gè)相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于另一種生產(chǎn)抗體的方法。該方法涉及從具有編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物回收異種抗體。所述基因座中的所述核酸區(qū)段經(jīng)歷重排，導(dǎo)致產(chǎn)生異種抗體。在各種實(shí)施方案中，所述編碼異種抗體基因座的核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。在特定實(shí)施方案中，所述核酸獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在特定實(shí)施方案中，所述抗體的輕鏈和/或所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。所述抗體可以為單克隆抗體或者為多克隆抗體。在特定實(shí)施方案中，無需用特定抗原免疫所述有蹄類動物而產(chǎn)生的多克隆抗體例如IgG抗體，用作用人血清生產(chǎn)的IVIG(靜脈免疫球蛋白)的治療代用品。在各種實(shí)施方案中，從所述有蹄類動物的血清或乳中回收所述抗體。所述有蹄類動物優(yōu)選具有減少內(nèi)源抗體表達(dá)、減少功能性IgM重鏈表達(dá)、或者減少功能性Ig輕鏈表達(dá)的突變。所述有蹄類動物優(yōu)選在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。本發(fā)明也提供用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法。這些方法可以用來產(chǎn)生具有所需突變或者具有所需異種核酸的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。在一個(gè)這樣的方面，本發(fā)明的特征在于一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，所述方法涉及將細(xì)胞、得自細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中。所述細(xì)胞在內(nèi)源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中包括一個(gè)第一突變。將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。用于產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的細(xì)胞在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白和/或J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述細(xì)胞具有編碼外源J鏈例如人J鏈的核酸。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞包括一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子。所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸編碼異種抗體。在其它實(shí)施方案中，所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。所述異種抗體優(yōu)選為得自另一屬的抗體，例如人抗體。在特定實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。在其它特定實(shí)施方案中，所述染色體片段獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在上述方面的各種實(shí)施方案中，所述方法也包括從所述胚胎、所述胎兒或者由所述胎兒產(chǎn)生的后代分離細(xì)胞，并且在所述細(xì)胞的內(nèi)源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中引入第二突變。將所述細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)、或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中，并且將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或者所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。在上述方面的其它實(shí)施方案中，用來產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的細(xì)胞通過包括下述步驟的方法制備將具有一個(gè)盒的核酸插入所述細(xì)胞中，所述盒包括與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子。將所述盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸中的一個(gè)內(nèi)源等位基因中。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過將具有第一盒的核酸插入到所述細(xì)胞中而產(chǎn)生，所述第一盒包括與編碼第一選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子。將所述第一盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第一內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。向所述第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括與編碼第二選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與所述抗體重鏈或輕鏈核酸具有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。所述第二選擇標(biāo)記不同于所述第一選擇標(biāo)記。將所述第二盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第二內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。再一方面，本發(fā)明的特征在于另一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法。該方法涉及將具有一種或多種異種核酸的細(xì)胞插入到卵母細(xì)胞中。所述異種核酸編碼整個(gè)或部分異種Ig基因，并且所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子。將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。所述編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸優(yōu)選編碼異種抗體。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述抗體為多克隆抗體。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白鏈或抗體在血清和/或乳中表達(dá)。在各種實(shí)施方案中，所述核酸包含在染色體片段例如ΔHAC或ΔΔHAC中。所述核酸可以獨(dú)立于宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持或者整合到所述細(xì)胞的染色體中。所述核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它實(shí)施方案中，所述異種抗體為得自另一屬的抗體，例如人抗體。所述有蹄類動物優(yōu)選為牛、綿羊、豬或山羊。在再一相關(guān)方面，本發(fā)明的特征在于另一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法。該方法涉及將細(xì)胞、得自細(xì)胞的染色質(zhì)或得自細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中。所述細(xì)胞在所述細(xì)胞天然不表達(dá)的內(nèi)源基因中包括一個(gè)第一突變。將所述卵母細(xì)胞或者由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。最好讓所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。被突變的基因最好編碼抗體、α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒蛋白或J鏈。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，用于產(chǎn)生所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞，例如胎成纖維細(xì)胞。在上述方法的各種實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過下述步驟制備將具有一個(gè)盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述盒包括與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述基因具有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述基因的一個(gè)內(nèi)源等位基因中。在其它實(shí)施方案中，所述細(xì)胞通過將具有第一盒的核酸插入到所述細(xì)胞中而產(chǎn)生，所述第一盒包括與編碼第一選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與所述基因具有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子。將所述第一盒整合到所述基因的第一內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。向所述第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中插入具有第二盒的核酸，所述第二盒包括與編碼第二選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與所述基因具有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子。所述第二選擇標(biāo)記不同于所述第一選擇標(biāo)記。將所述第二盒整合到所述基因的第二內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在上述方面的其它實(shí)施方案中，所述方法也包括將第二突變引入到所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中。在這些實(shí)施方案中，從所述胚胎、所述胎兒或者由所述胎兒產(chǎn)生的后代分離細(xì)胞，并且將第二突變引入到所述細(xì)胞的內(nèi)源基因中。將所述細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中，并且將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。本發(fā)明的有蹄類動物可以用來生產(chǎn)含有感興趣抗體的抗血清或乳。在一個(gè)這樣的方面，本發(fā)明的特征在于具有多克隆人免疫球蛋白的有蹄類動物抗血清。所述抗血清優(yōu)選得自牛、綿羊、豬或山羊。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Ig針對所需抗原。再一方面，本發(fā)明的特征在于具有多克隆人Ig的有蹄類動物乳。所述乳優(yōu)選得自牛、綿羊、豬或山羊。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述Ig針對所需抗原。在本發(fā)明各個(gè)方面的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述重鏈?zhǔn)铅讨劓湥鲚p鏈?zhǔn)铅嘶颚瘦p鏈。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述編碼異種免疫球蛋白鏈或抗體的核酸為其未經(jīng)重排形式。最好是在將感興趣的抗原給予轉(zhuǎn)基因有蹄類動物后，所述異種免疫球蛋白基因座中的所述核酸區(qū)段重排并且產(chǎn)生與感興趣抗原具有反應(yīng)性的抗體。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物產(chǎn)生不止一類異種抗體。在各種實(shí)施方案中，所述有蹄類動物產(chǎn)生不止一種不同的異種Ig或抗體。優(yōu)選的核轉(zhuǎn)移方法包括將本發(fā)明的細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核插入到去核或有核卵母細(xì)胞中，并且將所述卵母細(xì)胞或者由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或者所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。在本發(fā)明各個(gè)方面的其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物在內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒和/或J鏈核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變。所述突變優(yōu)選減少或消除所述內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基(α1，3)半乳糖表位、朊病毒蛋白和/或J鏈的表達(dá)。在另外的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述有蹄類動物含有異種J鏈核酸，例如人J鏈核酸。所述有蹄類動物優(yōu)選產(chǎn)生含人J鏈的人IgA或IgM分子。在本發(fā)明的各種實(shí)施方案中，用來使內(nèi)源有蹄類動物核酸突變的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與待突變基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子)不包含在病毒載體例如腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體中。例如，所述核酸可以包含在質(zhì)粒或人工染色體中，用不涉及細(xì)胞的病毒感染的標(biāo)準(zhǔn)方法例如轉(zhuǎn)染或者脂轉(zhuǎn)染法，將所述核酸插入到有蹄類動物細(xì)胞中。在再一實(shí)施方案中，用來使內(nèi)源有蹄類動物核酸突變的核酸(例如敲除盒，所述敲除盒包括與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種與待突變基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子)包含在病毒載體例如腺病毒載體或腺相關(guān)病毒載體中。按照該實(shí)施方案，用含有所述病毒載體的病毒來感染有蹄類動物細(xì)胞，導(dǎo)致所述病毒載體的一部分或者整個(gè)病毒載體插入到所述有蹄類動物細(xì)胞中。示例性有蹄類動物包括奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄目(Artiodactyla)的成員，例如牛屬(Bos)的任何成員。其它優(yōu)選的有蹄類動物包括綿羊、大角羊、山羊、美洲野牛、羚羊、牛、馬、驢子、騾、鹿、駝鹿、北美馴鹿、水牛、駱駝、美洲駝、羊駝、豬和象。優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物表達(dá)得自另一屬的免疫球蛋白鏈或抗體，例如得自任何其它哺乳動物的抗體。本文所用的“排列前(pre-arranged)或未經(jīng)重排形式的核酸”是指尚未經(jīng)歷V(D)J重組的核酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，編碼抗體輕鏈V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。編碼抗體重鏈V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段最好與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸，和/或編碼抗體重鏈D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。未經(jīng)重排形式的核酸優(yōu)選基本上為人類核酸。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸與得自人類的天然存在的核酸的對應(yīng)區(qū)有至少70％、80％、90％、95％或99％相同。附圖簡述圖1A包括用來產(chǎn)生含有Ig敲除和人類人工染色體的母牛的方法的概述。圖1A中的時(shí)間列基于以下的估計(jì)制備所述Ig敲除載體和產(chǎn)生敲除細(xì)胞需18個(gè)月，從所述敲除細(xì)胞產(chǎn)生胎兒需2個(gè)月，進(jìn)行后續(xù)的敲除需9個(gè)月，妊娠產(chǎn)出幼仔需9個(gè)月，在可以從幼仔產(chǎn)生胚胎之前需12個(gè)月，而進(jìn)行HAC轉(zhuǎn)移需6個(gè)月。圖1B包括用來產(chǎn)生在內(nèi)源Ig基因中有突變并且含有ΔHAC或ΔΔHAC的母牛的方法的概述。對于圖1B中的時(shí)間列，估計(jì)每周篩選250個(gè)集落，在3個(gè)月內(nèi)總共篩選3,000個(gè)集落，以便分離雄性和雌性敲除細(xì)胞。假設(shè)每1,500個(gè)集落產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)敲除集落。純合敲除有蹄類動物可以通過下述方法產(chǎn)生(1)在核轉(zhuǎn)移之前，將第二Ig突變引入分離的敲除細(xì)胞中，(2)在得自胚胎、胎兒(例如妊娠約60天的胎兒)或者由第一輪核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的后代的細(xì)胞中引入第二Ig突變，并且用所得的純合細(xì)胞作為第二輪核轉(zhuǎn)移中的供體細(xì)胞，或者(3)讓半合型有蹄類動物交配。在圖1A和1B中，“同”表示純合的；“半”表示半合子的；“H”表示重鏈；“L”表示輕鏈；“HAC”表示人類人工染色體；“HAC1”表示任一種HAC；而“HAC2”表示第二種HAC。圖2A包括按照本發(fā)明的μ(IgM重鏈)敲除構(gòu)建體。圖2B為得自Holstein牛(荷蘭牛)的免疫球蛋白基因座的限制性圖譜。圖3A和3B包括構(gòu)建體“pSTneoB”和“pLoxP-STneoB”的示意圖，所述構(gòu)建體用來產(chǎn)生圖3C中所示的μ敲除DNA構(gòu)建體。圖3D為在所述μ敲除構(gòu)建體中用作第一同源區(qū)的基因組牛μ重鏈基因座的1.5kb區(qū)的多核苷酸序列(SEQIDNO47)。圖3E為在所述μ敲除構(gòu)建體中用作第二同源區(qū)的基因組牛μ重鏈基因座的3.1kb區(qū)的多核苷酸序列(SEQIDNO48)。在該序列中，每個(gè)“n”代表任何核苷酸或者無核苷酸。連續(xù)“n”核苷酸區(qū)代表其多核苷酸序列尚未測定的大約0.9-1.0kb的區(qū)。圖3F為嘌呤霉素抗性牛μ重鏈敲除構(gòu)建體的示意圖。圖3G為牛κ輕鏈cDNA的多核苷酸序列(SEQIDNO60)。在κ輕鏈敲除構(gòu)建體中可以使用完整的該序列或該序列的一部分。另外，這種κ輕鏈可以用來分離用于κ輕鏈敲除構(gòu)建體中的基因組κ輕鏈序列。圖4是構(gòu)建ΔHAC和ΔΔHAC的示意圖。圖5是瓊脂糖凝膠的照片，表明在ΔHAC胎兒中存在編碼人重鏈和輕鏈的基因組DNA。圖6是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Cμ外顯子3和4在妊娠77天的ΔHAC胎兒(胎兒#5996)中的表達(dá)。圖7是瓊脂糖凝膠的照片，表明內(nèi)源牛重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的重排。圖8是瓊脂糖凝膠的照片，表明重排的人重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的表達(dá)。圖9是瓊脂糖凝膠的照片，表明由所述人重鏈基因座剪接的恒定區(qū)在ΔHAC胎兒#5996中的表達(dá)。圖10是瓊脂糖凝膠的照片，表明重排的人重鏈在ΔHAC胎兒#5996中的表達(dá)。圖11A是得自ΔHAC胎兒#5996的重排人重鏈轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸序列(SEQIDNO49)。圖11B是該序列(“查詢序列”)與人抗肺炎球菌抗體(“待測序列”)(分別為SEQIDNO50和51)的一個(gè)區(qū)的序列比對。對于得自ΔHAC胎兒#5996的查詢序列而言，僅顯示了不同于所述人抗肺炎球菌抗體序列的對應(yīng)核苷酸的那些核苷酸。圖12A和12B是得自ΔHAC胎兒#5996的重排人重鏈轉(zhuǎn)錄物的另外兩個(gè)多核苷酸序列(SEQIDNO52和54)及其導(dǎo)出氨基酸序列(分別為SEQIDNO53和55)。圖13是瓊脂糖凝膠的照片，證明ΔΔHAC胎兒#5580既含有人重鏈免疫球蛋白基因座，又含有人輕鏈免疫球蛋白基因座。圖14是瓊脂糖凝膠的照片，證明ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B既含有人重鏈免疫球蛋白基因座，又含有人輕鏈基因座。圖15是瓊脂糖凝膠的照片，表明從人重鏈基因座剪接的μ恒定區(qū)在ΔΔHAC胎兒#5542A中的表達(dá)。圖16是瓊脂糖凝膠的照片，表明所述人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達(dá)。圖17是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B中的重排和表達(dá)。圖18是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A中的重排和表達(dá)。圖19是瓊脂糖凝膠的照片，表明人Igλ基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達(dá)。圖20是得自ΔΔHAC胎兒#5442A的重排人輕鏈轉(zhuǎn)錄物的多核苷酸序列和相應(yīng)的導(dǎo)出氨基酸序列(分別為SEQIDNO56和57)。圖21是得自ΔΔHAC胎兒#5442A的重排人輕鏈轉(zhuǎn)錄物的另外一個(gè)多核苷酸序列和相應(yīng)的導(dǎo)出氨基酸序列(分別為SEQIDNO58和59)。圖22A-22H是ΔΔHAC胎兒#5442A(圖22A-22D)和5442B(圖22E-22H)表達(dá)人λ輕鏈和牛重鏈蛋白的FACS分析圖。讓得自這些胎兒的脾的淋巴細(xì)胞與藻紅蛋白標(biāo)記的抗人λ抗體(圖22C和22D)、FITC標(biāo)記的抗牛IgM抗體(圖22D和22H)或無抗體(圖22A、22B、(22E和22F)反應(yīng)，然后在FASCalibur細(xì)胞分類器上分析。用其中一種所述抗體標(biāo)記的細(xì)胞的百分率顯示在每條頻率曲線的下方。圖23為α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除載體的示意圖，所述載體用來將嘌呤霉素抗性基因和轉(zhuǎn)錄終止序列插入到牛細(xì)胞中的內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因中。圖24是含有外顯子2、3和4、用作所述AAV打靶載體骨架的BamHI-XhoI片段的示意圖。新霉素抗性標(biāo)記用于通過插入到外顯子4中而對所述基因座進(jìn)行插入誘變。指示了用來隨后證實(shí)正確打靶的PCR引物的退火位點(diǎn)的位置。圖25是構(gòu)建設(shè)計(jì)用以除去牛內(nèi)源IgH序列的腺相關(guān)病毒構(gòu)建體的示意圖。圖26是瓊脂糖凝膠的照片，顯示正確打靶事件的各個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)克隆的PCR分析。在該實(shí)驗(yàn)中使用的載體示于圖24。指示正確打靶的PCR產(chǎn)物以星號標(biāo)注。圖27是列出攜帶HAC的胚胎妊娠率的表。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，優(yōu)選轉(zhuǎn)基因牛，其中內(nèi)源Ig的表達(dá)任選地被敲除，并且穩(wěn)定地導(dǎo)入了包含產(chǎn)生另一物種(優(yōu)選人類)的功能性抗體所必需的基因的核酸(優(yōu)選人工染色體)。因而，可以獲得不產(chǎn)生其內(nèi)源抗體、而產(chǎn)生另一物種抗體的轉(zhuǎn)基因動物?？梢援a(chǎn)生任何非內(nèi)源抗體，包括但不限于人類、非人類靈長類動物、狗、貓、小鼠、大鼠或豚鼠的抗體。雖然先前已經(jīng)報(bào)道了在山羊中產(chǎn)生人單克隆抗體，但這并未在牛中、在血清中或在不表達(dá)其內(nèi)源抗體的任何有蹄類動物中實(shí)現(xiàn)。此外，在轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中尚未進(jìn)行種系(未經(jīng)重排的)重鏈或輕鏈基因的插入、這些基因的重排以及多樣化抗體的表達(dá)。