專利名稱：誘導(dǎo)植物開花的hd3a基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及誘導(dǎo)植物開花的基因，以及用這些基因改變植物的開花時間的方法。改變植物的開花時間的方法對植物品種改良十分有用。
背景技術(shù)：
一般情況下，水稻的抽穗(開花)在短晝(short-day)時提前而長晝(1ong-day)時延遲。在已知的栽培品種中，通常是那些來自九州島和日本大陸南部的品種具有較強的光周期敏感性，而來自東北地區(qū)或北海道的品種完全喪失了這種敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生長期后有特征性的開花，該植物的抽穗期不隨光周期的改變而變化。水稻植物對栽培地點和時間的適應(yīng)性根據(jù)該植物中光周期敏感性的存在而徹底不同。因此，改變水稻的光周期敏感性對于水稻品種改良十分重要。
在常規(guī)品種改良項目中，水稻抽穗期通過涉及以下方面的方法來改變(1)通過雜交選擇早熟品種或晚熟品種；和(2)通過輻射和化學(xué)試劑進行誘變；等。但是，這類品種改良項目的成功需要較長時間，并存在其它問題，如不能預(yù)計后代中突變的程度或方向。
“光周期敏感性基因”是在水稻遺傳學(xué)領(lǐng)域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名稱。已發(fā)現(xiàn)多個光周期敏感性基因的存在在突變體和栽培品種中是固有的，還提示光周期敏感性基因存在于，例如，Sel基因座(6號染色體；Yokoo和Fujimaki(1971)Japan.J.Breed.2135-39)，E1基因座(7號染色體；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51115-128；Okumoto，Y.et a1.(1992)Jpn.J.Breed.42415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3號染色體)；Okumoto et al.Japanese Society of Breeding，91st lecture，Japanese Journal ofBreeding 47(Suppl.1)31)；和其它類似基因座(Yamagata et al.(1986)In Ricegenetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。
當分離出水稻的光周期敏感性基因或由光周期敏感性基因控制的調(diào)節(jié)水稻抽穗的基因，通過轉(zhuǎn)化方法將該基因引入任意目標水稻品種，將使控制水稻品種的抽穗時間成為可能。此外，不同植物的開花時間可以利用其它植物中對應(yīng)于這種水稻光周期敏感性基因的基因進行控制。這種育種方法在方便性和可靠性方面與傳統(tǒng)方法相比較具有極大優(yōu)勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是針對上述情況做出的。本發(fā)明的目的是提供新的控制植物開花基因。此外，本發(fā)明另一目的是用這些基因調(diào)節(jié)植物的開花時間。
本發(fā)明人特別關(guān)注于極需開發(fā)能改變其抽穗期(開花期)的簡便方法的那些水稻，并積極地分離與水稻抽穗相關(guān)的基因。
在水稻中，用Nipponbare和Kasalath的雜交后代檢測一種量化特性座位(QTL)Hd3a，發(fā)現(xiàn)它位于6號染色體的短臂上。此外，用具有Nipponbare遺傳背景的Hd3a區(qū)(Kasalath的等位基因)近似純合系進行的分析揭示，Hd3a基因座與短日照條件下促進抽穗的光周期敏感性基因座相同。
為了分離已知其存在但未鑒定出的光周期敏感性基因Hd3a，本發(fā)明人首先用P1衍生的人工染色體(PAC)克隆通過連鎖分析對Hd3a基因區(qū)進行作圖。具體地，用基于作圖而進行的克隆所必需的大隔離群對Hd3a區(qū)進行了連鎖分析。首先，使用Hd3a區(qū)的隔離群體和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)標記物建立連鎖圖譜，經(jīng)證實Hd3a位于RELP標記物C764和B174之間的間隔區(qū)中(Monna等，the 1999 Annual Meeting of Japanese Society of MolecularBiology)。另外，利用Hd3a兩側(cè)的切割擴增多態(tài)性序列(CAPS)標記物CP13和CP15，從具有Hd3a區(qū)、擬利用子代分析確定其基因型的隔離群體，選出了在染色體上Hd3a的鄰接區(qū)發(fā)生了重組的植株。經(jīng)鑒定有8個個體在Hd3a和CP13之間發(fā)生重組，有2個在Hd3a和CP15之間發(fā)生重組。