不可預(yù)測這類有蹄類動物是否能夠生存，因?yàn)椴荒艽_定人Ig是否被功能表達(dá)，或者以足以保證適當(dāng)免疫應(yīng)答的量表達(dá)。此外，人染色體是否穩(wěn)定地保持在轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中是不確定的。再者，該有蹄類動物(例如牛)的B細(xì)胞是否能夠表達(dá)或者正確地重排人Ig或其它非內(nèi)源Ig也是不確定的。在本方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，異種免疫球蛋白的生產(chǎn)基本上通過聯(lián)合應(yīng)用核轉(zhuǎn)移、同源重組技術(shù)和攜帶完整異種Ig基因座的人工染色體的導(dǎo)入來實(shí)現(xiàn)。更具體地講，所述方法優(yōu)選包括定向破壞所述IgM重鏈基因中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因，并且任選地定向破壞所述Ig輕鏈基因中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因，雖然異種抗體的生產(chǎn)也可以在野生型動物(即無Ig敲除的動物)中實(shí)現(xiàn)?；蚯贸梢酝ㄟ^連續(xù)同源重組、然后通過另一個(gè)交配步驟來實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這通過最初用合適的同源重組載體實(shí)現(xiàn)定向破壞組織培養(yǎng)物中雄性或雌性有蹄類動物(例如牛)胎成纖維細(xì)胞的IgM重鏈基因的一個(gè)等位基因來實(shí)現(xiàn)。胎成纖維細(xì)胞的應(yīng)用優(yōu)于某些其它體細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞容易在組織培養(yǎng)物中繁殖和遺傳操作。然而，胎成纖維細(xì)胞的應(yīng)用并不是本發(fā)明所必需的，實(shí)際上可以用其它細(xì)胞系替代，并且獲得等同的結(jié)果。當(dāng)然，這一方法需要構(gòu)建具有與靶IgM重鏈等位基因具有同源性的區(qū)的DNA構(gòu)建體，使得所述構(gòu)建體在整合到所述有蹄類動物基因組的IgM重鏈等位基因中破壞所述等位基因的表達(dá)。用于實(shí)現(xiàn)IgM等位基因的這種定向破壞的一種示例性載體在以下實(shí)施例中有描述。在這一方面，保證在靶位點(diǎn)同源重組的載體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此外，在這種情況下，合適載體的構(gòu)建在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)，尤其是已知牛IgM重鏈和Igλ輕鏈基因的序列、也已知得自其它有蹄類動物的免疫球蛋白基因的序列(參見下文)的條件下。為了便于同源重組，用以實(shí)現(xiàn)同源重組和所述IgM基因失活的載體分別包含表現(xiàn)出與所述有蹄類動物IgM重鏈和Ig輕鏈基因有顯著序列同一性的DNA部分。這些序列優(yōu)選具有至少98％的序列同一性，更優(yōu)選至少99％的序列同一性，再更優(yōu)選這些序列與靶基因座等基因，以有助于同源重組以及定向缺失或失活。通常并且優(yōu)選所述構(gòu)建體將包含一個(gè)標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因保證選擇出其中所述IgM重鏈基因和/或Ig輕鏈基因已被有效破壞的所需同源重組子，例如成纖維細(xì)胞。示例性標(biāo)記基因其中包括抗生素抗性標(biāo)記、抗藥性標(biāo)記和綠色熒光蛋白。一種優(yōu)選的構(gòu)建體示于圖2A，用來制備該構(gòu)建體的起始材料示于圖3A和3B。用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)可以產(chǎn)生含有與內(nèi)源免疫球蛋白基因同源的兩個(gè)區(qū)的其它構(gòu)建體，所述同源區(qū)鄰接與啟動子操作上連接的正選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性基因)，并且將所述構(gòu)建體用于本發(fā)明的方法中。圖2A和3C中所示的μ敲除構(gòu)建體，設(shè)計(jì)用以除去編碼牛免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的外顯子(命名為“C-μ外顯子1-4”)和編碼跨膜結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)外顯子(命名為“TM外顯子”)。為了構(gòu)建這種載體，將來自基因組μ重鏈牛序列的名為“1”的區(qū)-Xbal-Xhol片段，亞克隆到預(yù)先用酶XbaI和XhoI切割的商業(yè)DNA載體pBluescript(Stratagene，LaJolla，California)中。一旦克隆了該片段，則鄰近XbaI位點(diǎn)有一個(gè)NotI限制性酶識別序列，用該序列插入一個(gè)約3.5Kb的NotI片段。這一片段含有新霉素抗性標(biāo)記，在下文有進(jìn)一步的描述。需要時(shí)，可以用得自另一有蹄類動物品種、物種或?qū)俚幕蚪Mμ重鏈序列(例如得自SwissBull/Holstein雜種、Genbank登錄號U63637的μ重鏈序列)，來構(gòu)建其它μ敲除構(gòu)建體。將片段“1”和新霉素抗性標(biāo)記一起連接到pBluescript中后，SacI位點(diǎn)保持鄰近新霉素抗性標(biāo)記。用SacI將所述新構(gòu)建體線性化，通過用DNA聚合酶補(bǔ)平SacI消化留下的粘性末端將其轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉?。分離作為XhoI-BstI1071片段的名為“2”的片段，通過用DNA聚合酶補(bǔ)平XhoI和BstI1071酶留下的粘性末端將其轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉似?。一旦完成所述?gòu)建，則最終的構(gòu)建體分別含有區(qū)2、新霉素抗性標(biāo)記和區(qū)1。關(guān)于牛成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，所述構(gòu)建體用限制性酶KpnI(在該圖中顯示了兩個(gè)KpnI位點(diǎn))消化，用所述DNA片段進(jìn)行同源重組。新霉素抗性構(gòu)建體如下裝配。名為“pSTneoB”的構(gòu)建體(Katoh等，CellStruct.Funct.12575，1987；日本研究生物制品保藏中心(JapaneseCollectionofResearchBiologicals)(JCRB)保藏號VE039)設(shè)計(jì)含有處于編碼區(qū)上游的SV40啟動子和TK增強(qiáng)子控制之下的新霉素抗性基因。所述編碼區(qū)下游是SV40終止序列。將neo盒作為XhoI片段從“pSTneoB”切下。在使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將該片段的末端轉(zhuǎn)變?yōu)槠蕉撕?，將平端片段克隆到載體pBS246(Gibco/LifeTechnologies)的EcoRV位點(diǎn)中。該位點(diǎn)鄰接loxP位點(diǎn)。用命名為“pLoxP-STNeoR”的新構(gòu)建體來產(chǎn)生所述μ敲除DNA構(gòu)建體。該構(gòu)建體的所需片段鄰接pBS246克隆載體中原有的loxP位點(diǎn)和NotI位點(diǎn)。用含有l(wèi)oxP-neo-loxP的所需NotI片段來取代所述免疫球蛋白μ恒定區(qū)外顯子。與新霉素抗性基因操作上連接的SV40啟動子激活新霉素抗性基因的轉(zhuǎn)錄，使得其中所需NotI片段已經(jīng)取代了所述μ恒定區(qū)外顯子的細(xì)胞根據(jù)其所產(chǎn)生的抗生素抗性而被選擇出來。在獲得其中IgM重鏈等位基因已被有效破壞的細(xì)胞系后，將其用作核轉(zhuǎn)移供體，來產(chǎn)生克隆有蹄類動物胎兒(例如克隆牛胎兒)，并且最終產(chǎn)生其中一個(gè)IgM重鏈等位基因被破壞的胎兒或動物。此后，可以用從中得到的體細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)第二輪的基因定向破壞，以便使用相似但含有一種不同選擇標(biāo)記的載體，產(chǎn)生其中第二IgM重鏈等位基因被失活的細(xì)胞。最好在所述第一定向基因破壞的同時(shí)，也對第二有蹄類動物(例如牛)體細(xì)胞系進(jìn)行遺傳修飾，所述細(xì)胞系同樣可以來源于雄性或雌性。如果操作的第一細(xì)胞系是雄性的，則最好修飾雌性細(xì)胞系；反之，如果操作的第一細(xì)胞系是雌性的，則最好選擇雄性細(xì)胞系。再者，所操作的細(xì)胞最好包含有蹄類動物(例如牛)胎成纖維細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，對所述雌性胎成纖維細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便引入Igλ輕鏈基因中一個(gè)等位基因的定向破壞。這一方法同樣采用具有與所述有蹄類動物(例如牛)Igλ輕鏈同源的區(qū)以及選擇標(biāo)記的載體來進(jìn)行，設(shè)計(jì)所述DNA構(gòu)建體，使得在整合和與所述內(nèi)源Ig輕鏈同源重組時(shí)，導(dǎo)致靶Igλ輕鏈基因的破壞(失活)。一旦選擇出具有所需定向破壞的雌性成纖維細(xì)胞系，則同樣將其用作核轉(zhuǎn)移的供體細(xì)胞，或者將得自這類細(xì)胞系的DNA用作核轉(zhuǎn)移的供體。另一方面，這種細(xì)胞可以經(jīng)過第二輪同源重組，從而用與破壞第一等位基因相似但含有不同選擇標(biāo)記的DNA構(gòu)建體來失活所述第二Igλ輕鏈。正如在發(fā)明背景中所論述的，用于實(shí)現(xiàn)核轉(zhuǎn)移、特別是用于產(chǎn)生克隆牛和克隆轉(zhuǎn)基因牛的方法已有報(bào)道，描述于授予Stice等并且轉(zhuǎn)讓給UniversityofMassachusetts的美國專利5995577。再者，另一方面，可以使用在WO95/16670；WO96/07732；WO97/0669；或WO97/0668中公開的核轉(zhuǎn)移技術(shù)(統(tǒng)稱Roslin法)。Roslin法不同于UniversityofMassachusetts的技術(shù)，因?yàn)樗鼈兪褂渺o息供體細(xì)胞，而不是增殖中的供體細(xì)胞。所有這些專利通過引用全部結(jié)合到本文中。這些核轉(zhuǎn)移方法將產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因克隆胎兒，所述胎兒可以用來產(chǎn)生克隆轉(zhuǎn)基因牛后代，例如包含Ig輕鏈基因和/或IgM基因的至少一個(gè)等位基因定向破壞的后代。在創(chuàng)建了這樣的細(xì)胞系后，可以用它們來產(chǎn)生雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)胎兒和后代。此外，這些技術(shù)并不限于用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因牛；上述技術(shù)也可以用于其它有蹄類動物的核轉(zhuǎn)移。在核轉(zhuǎn)移之后，或者通過讓所述有蹄類動物交配，或者通過使用先前描述的同源打靶載體進(jìn)行第二次基因打靶，可以實(shí)現(xiàn)所需動物的產(chǎn)生。如前所述，本發(fā)明的再一目的涉及創(chuàng)建雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者，其中這類半合敲除者使用已經(jīng)描述的細(xì)胞系來產(chǎn)生。通過讓按照上述方法產(chǎn)生的后代交配，其中讓包含所述IgM重鏈基因的已破壞等位基因的后代與包含所述Ig輕鏈的已破壞等位基因的另一后代交配，可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。或者，通過操作從按照上述方法產(chǎn)生的后代獲得的細(xì)胞進(jìn)行第二次基因打靶，可以實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。這將包括通過同源重組定向破壞IgM重鏈基因的等位基因或所述Ig輕鏈的等位基因的實(shí)現(xiàn)。在產(chǎn)生包含雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除(M和FHemiH/L)的細(xì)胞系后，用所述細(xì)胞系產(chǎn)生包含這樣一種敲除的胎兒或幼仔。如上所述，這或者通過交配或者通過第二次基因打靶來實(shí)現(xiàn)。一旦獲得雄性和雌性重鏈和輕鏈半合敲除者，則可以用得自這些動物的細(xì)胞來創(chuàng)建純合敲除(HomoH/L)胎兒。這又或者通過順序基因打靶或者通過交配來實(shí)現(xiàn)。從本質(zhì)上講，如果通過交配來實(shí)現(xiàn)，則這將包括讓雄性重鏈和輕鏈半合敲除者與雌性重鏈和輕鏈半合敲除者交配，并且選擇包含純合敲除的后代。另一方面，可以在組織培養(yǎng)物中對得自上述半合敲除者的細(xì)胞進(jìn)行操作，以便敲除所述IgM或Ig輕鏈(λ鏈)基因的另一等位基因。優(yōu)選進(jìn)行第二次基因打靶，而不是交配，因?yàn)檫@可以獲得更為快速的結(jié)果，尤其是在有蹄類動物例如牛的妊娠期相對長的條件下。一旦獲得了純合敲除者(HomoH/L)，則利用它們來導(dǎo)入含有用來產(chǎn)生特定物種(例如人類)抗體的基因(優(yōu)選整個(gè)基因座)的所需核酸。優(yōu)選使用人類人工染色體，例如在WO97/07671(EP0843961)和WO00/10383(EP1106061)中公開的那些人類人工染色體。這些人類人工染色體在相應(yīng)的已授予的日本專利JP30300092中也有描述。這兩個(gè)申請都通過引用全部結(jié)合到本文中。此外，含有并表達(dá)人免疫球蛋白基因的人工人類染色體的構(gòu)建公開于Shen等，Hum.Mol.Genet.6(8)1375-1382(1997)；Kuroiwa等，NatureBiotechnol.18(10)1086-1090(2000)；和Loupert等，Chromosome107(4)255-259(1998)，所有這些文獻(xiàn)通過引用全部結(jié)合到本文中。人類人工染色體也可以用來將異種抗體基因?qū)胍吧蛣游锛?xì)胞中；這采用上述方法來完成。將人工染色體導(dǎo)入到動物細(xì)胞中，尤其是胎成纖維細(xì)胞中，可以通過本文所述的微細(xì)胞融合來進(jìn)行。在應(yīng)用人類人工染色體的一個(gè)替代方法中，使用YAC載體、BAC載體或粘粒載體，可以將編碼免疫球蛋白基因的核酸整合到染色體中?？梢杂靡阎椒?，例如電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、與包含YAC載體的酵母原生質(zhì)球融合等，將包含異種Ig基因的載體(WO98/24893，WO96/33735，WO97/13852，WO98/24884)導(dǎo)入胎成纖維細(xì)胞中。此外，可以將包含異種Ig基因的載體打靶至所述胎成纖維細(xì)胞的內(nèi)源Ig基因座中，導(dǎo)致同時(shí)導(dǎo)入所述異種Ig基因和破壞所述內(nèi)源Ig基因。也可以如Lonberg等(參見上文)的專利中所述，實(shí)現(xiàn)編碼異種免疫球蛋白基因的核酸的整合。在用以將異種免疫球蛋白基因插入到宿主有蹄類動物染色體中的“敲入”構(gòu)建體中，可以將一種或多種免疫球蛋白基因和抗生素抗性基因與在被所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型中有活性的啟動子操作上連接。例如可以使用組成型活性、誘導(dǎo)型或組織特異性啟動子來激活所整合抗生素抗性基因的轉(zhuǎn)錄，使得轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以根據(jù)其所產(chǎn)生的抗生素抗性而被選擇出來。另一方面，可以使用其中含有所述Ig基因和所述抗生素抗性基因的敲入盒不與啟動子操作上連接的敲入構(gòu)建體。在這種情況下，根據(jù)所產(chǎn)生的在所述內(nèi)源啟動子控制之下所述抗生素抗性標(biāo)記的表達(dá)，可以選擇出其中敲入盒整合到內(nèi)源啟動子下游的細(xì)胞。這些被選出的細(xì)胞可以用于本文所述的核轉(zhuǎn)移方法中，以產(chǎn)生含有整合到宿主染色體中的異種免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。采用相似的方法，有可能產(chǎn)生和插入含有供不同物種(其中例如狗、貓、其它有蹄類動物、非人類靈長類動物)Ig表達(dá)用的基因的人工染色體。如上所述并且如本領(lǐng)域已知的，眾所周知不同物種的免疫球蛋白基因在不同物種之間表現(xiàn)出大致的序列同源性。一旦確定了所插入的人工染色體(例如人類人工染色體)已經(jīng)穩(wěn)定地導(dǎo)入細(xì)胞系(例如牛胎成纖維細(xì)胞)，則它可以用作核轉(zhuǎn)移的供體。這可以通過PCR法來確定。同樣，獲得包含純合敲除、并且還包含穩(wěn)定導(dǎo)入的核酸(例如人類人工染色體)的動物。在得到包括穩(wěn)定摻入的核酸(例如人類人工染色體)的幼仔后，檢驗(yàn)所述動物，以確定它們是否對免疫和親和性成熟應(yīng)答而表達(dá)人Ig基因。也可以進(jìn)行以上概述方法的改進(jìn)方法。例如，可以首先導(dǎo)入異種Ig基因，然后可以將內(nèi)源Ig基因失活。此外，可以讓保留異種Ig基因的動物與其中內(nèi)源Ig基因被失活的動物交配。雖然上文已經(jīng)描述了將在本本發(fā)明中使用的方法，但是所使用的技術(shù)在下文有更詳細(xì)的描述。提供這些實(shí)施例是為了說明本發(fā)明，不應(yīng)解釋為是限制性的。特別是，雖然這些實(shí)施例集中于轉(zhuǎn)基因牛，但是可以使用所述方法來產(chǎn)生和檢驗(yàn)任何轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。產(chǎn)生表達(dá)人Ig的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的敲除法如上所述，本發(fā)明涉及HomoH/L胎兒或幼仔的產(chǎn)生。該方法概述于圖1。其中概述了三個(gè)流程。第一個(gè)流程依靠再生的胎兒細(xì)胞系中的連續(xù)敲除。該方法在技術(shù)上最難，且危險(xiǎn)水平最高，但是如上所述，潛在地比育種法更快地得到結(jié)果。其它兩個(gè)流程依靠將動物配種。在第二個(gè)流程中，在雄性和雌性細(xì)胞系中僅分別需要重鏈基因和輕鏈基因的一次敲除。這一流程不依靠細(xì)胞系的再生，是最簡單的技術(shù)，但需要最長的時(shí)間來完成。流程3介于流程1和流程2之間。在所有流程中，僅產(chǎn)生HomoH/L胎兒，因?yàn)樵贖omoH/L敲除幼仔的生存和維持方面有潛在的困難。如有必要，可以用被動免疫療法來提高HomoH/L敲除幼仔的存活率。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本發(fā)明優(yōu)選涉及雄性半合重鏈敲除者(MHemiH)和半合子雌性輕鏈敲除者(FHemiL)的產(chǎn)生、以及由這些定向缺失產(chǎn)生40天的胎兒。收獲得自所述胚胎的細(xì)胞，在MHemiH細(xì)胞中所述輕鏈基因座中的一個(gè)等位基因被打中，而在FHemiL細(xì)胞中所述重鏈基因座中的一個(gè)等位基因被打中，產(chǎn)生在H和L基因座中都有半合子缺失的細(xì)胞(HemiH/L)。用這些細(xì)胞來得到40天的胎兒，從所述胎兒分離成纖維細(xì)胞。用其它H鏈等位基因?qū)HemiH/L成纖維細(xì)胞打靶，以創(chuàng)建MHomoH/HemiL，而用其它L鏈等位基因?qū)HemiH/L打靶，以創(chuàng)建FHomoL/HemiH。為了創(chuàng)建純合缺失，使用較高的藥物濃度來驅(qū)動純合打靶。然而，有可能這種方法不會成功，并且育種可能是必不可少的。一種依靠選擇盒的cre/lox打靶的示例性策略，使得可以將相同的選擇性系統(tǒng)用于不止一個(gè)靶缺失?？寺∵@些成纖維細(xì)胞，收獲40天的胎兒，然后分離成纖維細(xì)胞。對得自這種克隆的胎兒細(xì)胞打靶，產(chǎn)生或者H基因座或者L基因座的純合缺失，產(chǎn)生MHomoH/L和FHomoH/L胎成纖維細(xì)胞?？寺∵@些成纖維細(xì)胞，得到40天的胎兒，然后分離成纖維細(xì)胞。然后用HomoH/L胎成纖維細(xì)胞，任選地利用育種法來摻入所述HAC。文庫構(gòu)建用胎成纖維細(xì)胞構(gòu)建基因組文庫。盡管已報(bào)道重要的是打靶構(gòu)建體與用于克隆的細(xì)胞等基因，但它對于本發(fā)明而言并非是必需的。例如，可以用等基因、基本等基因或非等基因構(gòu)建體來產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白基因中的突變。在一個(gè)可能的方法中，使用與其它牛品種相比遺傳上有高水平近交的Holstein牛。我們在不同動物中沒有檢測到免疫球蛋白基因的任何多態(tài)性。這提示，序列同源性應(yīng)該高，并且用非等基因構(gòu)建體打靶應(yīng)該能成功。由一個(gè)雄性細(xì)胞系和一個(gè)雌性細(xì)胞系構(gòu)建文庫，同時(shí)進(jìn)行“克隆性”檢驗(yàn)。設(shè)想了在該方法結(jié)束時(shí)，將產(chǎn)生一個(gè)文庫，并且將檢驗(yàn)眾多不同的胎兒細(xì)胞系，選擇一個(gè)細(xì)胞系作為供克隆用的最佳細(xì)胞系。用從所述胎成纖維細(xì)胞分離的高分子量DNA構(gòu)建基因組文庫。將DNA進(jìn)行大小分級分離，將20-23Kb的高分子量DNA插入到λ噬菌體載體λZap或λFix中。本發(fā)明人用Stratagene制備的文庫取出了很大成功。因此，分離DNA，將經(jīng)大小選擇的DNA送至Stratagene用于文庫制備。為了分離含有牛重鏈和輕鏈的克隆，使用放射性標(biāo)記IgMcDNA和放射性標(biāo)記輕鏈cDNA。另外，在必需缺失輕鏈基因座時(shí)，分離輕鏈基因組克隆。對每個(gè)胎細(xì)胞文庫篩選含有牛重鏈和輕鏈的克隆?？紤]了篩選大約105-106噬斑應(yīng)該導(dǎo)致分離出含有或者重鏈或者輕鏈基因座的克隆。一旦分離出，則將兩個(gè)基因座亞克隆到pBluescript中，制作限制性圖譜。Holstein牛中這些基因座的限制性圖譜于圖2B中提供(Knight等JImmunol140(10)3654-9，1988)。另外，制作得自所獲克隆的圖譜，用來裝配所述打靶構(gòu)建體。打靶構(gòu)建體的產(chǎn)生一旦分離出重鏈和輕鏈基因，則制備構(gòu)建體。通過缺失IgM恒定區(qū)膜結(jié)構(gòu)域，制備IgM構(gòu)建體。正如Rajewsky及其同事用小鼠所表明的，IgM膜結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致B細(xì)胞發(fā)育的阻斷，因?yàn)楸砻鍵gM是B細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育所需的信號(Kitamura等，Nature350423-6)。因此，純合IgM牛缺乏B細(xì)胞。這不應(yīng)該成為問題，因?yàn)樵诒景l(fā)明的策略中，缺乏功能性Ig的動物活著出生并非必需。然而，如有必要，可以用被動免疫療法來改進(jìn)動物的存活率，直至導(dǎo)入人Ig基因座的最后一個(gè)步驟。用以實(shí)現(xiàn)IgM重鏈等位基因敲除的一種示例性打靶構(gòu)建體示于以下圖2A中。對于重鏈，所述膜IgM結(jié)構(gòu)域用鄰接loxP位點(diǎn)的新霉素盒取代。將所連接的膜結(jié)構(gòu)域與新霉素盒剪接在一起，使得所述膜結(jié)構(gòu)域具有一個(gè)緊接loxP位點(diǎn)5’插入的TAG終止密碼子，從而確保所述膜結(jié)構(gòu)域被失活。將其與大約5-6千堿基3’染色體DNA一起置于所述打靶構(gòu)建體的5’端。如果提高藥物濃度并未達(dá)到或者IgM重鏈或者輕鏈的第二等位基因缺失，則使用cre/lox系統(tǒng)(在Sauer，1998，Methods14381-392中有綜述)來缺失所述選擇標(biāo)記。如下所述，cre/lox系統(tǒng)允許定向缺失所述選擇標(biāo)記。使所有選擇標(biāo)記鄰接loxP序列，以便于必要時(shí)缺失這些標(biāo)記。輕鏈構(gòu)建體含有牛λ鏈恒定區(qū)(例如在Genbank登錄號AF396698中發(fā)現(xiàn)的λ輕鏈恒定區(qū)或任何其它有蹄類動物λ輕鏈恒定區(qū))和鄰接loxP位點(diǎn)的嘌呤霉素抗性基因盒，并且將用鄰接loxP位點(diǎn)的嘌呤霉素盒取代所述?；颉＆撕愣▍^(qū)基因3’的約5-6千堿基DNA將被嘌呤霉素抗性基因3’的DNA取代。所述嘌呤霉素抗性基因?qū)⒃?’端和3’端都帶有l(wèi)oxP位點(diǎn)，以便于必要時(shí)進(jìn)行缺失。由于在有蹄類動物抗體基因之間有高度的同源性，故此預(yù)計(jì)在Genbank登錄號AF396698中的牛λ輕鏈序列將與得自種類繁多的有蹄類動物的基因組λ輕鏈序列雜交，因而可以用于標(biāo)準(zhǔn)方法中，以分離各種有蹄類動物λ輕鏈基因組序列。這些基因組序列可以用于標(biāo)準(zhǔn)方法例如本文所述的方法中，來產(chǎn)生用以失活任何有蹄類動物中的內(nèi)源λ輕鏈的敲除構(gòu)建體。κ輕鏈敲除構(gòu)建體可以同樣使用圖3G中的牛κ輕鏈序列或任何其它的有蹄類動物κ輕鏈序列來構(gòu)建。這種牛κ輕鏈可以用作雜交探針，來從各種各樣的有蹄類動物中分離基因組κ輕鏈序列。這些基因組序列可以用于標(biāo)準(zhǔn)方法例如本文所述的方法中，來產(chǎn)生用以失活任何有蹄類動物中內(nèi)源κ輕鏈的敲除構(gòu)建體?？