然后，本發(fā)明人利用P1衍生的人工染色體(PAC)克隆對Hd3a基因區(qū)進行對比排列。更具體地，從Nipponbare PAC基因組文庫選出了3種PAC克隆，它們在Hd3a基因座的鄰接區(qū)內(nèi)具有DNA標記物的序列。P0046E09和P0698G05克隆帶有位于Hd3a兩側(cè)的標記物CP13和CP15的核苷酸序列，從而揭示了這些PAC克隆包含所述Hd3a基因區(qū)(圖1)。對PAC克隆P0046E09的核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，候選基因組區(qū)限定在一個約20kb的區(qū)域內(nèi)。針對該候選區(qū)的核苷酸序列進行基因預(yù)測和同源性搜索，檢測出以下區(qū)域，它們顯示了與脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因，?；?CoA合成酶基因，和擬南芥的FT基因具有高度同源性。
然后，用Nipponbare和近似純合系(NIL(Hd3a))以RT-PCR分析這些候選基因的表達，該近似純合系的Hd3a基因區(qū)被Kasalath染色體節(jié)段取代。結(jié)果證實了全部三種基因的表達，并發(fā)現(xiàn)在短日照條件下FT-樣基因的轉(zhuǎn)錄水平增加(圖2)。因此，選擇FT-樣基因作為潛在的候選基因。
從Kasalath基因組DNA建立粘粒文庫。從粘粒文庫篩選與FT-樣基因區(qū)相應(yīng)的克隆(圖1)，并分析FT-樣基因區(qū)的核苷酸序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Nipponbare的核苷酸序列相比，Kasalath的核苷酸序列中有41個位點發(fā)生突變(核苷酸的插入，缺失和取代)(圖3)。外顯子內(nèi)的核苷酸取代導(dǎo)致一個氨基酸取代由天冬酰胺(Kasalath)變成脯氨酸(Nipponbare)(圖3)。
接著，本發(fā)明人將僅含Kasalath或Nipponbare候選基因區(qū)的片段引入一種可轉(zhuǎn)化載體，來轉(zhuǎn)化水稻植物，并分析所得轉(zhuǎn)化體的表型。結(jié)果，在引入了這些基因的植物中，發(fā)現(xiàn)在短日照條件和長日照條件下都能提前抽穗的植株。但在僅引入了載體的植物中未發(fā)現(xiàn)抽穗時間的明顯改變(表1)。另還對短日照條件下提前抽穗的轉(zhuǎn)化植物的自花授粉后代進行培育，檢查從播種到抽穗所需天數(shù)(抽穗期)的差異。結(jié)果隔離出比對照植株提早抽穗的植株，所有提早抽穗的植物都含有引入的基因(圖4)。類似地，在長日照條件下，對照植物不能達到抽穗階段，但在上述自花授粉后代中卻發(fā)現(xiàn)了抽穗植物，它們?nèi)慷急Ａ袅艘氲钠?圖4)。
上述結(jié)果證實，候選的FT-樣基因具有促進水稻抽穗(開花)的功能，結(jié)論是這種候選的FT-樣基因是Hd3a基因。Hd3a基因廣泛分布在植物中，有觀點認為它與誘導(dǎo)這些植物開花有關(guān)。
最后，本發(fā)明人成功地分離出能誘導(dǎo)植物開花的Hd3a基因。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，植物的開花時間可利用這種基因進行改變，因此完成本發(fā)明。
更具體地，本發(fā)明提供了(1)一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可誘導(dǎo)植物開花，所述DNA選自(a)編碼含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；和(c)能在嚴謹條件下與由SEQ ID NO1，3，23或24的核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
(2)(1)的DNA，其中該DNA來自水稻。
(3)一種DNA，其編碼與(1)或(2)的DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA。
(4)一種DNA，其編碼具有特異性消化(1)或(2)所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
(5)一種DNA，其編碼能通過在植物細胞中表達而利用共抑制效應(yīng)來抑制(1)或(2)所述DNA的表達的RNA。
(6)(1)或(2)的DNA，其中所述DNA用來誘導(dǎo)植物開花。
(7)(3)至(5)中任一項的DNA，其中所述DNA用來抑制植物開花。