梢匀芜x地使另外的有蹄類動物基因突變或失活。例如，可以敲除有蹄類動物內(nèi)源IgJ鏈基因，從而防止給予人類的本發(fā)明抗體中所述有蹄類動物IgJ鏈的潛在抗原性。為了構(gòu)建所述打靶載體，可以使用在Genbank登錄號U02301中發(fā)現(xiàn)的牛IgJ鏈區(qū)的cDNA序列。這一cDNA序列可以用作探針，來從BAC文庫例如RPC1-42(BACPACinOakland，CA)分離牛IgJ鏈的基因組序列，或者從任何其它有蹄類動物中分離所述J鏈的基因組序列。另外，可以將人J鏈編碼序列導(dǎo)入本發(fā)明的有蹄類動物中，以進(jìn)行人IgA和IgM分子的功能性表達(dá)。人J鏈的cDNA序列可從Genbank登錄號AH002836、M12759和M12378中獲得?？梢杂脴?biāo)準(zhǔn)方法，例如本文所述的方法，將這種序列插入到有蹄類動物胎成纖維細(xì)胞中。例如，可以將HAC、YAC載體、BAC載體、粘粒載體或敲入構(gòu)建體中的人J鏈核酸整合到有蹄類動物內(nèi)源染色體中，或者獨(dú)立于有蹄類動物內(nèi)源染色體而保持。所得的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物細(xì)胞可以用于本文所述的核轉(zhuǎn)移法中，以產(chǎn)生具有減少或消除有蹄類動物功能性J鏈表達(dá)的突變并且含有表達(dá)人J鏈的異種核酸的所需有蹄類動物。另外，可以使有蹄類動物α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因突變，以減少或消除由α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生的半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表達(dá)。如果本發(fā)明的有蹄類動物所產(chǎn)生的人抗體被這種糖表位修飾，則這些糖基化抗體在作為治療藥給予人類時(shí)，被接受者體內(nèi)與所述糖表位反應(yīng)的抗體失活或消除。為了消除這種對所述糖表位的可能的免疫應(yīng)答，可以用牛α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列來設(shè)計(jì)用以失活有蹄類動物中該基因的敲除構(gòu)建體(Genbank登錄號J04989；Joziasse等，J.Biol.Chem.264(24)14290-7，1989)。在美國專利6,153,428和5,821,117中公開的這種牛序列或者豬α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶序列，可以用來從各種各樣有蹄類動物中獲得基因組α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶序列，以產(chǎn)生半乳糖基(α1，3)半乳糖表位的表達(dá)減少或消除的其它有蹄類動物。必要時(shí)，可以使有蹄類動物朊病毒基因突變或失活，從而降低諸如牛海綿狀腦病(BSE)的感染的潛在危險(xiǎn)。為了構(gòu)建所述打靶載體，可以使用牛朊病毒基因的基因組DNA序列(Genbank登錄號AJ298878)?；蛘?，可以用這種基因組朊病毒序列，從其它有蹄類動物中分離基因組朊病毒序列?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方法，例如本文所述的方法或者提示用于敲除綿羊α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因或者朊病毒基因的方法(Denning等，NatureBiothech.，19559-562，2001)，使朊病毒基因失活。為了對每個(gè)基因座的第二等位基因打靶，如果第一選擇標(biāo)記留在所述細(xì)胞中，則可能必需裝配含有不同選擇標(biāo)記的一種新的打靶構(gòu)建體。如表1所述，可獲得各種各樣的選擇策略，將其進(jìn)行比較，選擇出合適的選擇系統(tǒng)。最初，通過提高藥物濃度(例如使藥物濃度加倍)，靶向第二等位基因。如果不成功，則可以使用一種新的打靶構(gòu)建體?？梢圆捎酶鞣N方法，將上述其它的突變或基因失活摻入到本發(fā)明的有蹄類動物中。一旦對于每個(gè)所需突變產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因有蹄類動物細(xì)胞系，則可以使用雜交育種，將這些另外的突變摻入到本發(fā)明的有蹄類動物中?；蛘?，具有這些另外的突變的胎成纖維細(xì)胞可以用作起始材料，來敲除內(nèi)源Ig基因和/或?qū)氘惙NIg基因。此外，在內(nèi)源Ig基因中具有一個(gè)敲除突變和/或含有異種Ig基因的胎成纖維細(xì)胞，可以用作這些另外的突變或失活的起始材料。Ig基因座的定向缺失例如通過電穿孔，將打靶構(gòu)建體導(dǎo)入胚胎成纖維細(xì)胞中。利用合適的抗生素，選擇摻入了所述打靶載體的細(xì)胞。將根據(jù)生長選擇出抗所選藥物的克隆。然后這些克隆用更昔洛韋進(jìn)行負(fù)選擇，這將選擇出已經(jīng)適當(dāng)整合的那些克隆?；蛘撸ㄟ^PCR選擇經(jīng)得住所述藥物選擇的克隆。估計(jì)必需篩選至少500-1000個(gè)克隆，以便發(fā)現(xiàn)被適當(dāng)打中的克隆。本發(fā)明人的估計(jì)基于Kitamura(Kitamura等，Nature350423-6，1991)的論文，Kitamura發(fā)現(xiàn)，當(dāng)對IgM重鏈恒定區(qū)的膜結(jié)構(gòu)域打靶時(shí)，大約1/300的neo抗性克隆被正確打中。因此，建議在96孔板中，以10個(gè)克隆一組將克隆混合，并且對10個(gè)克隆的庫篩選所選擇的被打中的克隆。一旦鑒定出陽性克隆，則對從混合克隆分離出的單個(gè)克隆進(jìn)行篩選。這種策略應(yīng)該能夠鑒定出被打中的克隆。因?yàn)槌衫w維細(xì)胞在培養(yǎng)物中遷移，所以當(dāng)每個(gè)培養(yǎng)皿有超過大約10個(gè)克隆時(shí)，難以鑒別單個(gè)克隆。此外，可以開發(fā)用于以高效轉(zhuǎn)染克隆繁殖的策略。可以使用幾種合理的策略，例如稀釋克隆法?？顾幮詷?biāo)記的Cre/Lox切除如上所述，示例性打靶構(gòu)建體含有鄰接loxP位點(diǎn)的選擇標(biāo)記，以便于用cre/lox系統(tǒng)有效地缺失所述標(biāo)記。通過電穿孔，用含Cre的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染帶有所述打靶載體的胎成纖維細(xì)胞?？梢允褂米罱枋龅暮蠫FPcre融合基因的Cre質(zhì)粒[GagnetenS.等，NucleicAcidsRes253326-31(1997)]。這使得可以快速選擇含有Cre蛋白的所有克隆?；蛘咄ㄟ^FACS分選，或者通過經(jīng)顯微操作人工收獲發(fā)綠色熒光的細(xì)胞，選擇這些細(xì)胞。預(yù)計(jì)綠色的細(xì)胞攜帶活性轉(zhuǎn)錄的Cre重組酶，因此缺失抗藥性標(biāo)記。將根據(jù)Cre表達(dá)選擇的細(xì)胞克隆，并且通過PCR分析，分析克隆的抗藥性標(biāo)記的缺失情況。讓經(jīng)測定經(jīng)歷了切除的那些細(xì)胞生長為小克隆，將其分瓶，并且在選擇培養(yǎng)基中檢驗(yàn)一個(gè)等份樣品，從而肯定地確定抗藥性基因已經(jīng)缺失。用其它等份樣品進(jìn)行下一輪的定向缺失。表1選擇標(biāo)記和供選擇用的藥物基因藥物NeorG4181Hph潮霉素B2Puro嘌呤霉素3Ecogpt霉酚酸4Bsr殺稻瘟素S5HisD組氨醇6DT-A白喉毒素71SouthernPJ，BergP.1982.TransformationofmammaliancellstoantibioticresistancewithabacterialgeneundercontroloftheSV40earlyregionpromoter(用SV40早期區(qū)啟動子控制下的細(xì)菌基因?qū)⒉溉閯游锛?xì)胞轉(zhuǎn)化為抗生素抗性).JMolAppIGenet1327-41。2SanterreRF，AllenNE，HobbsJNJr，RaoRN，SchmidtRJ.1984.ExpressionofprokaryoticgenesforhygromycinBandG418resistanceasdominant-selectionmarkersinmouseLcells(作為顯性選擇標(biāo)記的潮霉素B和G418抗性的原核基因在小鼠L細(xì)胞中的表達(dá)).Gene30147-56。3WirthM，BodeJ，ZettlmeisslG，HauserH.1988.Isolationofoverproducingrecombinantmammaliancelllinesbyafastandsimpleselectionprocedure(通過一種快速而簡單的選擇法分離過量生產(chǎn)的重組哺乳動物細(xì)胞系).Gene73419-26。4DrewsRE，KolkerMT，SacharDS，MoranGP，SchnipperLE.1996.Passagetononselectivemediatransientlyaltersgrowthofmycophenolicacid-resistantmammaliancellsexpressingtheescherichiacolixanthine-guaninephosphoribosyltransferasegeneimplicationsforsequentialselectionstrategies(在非選擇培養(yǎng)基上傳代瞬時(shí)改變了表達(dá)大腸桿菌黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因的霉酚酸抗性哺乳動物細(xì)胞的生長順序選擇策略的意義).AnalBiochem235215-26。5KarremanC.1998.Newpositive/negativeselectablemarkersformammaliancellsonthebasisofBlasticidindeaminase-thymidinekinasefusions(基于殺稻瘟素脫氨酶-胸苷激酶融合的供哺乳動物細(xì)胞用的新型正/負(fù)選擇標(biāo)記).NucleicAcidsRes262508-10。6HartmanSC，MulliganRG.1988.Twodominant-actingselectablemarkersforgenetransferstudiesinmammaliancells(在哺乳動物細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)移研究用的兩種顯性開放選擇標(biāo)記).ProcNatlAcadSciUSA858047-51。7YagiT，NadaS.，WatanabeN，TamemotoH，KohmuraN，IkawaY，AizawaS.1993.AnovelnegativeselectionforhomologousrecombinantsusingdiphtheriatoxinAfragmentgene(一種使用白喉毒素A片段基因的同源重組子的新型負(fù)選擇).AnalBiochem21477-86。應(yīng)用打靶策略改變其它有蹄類動物的免疫球蛋白基因?yàn)榱烁淖兤渌刑泐悇游锏拿庖咔虻鞍谆颍O(shè)計(jì)打靶載體，使其含有三個(gè)主要區(qū)域。第一區(qū)與靶基因座同源。第二區(qū)為特異性取代靶基因座的一部分的藥物選擇標(biāo)記。第三區(qū)同第一區(qū)一樣，與靶基因座同源，但是不與野生型基因組中的第一區(qū)相鄰。打靶載體與所需野生型基因座之間的同源重組，導(dǎo)致打靶載體中提供的兩個(gè)同源區(qū)之間的基因座序列缺失并且該序列被抗藥性標(biāo)記所取代。在優(yōu)選實(shí)施方案中，這兩個(gè)同源區(qū)的總大小大約為6千堿基，取代靶基因座一部分的第二區(qū)的大小約為2千堿基。這種打靶策略可廣泛地用于從原核細(xì)胞至人細(xì)胞的種類繁多的物種。所用的每種載體的唯一性在基因打靶法所選擇的基因座和該策略中所使用的序列中。這一方法可用于所有有蹄類動物，包括但不限于山羊(Caprahircus)、綿羊(Ovisaries)和豬(Susscrufa)以及牛(Bostaurus)。應(yīng)用電穿孔對有蹄類動物細(xì)胞中的特定基因打靶，也可以廣泛用于有蹄類動物。本文所述的通用方法適用于將靶突變引入其它有蹄類動物的基因組中。電穿孔條件(電壓和電容)的改進(jìn)條件可以用來對從其它有蹄類動物獲得的轉(zhuǎn)染子數(shù)目進(jìn)行優(yōu)化。另外，在此用來對牛中重鏈基因座打靶(即使用含與緊接被除去外顯子側(cè)翼區(qū)同源的區(qū)的載體除去所有編碼外顯子和間插序列)的策略在其它有蹄類動物也可以同樣好地應(yīng)用。例如，已經(jīng)對綿羊(Ovisaries)的免疫球蛋白重鏈基因座進(jìn)行了廣泛的序列分析，所述綿羊基因座與牛基因座在結(jié)構(gòu)和序列方面非常相似(Genbank登錄號Z71572、Z49180-Z49188、M60441、M60440、AF172659-AF172703)。除了已報(bào)道的關(guān)于重排的Ovisaries免疫球蛋白鏈的大量cDNA序列之外，還報(bào)道了關(guān)于所述重鏈基因座、包括重鏈5’增強(qiáng)子(Genbank登錄號Z98207)、3’μ轉(zhuǎn)換區(qū)(Z98680)和5’μ轉(zhuǎn)換區(qū)(Z98681)的基因組序列信息。綿羊分泌形式重鏈的完整mRNA序列已經(jīng)以登錄號X59994錄入。這一錄入的序列含有四個(gè)編碼外顯子的全序列，它們與相應(yīng)的牛序列高度同源。關(guān)于所述綿羊基因座的信息從Genbank獲得，用來確定與牛序列高度同源的區(qū)域，以供設(shè)計(jì)用于PCR分析的引物。因?yàn)槭褂梅堑然駾NA對牛細(xì)胞打靶，發(fā)現(xiàn)與綿羊序列高度同源的區(qū)用作牛品種之間序列可能相似保守的指標(biāo)。已知牛和綿羊免疫球蛋白基因座的序列和結(jié)構(gòu)之間有相似性，則可以預(yù)期，用以除去牛免疫球蛋白基因座的打靶策略可以成功地應(yīng)用于所述綿羊系統(tǒng)。另外，關(guān)于豬(Susscrofa，登錄號S42881)和山羊(Caprahircus，登錄號AF140603)的現(xiàn)有信息表明，這兩個(gè)物種的免疫球蛋白基因座也與所述?；蜃銐蛳嗨?，因此可以利用本發(fā)明的打靶策略。插入HAC的方法重要的是，獲得含有人類人工染色體序列(#14fg.、#2fg.和#22fg.)的雄性和雌性牛胎成纖維細(xì)胞系并且對其進(jìn)行選擇，用來從這些細(xì)胞系產(chǎn)生克隆幼仔。例如，可以同時(shí)或者順序?qū)氲米匀祟?4號染色體的HAC(＂#14fg，包含Ig重鏈基因)、人類2號染色體(＂#2fg，包含Igκ鏈基因)和人類22號染色體(＂#22fg＂，包含Igλ鏈基因)。通過讓雄性#14fg.動物與雌性#2fg.和#22fg.動物交配，并且評估后代，檢驗(yàn)這些染色體片段的遺傳。如果遺傳成功，則讓這兩個(gè)系交配，以產(chǎn)生含有所有三種染色體片段的系。也可以將#14fg.、#2fg.和#22fg.染色體片段插入到HomoH/L胎兒細(xì)胞中，用來產(chǎn)生克隆幼仔，或者讓轉(zhuǎn)基因HAC幼仔與HomoH/L幼仔雜交。另一方面，可以如實(shí)施例2所述，導(dǎo)入其它HAC，例如ΔHAC或ΔΔHAC，或者用任何其它染色體轉(zhuǎn)移法將其導(dǎo)入。原理HAC的種系遺傳應(yīng)該可用來將所述HAC導(dǎo)入Ig敲除動物以及在生產(chǎn)畜群中繁殖動物。對通過種系繁殖HAC的擔(dān)憂是在減數(shù)分裂期間染色體物質(zhì)不完全配對。然而，如Tomizuka等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97722，2000)所指明的，種系遺傳在小鼠中已經(jīng)獲得成功。圖1A中概述的策略包括將#14fg.插入到雄性細(xì)胞系中，而將#2fg.和#22fg.分別插入到雌性細(xì)胞系中。產(chǎn)生保留HAC的幼仔，可以通過雌性和雄性檢驗(yàn)種系遺傳。一部分所得后代(～25％)應(yīng)該既含有重鏈HAC，又含有輕鏈HAC。進(jìn)一步的雜交應(yīng)該產(chǎn)生含有所有三種染色體片段的幼仔系。用這些動物與如先前所述從胎兒細(xì)胞中產(chǎn)生的HomoH/L動物雜交。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從細(xì)胞系的初次篩選獲得細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是Holstein牛細(xì)胞或者是與上述所用的不同的系。這允許雜交，同時(shí)盡可能地在畜群中保持大量的遺傳變異。然后將HAC導(dǎo)入細(xì)胞系中并且選擇陽性細(xì)胞系。選出的細(xì)胞系用于核轉(zhuǎn)移，并且產(chǎn)生幼仔。從12月齡開始，收集精子和卵，讓其受精，然后轉(zhuǎn)移到受體動物中。取細(xì)胞樣品進(jìn)行DNA標(biāo)記分析和核型分析。在分娩之前，取血樣，分析人Ig蛋白的存在。如上所述，也可以用在上述實(shí)驗(yàn)中開發(fā)的方法，將HAC轉(zhuǎn)移到HomoH/L細(xì)胞系中。人Ig表達(dá)的檢驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)的目的是產(chǎn)生雄性HomoH細(xì)胞和克隆胎兒，以便將一種或多種同時(shí)含有人IgH和人IgL基因座的HAC(例如HAC#14fg.和#22fg.)插入到HomoH細(xì)胞中并且產(chǎn)生幼仔，然后檢驗(yàn)對免疫應(yīng)答的人Ig表達(dá)和親和性成熟。這可如下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從如前所述產(chǎn)生的HemiH細(xì)胞，產(chǎn)生HomoH細(xì)胞?；蛘咄ㄟ^抗生素選擇，或者通過第二次插入，產(chǎn)生雙敲除者。如前所述將HAC轉(zhuǎn)移到這些細(xì)胞中。通過核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生幼仔。對保留HAC的幼仔的檢驗(yàn)在出生后不久開始，并且包括(1)評價(jià)人Ig表達(dá)，(2)對免疫的應(yīng)答，(3)親和性成熟，和(4)所述HAC遺傳至后代的情況。通過讓動物配種，并且通過ELISA、RT-PCR或FACS分析人重鏈和輕鏈表達(dá)的存在，監(jiān)測人Ig的表達(dá)。一旦確定了所述動物產(chǎn)生人Ig，則用加有佐劑的破傷風(fēng)類毒素免疫動物。在免疫后，每周給動物放血一次，通過ELISA或FACS測定對抗原的應(yīng)答，并且與在免疫前收集的原放血樣品進(jìn)行比較。初次免疫后一個(gè)月，用含水形式的所述抗原給動物加強(qiáng)免疫。加強(qiáng)免疫后一周，給動物放血，通過ELISA或FACS測量對抗原的應(yīng)答，并且將其與原放血樣品進(jìn)行比較。ELISA或FACS分析提供對大多數(shù)應(yīng)答的效價(jià)以及所產(chǎn)生的重鏈同種型的測量。這一數(shù)據(jù)提供對抗體效價(jià)的增加以及類別轉(zhuǎn)換發(fā)生的測量。也測量平均親和力的估計(jì)量，以確定在對抗原應(yīng)答期間是否發(fā)生親和性成熟。在如上所述獲得轉(zhuǎn)基因牛之后，用它們來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因Ig，優(yōu)選人Ig，但有可能生產(chǎn)其它物種(例如狗、貓、非人類靈長類動物、其它有蹄類動物諸如綿羊、豬、山羊、鼠類例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔子等)的Ig。正如所知的，已知Ig基因在物種間是保守的。含有異種抗體的轉(zhuǎn)基因抗血清和乳所述牛(或其它有蹄類動物)產(chǎn)生針對內(nèi)源性暴露的任何抗原的轉(zhuǎn)基因抗血清，或者針對外源給予的抗原的轉(zhuǎn)基因抗血清。例如，可以將抗原給予所述有蹄類動物，以生產(chǎn)與所述抗原反應(yīng)的所需抗體，所述抗原包括例如病原體(例如細(xì)菌、病毒、原生動物、酵母或真菌)的抗原、腫瘤抗原、受體、酶、細(xì)胞因子等。用于抗體生產(chǎn)的示例性病原體包括但不限于肝炎病毒(例如丙型肝炎病毒)、免疫缺陷病毒(例如HIV)、皰疹病毒、細(xì)小病毒、腸道病毒、埃博拉病毒(ebolavirus)、狂犬病毒、麻疹病毒、痘苗病毒、鏈球菌屬(Streptococcus)(例如肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae))、嗜血菌屬(Haemaphilus)(例如流感嗜血菌(Haemophilusinfluenza))、奈瑟氏球菌屬(Neisseria)(例如腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitis))、白喉棒桿菌(Coryunebacteriumdiptheriae)、嗜血菌屬(Haemophilus)(例如百日咳嗜血菌(Haemophiluspertussis))、梭菌屬(Clostridium)(例如肉毒梭菌(Clostridiumbotulinium))、葡萄球菌屬(Staphlococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)(例如銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa))和呼吸道合胞病毒(RSV)?？梢詫⒁环N或多種病原體給予轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，以產(chǎn)生可用于預(yù)防、穩(wěn)定或治療特定疾病的超免疫血清。例如，可以將與兒童呼吸道感染相關(guān)的病原體給予轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，以產(chǎn)生與這些病原體(例如肺炎鏈球菌、流感嗜血菌和/或腦膜炎奈瑟氏球菌)反應(yīng)的抗血清。在給予所述有蹄類動物之前，可以任選地處理這些病原體，以降低其毒性(例如通過暴露于熱或化學(xué)藥品例如甲醛)。為了產(chǎn)生廣譜Ig，可以將各種各樣的病原體(例如多種細(xì)菌和/或病毒病原體)給予轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。這種超免疫血清可以用來預(yù)防、穩(wěn)定或治療哺乳動物(例如人類)的感染，尤其可用來治療具有遺傳性或獲得性免疫缺陷的哺乳動物。另外，通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的抗體可以用來抑制免疫系統(tǒng)，例如以治療神經(jīng)病，以及消除特定的人細(xì)胞和調(diào)節(jié)特定的分子。例如，抗獨(dú)特型抗體(即抑制其它抗體的抗體)和與T細(xì)胞、B細(xì)胞或細(xì)胞因子反應(yīng)的抗體，可以用來治療自身免疫病或神經(jīng)病(例如由于炎癥引起的神經(jīng)病)。這些抗體可以從尚未給予抗原的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中獲得，或者它們可以從已經(jīng)給予了抗原例如B細(xì)胞、T細(xì)胞或者細(xì)胞因子(例如TNFα)的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物中獲得。從尚未給予抗原的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因抗血清，可以用來生產(chǎn)包含人多克隆抗體、優(yōu)選人IgG分子的藥物。這些人抗體可以用來替代從人類中分離的抗體，例如靜脈免疫球蛋白(IVIG)治療藥?？梢匀芜x地對轉(zhuǎn)基因抗血清進(jìn)行與一種或多種感興趣抗原反應(yīng)的抗體的富集。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如Ausubel等所述的技術(shù)(CurrentProtocolsinMolecularBiology，volume2，p.11.13.1-11.13.3，JohnWiley&Sons，1995)，純化所述抗血清。優(yōu)選的純化方法包括用抗原或抗體包被的微珠沉淀、柱層析例如親和層析、磁珠親和純化和用板結(jié)合抗原進(jìn)行淘選。另外，可以讓所述轉(zhuǎn)基因抗血清與一種或多種感興趣抗原接觸，根據(jù)抗體/抗原復(fù)合物的增加的大小，可以從未結(jié)合抗體中分離出結(jié)合抗原的抗體。也可以用蛋白A和/或蛋白G來純化IgG分子。如果內(nèi)源抗體的表達(dá)未被消除，則可以用蛋白A和/或抗人Ig輕鏈λ的抗體(Pharmingen)，從內(nèi)源有蹄類動物抗體或有蹄類動物/人類嵌合抗體中分離出所需的人抗體。蛋白A對人Ig重鏈的親和力大于對牛Ig重鏈的親和力，因而可以用來從含有一條或兩條有蹄類動物重鏈的其它抗體中分離含有兩條人重鏈的所需Ig分子?？谷薎g輕鏈λ的抗體可以用來從具有一條或兩條有蹄類動物Ig輕鏈的抗體中分離具有兩條人Igλ鏈的所需Ig分子。另外或者另一方面，可以在一個(gè)負(fù)選擇步驟中使用一種或多種對有蹄類動物Ig重鏈或輕鏈特異性的抗體，以除去含有一條或兩條有蹄類動物重鏈和/或輕鏈的Ig分子。所得的抗血清本身可以用于針對抗原的被動免疫?；蛘?，所述抗血清具有診斷、預(yù)防或純化用途，例如用于達(dá)到純化抗原。另一方面，在給予抗血清后，可以從所述轉(zhuǎn)基因牛中分離出B細(xì)胞，將其用于雜交瘤的制備。例如，可以用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，將得自轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的B細(xì)胞與骨髓瘤融合，產(chǎn)生分泌感興趣的單克隆抗體的雜交瘤(Mocikat，J.Immunol.Methods225185-189，1999；Jonak等，Hum.AntibodiesHybridomas3177-185，1992；Srikumaran等，Science220522，1983)。