(8)一種載體，其包含(1)至(5)中任一項的DNA。
(9)一種植物細胞，其引入了(8)的載體。
(10)一種植物轉(zhuǎn)化體，其包含(9)的植物細胞。
(11)(10)的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
(12)一種植物轉(zhuǎn)化體，其為(10)或(11)的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
(13)(10)至(12)中任一項的植物轉(zhuǎn)化體的育種材料。
(14)一種產(chǎn)生(10)或(11)所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，其包括以下步驟(a)將(1)或(2)的DNA引入植物細胞，和(b)從該植物細胞中再生植物。
(15)一種誘導(dǎo)植物開花的方法，其中所述方法包括在該植物體的細胞中表達(1)或(2)的DNA的步驟。
(16)一種抑制植物開花的方法，該方法以抑制植物體的細胞中(1)或(2)的內(nèi)源DNA的表達為特征。
(17)(16)的方法，其包括在植物體的細胞中表達(3)至(5)任一項的DNA的步驟。
(18)(14)至(17)中任一項的方法，其中所述植物為水稻。
本發(fā)明提供了編碼Hd3a蛋白的DNA。Kasalath的Hd3a基因組DNA和cDNA的核苷酸序列分別見SEQ ID NO1和SEQ ID NO23，這些DNA編碼的蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO2。Nipponbare的Hd3a基因組DNA和cDNA的核苷酸序列分別見SEQ ID NO3和SEQ ID NO24，它們編碼的蛋白的氨基酸序列見SEQ ID NO4。
Hd3a是用Nipponbare和Kasalath的雜交后代檢測到的一種量化性狀座位(QTL)，經(jīng)證實該座位位于6號染色體短臂上。通過分析具有Nipponbare遺傳背景的Kasalath的Hd3a等位基因近似純合系，結(jié)果表明Hd3a基因座能促進短日照條件下的抽穗。
盡管已知Hd3a是具有促進短日照條件下抽穗的作用的基因，并且它在水稻6號染色體短臂的較寬區(qū)域內(nèi)廣泛存在，但該基因本身并未得到鑒定或分離。本發(fā)明人經(jīng)過復(fù)雜步驟，最終闡述了Hd3a存在的區(qū)域，并首次成功分離了單個基因形式的Hd3a基因。
目前在日本，水稻栽培中一個重要目標是控制水稻的抽穗期。在寒冷地區(qū)逃避由于秋季低溫的早早到來而引起的低溫損害是十分重要的。另一方面，在西南部溫暖地區(qū)的水稻栽培重點區(qū)，為了減少收獲過于集中而帶來的繁重勞動，也需要提前或延遲抽穗期。
Hd3a具有誘導(dǎo)開花的功能。因此，用Hd3a基因的正義鏈進行轉(zhuǎn)化能促進水稻抽穗(開花)。另一方面，按照反義方向引入該基因能抑制開花。植物育種中這類轉(zhuǎn)化技術(shù)所需時間與通過雜交育種進行的基因轉(zhuǎn)移相比顯著縮短。而且，由于轉(zhuǎn)化并不伴有性狀的其它改變，這也是有利的。故植物的開花時間可以容易地利用分離的Hd3a基因進行改變。因此，該基因?qū)m應(yīng)不同地區(qū)而進行的水稻品種培育具有影響。而且，植物的抽穗時間多種多樣，通過基因重組方式引入Hd3a基因，可培育缺陷該基因的植物新品種，通過用反義DNA或核酶控制該基因的表達，可培育攜帶該基因的品種。
編碼本發(fā)明Hd3a蛋白的DNA包括基因組DNA，cDNA，和化學(xué)合成的DNA?；蚪MDNA和cDNA可根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法來制備。更具體地，基因組DNA可以如下制備(1)從具有Hd3a基因的水稻品種(如Kasalath或Nipponbare)中提取基因組DNA；(2)構(gòu)建基因組文庫(利用載體，如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、BAC、PAC等)；(3)將該文庫鋪板；和(4)利用根據(jù)編碼本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO1，3，23，或24)制備的探針進行菌落雜交或空斑雜交?；蛘撸衫锰禺愋葬槍幋a本發(fā)明蛋白的DNA(如SEQ ID NO1，3，23，或24)的引物經(jīng)PCR來制備基因組DNA。另一方面，cDNA可如下制備(1)根據(jù)從具有Hd3a基因的水稻品種(如Kasalath或Nipponbare)提取的mRNA合成cDNA；(2)通過將該合成的cDNA插入載體，如λZAP來制備cDNA文庫；(3)將該cDNA文庫鋪板；和(4)如上所述進行菌落雜交或空斑雜交?；蛘撸琧DNA也可通過PCR來制備。
本發(fā)明包括能編碼與SEQ ID NO2或4所示Hd3a蛋白(Kasalath或Nipponbare)功能等價的蛋白的DNA。本文中術(shù)語“與Hd3a蛋白功能等價”指目標蛋白具有誘導(dǎo)植物開花的功能。這類DNA優(yōu)選來自單子葉植物，更優(yōu)選來自禾本科(Gramineae)，最優(yōu)選來自水稻。
這類DNA的實例包括編碼含有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的突變體、衍生物、等位基因變體、變體或同系物的那些DNA。
制備能編碼含本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知氨基酸改變的蛋白的DNA的方法包括定點誘變(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，“Oligonucleotide-directedconstruction of mutagenesis via gapped duplex DNA.”Methods in Enzymology，154350-367，1987)。蛋白的氨基酸序列也可由于核苷酸序列的突變而自然突變。編碼具有天然Hd3a蛋白的氨基酸序列但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、和/或添加的蛋白的DNA也包括在本發(fā)明的DNA中，只要它們編碼與天然Hd3a蛋白(SEQ ID NO2或4)功能等價的蛋白。此外，不引起蛋白質(zhì)中氨基酸序列改變的那些核苷酸序列突變體(簡并突變體)也包括在本發(fā)明的DNA中。
對一種DNA是否編碼能誘導(dǎo)植物開花的蛋白可如下進行評價將待測DNA引入植物和將該植物培養(yǎng)在能改變光照時間長短的培養(yǎng)箱中；檢測從播種到開花(水稻中從播種到抽穗)所需的天數(shù)。在任何光周期條件下，如果一種蛋白能使植物與對照植物相比開花提早，就認為該蛋白具有促進開花的功能。由于與參比對照在開花時間上預(yù)計有較大差異，故可以在抑制對照植物開花的光周期條件下，特別容易地證實促進開花的功能，例如，對水稻而言，所述條件為長日照條件(14-16h)。
編碼與SEQ ID NO2或4所示Hd3a蛋白功能等價的蛋白的DNA可通過本領(lǐng)域已知方法產(chǎn)生，這些方法包括雜交技術(shù)(Southem，E.M.Journal ofMolecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.et al.Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.et al.Science，vol.239，487-491，1988)。也就是說，用Hd3a基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1，3，23或24)或其部分作為探針，用能與Hd3a基因的核苷酸序列(SEQ ID NO1，3，23或24)特異性雜交的寡核苷酸作為引物，分離出與水稻和其它植物的Hd3a基因高度同源的DNA是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這類能編碼Hd3a蛋白的功能等價蛋白的DNA可通過雜交技術(shù)或PCR技術(shù)獲得，它們都包括在本發(fā)明的DNA中。
用于分離這類DNA的雜交反應(yīng)優(yōu)選在嚴謹條件下進行。本發(fā)明的嚴謹條件包括如下條件6M尿素，0.4％SDS，和0.5×SSC；和那些產(chǎn)生類似嚴謹度的條件。能在較高嚴謹條件，如6M尿素，0.4％SDS，和0.1×SSC下雜交的DNA具有較高的同源性。在這類條件下分離的DNA預(yù)計能編碼與Hd3a蛋白(SEQ ID NO2或4)具有較高氨基酸水平同源性的蛋白。本文中高同源性是指，整個氨基酸序列的同一性至少50％或更高，更優(yōu)選至少70％或更高，更優(yōu)選至少90％或更高(如至少95％或更高)。
一種氨基酸序列或核苷酸序列與另一種序列的同源性程度可按照Karlin和Altschl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877，1993)所述BLAST算法來確定。BLASTN和BLASTX等程序都是根據(jù)該算法開發(fā)的(Altschul et al.J.Mol.Biol.215403-410，1990)。為了根據(jù)基于BLAST的BLASTN來分析核苷酸序列，將參數(shù)設(shè)置為，例如score＝100和word length＝12。另一方面，用基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列時，所用參數(shù)包括score＝50和word length＝3。當使用BLAST和空隙化BLAST程序時，使用每種程序的默認參數(shù)。這類分析的特定技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(http//www.ncbi.nlm.nih.gov)。