優(yōu)選的雜交瘤包括通過B細(xì)胞與得自與所述轉(zhuǎn)基因有蹄類動物同一屬或同一物種的哺乳動物的骨髓瘤融合所產(chǎn)生的雜交瘤。其它優(yōu)選的骨髓瘤得自Balb/C小鼠或人類。在這種情況下，提供生產(chǎn)抗特定抗原的異種單克隆抗體的雜交瘤。例如，這一技術(shù)可以用來生產(chǎn)對病原體特異性的人類、貓、狗等(取決于特定的人工染色體)的單克隆抗體。用來選擇生產(chǎn)具有所需特性(即增強(qiáng)的結(jié)合親和性、親合力)的抗體的雜交瘤的方法是眾所周知的。或者，可以對得自轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的B細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以表達(dá)癌基因，例如ras、myc、abl、bcl2或neu，或者用轉(zhuǎn)化DNA或RNA病毒如EB病毒或SV40病毒感染所述B細(xì)胞(Kumar等，Immunol.Lett.65153-159，1999；Knight等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA853130-3134，1988；Shammah等，J.Immunol.Methods160-19-25，1993；Gustafsson和Hinkula，Hum.AntibodiesHybridomas598-104，1994；Kataoka等，Differentiation62201-211，1997；Chatelut等，Scand.J.Immunol.48659-666，1998)。所得的無限增殖化B細(xì)胞也可以用來生產(chǎn)理論上無限量的抗體。因?yàn)镮g也分泌到有蹄類動物的乳中，所以有蹄類動物的乳也可以用作異種抗體的來源。雖然在上文已經(jīng)適當(dāng)?shù)孛枋隽吮景l(fā)明，但另外提供以下實(shí)施例作為本發(fā)明的進(jìn)一步例證。實(shí)施例1牛IgM的敲除以下方法用來產(chǎn)生其中免疫球蛋白重鏈(μ)基因座的一個(gè)等位基因已經(jīng)通過同源重組而被破壞的牛成纖維細(xì)胞系。通過除去μ基因座(對應(yīng)于IgM重鏈基因)的外顯子1-4，并用一個(gè)拷貝的新霉素抗性基因取代，產(chǎn)生用于實(shí)施IgM敲除的DNA構(gòu)建體。使用這種構(gòu)建體，獲得了成功用于核轉(zhuǎn)移法的新霉素抗性細(xì)胞系，并且將得自這些細(xì)胞系的胚泡植入到受體母牛中。另外，測試這些胚泡的一些胚泡，以便用PCR法證實(shí)在μ基因座中恰當(dāng)?shù)匕l(fā)生了定向插入。從所獲得的幾個(gè)細(xì)胞系通過核轉(zhuǎn)移法產(chǎn)生的胚泡表明，在妊娠時(shí)為雜合IgM-KO胎兒。另外，已經(jīng)產(chǎn)生了包含IgM重鏈(μ)單敲除的雄性和雌性細(xì)胞系。預(yù)期從這些細(xì)胞系克隆的動物的配種，將產(chǎn)生其中μ的兩個(gè)拷貝都被失活的后代。這些方法在下文有更為詳細(xì)的論述。DNA構(gòu)建體在本文件中所述的所有轉(zhuǎn)染中所使用的DNA如下產(chǎn)生。四個(gè)主要的外顯子(除了跨膜結(jié)構(gòu)域外顯子)-CH1-4下游(CH4)端的側(cè)翼為一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)，上游(CH1)端的側(cè)翼為一個(gè)XbaI位點(diǎn)。供轉(zhuǎn)染法用的構(gòu)建體由XhoI位點(diǎn)下游的1.5kb基因組序列和XbaI位點(diǎn)上游的3.1Kb基因組序列組成(圖3D和3E)。這些序列如本文所述從來自Massachusetts乳牛群的Holstein牛中分離。將一個(gè)位于3.5Kb片段上的新霉素抗性標(biāo)記插入到這兩個(gè)片段之間，取代原來含有CH1-4、得自原始基因組序列的2.4KbDNA。所述載體的骨架為pBluescriptIISK+(Stratagene)，純化8.1Kb的插入片段，用其轉(zhuǎn)染牛胎成纖維細(xì)胞。該構(gòu)建體示于圖3A-3C。使用標(biāo)準(zhǔn)方法，也可以構(gòu)建含有其它同源區(qū)和/或含有另一種抗生素抗性基因的其它μ敲除構(gòu)建體，用來使內(nèi)源μ重鏈基因突變。轉(zhuǎn)染/敲除方法胎牛的轉(zhuǎn)染用市售試劑SuperfectTransfectionReagent(Qiagen，Valencia，CA，USA)，CatalogNumber301305來進(jìn)行。牛成纖維細(xì)胞產(chǎn)自Hematech′sKansasfacility的經(jīng)病害檢驗(yàn)的雄性Charlais牛，并且送至Hematech′sWorcesterMolecularBiologyLabs，用于所述的所有實(shí)驗(yàn)。任何其它有蹄類動物品種、屬或物種都可以用作供體細(xì)胞(例如體細(xì)胞，如胎成纖維細(xì)胞)來源。對所述供體細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，使其含有減少或消除功能性內(nèi)源Ig表達(dá)的突變。用于培養(yǎng)牛胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基由下述成分組成500mlαMEM(Bio-Whittaker#12-169F)；50ml胎牛血清(Hy-Clone#A-1111-D)；2ml抗生素/抗真菌劑(Gibco/BRL#15245-012)；1.4ml2-巰基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)；5.0mlL-谷氨酰胺(SigmaChemical#G-3126)；和0.5ml酒石酸酪氨酸(SigmaChemical#T-6134)。在轉(zhuǎn)染操作前一天，將細(xì)胞接種到60mm組織培養(yǎng)皿中，通過顯微鏡檢查測定達(dá)到40-80％的目標(biāo)匯合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將總體積為150μl無血清無抗生素培養(yǎng)基中的5μgDNA與20μlSupeffect轉(zhuǎn)染試劑混合，讓其于室溫靜置5-10分鐘，以便形成DNA-Superfect復(fù)合物。當(dāng)發(fā)生所述復(fù)合物形成時(shí)，從含有待轉(zhuǎn)染的牛成纖維細(xì)胞的60mm組織培養(yǎng)皿中取出培養(yǎng)基，細(xì)胞用4ml磷酸緩沖鹽溶液沖洗一次。將1ml生長培養(yǎng)基加入到170μlDNA/Superfect混合物中，立即將其轉(zhuǎn)移到60mm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞上。將細(xì)胞于38.5℃、50％二氧化碳下孵育2.5小時(shí)。在細(xì)胞與DNA/Superfect復(fù)合物一起孵育后，吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞用4mlPBS洗滌4次。加入5ml完全培養(yǎng)基，將培養(yǎng)物于38.5℃、5％CO2下孵育過夜。然后細(xì)胞用PBS洗滌一次，然后與1ml含0.3％胰蛋白酶的PBS一起于37℃孵育，直至通過顯微鏡觀察確定細(xì)胞與板分離。將得自每個(gè)60mm培養(yǎng)皿的細(xì)胞分裝到24孔組織培養(yǎng)板的24個(gè)孔中(41.7μl/孔)。向各孔加入1ml組織培養(yǎng)基，讓板于38.5℃和5％CO2下孵育24小時(shí)。在所有轉(zhuǎn)染操作期間，用不含DNA的Superfect/PBS混合物進(jìn)行假轉(zhuǎn)染，因?yàn)榭梢灶A(yù)期那些細(xì)胞中都不含新霉素抗性基因，并且可以預(yù)期所有細(xì)胞在將G418加入到組織培養(yǎng)基后都死亡。這用作接受DNA的細(xì)胞正選擇的陰性對照。孵育24小時(shí)后，再將1ml含有400μgG418的組織培養(yǎng)基加入到各孔中，使G418的終濃度為200μg/ml。將細(xì)胞放回到培養(yǎng)箱中，進(jìn)行7天的G418選擇。在此期間，監(jiān)測轉(zhuǎn)染板和假轉(zhuǎn)染板的細(xì)胞死亡情況，并且在7天內(nèi)，來自假轉(zhuǎn)染的大多數(shù)孔含有很少或不含活細(xì)胞，而含有接受所述DNA的細(xì)胞的板則顯示出很好的細(xì)胞生長。在7天的選擇期之后，來自90-100％匯合的孔的細(xì)胞用0.2ml含0.3％胰蛋白酶的PBS解離，并且將其轉(zhuǎn)移到35mm組織培養(yǎng)板中以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和孵育，直至它們至少50％匯合，此時(shí)，細(xì)胞用0.6ml含0.3％胰蛋白酶的PBS進(jìn)行胰蛋白酶處理。從每個(gè)35mm組織培養(yǎng)板，將0.6ml細(xì)胞懸浮液中的0.3ml轉(zhuǎn)移至12.5cm2組織培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。將剩余的0.3ml再接種到35mm培養(yǎng)皿中并孵育，直至它們最低達(dá)到大約50％匯合，此時(shí)，對來自那些板的細(xì)胞進(jìn)行加工，以供提取用于PCR分析的DNA。來自每個(gè)系的燒瓶保留在培養(yǎng)箱中，直至它們經(jīng)過這些分析，如果它們不含所需的DNA整合，則終止培養(yǎng)，或者保持在培養(yǎng)箱中，以供將來的核轉(zhuǎn)移和深低溫保藏用。定向整合的篩選如上所述，供篩選含所述DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染子用的DNA源為一個(gè)含有一次傳代的待分析細(xì)胞的35mm組織培養(yǎng)皿。按照Laird等(Laird等，＂SimplifiedmammalianDNAisolationprocedure＂，NucleicAcidsResearch，194293)公開的方法并且對其進(jìn)行改進(jìn)，制備DNA。簡而言之，如下制備DNA。用以下成分制備細(xì)胞裂解緩沖液100mMTris-HCl緩沖液，pH8.5；5mMEDTA，pH8.0；0.2％十二烷基硫酸鈉；200mMNaCl；和100μg/ml蛋白酶K。從每個(gè)35mm組織培養(yǎng)皿中吸取培養(yǎng)基，用0.6ml上述緩沖液取代。將培養(yǎng)皿放回培養(yǎng)箱中達(dá)3小時(shí)，在此期間讓細(xì)胞發(fā)生裂解和蛋白消化。在該孵育之后，將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5ml微量離心管中，加入0.6ml異丙醇以沉淀DNA。通過顛倒離心管，將離心管充分振搖，然后讓其于室溫靜置3小時(shí)，此后將DNA沉淀在微量離心機(jī)中以13,000rpm離心10分鐘。棄去得自每個(gè)管的上清液，沉淀用70％乙醇沖洗一次。吸出70％乙醇，讓DNA沉淀風(fēng)干。干燥后，將每種沉淀重懸于30-50μlTris(10mM)-EDTA(1mM)緩沖液，pH7.4中，讓其過夜水合和溶解。每個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法使用5-7μl的每種DNA溶液。用兩個(gè)獨(dú)立的PCR方法來分析轉(zhuǎn)染子。第一個(gè)方法使用兩種引物，所述引物預(yù)期退火至都位于供轉(zhuǎn)染用的DNA內(nèi)的位點(diǎn)上。第一種引物序列與所述DNA構(gòu)建體的新霉素抗性盒同源，而第二種引物序列距其大約0.5Kb，產(chǎn)生0.5Kb的短PCR產(chǎn)物。具體地說，使用引物Neol(5′-CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3′，SEQIDNO42)和IN2521(5′-CTGAGACTTCCTTTCACCCTCCAGGCACCG-3′，SEQIDNO43)。使用QiagenPCR試劑盒進(jìn)行這一PCR反應(yīng)。所述PCR反應(yīng)混合物含有每種引物各1pmole、5μl10×反應(yīng)緩沖液、10μlQ溶液、5μlDNA和1μldNTP溶液。用水使反應(yīng)混合物的總體積為50μl。采用最初于94℃變性保溫2分鐘，進(jìn)行這一PCR擴(kuò)增。然后通過于94℃保溫45秒、于60℃保溫45秒和于72℃保溫2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，讓反應(yīng)混合物于72℃保溫5分鐘，于4℃保溫直至從PCR儀中取出混合物?；蛘?，在適當(dāng)反應(yīng)條件下進(jìn)行的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)中，可以使用與所述敲除構(gòu)建體中整合到所述細(xì)胞基因組中的區(qū)同源的任何其它引物，以證實(shí)經(jīng)得住G418選擇的細(xì)胞由于所述DNA構(gòu)建體的整合而成為抗性細(xì)胞。因?yàn)榭梢灶A(yù)期，僅一小部分的轉(zhuǎn)染子在所需位置(μ基因座)中含有DNA整合，所以使用另一對引物，來確定不僅所導(dǎo)入的DNA存在于所述轉(zhuǎn)染子的基因組中，而且整合到所需的位置中。使用位于所述DNA構(gòu)建體中新霉素抗性盒內(nèi)的一種引物和可以預(yù)期僅當(dāng)所述DNA整合在IgM基因座的適當(dāng)位點(diǎn)時(shí)才退火在1.8Kb之外(因?yàn)橥磪^(qū)位于轉(zhuǎn)染用的DNA構(gòu)建體中所包含的區(qū)之外)的一種引物，進(jìn)行用來測定恰當(dāng)整合的PCR方法。設(shè)計(jì)所述引物退火到緊鄰所述DNA構(gòu)建體中提供的將整合到所需位置(所述基因座的DNA序列(都在所述DNA中存在的區(qū)內(nèi)并且與之相鄰)先前已經(jīng)測定)的那些序列的DNA序列上。具體地說，使用引物Neol和OUT3570(5′-CGATGAATGCCCCATTTCACCCAAGTCTGTC-3′，SEQIDNO44)進(jìn)行該分析。這一PCR反應(yīng)用QiagenPCR試劑盒如上用于第一個(gè)PCR反應(yīng)所述的方法進(jìn)行，以證實(shí)所述打靶構(gòu)建體整合到所述細(xì)胞中。或者，可以用任何合適的反應(yīng)條件以及與所述敲除構(gòu)建體中整合到所述細(xì)胞基因組中的區(qū)同源的任何其它引物、以及與所述細(xì)胞基因組中所述整合位點(diǎn)上游或下游的區(qū)同源的任何其它引物，進(jìn)行這一PCR分析。采用這些方法，在所述DNA構(gòu)建體定向整合到合適的基因座方面，篩選135個(gè)獨(dú)立的35mm平板。從中確定了得自8個(gè)平板的DNA含有恰當(dāng)定向的DNA構(gòu)建體，然后從中選出三種DNA供核轉(zhuǎn)移方法用。那些細(xì)胞系命名為“8-1C”、“5-3C”和“10-1C”。未用于轉(zhuǎn)移到受體母牛的剩余的胚泡，用來提取DNA，對所述DNA進(jìn)行另外的PCR分析。該分析用嵌套PCR法，使用也用于轉(zhuǎn)染系的初次篩選的引物是有效的。如上所述，用設(shè)計(jì)用以除去μ基因座的外顯子1-4的基因打靶構(gòu)建體，產(chǎn)生三個(gè)細(xì)胞系。用基于PCR的試驗(yàn)，檢驗(yàn)出這些系在定向插入方面都為陽性，將其用于核轉(zhuǎn)移。通過PCR測試已恰當(dāng)打靶的構(gòu)建體，篩選從那些核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的剩余的胚泡。獲得以下頻率的陽性胚泡細(xì)胞系8-1C6/8細(xì)胞系10-1C2/16細(xì)胞系5-3C0/16雖然在妊娠第40天，通過超聲波檢測到總共11次妊娠，到第60天，7個(gè)胎兒死亡。剩余4個(gè)胎兒經(jīng)處理以再生新胎成纖維細(xì)胞，剩余的器官用來產(chǎn)生小組織樣品以進(jìn)行PCR分析。分析結(jié)果如下系8-1C2個(gè)胎兒，1個(gè)胎兒經(jīng)PCR檢查為定向插入陽性系10-1C1個(gè)胎兒，經(jīng)PCR檢查為定向插入陽性系5-3C1個(gè)胎兒，經(jīng)PCR檢查為定向插入陰性令人驚訝的是，雖然10-1C胚泡中檢驗(yàn)為定向插入陽性的頻率僅為2/16，但從該細(xì)胞系獲得的一個(gè)有活力的60天胎兒經(jīng)PCR檢測為陽性。也獲得了得自8-1C的一個(gè)陽性胎兒。對所有組織樣品的DNA進(jìn)行DNA印跡分析，以證實(shí)所述構(gòu)建體不僅在一個(gè)末端正確地打中(這通過對原始構(gòu)建體中存在的較短同源區(qū)進(jìn)行PCR來測定)，而且在另一個(gè)末端也正確地打中。根據(jù)迄今獲得的結(jié)果，認(rèn)為已經(jīng)產(chǎn)生了得自兩個(gè)獨(dú)立整合事件的兩個(gè)重鏈敲除胎兒。此外，由于這些胎兒得自兩個(gè)不同的系，所以至少一個(gè)胎兒可能在兩個(gè)末端正確整合了構(gòu)建體。一旦DNA印跡分析證實(shí)了打靶載體在兩個(gè)末端恰當(dāng)打靶，則進(jìn)行進(jìn)一步的核轉(zhuǎn)移，以產(chǎn)生另外的胎兒，讓其發(fā)育至足月。核轉(zhuǎn)移和胚胎轉(zhuǎn)移用K/O細(xì)胞系(8-1-C(18))進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生8個(gè)胚胎。將得自這一批的總共6個(gè)胚胎在TransOvaGenetics(TOG＂；Iowa)轉(zhuǎn)移到3個(gè)無病受體中。已經(jīng)將冷凍胚胎轉(zhuǎn)移到10個(gè)無病受體中，獲得無病雌性成纖維細(xì)胞系。在35-40天證實(shí)妊娠后，制訂胎兒回收時(shí)間表。妊娠診斷和胎兒回收轉(zhuǎn)移了得自敲除胎兒細(xì)胞的克隆胚胎的18個(gè)受體的妊娠情況，通過超聲波檢查法檢查。結(jié)果概述如下。表2.使用μ重鏈敲除供體細(xì)胞的40天時(shí)的妊娠妊娠診斷檢查了從敲除細(xì)胞(8-1C)轉(zhuǎn)移了克隆胚胎的3個(gè)受體的妊娠情況；一個(gè)已打開(open)，而另外兩個(gè)需要在1個(gè)月后再加以證實(shí)。胎兒回收和細(xì)胞系的建立獲得了40天時(shí)懷有K/O胚胎的11頭妊娠牛。第60天，從這些牛取出4個(gè)活胎兒。從所有4個(gè)胎兒建立了細(xì)胞系，并將細(xì)胞系冷藏待用。此外，我們收集得自所述胎兒的組織樣品并將其快速冷凍，送至Hematechmolecularbiologylaboratory進(jìn)行PCR/DNA印跡分析。所有4個(gè)細(xì)胞系都是雄性細(xì)胞系。為了獲得雌性細(xì)胞系，從在TransOvaGenetics用無病受體所建立妊娠的妊娠55天時(shí)所收集的胎兒(6個(gè))建立細(xì)胞系并且將其冷藏，以供將來建立K/O細(xì)胞。最近，證實(shí)了存在含一個(gè)μ敲除的雌性細(xì)胞系?？梢杂眠@一雌性細(xì)胞系產(chǎn)生克隆動物，可以讓所述克隆動物與從雄性細(xì)胞系產(chǎn)生的動物交配，并且在后代中篩選含有雙μ敲除的后代。實(shí)施例2HAC的導(dǎo)入進(jìn)行另外的實(shí)驗(yàn)，以證明牛宿主可以或者單獨(dú)產(chǎn)生或者聯(lián)合產(chǎn)生免疫球蛋白重鏈(μ)和λ輕鏈。另外，這些實(shí)驗(yàn)證明，所述免疫球蛋白鏈被重排，并且獲得了多克隆血清。在這些方法中，用人類人工染色體將表達(dá)免疫球蛋白的基因?qū)肱３衫w維細(xì)胞中。然后用成纖維細(xì)胞進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，獲得胎兒，并且分析胎兒抗體產(chǎn)生的情況。這些方法和結(jié)果在下文有更詳細(xì)的描述。HAC構(gòu)建體用先前描述的染色體克隆系統(tǒng)(Kuroiwa等，NatureBiotech.181086-1090，2000)，構(gòu)建人類人工染色體(HAC)。簡而言之，為了構(gòu)建ΔHAC，用端粒定向染色體截短法(Kuroiwa等，NucleicAcidRes.，263447-3448，1998)，使先前報(bào)道的含有在HCF2基因座整合的loxP序列的人類22號染色體片段(hChr22)在AP000344基因座截短。接著，通過將含有在AP000344基因座截短的上述hChr22片段(hCF22)的DT40細(xì)胞克隆與含有穩(wěn)定的且種系可遺傳的人類微型染色體SC20載體的DT40細(xì)胞克隆(稱為“R克隆”)融合，形成細(xì)胞雜種。SC20載體通過在S20片段的RNR2基因座插入一個(gè)loxP序列而產(chǎn)生。SC20片段是天然存在的來源于人類14號染色體的片段，該片段包含完整的人Ig重鏈基因區(qū)(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97722，2000)。所得的DT40細(xì)胞雜種含有兩種hChr片段。所述DT40雜種用Cre重組酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，以誘導(dǎo)hCF22和SC20載體之間的Cre/loxP介導(dǎo)的染色體易位。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子用嵌套PCR分析，以證實(shí)由HCF2和AP000344基因座限定的2.5兆堿基hChr22區(qū)克隆到SC20載體的loxP克隆位點(diǎn)中。然后通過FACS分選，根據(jù)所編碼的綠色熒光蛋白的熒光，分離預(yù)期含有ΔHAC的PCR陽性細(xì)胞。經(jīng)分選細(xì)胞的熒光原位雜交(FISH)分析，也用來證實(shí)含有所述2.5兆堿基hChr22插入片段的ΔHAC的存在。同樣采用這種染色體克隆系統(tǒng)，也構(gòu)建了ΔΔHAC。將hChr22片段在AP000344基因座截短，然后通過在DT40細(xì)胞中同源重組，將loxP序列整合到AP000553基因座中。然后將所得細(xì)胞與含有SC20微型染色體載體的R克隆融合。所述細(xì)胞雜種用Cre表達(dá)載體轉(zhuǎn)染，以達(dá)到Cre/loxP介導(dǎo)的染色體易位。通過PCR和FISH分析，證實(shí)了含有由AP000553和AP000344基因座限定的1.5兆堿基hChr22插入片段的ΔΔHAC的產(chǎn)生。ΔHAC和Δ/ΔHAC的體內(nèi)功能性通過產(chǎn)生含有這些HAC的嵌合小鼠來評價(jià)。采用標(biāo)準(zhǔn)方法，將這些HAC各自導(dǎo)入小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞，然后用所述胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生嵌合小鼠(日本專利號2001-142371；2000年5月11日申請)。所得的小鼠具有高度嵌合狀態(tài)(85-100％的毛色)，證明含有這些HAC的ES細(xì)胞高水平的多能性和這些HAC在體內(nèi)的有絲分裂穩(wěn)定性。此外，ΔHAC通過所述ΔHAC嵌合小鼠的種系，遺傳給下一代，證明這種HAC的減數(shù)分裂穩(wěn)定性。保留這些HAC的雞DT40細(xì)胞已經(jīng)根據(jù)布達(dá)佩斯條約，于2001年5月9日提交獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物寄托中心(InternationalPatentOrganismDepository，NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology，TsukubaCentral6，1-1，Higashi1-ChomeTsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566Japan)保藏。保藏號如下ΔHAC(FERMBP-7582)、ΔΔHAC(FERMBP-7581)和SC20片段(FERMBP-7583)。保留這些HAC的雞DT40細(xì)胞也已經(jīng)保藏在臺灣的食品工業(yè)研究和發(fā)育研究所(FoodIndustryResearchandDevelopmentInstitute)(FIRDI)。保藏號和保藏日期如下ΔHAC(CCRC960144；2001年11月9日)，ΔΔHAC(CCRC960145；2001年11月9日)和SC20片段(該細(xì)胞系以名稱SC20(D)提交保藏；CCRC960099；1999年8月18日)。ΔHAC中的2.5兆堿基(Mb)hChr22插入片段由以下BAC毗連群構(gòu)成，所述毗連群由以下Genbank登錄號列出AC002470、AC002472、AP000550、AP000551、AP000552、AP000556、AP000557、AP000558、AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344。ΔΔHAC中的1.5MbhChr22插入片段由以下BAC毗連群構(gòu)成AP000553、AP000554、AP000555、D86995、D87019、D87012、D88268、D86993、D87004、D87022、D88271、D88269、D87000、D86996、D86989、D88270、D87003、D87018、D87016、D86999、D87010、D87009、D87011、D87013、D87014、D86991、D87002、D87006、D86994、D87007、D87015、D86998、D87021、D87024、D87020、D87023、D87017、AP000360、AP00361、AP000362、AC000029、AC000102、U07000、AP000343和AP000344(Dunham等，Nature402489-499，1999)。