例如，改變了開花時間的植物轉(zhuǎn)化體可利用本發(fā)明的DNA來產(chǎn)生。更具體地，將編碼本發(fā)明蛋白的DNA插入適當載體；將該載體引入植物細胞；然后使所得的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細胞再生。由本發(fā)明人分離的Hd3a基因能誘導(dǎo)開花。因此，任意品種的開花時間可通過用該基因轉(zhuǎn)化該品種并表達該基因來進行控制。這種轉(zhuǎn)化比普通的通過雜交進行的基因轉(zhuǎn)移所需的時間短很多。而且，轉(zhuǎn)化不伴有特性的其它改變，這也很有利。
另一方面，開花受抑的植物轉(zhuǎn)化體可利用能抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達的DNA來產(chǎn)生將該DNA插入適當載體，將載體導(dǎo)入植物細胞，然后使所得已轉(zhuǎn)化的植物細胞再生。術(shù)語“抑制編碼本發(fā)明蛋白的DNA表達”包括抑制基因轉(zhuǎn)錄以及抑制蛋白翻譯。它不僅包括徹底抑制DNA表達，還包括降低表達水平。
植物中特定內(nèi)源基因的表達可通過領(lǐng)域內(nèi)常用的、利用了反義技術(shù)的方法來抑制。Ecker等人首次通過瞬時基因表達法證實了經(jīng)電穿孔導(dǎo)入植物細胞的反義RNA的反義效應(yīng)(J.R.Ecker和R.W.Dayis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372(1986))。此后，有報道在煙草和矮牽牛中通過表達反義RNA減少了靶基因的表達(A.R.van der Krol et al.，(1988)Nature 333866)。如今反義技術(shù)已作為抑制植物中靶基因表達的一種成熟手段。
反義核酸抑制靶基因表達需要多種因素，包括通過形成三鏈而抑制轉(zhuǎn)錄起始；通過在RNA酶形成局部開環(huán)結(jié)構(gòu)的位點處形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過與被合成的RNA形成雜合體而抑制轉(zhuǎn)錄；通過在內(nèi)含子與外顯子連接處形成雜合體而抑制剪接；通過在剪接體形成位點形成雜合體而抑制剪接；通過與mRNA形成雜合體而抑制mRNA從核到細胞漿的轉(zhuǎn)位；通過在加帽位點或poly A添加位點形成雜合體而抑制剪接；通過在翻譯起始因子結(jié)合位點形成雜合體而抑制翻譯的起始；通過在起始密碼子附近的核糖體結(jié)合位點形成雜合體而抑制翻譯；通過在已翻譯區(qū)或在mRNA的多體結(jié)合位點形成雜合體而抑制肽鏈延伸；通過在核酸與蛋白相互作用的位點形成雜合體而抑制基因表達。這些因素通過抑制轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯而抑制靶基因的表達(Hirashima和Inoue，“Shin Seikagaku Jikken Koza(NewBiochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，IdenshiNo Fukusei To Hatsugen(Replication and Expression of genes)”，NihonSeikagakukai Hen(The Japanese Biochemical Society)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本發(fā)明的反義序列可通過上述任何機制抑制靶基因的表達。在一個實施方案中，如果將反義序列設(shè)計成與所述基因的mRNA 5’端附近的非翻譯區(qū)互補，它就能有效抑制基因翻譯。也有可能使用與編碼區(qū)或非翻譯區(qū)在3’側(cè)互補的序列。因此，本發(fā)明中使用的反義DNA包括具有針對所述基因非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。將所用的反義DNA連接在適當啟動子下游，并優(yōu)選將含有轉(zhuǎn)錄終止信號的序列連接在3’側(cè)。將如此制備的DNA通過已知方法轉(zhuǎn)染至目標植物中。優(yōu)選反義DNA的序列是互補于轉(zhuǎn)化植物的內(nèi)源基因的序列或其一部分，但它不需要完全互補，只要它能有效抑制基因表達。所轉(zhuǎn)錄的RNA優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％互補于靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。為了用反義序列有效抑制靶基因的表達，該反義DNA應(yīng)至少含有15個核苷酸，更優(yōu)選至少100個核苷酸，還更優(yōu)選至少500個核苷酸。所用反義DNA通常短于5kb，優(yōu)選短于2.5kb。