牛胎成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生為了產(chǎn)生牛胎成纖維細(xì)胞，從在TransOva(Iowa)家畜舍內(nèi)飼養(yǎng)的經(jīng)過疾病檢驗(yàn)的Holstein?；騄ersey牛中收集45-60天的胎兒，其中記錄父本和母本連續(xù)三代的系譜。所收集的胎兒在濕冰上運(yùn)送到Hematech′sWorcesterMolecularBiologyDivsion，以產(chǎn)生原代胎成纖維細(xì)胞。達(dá)到后，將胎兒轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)櫥中的非組織培養(yǎng)級的100mm塑料培養(yǎng)皿中。使用無菌鑷子和剪刀，從所述胎兒除去胚外膜和臍帶。在將胎兒轉(zhuǎn)移到新的塑料培養(yǎng)皿后，除去頭部、肢體和內(nèi)臟。將已取出內(nèi)臟的胎兒轉(zhuǎn)移到含有約10ml胎兒沖洗液的第三個(gè)培養(yǎng)皿中，所述胎兒沖洗液由以下物質(zhì)組成125ml1×Dulbecco′s-PBS(D-PBS)，含有Ca2+和Mg2+(Gibco-BRL，cat#.14040)；0.5ml酒石酸泰樂菌素(TylosineTartrate)(8mg/ml，Sigma，cat#.T-3397)；2ml青霉素-鏈霉素(Sigma，cat#.P-3539)；和1ml兩性霉素(Fungizone)(Gibco-BRL，cat#.15295-017)(混合并通過0.2μm尼龍過濾裝置(Nalgene，cat#.150-0020)過濾)。所述胎兒用胎兒沖洗液再洗滌3次，以除去痕量的血液，將其轉(zhuǎn)移到50ml錐形組織培養(yǎng)管中，用無菌手術(shù)刀將其切碎成小塊。組織小塊用無Ca2+和Mg2+的1×D-PBS(Gibco-BRL，cat#.14190)洗滌1次。在組織小塊沉降至管底部后，除去上清液，更換為約30ml細(xì)胞解離緩沖液(Gibco-BRL，cat#.13151-014)。將管倒置數(shù)次，以便讓其混合，然后在組織培養(yǎng)箱中于38.5℃/5％CO2孵育20分鐘。在組織沉降至管底部后，除去上清液，更換為等體積的新鮮細(xì)胞解離緩沖液。將組織和細(xì)胞解離緩沖液的混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)帶有24mm圓端旋轉(zhuǎn)棒的75ml無菌玻璃胰蛋白酶處理瓶(WheatonScienceProducts，cat#.355393)中。將瓶轉(zhuǎn)移到38.5℃/5％CO2組織培養(yǎng)箱，置于磁力攪拌板上，以足以允許有效混合的速度攪拌大約20分鐘。將瓶轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)櫥中；讓組織小塊沉降，然后除去上清液，通過以1,200rpm離心5分鐘收集解離的細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀重懸于小體積的成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基的組成如下440mlαMEM(BioWhittaker，cat#.12-169F)；50ml經(jīng)照射的胎牛血清；5mlGLUTAMAX-I增補(bǔ)劑(Gibco-BRL，cat#.25050-061)；5ml青霉素-鏈霉素(Sigma，cat#.P-3539)；1.4ml2-巰基乙醇(Gibco-BRL，cat#.21985-023)(將除胎牛血清之外的所有組分混合，然后通過0.2μm尼龍過濾裝置[Nalgene，cat#.151-4020]過濾)，并且在冰上貯存。所述解離過程再重復(fù)3次，在每個(gè)步驟期間使用另外30ml細(xì)胞解離溶液。將細(xì)胞合并，用成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基洗滌；順序通過23號和26號針頭，最后通過70μm細(xì)胞濾過器(B-DFalcon，cat#.352350)，產(chǎn)生單細(xì)胞懸浮液。通過在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，在存在錐蟲藍(lán)(0.4％溶液，Sigma，cat#.T-8154)的情況下計(jì)數(shù)，測定細(xì)胞密度和活力。原代成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，以1×106活細(xì)胞/T75cm2組織培養(yǎng)瓶的細(xì)胞密度于38.5℃/5％CO2擴(kuò)大培養(yǎng)。在培養(yǎng)3天后，或者在細(xì)胞達(dá)到匯合之前，通過用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)沖洗培養(yǎng)瓶1次，并且與10ml細(xì)胞解離緩沖液一起于室溫孵育5-10分鐘，收獲成纖維細(xì)胞。用倒置顯微鏡目測監(jiān)測細(xì)胞的解離。在這一步，小心確保通過用吸管反復(fù)吹打使細(xì)胞塊消散。在洗滌和定量后，解離的成纖維細(xì)胞隨時(shí)可用于基因打靶實(shí)驗(yàn)。這些細(xì)胞也可以冷藏，以供長期貯藏。將HAC導(dǎo)入牛胎成纖維細(xì)胞采用微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體轉(zhuǎn)移(MMCT)(Kuroiwa等NatureBiotech.181086-1090，2000)，將ΔHAC和ΔΔHAC從所述DT40細(xì)胞雜種轉(zhuǎn)移到中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中。在補(bǔ)充10％FBS(Gibco)、1mg/mlG418和0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)培養(yǎng)基中，于37℃和5％CO2培養(yǎng)含有ΔHAC的CHO克隆(“D15克隆”)。將D15克隆在12個(gè)T25瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)匯合度達(dá)到80-90％時(shí)，以0.1μg/ml的終濃度加入秋水仙酰胺(Sigma)至培養(yǎng)基中。3天后，將培養(yǎng)基更換為補(bǔ)充10μg/ml細(xì)胞松弛素B(Sigma)的DMEM(Gibco)。將培養(yǎng)瓶以8,000rpm離心60分鐘，收集微細(xì)胞。微細(xì)胞通過8、5和3μm濾器(Costar)純化，然后重懸于DMEM培養(yǎng)基中。用所述微細(xì)胞如下所述與牛成纖維細(xì)胞融合。牛胎成纖維細(xì)胞在補(bǔ)充10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco)培養(yǎng)基中于37℃和5％CO2下培養(yǎng)。將成纖維細(xì)胞在T175瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到70-80％匯合時(shí)，用0.05％胰蛋白酶使細(xì)胞與培養(yǎng)瓶解離。成纖維細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，然后鋪在所述微細(xì)胞懸浮液上。在微細(xì)胞-成纖維細(xì)胞懸浮液以1,500rpm離心5分鐘后，按照生產(chǎn)商的方案，將PEG1500(Roche)加入到沉淀中，使微細(xì)胞能夠與所述牛成纖維細(xì)胞融合。融合后，將融合的細(xì)胞接種到6個(gè)24孔板中，在補(bǔ)充10％FBS的α-MDM培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。然后將培養(yǎng)基更換為含有0.7mg/mlG418的培養(yǎng)基。在G418抗生素存在下生長大約2周后，選擇G418抗性融合細(xì)胞。用這些G418抗性克隆如下所述進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。同樣借助MMCT，將ΔΔHAC從CHO克隆ΔΔC13轉(zhuǎn)移到牛胎成纖維細(xì)胞中。經(jīng)選擇的G418抗性克隆用于核轉(zhuǎn)移。核轉(zhuǎn)移、激適和胚胎培養(yǎng)基本上如先前已描述的方法(Cibelli等，Science19982801256-1258)，進(jìn)行所述核轉(zhuǎn)移法。在成熟后約18-20小時(shí)(hpm)，將體外成熟的卵母細(xì)胞去核，通過bisBenzimide(Hoechst33342，Sigma)標(biāo)記，在紫外線下證實(shí)染色體的除去。通過應(yīng)用2.4kV/cm達(dá)20μsec的單個(gè)電脈沖(Electrocellmanipulator200，Genetronics，SanDiego，CA)，使這些胞質(zhì)供體細(xì)胞雙聯(lián)體融合。3-4小時(shí)后，取出總轉(zhuǎn)移雙鏈體的25％的一個(gè)隨機(jī)亞組，通過bisBenzimide標(biāo)記轉(zhuǎn)移的細(xì)胞核，證實(shí)融合。30hpm時(shí)，重新構(gòu)建的卵母細(xì)胞和對照如先前已描述的方法(Lin等，Mol.Reprod.Dev.199849298-307；Presicce等，Mol.Reprod.Dev.199438380-385)，用鈣離子載體(5μM)活化4分鐘(CalBiochem，SanDiego，CA)以及用含10μg放線菌酮和2.5μg細(xì)胞松弛素D(Sigma)的ACM培養(yǎng)基活化6小時(shí)。在活化后，卵在HEPES緩沖的倉鼠胚胎培養(yǎng)基(HECM-Hepes)中洗滌5次，然后置于4孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)，所述培養(yǎng)板含有經(jīng)照射小鼠胎成纖維細(xì)胞和0.5ml胚胎培養(yǎng)基并覆蓋0.2ml經(jīng)過胚胎試驗(yàn)的(embryotested)礦物油(Sigma)。每個(gè)孔放置25-50個(gè)胚胎，在空氣環(huán)境下于38.5℃、5％CO2下培養(yǎng)。第4天，向培養(yǎng)基中加入10％FCS。胚胎轉(zhuǎn)移第7天和第8天，將核轉(zhuǎn)移胚泡分別轉(zhuǎn)移到第6天和第7天同步化的受體小母牛中。受體動物采用一次注射Lutalyse(Pharmacia&Upjohn，Kalamazoo，MI)、然后檢查發(fā)情進(jìn)行同步化。在胚胎轉(zhuǎn)移后第30天和第60天，通過超聲波檢查法，檢查受體孕體的存在，此后，每30天通過直腸觸診進(jìn)行檢查，直至270天。HAC在這些牛胎兒中的保留情況概述于表3，并且在以下的小節(jié)中更詳細(xì)地描述。表3牛胎兒中的HCA保留概述含人14號染色體的片段的HAC的導(dǎo)入將SC20片段-人14號染色體片段(“hchr.14fg”，含有Ig重鏈基因)以與上述方法基本相同的方法，導(dǎo)入到胎成纖維細(xì)胞中。也可以使用任何其它的標(biāo)準(zhǔn)染色體轉(zhuǎn)移法，將該HAC或含有人Ig基因的另一種HAC插入到供體細(xì)胞中。所得的供體細(xì)胞可以用于標(biāo)準(zhǔn)核轉(zhuǎn)移技術(shù)，例如上述的那些技術(shù)，以產(chǎn)生具有所述HAC的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。通過超聲波檢查法，檢查從含hchr.14fg的細(xì)胞轉(zhuǎn)移了克隆胚胎的28個(gè)受體的妊娠情況。結(jié)果概述于表4。表4使用含hchr.14fg的供體細(xì)胞于40天的妊娠妊娠率低于預(yù)期。認(rèn)為這可歸因于胚胎轉(zhuǎn)移期間極其異常的炎熱氣候。如圖27中所示，攜帶HAC的胚胎的妊娠率看來與非轉(zhuǎn)基因克隆妊娠率相當(dāng)。一個(gè)攜帶ΔΔHAC幼仔的受體最近產(chǎn)出一個(gè)活的健康幼仔。其它受體將在接下來的數(shù)月內(nèi)生產(chǎn)。人重鏈基因座在ΔHAC牛胎兒中重排和表達(dá)的證明在各種妊娠天數(shù)時(shí)取出克隆ΔHAC轉(zhuǎn)基因牛胎兒，分析其人免疫球蛋白基因座的存在、重排和表達(dá)。對通過RT-PCR從這些胎兒之一的脾和非淋巴組織(肝和腦)獲得的基因組DNA和cDNA的分析，顯示出所述ΔHAC的存在、重排和表達(dá)。在ΔHAC胎兒中存在人重鏈和/或輕鏈為了確定人重鏈和輕鏈?zhǔn)欠癖Ａ粼讦AC胎兒中，從ΔHAC胎兒中分離肝DNA，通過PCR分析編碼人重鏈和輕鏈的基因組DNA的存在情況。為了檢測基因組重鏈DNA，使用以下引物VH3-F5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′(SEQIDNO1)和VH3-R5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′(SEQIDNO2)。用于檢測λ輕鏈DNA的引物是IgL-F5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′(SEQIDNO3)和IgL-R5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′(SEQIDNO4)。PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物和10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlExTaq。通過將反應(yīng)混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)的PCR。如圖5所示，胎兒#5968、6032和6045都含有人重鏈(μ)和輕鏈(λ)兩個(gè)基因座。胎兒#5996僅含有人重鏈基因座。胎兒#5983不含人重鏈，也可能不含人輕鏈。胎兒#5846不含任一種人序列。因此，胎兒#5983和5846可能沒有保留所述HAC。這些結(jié)果提示，ΔHAC可以在牛中穩(wěn)定地保留直至妊娠第58天。在ΔHAC胎兒#5996中存在人Cμ外顯子用對包括Cμ3和Cμ4的部分的mRNA轉(zhuǎn)錄物特異性的引物，來測定在胎兒#5996中ΔHAC是否存在以及是否表達(dá)編碼人μ基因座恒定區(qū)的轉(zhuǎn)錄物。關(guān)于人μ重鏈的基因組恒定區(qū)的這種RT-PCR分析，使用引物“CH3-F1”(5′-accacctatgacagcgtgac-3′，SEQIDNO5)和“CH4-R2”(5′-gtggcagcaagtagacatcg-3′，SEQIDNO6)，產(chǎn)生一種350堿基對的RT-PCR產(chǎn)物。這種PCR擴(kuò)增通過最初于95℃變性保溫5分鐘來進(jìn)行。然后，通過于95℃保溫1分鐘、于59℃保溫1分鐘和于72℃保溫2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，將反應(yīng)混合物于72℃保溫10分鐘。如下所述用引物I7L和P9，檢測重排的牛重鏈(圖7)。作為內(nèi)部對照，用引物“GAPDH正向”(5′-gtcatcatctctgccccttctg3′，SEQIDNO7)和“GAPDH反向”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQIDNO8)，檢測GAPDHRNA的水平。對于這一GAPDHRNA的擴(kuò)增，將樣品于95℃保溫5分鐘，然后于95℃1分鐘、55℃1分鐘和72℃2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的保溫。然后將混合物于72℃保溫7分鐘。該分析表明，胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產(chǎn)生與使用對照人脾cDNA(第4泳道)和得自ΔHAC嵌合小鼠的cDNA(第5泳道)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物匹配的一個(gè)條帶(第3泳道)(圖6)。在非淋巴組織中沒有檢測到這樣的條帶牛肝(第1泳道)或牛腦(第2泳道)。在肝(圖6的第10泳道)和腦(圖7的第6泳道)中成功地?cái)U(kuò)增管家基因GADPH，表明這些組織支持RT-PCR的能力。到妊娠77天時(shí)牛重鏈基因座的重排測試ΔHAC胎兒#5996，以確定它是否經(jīng)歷了免疫球蛋白重鏈基因座重排所需的重組系統(tǒng)表達(dá)和激活所必需的發(fā)育過程。關(guān)于該分析，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR分析，來檢測編碼μ-VH重排的mRNA轉(zhuǎn)錄物的存在。使用引物“17L”(5′-ccctcctctttgtgctgtca-3′，SEQIDNO9)和“P9”(5′-caccgtgctctcatcggatg-3′，SEQIDNO10)，通過RT-PCR分析從胎兒#5996脾、肝和腦分離的RNA。PCR反應(yīng)混合物于95℃保溫3分鐘，然后采用以下條件95℃1分鐘、58℃1分鐘和72℃2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，將反應(yīng)混合物于72℃保溫10分鐘。圖7的第5泳道表明，獲得了預(yù)期大小的重排牛重鏈(450堿基對)擴(kuò)增產(chǎn)物。該產(chǎn)物遷移到與對照牛Cμ重鏈cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的相同位置(第7泳道)，已知所述對照含有對應(yīng)于重排牛重鏈轉(zhuǎn)錄物的序列。正如所預(yù)期的，所述重排重鏈在脾(第5泳道)中表達(dá)，但在發(fā)育的這一時(shí)間點(diǎn)在腦(第2泳道)和肝(第3泳道)中沒有表達(dá)。人重鏈基因座在ΔHAC胎兒#5996中的重排和表達(dá)通過擴(kuò)增包括Cμ和VH區(qū)的部分的DNA區(qū)段，證明人重鏈基因座的重排和表達(dá)。用對包括Cμ(Cμl)和VH(VH3-30)的部分的RNA轉(zhuǎn)錄物特異性的引物，來測定含有重排人Cμ-VDJ序列的RNA轉(zhuǎn)錄物是否存在(圖8)。對于這種RT-PCR分析，使用引物“Cμl”(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQIDNO11)和“VH3-30”(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQIDNO12)，產(chǎn)生450堿基對的RT-PCR產(chǎn)物。這種RT-PCR如下進(jìn)行將反應(yīng)混合物于95℃保溫3分鐘，然后進(jìn)行以下40個(gè)保溫循環(huán)95℃30分鐘、69℃30分鐘和72℃45分鐘，再進(jìn)行72℃10分鐘的一個(gè)保溫循環(huán)。這種RT-PCR產(chǎn)物用相同的引物如下進(jìn)行再擴(kuò)增95℃3分鐘的一個(gè)保溫循環(huán)；95℃1分鐘、59℃1分鐘、72℃1分鐘，40個(gè)保溫循環(huán)；和72℃10分鐘，一個(gè)保溫循環(huán)。作為內(nèi)部對照，如上所述進(jìn)行GAPDH的RT-PCR擴(kuò)增。圖8中的凝膠表明，對胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產(chǎn)生與使用人脾cDNA(第4泳道)或ΔHAC嵌合小鼠脾cDNA(第1泳道)產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物匹配的一個(gè)條帶(第5泳道)。在牛肝(第2泳道)或牛腦(第3泳道)中沒有檢測到這樣的條帶。作為陽性對照，GADPHRNA的擴(kuò)增(第8泳道和第9泳道)表明這些組織支持RT-PCR的能力。也使用引物CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO13)和CH4-R2(5′-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3′，SEQIDNO14)，通過RT-PCR分析，證實(shí)了人重鏈區(qū)在胎兒#5996中的重排和表達(dá)。這些PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。通過將反應(yīng)混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR。如圖9的第6泳道和第7泳道所示，得自胎兒#5996脾的擴(kuò)增序列的大小與得自兩個(gè)陽性對照的剪接恒定區(qū)片段的大小相同，所述陽性對照為得自人脾(第8泳道)和ΔHAC嵌合小鼠脾(第9泳道)的樣品。正如所預(yù)期的，得自正常小鼠脾和牛脾的陰性對照不含擴(kuò)增序列(第1泳道和第2泳道)。得自胎兒#5996肝和腦的樣品不含與經(jīng)剪接的人μ重鏈恒定區(qū)片段一樣大小的擴(kuò)增剪接序列，但含有來源于污染所述RNA樣品的基因組DNA的未剪接基因組片段的擴(kuò)增序列(第3、4和5泳道)。人重鏈基因座在ΔHAC胎兒中的VDJ重排也進(jìn)行了RT-PCR分析，以進(jìn)一步證實(shí)所述重鏈基因座在ΔHAC胎兒#5996中的VDJ重排。進(jìn)行嵌套RT-PCR，第一個(gè)反應(yīng)使用引物Cμ-1(5′-CAGGAGAAAGTGATGGAGTC-3′，SEQIDNO15)，第二個(gè)反應(yīng)使用引物Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQIDNO16)，兩個(gè)反應(yīng)都使用引物VH3-30.3(5′-CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3′，SEQIDNO17)。所述RT-PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。所述RT-PCR如下進(jìn)行，第一個(gè)反應(yīng)使用以下條件進(jìn)行38個(gè)循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。對于第二個(gè)反應(yīng)，使用引物VH3-30.3和Cμ-2(5′-AGGCAGCCAACGGCCACGCT-3′，SEQIDNO16)，在以下條件下進(jìn)行38個(gè)循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、65℃30秒和72℃30秒。如圖10的第6泳道和第7泳道所示，對胎兒#5996脾的RT-PCR分析，產(chǎn)生其大小與第8泳道和第9泳道中的陽性對照一樣的一條重鏈條帶。得自胎兒#5996肝和腦的樣品含有某些污染性重排DNA(第3泳道和第5泳道)。第1泳道和第2泳道中的陰性對照產(chǎn)生大小不正確的條帶。通過測序證實(shí)ΔHAC重排通過從ΔHAC胎兒#5996脾的RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA，用對重排人μ特異性的引物擴(kuò)增，并且在瓊脂糖凝膠上電泳。從凝膠切取通過用Cμl-VH3-30引物對擴(kuò)增所產(chǎn)生的條帶。從該條帶回收所擴(kuò)增的cDNA并將其克隆。純化得自經(jīng)PCR檢測為重排人μ陽性的所得克隆的DNA，并對其測序(圖11A)。得自該ΔHAC胎兒的序列與20種以上的已知人重鏈序列的同源性超過95％。例如，人抗肺炎球菌抗體的μ鏈與該序列的一個(gè)區(qū)有97％同源(圖11B)。通過用引物Cμ-1和VH3-30.3對胎兒#5996的脾進(jìn)行RT-PCR分析，然后用引物Cμ-2和VH3-303進(jìn)行再擴(kuò)增，也獲得了得自重排人重鏈的另外的序列。用CHROMASPIN柱(CLONETECH)純化所述RT-PCR產(chǎn)物，并且按照生產(chǎn)商的方案，將其克隆到pCR2.1TA克隆載體(Invitrogen)中。在由BigDyeTerminator反應(yīng)混合物(3μl)、模板質(zhì)粒(200ng)和Cμ-2引物(1.6pmol)組成的10μl體積的反應(yīng)混合物中，進(jìn)行染料終止序列反應(yīng)(ABIAppliedSystem)。測序反應(yīng)用ABI3700測序儀進(jìn)行。對于該分析，在以下條件下進(jìn)行25個(gè)循環(huán)96℃1分鐘、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分鐘。鑒定出至少兩種重排人重鏈轉(zhuǎn)錄物，它們是VH3-11/D7-27/JH3/Cμ和VH3-33/D6-19/JH2/Cμ(圖12A和12B)。這些結(jié)果證明，在胎兒#5996脾中的所述ΔHAC中發(fā)生人μ重鏈基因座的VDJ重排。從同一個(gè)胎兒鑒定出不止一種重排重鏈序列，也證明了ΔHAC胎兒產(chǎn)生多樣化人免疫球蛋白序列的能力。人重鏈和輕鏈基因座在ΔΔHAC胎兒中的重排和表達(dá)從不同妊娠日期的受體母牛，取出得自牛胎成纖維細(xì)胞ΔΔHAC染色體轉(zhuǎn)移的克隆胎兒。分析所述胎兒的帶有HAC的人免疫球蛋白重鏈和λ輕鏈基因座的存在和重排。對得自這些組織的基因組DNA的研究表明，在其中某些胎兒中存在人免疫球蛋白重鏈和輕鏈。對得自這些胎兒脾的cDNA的檢查表明，所述免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座在其中某些胎兒中重排和表達(dá)。FACS分析也證明了人λ輕鏈蛋白在其中兩個(gè)胎兒的脾淋巴細(xì)胞表面表達(dá)。在ΔΔHAC胎兒中存在人重鏈和輕鏈基因座為了確定ΔΔHAC胎兒是否保留有人重鏈和輕鏈基因座，對得自58天胎兒#5580、57天胎兒#5848以及91天胎兒#5442A和5442B的肝的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。用于檢測所述重鏈基因座的PCR引物是VH3-F(5′-AGTGAGATAAGCAGTGGATG-3′，SEQIDNO18)和VH3-R(5′-CTTGTGCTACTCCCATCACT-3′，SEQIDNO19)，而用于檢測所述輕鏈的引物是IgL-F(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO20)和IgL-R(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTYGACT-3′，SEQIDNO21)。