編碼核酶的DNA也可用于抑制內(nèi)源基因的表達。核酶是具有催化活性的RNA分子。核酶有很多種，它們具有不同的活性。對核酶作為RNA裂解酶的研究使得能設(shè)計出以位點特異性方式裂解RNA的核酶。一部分I組內(nèi)含子型核酶或包含在RNA酶P中的M1RNA由至少400個核苷酸組成，而其它屬于錘頭型或發(fā)卡型的核酶具有約40個核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域(Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Nucleic acid，Protein，和Enzyme)，352191(1990))。
錘頭型核酶的自我裂解區(qū)在序列G13U14C15中C15的3’側(cè)裂解。U14與第9位的A之間形成核苷酸對被認為對核酶活性是十分重要的。此外，已知當?shù)?5位的核苷酸是A或U而不是C時也發(fā)生裂解(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.228225(1988))。如果將核酶的底物結(jié)合位點設(shè)計成與靶位點的鄰近RNA序列互補，則能產(chǎn)生限制酶樣RNA裂解性核酶，它識別靶RNA中的序列UC、UU、或UA(M.Koizumi et al.，F(xiàn)EBS Lett.239285(1988)；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka，Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid，和Enzyme)，352191(1990)；M.Koizumi et al.，Nucleic Acids Res.177059(1989))。例如，在Hda3基因(SEQ ID NO1，3，23或24)的編碼區(qū)中有多個可作為核酶作用目標的位點。
發(fā)卡型核酶也可用于本發(fā)明。發(fā)卡型核酶可在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA負鏈中找到(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。該核酶也能以靶特異性方式裂解RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki，Nucleic Acids Res.196751(1992)；Yo Kikuchi，Kagaku To Seibutsu(Chemistry和Biology)30112(1992))。
設(shè)計用于裂解目標的核酶可與啟動子，如花椰菜花葉病毒35S啟動子融合，并與轉(zhuǎn)錄終止序列融合，使它能在植物細胞中轉(zhuǎn)錄。但如果在所轉(zhuǎn)錄的RNA的5’或3’端添加了額外的序列，核酶的活性可能丟失。在這種情況下，可另外安排一個能清理接縫(trimming)的核酶，它能在核酶部分的5’或3’側(cè)順式清理接縫，從而從含有該核酶的轉(zhuǎn)錄RNA上準確切出核酶部分(K.Taira et al.，Protein Eng.3733(1990)；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823(1989)；C.A.Grosshands和R.T.Cech，Nucleic Acids Res.193875(1991)；K.Taira et al.Nucleic Acid Res.195125(1991))。通過隨機排列靶基因內(nèi)的多個位點可以裂解這些結(jié)構(gòu)單位并獲得更大效應(yīng)(N.Yuyama et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。通過利用這類核酶，有可能特異性裂解本發(fā)明靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，從而抑制該基因的表達。
內(nèi)源基因的表達也可通過用具有與該靶基因序列相同或相似序列的DNA進行轉(zhuǎn)化而進行共抑制。“共抑制”是指將具有與內(nèi)源靶基因序列相同或相似序列的基因通過轉(zhuǎn)化而導(dǎo)入植物后，該導(dǎo)入基因和內(nèi)源靶基因的表達都受到抑制的現(xiàn)象。共抑制的詳細機制目前尚不明了，但它常見于植物(Curr.Biol.7R793(1997)，Curr.Biol.6810(1996))。例如，如果想獲得Hd3a基因已被共抑制的植物體，可以用設(shè)計成能表達Hd3a基因的載體DNA或具有相似序列的DNA來轉(zhuǎn)化該植物，在所得植物群體中選出與野生型植物相比開花受到抑制的植物。用于共抑制的基因不必與靶基因完全相同，但應(yīng)有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％(如至少95％)的序列同一性。序列同一性可通過上述方法確定。
此外，本發(fā)明內(nèi)源基因的表達也可通過用具有該靶基因的顯性陰性表型(dominant negative phenotype)的基因轉(zhuǎn)化該植物來抑制。具有該靶基因的顯性陰性表型的基因是指，表達后能消除或降低該植物固有的野生型內(nèi)源基因活性的那些基因。
對用于植物細胞轉(zhuǎn)化的載體沒有限制，只要該載體能在植物細胞中表達所插入的基因。例如，可以使用含有用于植物細胞中組成型基因表達的啟動子(如花椰菜花葉病毒35S啟動子)和受外源刺激誘導(dǎo)的啟動子的載體。術(shù)語“植物細胞”在本文中包括各種形式的植物細胞，如培養(yǎng)細胞懸液，原生質(zhì)體，葉切片，和愈傷組織。
可通過已知方法將載體導(dǎo)入植物細胞，如聚乙二醇法，電穿孔，農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，和粒子轟擊?？筛鶕?jù)植物細胞的類型用已知方法從已轉(zhuǎn)化的植物細胞再生植物(Toki et al.，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。
例如，水稻植物的轉(zhuǎn)化和再生方法包括(1)用聚乙二醇將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于indica水稻品種)(Datta，S.K.(1995)in“GeneTransfer To Plants”，Potrykus I和Spangenberg Eds.，pp66-74)；(2)用電脈沖將基因?qū)朐|(zhì)體并再生植物體(適于japonica水稻品種)(Toki et al(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通過粒子轟擊將基因直接導(dǎo)入細胞并再生植物體(Christou et al.(1991)Bio/Technology，9957-962)；(4)利用農(nóng)桿菌導(dǎo)入基因并再生植物體(Hiei et al.(1994)Plant J.6271-282)；等等。這些都是領(lǐng)域內(nèi)現(xiàn)有方法，都廣泛用于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域。這些方法適用于本發(fā)明。
一旦獲得了一種轉(zhuǎn)化植物，其中已將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入了基因組，就有可能通過有性或無性繁殖從該植物體獲得后代。或者，可從該植物及其后代或克隆獲得育種材料(如種子、果實、穗、塊莖、塊根、株、愈傷組織、原生質(zhì)體等)來大規(guī)模生產(chǎn)植物。用本發(fā)明DNA轉(zhuǎn)化的植物細胞，包含這些細胞的植物體，該植物的后代和克隆，以及從該植物獲得的育種材料、其后代或克隆，它們都包括在本發(fā)明中。
如上述制備的植物的花期不同于野生型植物。例如，用編碼Hd3a蛋白的DNA轉(zhuǎn)化的植物在田間生長條件下花期提前。另一方面，由于導(dǎo)入反義DNA使得編碼Hd3a蛋白的DNA的表達受到抑制的那些植物花期延遲。因此，植物開花所需時間可通過控制Hd3a基因的表達來調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明，可以容易地控制水稻，這種極具價值的作物的抽穗期，這對于培育能適應(yīng)特定環(huán)境的水稻品種非常有利。


圖1示Hd3a區(qū)及其候選基因組區(qū)的詳細連鎖圖譜A用2207個植株的隔離群制備的連鎖圖譜；B位于Hd3a區(qū)中的來自Nipponbare的PAC克隆；CHd3a區(qū)的鄰接區(qū)的放大圖譜。