所述PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlExTaq。如下進(jìn)行38個(gè)PCR循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、56℃30秒和72℃30秒(圖13和14)。如圖13和14所示，陽性對照58天胎兒#5580含有人重鏈和輕鏈免疫球蛋白兩個(gè)基因座。另外，91天的胎兒#5442A和5442B也含有重鏈和輕鏈兩個(gè)基因座(圖14)。相反，胎兒#5848不含任一種人基因座，因此可能不含有ΔΔHAC。這些結(jié)果提示，ΔΔHAC可以在牛中穩(wěn)定保留直至妊娠第91天。人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A中的重排和表達(dá)用RT-PCR來檢測重排人重鏈RNA轉(zhuǎn)錄物在ΔHAC胎兒#5542A中的表達(dá)。所用的RT-PCR引物是CH3-F3(5′-GGAGACCACCAAACCCTCCAAA-3′，SEQIDNO22)和CH4-R2(5′-GAGAGTTGCAGAAGGGGTGACT-3′，SEQIDNO23)。所述RT-PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。如下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的RT-PCR循環(huán)85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒。圖15的第4泳道和第5泳道含有來自胎兒#5442A脾的擴(kuò)增的剪接μ重鏈恒定區(qū)序列，其大小與所述陽性對照樣品的大小相似。這些結(jié)果表明，胎兒#5442A在其脾中表達(dá)一種重排的μ重鏈轉(zhuǎn)錄物。在未經(jīng)剪接的基因組序列的區(qū)中也觀察到模糊條帶，它們是從所述RNA樣品中污染的基因組DNA擴(kuò)增的。得自胎兒#5442A肝和腦的對照樣品不產(chǎn)生擴(kuò)增重排重鏈序列所預(yù)期大小的條帶。人重鏈基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達(dá)用RT-PCR來檢測重排人重鏈RNA轉(zhuǎn)錄物在一個(gè)妊娠119天的ΔΔHAC胎兒(胎兒#5868A)的脾中的表達(dá)。用于該分析的引物是VH30-3(5′-caggtgcagctggtggagtctgg-3′，SEQIDNO24)和CM-1(5′-caggagaaagtgatggagtc-3′，SEQIDNO25)。另外，使用引物“GAPDHup”(5′-gtcatcatctctgccccttctg-3′，SEQIDNO26)和“GAPDHdown”(5′-aacaacttcttgatgtcatcat-3′，SEQIDNO27)來擴(kuò)增GAPDH對照轉(zhuǎn)錄物。對于該P(yáng)CR分析，將反應(yīng)混合物于95℃保溫5分鐘，然后通過于95℃保溫1分鐘、58℃保溫1分鐘和72℃保溫2分鐘，進(jìn)行多個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，將混合物于72℃保溫10分鐘。圖16的第3泳道含有通過對ΔΔHAC胎兒#5868A進(jìn)行該分析而產(chǎn)生的RT-PCR產(chǎn)物。這種RT-PCR產(chǎn)物為擴(kuò)增重排人重鏈所預(yù)期的大小(470堿基對)，并且在凝膠中遷移到與已知含有對應(yīng)于重排人重鏈轉(zhuǎn)錄物的序列的對照cDNA相同的位置。作為對照，ΔΔHAC胎兒#5868A的胎脾cDNA和正常牛cDNA樣品當(dāng)用GAPDH引物擴(kuò)增時(shí)，都產(chǎn)生一種產(chǎn)物，證明所述cDNA支持?jǐn)U增的能力(第7泳道和第8泳道)。人λ基因座在ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B中的重排和表達(dá)使用對擴(kuò)增包括人λ的部分的轉(zhuǎn)錄物特異性的引物，來檢測得自重排人λ輕鏈基因座的RNA轉(zhuǎn)錄物。對于圖17中所示的RT-PCR分析，使用引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQIDNO28)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQIDNO29)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQIDNO30)的等摩爾混合物和引物Vλ1LEA1(5′-CCCCCAAGCTTRCCKGSTYYCCTCTCCTC-3′，SEQIDNO31)。所述RT-PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×ExTaq緩沖液、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μlcDNA和0.3μlExTaq。所述RT-PCR的條件如下85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒、60℃30秒和72℃30秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。如圖18所示，該RT-PCR分析也使用下述引物進(jìn)行引物Vλ3LEA1(5′-CCCCCAAGCTTGCCTGGACCCCTCTCTGG-3′；SEQIDNO32)、Vλ3JLEAD(5′ATCGGCAAAGCTTGGACCCCTCTCTGGCTCAC-3′，SEQIDNO33)，VλBACK4(5′-CCCCCAAGCTTCTCGGCGTCCTTGCTTAC-3′，SEQIDNO34)的等摩爾混合物以及引物Cλ1(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTTCACTGATCAG-3′，SEQIDNO35)、Cλ2-3(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTATGAG-3′，SEQIDNO36)和Cλ7(5′-GGGAATTCGGGTAGAAGTCACTTACGAG-3′，SEQIDNO37)的等摩爾混合物。所述RT-PCR的反應(yīng)條件與以上關(guān)于圖7所述的條件相同。圖17的第6泳道和第7泳道以及圖18的第4泳道和第5泳道含有得自胎兒#5442A脾、大小與所述陽性對照條帶相似的RT-PCR產(chǎn)物，表明在該胎兒中存在重排的輕鏈RNA轉(zhuǎn)錄物。得自胎兒#5442B的脾樣品產(chǎn)生在該照片中肉眼不可見的非常弱的大小合適的條帶。這種RT-PCR產(chǎn)物表明，胎兒#5442B也在其脾中表達(dá)重排的輕鏈免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄物。正如所預(yù)期的，得自胎兒#5442A和5442B腦的樣品不表達(dá)人重排λ輕鏈轉(zhuǎn)錄物。人λ基因座在ΔΔHAC胎兒#5868A中的重排和表達(dá)在ΔΔHAC胎兒#5868A中也檢測到重排人λ輕鏈基因座的RNA轉(zhuǎn)錄物。關(guān)于這一分析，使用對擴(kuò)增包括人λ的部分的轉(zhuǎn)錄物特異性的引物，來檢測編碼重排人λ基因座部分的轉(zhuǎn)錄物的ΔΔHAC編碼的表達(dá)。該分析使用引物VL1LEAI(5′-cccccaagcttRccKgStYYcctctcctc-3′；SEQIDNO38)以及引物CL1(5′-gggaattcgggtagaagtcactgatcag-3′；；SEQIDNO39)、CL2-3(5′-gggaattcgggtagaagtcacttatgag-3′；SEQIDNO40)和CL7(5′-gggaattcgggtagaagtcacttacgag-3′；SEQIDNO41)的等摩爾混合物。對于該RT-PCR反應(yīng)，將反應(yīng)混合物于95℃保溫5分鐘，然后通過于95℃保溫1分鐘、60℃保溫1分鐘和72℃保溫2分鐘進(jìn)行多個(gè)變性、退火和擴(kuò)增循環(huán)。然后將混合物于72℃保溫10分鐘。該分析證明，得自ΔΔHAC#5868A的脾cDNA(圖19的第4泳道)產(chǎn)生一種大小與TC小鼠脾cDNA(第6泳道)陽性對照相同的RT-PCR產(chǎn)物。使用得自ΔΔHAC#5868A腦或肝cDNA(分別為第2泳道和第3泳道)，檢測不到這樣的RT-PCR產(chǎn)物。用引物“GAPDHup”和“GAPDHdown”成功地?cái)U(kuò)增管家基因GAPDH(第8泳道和第10泳道)，表明這些組織中的每種組織支持RT-PCR的能力。通過測序證實(shí)ΔΔHAC重排使用引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩爾混合物和引物Vλ1LEA1，或者使用引物Vλ3LEA1、Vλ3JLEAD和VλBACK4的等摩爾混合物和引物Cλ1、Cλ2-3和Cλ7的等摩爾混合物，對胎兒#5442A脾樣品進(jìn)行RT-PCR分析。所述PCR產(chǎn)物用CHROMASPIN柱(CLONETECH)純化，并且按照生產(chǎn)商的方案，克隆到pCR2.1TA克隆載體(Invitrogen)中。使用Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物的等摩爾混合物進(jìn)行DyeTerminatorsequence反應(yīng)(ABIAppliedSystem)。于96℃1分鐘、96℃10秒、55℃5秒和60℃4分鐘，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。10μl反應(yīng)混合物含有BigDyeTerminator反應(yīng)混合物(3μl)、模板質(zhì)粒(200ng)以及Cλ1、Cλ2-3和Cλ7引物(1.6pmol)。用ABI3700測序儀分析反應(yīng)混合物。鑒定出至少兩種重排人λ輕鏈轉(zhuǎn)錄物(V1-17/JL3/Cλ和V2-13/JL2/Cλ)。這些結(jié)果證明人λ輕鏈基因在胎兒#5442A脾的ΔΔHAC中發(fā)生VJ重排(圖20和21)。人λ輕鏈和牛重鏈在ΔΔHAC胎兒#S442A和5442B中表達(dá)的FACS分析分析得自ΔΔHAC胎兒#5442A和5442B的脾淋巴細(xì)胞中人λ輕鏈和牛重鏈蛋白的表達(dá)。讓這些細(xì)胞與藻紅蛋白標(biāo)記的抗人λ抗體(圖22C和22D)、FITC標(biāo)記的抗牛IgM抗體(圖22D和22H)或無抗體(圖22A、22B、22E和22F)于4℃反應(yīng)20分鐘。然后細(xì)胞用PBS加上2％FCS洗滌2次，然后在FASCalibur細(xì)胞分類器上分析。用無抗體對照來電子設(shè)定門控(electronicallysethegates)，計(jì)算與所述抗體反應(yīng)的細(xì)胞的百分率。這些百分率顯示在每條頻率曲線的下方。胎兒#5442A(圖22A-22D)和胎兒#5442B(圖22E-22H)既表達(dá)人λ輕鏈蛋白，又表達(dá)牛重鏈蛋白。實(shí)施例3產(chǎn)生異種抗體和減少量的內(nèi)源抗體的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物也可以產(chǎn)生表達(dá)異種抗體并且具有內(nèi)源抗體表達(dá)水平降低的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。通過相對于功能性內(nèi)源重鏈基因或輕鏈基因的數(shù)目而言增加功能性異種免疫球蛋白重鏈基因或輕鏈基因的數(shù)目，應(yīng)該提高表達(dá)異種抗體的B細(xì)胞的百分率。為了產(chǎn)生這些轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，可以讓ΔHAC或ΔΔHAC轉(zhuǎn)基因有蹄類動物與在內(nèi)源免疫球蛋白鏈(例如μ重鏈或者λ或κ輕鏈)的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中含有突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物交配。如有必要，可以讓所得的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物(i)與在內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒和/或J鏈核酸的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中有突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物交配，或者(ii)與含有外源J鏈核酸(例如人J鏈)的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物交配?；蛘撸梢酝ㄟ^使一種或多種內(nèi)源免疫球蛋白基因突變，對得自ΔHAC或ΔΔHAC轉(zhuǎn)基因胎兒的細(xì)胞(例如胎成纖維細(xì)胞)進(jìn)行遺傳修飾。在另一種可能的方法中，將ΔHAC或ΔΔHAC導(dǎo)入到其中內(nèi)源免疫球蛋白(μ重鏈和/或λ輕鏈)被半合失活或純合失活的細(xì)胞(例如胎成纖維細(xì)胞)中。在任一上述方法中，也可以通過(i)將突變(優(yōu)選敲除突變)導(dǎo)入內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒和/或J鏈核酸的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中，或者(ii)導(dǎo)入內(nèi)源J鏈核酸，對所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。然后，可以將所得的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于核轉(zhuǎn)移方法中，以產(chǎn)生所需的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。以下描述示例性的方法DNA構(gòu)建體可以使用以上所述的μ重鏈(圖2A)、λ輕鏈、κ輕鏈、α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒和/或J鏈敲除構(gòu)建體。另一方面，可以使用以下所述的嘌呤霉素抗性μ重鏈構(gòu)建體(圖3F)。這種敲除構(gòu)建體設(shè)計(jì)用以除去牛μ重鏈基因座的4個(gè)主要編碼外顯子，而留下完整的跨膜結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致所述μ重鏈基因座失活。嘌呤霉素抗性構(gòu)建體如下裝配。將含有緊鄰編碼外顯子1的區(qū)的4.4千堿基XhoI片段插入到pBluescriptIISK+的XhoI位點(diǎn)。含有嘌呤霉素抗性基因的質(zhì)粒pPGKPuro得自PeterW.Laird博士，WhiteheadInstitute，USA。將含有嘌呤霉素抗性基因的1.7KbXhoI片段鄰近插入到多接頭區(qū)中存在的SalI位點(diǎn)中的所述4.4Kb片段亞克隆，或者在其下游亞克隆。這一1.7Kb嘌呤霉素標(biāo)記取代了牛免疫球蛋白重鏈基因座的編碼外顯子CH1、CH2、CH3和CH4。將含有位于野生型基因組序列中這四個(gè)外顯子下游的μ基因座的4.6Kb區(qū)的XbaI片段，加入到該構(gòu)建體中，用作第二同源區(qū)。為了產(chǎn)生最終的打靶構(gòu)建體，通過用NotI和MluI切割這三種裝配好的片段，產(chǎn)生該構(gòu)建體的亞克隆。MluI限制性消化將所述4.6Kb片段截短至1.4Kb。NotI位點(diǎn)位于多接頭中，并且不可切割成為亞克隆DNA本身。MluI位點(diǎn)用Klenow片段補(bǔ)平，產(chǎn)生平端，然后利用pBluescriptIISK+載體中存在的NotI和SmaI位點(diǎn)，將NotI/補(bǔ)平MluI片段亞克隆到新的所述pBluescript載體中。為了進(jìn)行基因打靶，最終的載體用NotI線性化。通過電穿孔進(jìn)行基因打靶和轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞的藥物選擇對于電穿孔，將經(jīng)歷了有限次數(shù)群體倍增的1×107牛胎成纖維細(xì)胞(例如按照實(shí)施例2所述從ΔHAC或ΔΔHAC轉(zhuǎn)基因胎兒獲得的成纖維細(xì)胞)的單細(xì)胞懸浮液以1200rpm離心5分鐘，然后重懸于0.8ml無血清α-MEM培養(yǎng)基中。將重懸浮的細(xì)胞移至0.4cm電穿孔樣品池(Invitrogen，cat#.P460-50)中。接著，加入30μg限制性酶線性化的基因打靶載體DNA，用1ml移液管將樣品池中的內(nèi)容物混合，然后進(jìn)行一個(gè)室溫下2分鐘的孵育步驟。將樣品池插入GenePulserII電穿孔系統(tǒng)(Biorad)的振蕩(shocking)室中，然后以1000伏特和50μF進(jìn)行電穿孔。迅速將樣品池轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)櫥中，用吸管將電穿孔細(xì)胞加入到大約30ml成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基中。將細(xì)胞同等地分配到30個(gè)100mm組織培養(yǎng)皿(Corning，cat#.431079)中，溫和旋轉(zhuǎn)，以使細(xì)胞均勻分布，然后于38.5℃/5％CO2下孵育16-24小時(shí)。吸出培養(yǎng)基，更換為含有所選的選擇藥物的成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)基每兩天進(jìn)行更換，持續(xù)總共7-14天。在所述藥物選擇過程中，目測監(jiān)測代表性板，以檢查細(xì)胞死亡和集落形成。設(shè)定陰性對照板，陰性對照板含有在無基因打靶載體時(shí)電穿孔的成纖維細(xì)胞，在所述藥物選擇過程中應(yīng)該不產(chǎn)生集落?？顾幮猿衫w維細(xì)胞集落的挑出和細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)在完成藥物選擇步驟(通常7-14天)之后，抗藥性集落用肉眼可見，隨時(shí)可供轉(zhuǎn)移到48孔組織培養(yǎng)板中以進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。為了有助于轉(zhuǎn)移過程，在用彩色標(biāo)記筆(Sharpie)在組織培養(yǎng)板底部圈出單個(gè)集落。含有集落的組織培養(yǎng)板用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)洗滌2次，然后每個(gè)板加入5ml細(xì)胞解離緩沖液的1∶5稀釋液。在室溫3-5分鐘的孵育步驟之后，單集落開始與組織培養(yǎng)皿底部分離。在集落分離之前，用P200自動移液器和氣溶膠阻擋吸頭(aerosolbarrierpipettetip)(200或250μl)，將它們分別轉(zhuǎn)移到48孔組織培養(yǎng)板的一個(gè)孔中。轉(zhuǎn)移后，用吸管反復(fù)吸打，使集落完全解離，然后加入1ml成纖維細(xì)胞完全培養(yǎng)基。為了確保所述細(xì)胞是抗藥性的，在整個(gè)所述48孔期繼續(xù)進(jìn)行藥物選擇。轉(zhuǎn)移的集落在38.5℃/5％CO2下培養(yǎng)，并且用倒置顯微鏡目測監(jiān)視。2-7天后，達(dá)到匯合的孔用1×D-PBS(無Ca2+和Mg2+)洗滌2次，通過加入0.2ml細(xì)胞解離緩沖液，后接一個(gè)于室溫孵育5分鐘的步驟，使其與孔底部分離。在解離后，通過用P1000自動移液器和氣溶膠吸頭(1000μl)反復(fù)吸打使細(xì)胞進(jìn)一步解離。將大約75％的解離成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到24孔組織培養(yǎng)板的各孔中進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，以供后續(xù)的PCR分析用，將剩余的25％轉(zhuǎn)移到第二個(gè)24孔板的一個(gè)孔中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并且最終用于體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。當(dāng)在含有75％原始細(xì)胞的板中的細(xì)胞增殖至接近匯合時(shí)，從該克隆分離DNA進(jìn)行遺傳分析。DHA制備用來分離供遺傳分析用的DNA的方法是Laird等，NucleicAcidsResearch，1991，Volume19，No.15的方法的改進(jìn)方法。特別是，一旦特定克隆在24孔板的一個(gè)孔中已經(jīng)達(dá)到接近匯合，則從該孔中吸出培養(yǎng)基，貼壁細(xì)胞用PBS洗滌2次。吸出PBS，更換為0.2ml緩沖液，以裂解所述細(xì)胞和從待分離DNA消化過量蛋白。該緩沖液的組成為100mMTris-HCl(pH8.5)、5mMEDTA、0.2％SDS、200mMNaCl和100μg/ml蛋白酶K。將24孔板放回組織培養(yǎng)箱中達(dá)最少3小時(shí)，從而讓所述DNA釋放和蛋白消化。將該操作的粘性產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到1.5ml微量離心管中，加入0.2ml異丙醇以沉淀DNA。通過離心回收沉淀，DNA沉淀用70％乙醇漂洗，風(fēng)干后，將沉淀重懸于含有10mMTris，pH8和1mMEDTA的25-50μl緩沖液中。該DNA用于克隆的PCR分析?？寺〉暮Y選用兩種不同的方法篩選克隆，兩種方法都使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。該小節(jié)中所述的所有方法可適用于任何其它基因的打靶，不同之處僅為遺傳分析所用引物的序列。按照第一種方法，用不同的兩對引物，獨(dú)立擴(kuò)增穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的產(chǎn)物。用一對引物來檢測克隆基因組中打靶載體的存在，而與整合位點(diǎn)無關(guān)。所述引物設(shè)計(jì)用以全都退火至打靶載體中存在的DNA序列上。該P(yáng)CR反應(yīng)的PCR產(chǎn)物的強(qiáng)度可能與已經(jīng)整合到基因組中的打靶載體的拷貝數(shù)相關(guān)。因此，僅含有一個(gè)拷貝打靶載體的細(xì)胞通過所述PCR反應(yīng)往往產(chǎn)生強(qiáng)度較弱的條帶。另一對引物設(shè)計(jì)用以僅檢測整合到所需基因座中的載體的拷貝。在這種情況下，一種引物設(shè)計(jì)退火到打靶載體內(nèi)，而另一種引物設(shè)計(jì)用以退火至在打靶載體中不存在的、對靶基因座特異性的序列上。在這種情況下，只有當(dāng)打靶載體緊鄰打靶載體中不存在的所述位點(diǎn)整合時(shí)，才可檢測到PCR產(chǎn)物，指示所需的打靶事件。如果檢測到產(chǎn)物，則用所述克隆進(jìn)行核轉(zhuǎn)移。對于新霉素抗性重鏈敲除構(gòu)建體，使用引物Neol(5′-CTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCC-3′，SEQIDNO42)和IN2521(5′-CTGAGACTTCCTTTCACCCTCCAGGCACCG-3′，SEQIDNO43)來檢測細(xì)胞中打靶載體的存在，而與整合位置無關(guān)。使用引物Neol和OUT3570(5′-CGATGAATGCCCCATTTCACCCAAGTCTGTC-3′，SEQIDNO44)來特異性地僅擴(kuò)增整合到μ重鏈基因座的打靶構(gòu)建體的那些拷貝。對于用來分析所述新霉素抗性重鏈敲除構(gòu)建體整合的這些PCR反應(yīng)，使用QiagenPCR試劑盒。所述PCR反應(yīng)混合物含有每種引物各1pmole、5μl10×反應(yīng)緩沖液、10μlQ溶液、5μlDNA和1μlofdNTP溶液。用水使反應(yīng)混合物的總體積達(dá)到50μl。使用最初于94℃變性保溫2分鐘，進(jìn)行該P(yáng)CR擴(kuò)增。然后通過于94℃保溫45秒、60℃保溫45秒和72℃保溫2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，將反應(yīng)混合物于72℃保溫5分鐘，然后于4℃溫育直至從PCR儀中取出混合物。在替代的方法中，用一個(gè)引物組來擴(kuò)增靶基因座，并且所述PCR產(chǎn)物的大小是正確打靶的鑒別特征。一種引物設(shè)計(jì)退火到打靶載體中不存在的所述基因座的一個(gè)區(qū)上，而另一種引物設(shè)計(jì)退火至打靶載體中存在、但在野生型基因座中也存在的位點(diǎn)上。在這種情況下，不能檢測到已經(jīng)在基因組中不想要的位點(diǎn)整合的打靶載體。因?yàn)榇虬休d體所缺失的區(qū)域在大小上與其位置中插入的藥物選擇標(biāo)記不同，所以所述產(chǎn)物的大小取決于所擴(kuò)增的基因座是野生型基因型還是靶基因型。含不正確插入的打靶載體或者根本沒有插入打靶載體的克隆的DNA的擴(kuò)增，產(chǎn)生預(yù)期大小的、野生型基因座的一種PCR產(chǎn)物。得自含被正確打中的(“敲除的”)等位基因的克隆的DNA的擴(kuò)增，產(chǎn)生兩種PCR產(chǎn)物，一種代表野生型等位基因的擴(kuò)增，一種代表由于抗藥性標(biāo)記取代野生型等位基因中某些序列所致的、其長度不同于所取代序列的、被改變的大小可預(yù)測的等位基因的擴(kuò)增。對于嘌呤霉素抗性重鏈敲除構(gòu)建體，使用引物Shortend(5′-CTGAGCCAAGCAGTGGCCCCGAG-3′，SEQIDNO45)和Longend(5′-GGGCTGAGACTGGGTGAACAGAAGGG-3′，SEQIDNO46)。這對引物既擴(kuò)增野生型重鏈基因座，又?jǐn)U增已經(jīng)被所述嘌呤霉素構(gòu)建體正確打中的基因座。這兩條帶的大小之差為0.7Kb。存在較短的條帶指示正確打靶。對于用以分析嘌呤霉素抗性重鏈敲除構(gòu)建體整合的這種PCR反應(yīng)，使用PromegaMasterMix試劑盒。所述PCR反應(yīng)混合物含有每種引物各1pmole、2.5μlDNA和25μl2×PromegaMasterMix。用水使反應(yīng)混合物的總體積達(dá)到50μl。使用最初于94℃變性保溫2分鐘，進(jìn)行該P(yáng)CR擴(kuò)增。然后通過于94℃保溫45秒、60℃保溫45秒和72℃保溫2分鐘，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的變性、退火和擴(kuò)增。然后，將反應(yīng)混合物于72℃保溫5分鐘，然后于4℃溫育直至從PCR儀中取出混合物。第一輪核轉(zhuǎn)移使用其中一個(gè)免疫球蛋白基因已被失活的經(jīng)過選擇的成纖維細(xì)胞，按照實(shí)施例2中所述進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生在內(nèi)源免疫球蛋白基因中有突變并且含有編碼異種免疫球蛋白基因的HAC的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。另一方面，可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行核轉(zhuǎn)移，從而將得自經(jīng)選擇的轉(zhuǎn)基因成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核或染色質(zhì)(即無膜包圍的一個(gè)或多個(gè)染色體)插入到去核卵母細(xì)胞中(U.S.S.N.60,258,151；于2000年12月22日申請)。這些方法也可以用于其中內(nèi)源α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、朊病毒和/或J鏈核酸已被突變的細(xì)胞。第二輪誘變和核轉(zhuǎn)移如有需要，可以由從第一輪核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物獲得細(xì)胞(例如胎成纖維細(xì)胞)。可以如上所述再進(jìn)行一輪基因打靶，以失活在第一輪打靶中被失活基因的第二個(gè)等位基因?；蛘撸梢栽谠撦喆虬兄?，使另一免疫球蛋白(例如μ重鏈、λ輕鏈、κ輕鏈或J鏈)、α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或朊病毒基因失活。對于這第二輪打靶，或者可以使用更高濃度的抗生素，或者可以使用具有不同抗生素抗性標(biāo)記的敲除構(gòu)建體?？股乜剐约?xì)胞可以如上所述進(jìn)行選擇。經(jīng)選擇的細(xì)胞可以如上所述用于第二輪核轉(zhuǎn)移，以產(chǎn)生例如在內(nèi)源免疫球蛋白基因中含有兩個(gè)突變并且含有編碼異種免疫球蛋白基因的HAC的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。另一方面，可以首先處理經(jīng)選擇的抗生素抗性細(xì)胞，以便如下所述分離G1期細(xì)胞，將其用于第二輪核轉(zhuǎn)移。為了分離用于核轉(zhuǎn)移的G1細(xì)胞，在分離之前24小時(shí)，將5.0×105細(xì)胞接種到含有10mlα-MEM+FCS的100mm組織培養(yǎng)平板上。第二天，平板用PBS洗滌，在分離前更換培養(yǎng)基達(dá)1-2小時(shí)。將平板在Vortex-Genie2(FisherScientific，Houston，TX，中速)上振搖30-60秒，取出培養(yǎng)基，以1000G離心5分鐘，將沉淀重懸于250μlMEM+FCS中。然后選擇以胞質(zhì)橋連接的新分裂的細(xì)胞雙聯(lián)體，因?yàn)檫@些細(xì)胞處于G1早期。這種分離方法稱為“搖出(shakeoff)”法。實(shí)施例4α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性降低的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物通過同源重組，產(chǎn)生其中α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因座中的一個(gè)等位基因被突變的牛成纖維細(xì)胞系。用于產(chǎn)生α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶敲除細(xì)胞的DNA構(gòu)建體，用來通過將嘌呤霉素抗性基因(puro，在實(shí)施例3中描述的)和轉(zhuǎn)錄終止盒(STOP)兩者插入到含有催化結(jié)構(gòu)域的外顯子9中，防止功能性全長α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶mRNA的轉(zhuǎn)錄。因而，所得的未成熟α-半乳糖轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)錄物缺乏催化結(jié)構(gòu)域。將所述DNA構(gòu)建體(即α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶KO載體)經(jīng)電穿孔導(dǎo)入三個(gè)獨(dú)立的牛成纖維細(xì)胞系中，然后分離嘌呤霉素抗性集落。基于PCR分析，在某些集落中在外顯子9區(qū)中發(fā)生同源重組。因而產(chǎn)生了其中α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因座中的一個(gè)等位基因被突變的牛成纖維細(xì)胞系。必要時(shí)，可以使用同一種敲除載體和更高濃度的抗生素來選擇純合敲除細(xì)胞，或者使用具有一種不同抗生素抗性基因的另一種敲除構(gòu)建體，使第二個(gè)等位基因突變。這種方法也可以應(yīng)用于得自其它有蹄類動物的細(xì)胞，以產(chǎn)生可供在本文所述的核轉(zhuǎn)移法中用以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。以下進(jìn)一步描述這些方法。α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶KO載體的構(gòu)建如下產(chǎn)生α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶KO載體(圖23)。為了分離α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因外顯子9周圍的基因組DNA，使用以下引物對5′-gatgatgtctccaggatgcc-3′(SEQIDNO61)和5′-gacaagcttaatatccgcagg-3′(SEQIDNO62)，通過PCR擴(kuò)增DNA探針。使用這種探針，篩選?；蚪Mλ噬菌體文庫，鑒定出7個(gè)陽性λ噬菌體克隆。一個(gè)克隆含有得自雄性Charolais牛成纖維細(xì)胞的DNA，通過制作限制性圖譜對其進(jìn)一步分析。將含有外顯子9的NotI-XhoI基因組片段亞克隆到pBluescriptIISK(-)中，然后將puro和STOP盒插入到NotI-XhoI基因組片段中位于催化結(jié)構(gòu)域5’的AviI位點(diǎn)。也將白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入到該載體構(gòu)建體中，以殺死其中打靶盒非同源整合的細(xì)胞。轉(zhuǎn)染/敲除方法用標(biāo)準(zhǔn)電穿孔法，如下進(jìn)行三個(gè)胎成纖維細(xì)胞系(兩個(gè)得自雄性Jersy牛，一個(gè)得自雌性Jersy牛)的轉(zhuǎn)染。用來培養(yǎng)所述牛胎成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)基含有500mlαMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml青霉素-鏈霉素(SIGMA)和1ml2-巰基乙醇(Gibco/BRL#21985-023)。在轉(zhuǎn)染前一天，將細(xì)胞接種到T175組織培養(yǎng)瓶中，通過顯微鏡檢查測定達(dá)到80-100％的目標(biāo)匯合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，大約107牛成纖維細(xì)胞經(jīng)過胰酶處理，并用α-MEM培養(yǎng)基洗滌1次。在將細(xì)胞重懸于800μlα-MEM中之后，向細(xì)胞懸浮液中加入30μgDNA，通過吸打充分混合。將細(xì)胞-DNA懸浮液轉(zhuǎn)移到電穿孔樣品池中，以1,000V和50μF進(jìn)行電穿孔。此后，將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞接種到帶有補(bǔ)充血清的α-MEM培養(yǎng)基的20個(gè)24孔板中。培養(yǎng)48小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為含有1μg/ml嘌呤霉素的培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)2-3周，以選擇嘌呤霉素抗性細(xì)胞。選擇后，挑出達(dá)到接近100％匯合的所有集落，從所述集落中提取基因組DNA，以通過PCR篩選所需的同源重組事件。靶整合的篩選如上所述，用PUREGENEDNA分離試劑盒(GentraSYSTEMS)，按照生產(chǎn)商的方案，從24孔的各孔中獨(dú)立地提取基因組DNA。將每種基因組DNA樣品重懸于20μl10mMTris-Cl(pH8.0)和1mMEDTA(EDTA)中。用以下引物對5′-aagaagagaaaggtagaagaccccaaggac-3′(SEQIDNO63)和5′-cctgggtatagacaggtgggtattgtgc-3′(SEQIDNO64)，通過PCR進(jìn)行篩選。一種引物的序列位于α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶KO載體內(nèi)，另一種引物的序列恰好位于靶內(nèi)源基因座中整合的載體之外(圖23)。因此，預(yù)期的PCR產(chǎn)物應(yīng)該僅在所述KO載體通過同源重組整合到靶基因座中時(shí)才可檢測到。所述PCR反應(yīng)混合物含有18.9μl水、3μl10×LAPCR緩沖液II(含Mg2+)、4.8μldNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、1μl基因組DNA和0.3μlLATaq。通過將反應(yīng)混合物在以下條件下保溫85℃3分鐘、94℃1分鐘、98℃10秒和68℃15分鐘，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的PCR。在PCR后，通過電泳分析反應(yīng)混合物。選擇出產(chǎn)生預(yù)期大小PCR產(chǎn)物的嘌呤霉素抗性克隆(圖23)。因此，成功地產(chǎn)生了其中α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因座中的一個(gè)等位基因被KO載體突變的牛成纖維細(xì)胞系。實(shí)施例5使用腺相關(guān)病毒使內(nèi)源基因突變的產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的替代方法腺相關(guān)病毒(AAV)可以用來特異性地取代細(xì)胞基因組中存在的靶序列(Inoue等，Mol.Ther.3(4)526-530，2001)；Hirata等，J.Virol.74(10)16536-42，2000)；Inoue等，J.Virol.73(9)7376-80，1999)；和Russell等，Nat.Genet.18(4)325-30，1998))。其基因打靶率與更傳統(tǒng)的基因打靶法相比非常有效。AAV有廣宿主范圍和組織特異性，包括對牛和人皮膚成纖維細(xì)胞的特異性。因此，可以用AAV來產(chǎn)生在內(nèi)源免疫球蛋白(例如μ重鏈、λ輕鏈、κ輕鏈或J鏈)、α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或朊病毒基因中含有一個(gè)或多個(gè)突變的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物細(xì)胞。然后可以將這些轉(zhuǎn)基因細(xì)胞用于本文所述的核轉(zhuǎn)移法中，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因有蹄類動物。應(yīng)用AAV，導(dǎo)致牛免疫球蛋白重鏈基因座以高于先前用傳統(tǒng)基因打靶策略(即電穿孔和脂轉(zhuǎn)染法)所達(dá)到的頻率進(jìn)行同源重組。在第一輪基因打靶實(shí)驗(yàn)中，在含有通過AAV載體所導(dǎo)入DNA的73個(gè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)子中，獲得5個(gè)正確打中的成纖維細(xì)胞克隆。這些實(shí)驗(yàn)如下進(jìn)行。AAV敲除載體AAV構(gòu)建體可以通過簡單地插入外源序列或者用AAV載體中存在的新序列取代內(nèi)源序列而破壞基因。圖24顯示了一種AAV構(gòu)建體，其中牛免疫球蛋白重鏈μ恒定區(qū)的所有4個(gè)編碼外顯子存在于2822堿基對的BamHI-XhoI片段上。將含有市售載體pMClNeo中存在的新霉素抗性標(biāo)記的1.16Kb片段，插入到得自Holstein牛的μ重鏈基因座外顯子4中存在的SacII位點(diǎn)中。該基因座是在分離用以產(chǎn)生實(shí)施例1中所述敲除載體的噬菌體克隆中所含有的基因座。為了產(chǎn)生所述AVV載體，將μ重鏈基因座中的SacII位點(diǎn)補(bǔ)平，構(gòu)建平端，隨后將其與平端SalI接頭(NewEnglandBiolabs)連接。然后，將含有新霉素抗性基因的pMClNeo的XhoI片段與通過SalI接頭加入到該基因座的SalI位點(diǎn)連接?？梢赃M(jìn)行這種連接，是因?yàn)閄hoI和SalI限制位點(diǎn)具有匹配末端。這種敲除載體引起新霉素抗性基因破壞性地插入到內(nèi)源μ重鏈基因中，從而使所述μ重鏈基因失活。該基因失活的發(fā)生無需使所述內(nèi)源μ基因座的區(qū)缺失。設(shè)計(jì)一種替代的載體，以在打靶期間從所述內(nèi)源基因座除去外顯子3和4，導(dǎo)致這兩個(gè)外顯子被一個(gè)功能性拷貝的新霉素抗性基因取代(圖25)。這種構(gòu)建體應(yīng)用從雌性Jersey牛經(jīng)PCR擴(kuò)增基因組DNA來產(chǎn)生。具體地說，使用以下引物擴(kuò)增3’同源區(qū)5′GGGGTCTAGAgcagacactacactgatgggcccttggtcc3′(SEQIDNO65)，該引物加入一個(gè)XbaI限制位點(diǎn)；和5′GGGGAAGCTTcgtgtccctggtcctgtctgacacag3′(SEQIDNO66)，該引物加入一個(gè)HindIII限制位點(diǎn)。用加入一個(gè)XhoI限制位點(diǎn)的引物5′GGGGCTCGAGgtcggcgaaggatggggggaggtg3′(SEQIDNO67)和加入一個(gè)KpnI限制位點(diǎn)的引物5′GGGGGGTACCgctgggctgagctgggcagagtggg3′(SEQIDNO68)，擴(kuò)增5’同源區(qū)。這些引物序列中大寫的核苷酸是不可退火至所述μ重鏈基因座上、但包括在所述引物中以加入限制位點(diǎn)以便于后續(xù)亞克隆步驟的核苷酸。加入前4個(gè)鳥嘌呤，以便將所述限制位點(diǎn)與所述引物的真正末端分開，因?yàn)橄拗菩悦覆磺懈钗挥谝镎嬲┒说奈稽c(diǎn)以及內(nèi)部位點(diǎn)。5’同源區(qū)長1.5Kb，含有外顯子1和2。5’同源區(qū)也含有外顯子3的前25個(gè)核苷酸，以保持外顯子的剪接受體位點(diǎn)。所述剪接受體位點(diǎn)使得外顯子3可以用于剪接，并因此防止外顯子1和2可能被剪接到下游跨膜結(jié)構(gòu)域，形成異常的膜結(jié)合產(chǎn)物。3’同源區(qū)長1.24Kb，含有緊接外顯子4下游的區(qū)域。對于圖24所示的構(gòu)建體，采用標(biāo)準(zhǔn)方法，將所述打靶盒插入到Ryan等(J.ofVirology701542-1553，1996)報(bào)道的含有病毒長末端重復(fù)(LTR)序列的AAV載體中。用TtetA2包裝細(xì)胞系，如先前描述的方法(Inoue和Russell，1998，J.Virol.727024-7031，1998)，將所述AAV載體包裝到衣殼中，并且按照先前所述的方法(Zolotukhin等，GeneTherapy，6973-985，1999)進(jìn)行純化。對于圖25所示的構(gòu)建體，可以使用上述方法或者任何其它標(biāo)準(zhǔn)方法，將所述打靶盒插入到Ryan等所述的AAV載體或者任何其它AAV載體(例如得自Stratagene的市售載體)中，產(chǎn)生含有所述載體的病毒。轉(zhuǎn)導(dǎo)方法將得自雌性Jersey牛的成纖維細(xì)胞以40,000細(xì)胞/孔接種到48孔組織培養(yǎng)板的一個(gè)孔中，在完全培養(yǎng)基中于38.5℃和5％CO2下培養(yǎng)，直至細(xì)胞粘附到孔的底部表面。一旦細(xì)胞貼壁，則取出培養(yǎng)基，更換為含有具有圖24所示載體的AAV顆粒的0.2ml新鮮培養(yǎng)基，感染復(fù)數(shù)(MOI)為500-20,000顆粒/細(xì)胞。MOI的選擇基于測定在藥物選擇期內(nèi)所產(chǎn)生的集落數(shù)和集落間隔(spacing)的預(yù)實(shí)驗(yàn)。將板孵育過夜。在該孵育期后，轉(zhuǎn)導(dǎo)孔用無鈣和鎂的PBS漂洗，如上所述用或者胰酶或者細(xì)胞解離緩沖液使細(xì)胞與孔分離。通過輕輕吸打解離的細(xì)胞，獲得均一的細(xì)胞懸浮液，使得自所述孔的細(xì)胞重新分配在10個(gè)100mm組織培養(yǎng)皿中。各培養(yǎng)皿用完全培養(yǎng)基孵育過夜。在該100mm培養(yǎng)皿孵育后，將培養(yǎng)基更換為含有350微克/ml濃度的G418的選擇培養(yǎng)基。每2-3天更換選擇培養(yǎng)基，直至在培養(yǎng)皿表面肉眼可見集落。此時(shí)，挑出單個(gè)集落，將其轉(zhuǎn)移到其自身的容器中。在組織培養(yǎng)皿的外表面，標(biāo)注含有集落的區(qū)域。一旦圈出所有集落，則從平板中吸出培養(yǎng)基，平板用無鈣和鎂的PBS洗滌3次。洗滌后，用1×胰酶的1∶25稀釋液漫過平板，讓其于室溫靜置，直至可見所述集落開始與平板表面分離。保持平板固定，以防止分離的集落漂浮到平板的另一位置上。用吸頭挑出50微升體積的細(xì)胞塊，將吸頭的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到24孔組織培養(yǎng)板中的一個(gè)孔。在轉(zhuǎn)移了所有的集落后，立即加入含有G418的完全培養(yǎng)基，讓分離的克隆擴(kuò)大培養(yǎng)接近匯合。當(dāng)一個(gè)孔接近匯合時(shí)，將其用無鈣和鎂的PBS洗滌2次。用0.2ml細(xì)胞解離緩沖液使細(xì)胞分離。在這種細(xì)胞懸浮液中，將20μl轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的24孔板中，讓剩余的細(xì)胞在加入2.0ml完全培養(yǎng)基后，再粘附至原始24孔板表面。將原始板孵育至100％匯合。新的板用作正確打中的細(xì)胞來源，以供將來的?？寺》ㄓ谩．?dāng)?shù)米栽?4孔板的一個(gè)孔變?yōu)?00％匯合時(shí)，除去培養(yǎng)基，細(xì)胞用PBS洗滌1次。除去PBS，更換為根據(jù)Laird等(NucleicAcidsRes.194293，1991)改進(jìn)的細(xì)胞裂解緩沖液。簡而言之，向該孔中加入含有200mMNaCl、100mMTris-HClpH8.5、5mMEDTA、0.2％SDS和100μg/ml蛋白酶K的0.2ml裂解緩沖液。將板再放回培養(yǎng)箱中達(dá)3小時(shí)至過夜。然后將粘性的細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到微量離心管中。加入等體積的異丙醇以沉淀DNA。在微量離心機(jī)中離心10分鐘后，棄去上清液，沉淀用0.5ml70％乙醇洗滌1次。除去乙醇后，將DNA沉淀風(fēng)干，重懸于35微升TE緩沖液(10mMTrispH8和1mMEDTA)中。將3μl的等份樣品用于PCR分析。PCR分析用PCR分析，在所述載體的正確打靶方面對得自用AAV顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗藥性克隆的DNA樣品進(jìn)行篩選。這種篩選策略使用一種退火到編碼所述藥物抗性標(biāo)記的DNA內(nèi)的引物和另一種退火到靶基因座內(nèi)但在所述AAV打靶顆粒中存在的序列之外的引物。僅當(dāng)所述AAV打靶DNA整合到所述內(nèi)源基因組的所需位置時(shí)，才可檢測到PCR產(chǎn)物。得自使用這些AAV顆粒的單打靶實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖26?；谶@一分析，73個(gè)獨(dú)立克隆中的5個(gè)克隆含有所述正確打靶的載體DNA。該方法也可以與圖25中所示的AAV載體或者與任何其它合適的腺病毒或腺相關(guān)病毒載體一起使用。如有需要，可以通過用帶有一種不同抗生素抗性基因(即除新霉素抗性基因之外的基因)的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，使所分離的集落中對第二μ重鏈等位基因突變。為了選擇所得的純合敲除細(xì)胞，在相應(yīng)的抗生素存在下培養(yǎng)被感染的細(xì)胞。或者，可以用含有新霉素抗性基因的AAV載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所分離的集落，然后在存在高濃度抗生素(即殺死雜合敲除細(xì)胞但不殺死純合敲除細(xì)胞的抗生素濃度)的情況下培養(yǎng)所述集落。其它實(shí)施方案從上述描述中，可以明顯看出，可以對本文所述的發(fā)明作出各種變化和改進(jìn)，以使其適合于各種用途和條件。這類實(shí)施方案也在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。在本說明書中提及的所有出版物都通過引用結(jié)合到本文中，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物或?qū)＠暾埦唧w而單獨(dú)指明通過引用結(jié)合到本文中一樣。權(quán)利要求1一種轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，所述有蹄類動物包含一種或多種編碼整個(gè)或部分異種免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述基因經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子。2.權(quán)利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸基本上為人類核酸。3.權(quán)利要求1的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼異種抗體的核酸。4.權(quán)利要求3的有蹄類動物，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。5.權(quán)利要求4的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。6.權(quán)利要求3的有蹄類動物，其中所述抗體為多克隆抗體。7.權(quán)利要求1的有蹄類動物，其中所述Ig鏈或抗體在血清和/或乳中表達(dá)。8.權(quán)利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸包含在一個(gè)染色體片段內(nèi)。9.權(quán)利要求6的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔHAC。10.權(quán)利要求6的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔΔHAC。11.權(quán)利要求1的有蹄類動物，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。12.權(quán)利要求1的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含減少內(nèi)源Ig基因表達(dá)的突變。13.權(quán)利要求3的有蹄類動物，其中所述核酸包含未經(jīng)重排的抗體輕鏈核酸區(qū)段，其中編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。14.權(quán)利要求3的有蹄類動物，其中所述核酸包括未經(jīng)重排的抗體重鏈核酸區(qū)段，其中或者(i)編碼V基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸和/或(ii)編碼D基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段與編碼J基因區(qū)段的所有核酸區(qū)段隔開一個(gè)或多個(gè)核苷酸。15.權(quán)利要求1的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。16.權(quán)利要求15的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛。17.一種轉(zhuǎn)基因有蹄類動物，所述有蹄類動物包含減少內(nèi)源抗體表達(dá)的突變。18.權(quán)利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達(dá)。19.權(quán)利要求18的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性IgM重鏈的表達(dá)。20.權(quán)利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達(dá)。21.權(quán)利要求20的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性Ig輕鏈的表達(dá)。22.權(quán)利要求17的有蹄類動物，其中所述突變減少功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達(dá)。23.權(quán)利要求17的有蹄類動物，其中所述突變基本上消除功能性IgM重鏈和功能性Ig輕鏈的表達(dá)。24.權(quán)利要求17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，所述基因經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子。25.權(quán)利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸基本上為人類核酸。26.權(quán)利要求17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼異種抗體的核酸。27.權(quán)利要求26的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。28.權(quán)利要求26的有蹄類動物，其中所述抗體為多克隆抗體。29.權(quán)利要求24的有蹄類動物，其中所述Ig鏈或抗體在血清中表達(dá)。30.權(quán)利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸包含在一個(gè)染色體片段內(nèi)。31.權(quán)利要求30的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔHAC。32.權(quán)利要求30的有蹄類動物，其中所述染色體片段為一種ΔΔHAC。33.權(quán)利要求24的有蹄類動物，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。34.權(quán)利要求26的有蹄類動物，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。35.權(quán)利要求34的有蹄類動物，其中所述異種抗體為人抗體。36.權(quán)利要求17的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。37.權(quán)利要求36的有蹄類動物，其中所述有蹄類動物為牛。38.一種有蹄類動物體細(xì)胞，所述體細(xì)胞包含一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子。39.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述核酸編碼異種抗體。40.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述核酸包含在染色體片段中。41.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。42.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。43.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述核酸基本上為人類核酸。44.權(quán)利要求39的細(xì)胞，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。45.權(quán)利要求44的細(xì)胞，其中所述異種抗體為人抗體。46.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是胎成纖維細(xì)胞。47.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是B細(xì)胞。48.權(quán)利要求38的細(xì)胞，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。49.權(quán)利要求47的細(xì)胞，其中所述有蹄類動物為牛。50.一種有蹄類動物體細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼Ig重鏈和/或輕鏈的核酸中包含突變。51.權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼IgM重鏈的核酸中包含突變。52.權(quán)利要求51的細(xì)胞，所述細(xì)胞在所述IgM重鏈的兩個(gè)等位基因中都包含突變。53.權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼Ig輕鏈的核酸中包含突變。54.權(quán)利要求53的細(xì)胞，所述細(xì)胞在所述Ig輕鏈的兩個(gè)等位基因中都包含突變。55.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述突變?yōu)闊o義突變或缺失突變。56.權(quán)利要求50的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子。57.權(quán)利要求56的細(xì)胞，其中所述核酸基本上為人類核酸。58.權(quán)利要求56的細(xì)胞，所述細(xì)胞還包含編碼異種抗體的核酸。59.權(quán)利要求56的細(xì)胞，其中所述核酸包含在染色體片段中，從而所述核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在所述有蹄類動物細(xì)胞中保持。60.權(quán)利要求59的細(xì)胞，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。61.權(quán)利要求56的細(xì)胞，其中所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。62.權(quán)利要求58的細(xì)胞，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。63.權(quán)利要求62的細(xì)胞，其中所述異種抗體為人抗體。64.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是胎成纖維細(xì)胞。65.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是B細(xì)胞。66.權(quán)利要求50的細(xì)胞，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。67.權(quán)利要求66的細(xì)胞，其中所述有蹄類動物為牛。68.一種雜交瘤，所述雜交瘤是通過權(quán)利要求47或65的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合而形成的。69.一種生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包括下述步驟(a)將一種或多種感興趣的抗原給予包含編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物，其中所述基因座中的所述核酸區(qū)段經(jīng)歷重排，導(dǎo)致產(chǎn)生對所述抗原特異性的抗體；且(b)從所述有蹄類動物回收所述抗體。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述有蹄類動物包含減少內(nèi)源抗體表達(dá)的突變。71.權(quán)利要求70的方法，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達(dá)。72.權(quán)利要求70的方法，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達(dá)。73.權(quán)利要求69的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。74.權(quán)利要求73的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。75.權(quán)利要求73的方法，其中核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。76.權(quán)利要求69的方法，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。77.權(quán)利要求69的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。78.權(quán)利要求69的方法，其中所述抗體的輕鏈由人類核酸編碼。79.權(quán)利要求69的方法，其中所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。80.權(quán)利要求69的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。81.權(quán)利要求79的方法，其中所述有蹄類動物為牛。82.權(quán)利要求69的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。83.權(quán)利要求69的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。84.權(quán)利要求69的方法，其中所述抗體從所述有蹄類動物的血清或乳中回收。85.一種生產(chǎn)抗體的方法，所述方法包括從包含編碼異種抗體基因座的核酸的有蹄類動物中回收異種抗體，其中所述基因座中的核酸區(qū)段經(jīng)歷重排，導(dǎo)致產(chǎn)生異種抗體。86.權(quán)利要求85的方法，其中所述有蹄類動物包含減少內(nèi)源抗體表達(dá)的突變。87.權(quán)利要求86的方法，其中所述突變減少功能性IgM重鏈的表達(dá)。88.權(quán)利要求86的方法，其中所述突變減少功能性Ig輕鏈的表達(dá)。89.權(quán)利要求85的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。90.權(quán)利要求89的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。91.權(quán)利要求89的方法，其中核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。92.權(quán)利要求85的方法，其中所述核酸整合到所述有蹄類動物的染色體中。93.權(quán)利要求85的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。94.權(quán)利要求93的方法，其中所述抗體的輕鏈由人類核酸編碼。95.權(quán)利要求93的方法，其中所述抗體的重鏈由人類核酸編碼。96.權(quán)利要求85的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。97.權(quán)利要求96的方法，其中所述有蹄類動物為牛。98.權(quán)利要求85的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。99.權(quán)利要求85的方法，其中所述抗體為多克隆抗體。100.權(quán)利要求85的方法，其中所述抗體從所述有蹄類動物的血清或乳中回收。101.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將細(xì)胞、得自細(xì)胞的染色質(zhì)或得自細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞在內(nèi)源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中包含一個(gè)第一突變；且(b)將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。102.權(quán)利要求101的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。103.權(quán)利要求101的方法，其中所述細(xì)胞通過包括下述步驟的方法制備將包含一個(gè)盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述盒包含與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)或多個(gè)與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的一個(gè)內(nèi)源等位基因中。104.權(quán)利要求101的方法，其中所述細(xì)胞通過包括下述步驟的方法產(chǎn)生(a)將包含第一盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子；從而將所述第一盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第一內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；且(b)將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與所述抗體重鏈或輕鏈核酸有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子；其中所述第二選擇標(biāo)記不同于所述第一選擇標(biāo)記；從而將所述第二盒整合到所述抗體重鏈或輕鏈核酸的第二內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。105.權(quán)利要求101的方法，所述方法還包括下述步驟(c)從所述胚胎、所述胎兒或者從所述胎兒產(chǎn)生的后代中分離出細(xì)胞；(d)將第二突變引入所述細(xì)胞的內(nèi)源抗體重鏈和/或輕鏈核酸中；(e)將所述細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中；且(f)將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。106.權(quán)利要求101的方法，其中所述細(xì)胞包含一種或多種編碼整個(gè)或部分異種Ig基因的核酸，其中所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)一種或多種異種Ig分子，并且其中將所述細(xì)胞插入到所述卵母細(xì)胞中。107.權(quán)利要求106的方法，其中所述核酸編碼異種抗體。108.權(quán)利要求106的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。109.權(quán)利要求108的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。110.權(quán)利要求108的方法，其中所述核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。111.權(quán)利要求106的方法，其中所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。112.權(quán)利要求107的方法，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。113.權(quán)利要求112的方法，其中所述異種抗體為人抗體。114.權(quán)利要求101的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。115.權(quán)利要求114的方法，其中所述有蹄類動物為牛。116.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將具有一種或多種異種核酸的細(xì)胞插入到卵母細(xì)胞中；其中所述異種核酸編碼整個(gè)或部分異種Ig基因；所述基因能夠在B細(xì)胞中經(jīng)歷重排并且表達(dá)不止一種異種Ig分子；且(b)將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。117.權(quán)利要求116的方法，其中所述核酸編碼異種抗體。118.權(quán)利要求117的方法，其中所述抗體是多克隆抗體。119.權(quán)利要求116或117的方法，其中所述免疫球蛋白鏈或抗體在血清和/或乳中表達(dá)。120.權(quán)利要求116的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。121.權(quán)利要求116的方法，其中所述核酸包含在染色體片段中。122.權(quán)利要求121的方法，其中所述染色體片段是ΔHAC或ΔΔHAC。123.權(quán)利要求121的方法，其中所述核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。124.權(quán)利要求116的方法，其中所述核酸整合到所述細(xì)胞的染色體中。125.權(quán)利要求116的方法，其中所述核酸基本上為人類核酸。126.權(quán)利要求116的方法，其中所述異種抗體為來自另一屬的抗體。127.權(quán)利要求126的方法，其中所述異種抗體為人抗體。128.權(quán)利要求116的方法，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。129.權(quán)利要求128的方法，其中所述有蹄類動物為牛。130.權(quán)利要求8或30的有蹄類動物，其中所述核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。131.權(quán)利要求40的細(xì)胞，其中所述核酸獨(dú)立于所述宿主染色體而在有蹄類動物細(xì)胞中保持。132.包含多克隆人免疫球蛋白(Ig)的有蹄類動物抗血清。133.包含多克隆人Ig的有蹄類動物的乳。134.權(quán)利要求132或133的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述有蹄類動物為牛、綿羊、豬或山羊。135.權(quán)利要求134的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述有蹄類動物為牛。136.權(quán)利要求132或133的有蹄類動物抗血清或乳，其中所述Ig針對所需抗原。137.一種產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因有蹄類動物的方法，所述方法包括下述步驟(a)將細(xì)胞、得自細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中，其中所述細(xì)胞在內(nèi)源基因中包括一個(gè)第一突變，其中所述細(xì)胞在正常情況下不表達(dá)所述基因；且(b)將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。138.權(quán)利要求137的方法，其中所述胎兒發(fā)育成有活力的后代。139.權(quán)利要求137的方法，其中所述細(xì)胞通過包括下述步驟的方法制備將包含一個(gè)盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述盒包含與編碼選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一種或多種與所述基因有顯著序列同一性的核酸操作上連接的啟動子；從而將所述盒整合到所述基因的一個(gè)內(nèi)源等位基因中。140.權(quán)利要求137的方法，其中所述細(xì)胞通過包括下述步驟的方法產(chǎn)生(a)將包含第一盒的核酸插入到所述細(xì)胞中，所述第一盒包含與編碼第一選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與所述基因有顯著序列同一性的第一核酸操作上連接的第一啟動子；從而將所述第一盒整合到所述基因的第一內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；且(b)將包含第二盒的核酸插入到所述第一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中，所述第二盒包括與編碼第二選擇標(biāo)記的核酸操作上連接并且與一個(gè)與所述基因有顯著序列同一性的第二核酸操作上連接的第二啟動子；其中所述第二選擇標(biāo)記不同于所述第一選擇標(biāo)記；從而將所述第二盒整合到所述基因的第二內(nèi)源等位基因中，產(chǎn)生第二轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。141.權(quán)利要求137的方法，所述方法還包括下述步驟(c)從所述胚胎、所述胎兒或者從所述胎兒產(chǎn)生的后代中分離出細(xì)胞；(d)將第二突變引入所述細(xì)胞的內(nèi)源基因中；(e)將所述細(xì)胞、得自所述細(xì)胞的染色質(zhì)或者得自所述細(xì)胞的細(xì)胞核插入到卵母細(xì)胞中；且(f)將所述卵母細(xì)胞或由所述卵母細(xì)胞形成的胚胎在允許所述卵母細(xì)胞或所述胚胎發(fā)育成胎兒的條件下，轉(zhuǎn)移到宿主有蹄類動物的子宮中。142.權(quán)利要求137的方法，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。143.權(quán)利要求142的方法，其中所述細(xì)胞是胎成纖維細(xì)胞。144.權(quán)利要求137的方法，其中所述基因編碼一種抗體。145.權(quán)利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。146.權(quán)利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼朊病毒蛋白的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。147.權(quán)利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物在編碼J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。148.權(quán)利要求1或17的有蹄類動物，所述有蹄類動物包含編碼外源J鏈的核酸。149.權(quán)利要求148的有蹄類動物，其中所述J鏈為人J鏈。150.權(quán)利要求38或50的細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。151.權(quán)利要求38或50的細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼朊病毒蛋白的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。152.權(quán)利要求38或50的細(xì)胞，所述細(xì)胞在編碼J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。153.權(quán)利要求38或50的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含編碼外源J鏈的核酸。154.權(quán)利要求153的細(xì)胞，其中所述J鏈為人J鏈。155.權(quán)利要求69、85、101或116的方法，其中所述有蹄類動物在編碼α-(1，3)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。156.權(quán)利要求69、85、101或116的方法，其中所述有蹄類動物在編碼朊病毒蛋白的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。157.權(quán)利要求69、85、101、116或137的方法，其中所述有蹄類動物在編碼J鏈的內(nèi)源核酸中的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中包含突變。158.權(quán)利要求69、85、101、116或137的方法，其中所述有蹄類動物包含編碼外源J鏈的核酸。159.權(quán)利要求158的方法，其中所述J鏈為人J鏈。全文摘要本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因牛的產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)基因牛包含導(dǎo)致其內(nèi)源抗體表達(dá)失活和損失并且表達(dá)異種抗體(優(yōu)選人抗體)的遺傳修飾。這通過使IgM重鏈表達(dá)失活和任選地通過使所述Ig輕鏈表達(dá)失活，并且進(jìn)一步導(dǎo)入導(dǎo)致非?？贵w(優(yōu)選人抗體)表達(dá)的人工染色體而得以實(shí)現(xiàn)。文檔編號C12N9/10GK1486365SQ01822076公開日2004年3月31日申請日期2001年11月16日優(yōu)先權(quán)日2000年11月17日發(fā)明者J·M·羅布爾,R·A·戈德斯拜,S·E·費(fèi)爾古森,黑巖義巳,富塜一磨,石田功,JM羅布爾,巳,戈德斯拜,磨,費(fèi)爾古森申請人:赫馬技術(shù)有限公司,麒麟麥酒株式會社