線上的實心圓表示CAPS標記物；箭頭表示預(yù)測的基因區(qū)；Rec.顯示重組個體重組的大概位置。候選區(qū)用方框表示。轉(zhuǎn)化所用DNA片段也顯示在圖的下部。
圖2的照片顯示不同光周期條件下培育的水稻中，F(xiàn)T-樣基因轉(zhuǎn)錄物的量的改變?！癝”代表播種后，于長日照條件(16h日照)下培養(yǎng)30天，然后轉(zhuǎn)移至短日照條件(10h日照)下培養(yǎng)0，2，6，和10天的植物的轉(zhuǎn)錄物?！癓”代表在長日照條件下進一步培養(yǎng)了10天的植物的轉(zhuǎn)錄物?！癎”代表基因組DNA；“N”代表未用模板而得到的轉(zhuǎn)錄物對照。
圖3示Hd3a基因的結(jié)構(gòu)。盒子代表翻譯區(qū)。Nipponbare中不同于Kasalath的序列位置已示于圖中。轉(zhuǎn)錄起始位點由圖左側(cè)的箭頭指示。
圖4示經(jīng)轉(zhuǎn)化的水稻植物的自花授粉后代(T1)分別在短日照(A)和長日照(B)條件下達到抽穗所需天數(shù)的分布頻率。兩圖中，黑柱代表攜有轉(zhuǎn)基因的植物，斜紋柱代表不含轉(zhuǎn)基因的植物。在長日照條件下，即使100天后，都未能在Nipponbare或NIL(Hd3a)中觀察到抽穗。
具體實施例方式
本發(fā)明參照以下實施例舉例說明，但不應(yīng)理解為本發(fā)明僅限于此。
高精度連鎖分析用基于圖譜進行克隆所必需的大隔離群進行詳細的Hd3a區(qū)連鎖分析。連鎖分析的隔離群使用的是Nipponbare與Kasalath雜交之后的回交后代BC3F3代。連鎖分析分兩步實施。首先，用595株植物的隔離群以及RFLP標記物制備Hd3a連鎖圖譜。結(jié)果證實Hd3a位于RFLP標記物C764和B174之間的區(qū)內(nèi)(Monna等，The 1999 Annual Meeting，Japanese Society of MolecularBiology)。然后，為了進一步提高圖譜分辨率，使用大群體進行連鎖分析。具體地，從2207株為了分析Hd3a區(qū)而隔離的植物中篩選出在Hd3a的鄰接區(qū)發(fā)生了重組的植物，該篩選使用下列的Hd3a側(cè)翼CAPS(切割擴增多態(tài)性序列)標記物CP13(引物[SEQ ID NO5/5′-GAGTAATTTGCGGTCAGAGTC-3′]和[SEQ ID NO6/5′-CCAAACAACACATCCTCAG-3′]，限制酶Tai I))；和CP15(引物[SEQ ID NO7/5’-ACCGCAGGTCTCCTTGTCATT-3′]和[SEQ IDNO8/5′-GCTATTGCCATCGCCTTGTGT-3′]，限制酶Msp I)。Hd3a基因座的基因型通過對后代的檢測來確定。具體地，將篩選出的植物的10株自花授粉后代培養(yǎng)在短日照條件(10h光照)下的溫室中，根據(jù)每一水稻品系達到抽穗所用天數(shù)的差異來確定Hd3a的基因型。通過連鎖分析鑒定出8株具有Hd3a與CP13連鎖的重組植物，2株具有Hd3a與CP15連鎖的重組植物(圖1)。
利用P1-衍生的人工染色體(PAC)克隆對Hd3a基因區(qū)進行比對從Nipponbare的PAC基因組文庫選出3個PAC克隆(P0037G03，P0046E09，和P0698G05)，它們在Hd3a基因座附近具有DNA標記物1-5A，R778，和CP39的核苷酸序列。通過篩選發(fā)現(xiàn)，這3個PAC克隆中，P0046E09和P0698G05具有Hd3a-側(cè)翼標記物CP13和CP15的核苷酸序列，因此它們含有Hd3a基因區(qū)(圖1)。
通過核苷酸序列分析鑒定候選基因區(qū)為了界定Hd3a的候選基因組區(qū)并鑒定該候選基因，分析了PAC克隆P0046E09的核苷酸序列。為此，用超聲處理將P0046E09的DNA插入子(包括載體)變成片段，以便制備兩個包含DNA插入子的亞文庫，其一平均長度為2kb，另一為5kb。從這兩類亞文庫中隨機選出2000個克隆，分析它們的核苷酸序列，用計算機軟件Phred/Phrap(http//bozeman.genome.washington.edu/index.html)裝配。根據(jù)連鎖分析所鑒定的候選基因區(qū)內(nèi)核苷酸序列的信息，制備新的CAPS(切割擴增多態(tài)性序列)標記物來限制候選區(qū)。
Hd3a基因與CAPS標記物25-3UL(引物[SEQ ID NO9/5’-TCAGAACTTCAACACCAAGG-3’]和[SEQ ID NO10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’]，限制酶Hae III)和CP39(引物[SEQ IDNO11/5’-GGGAGAATATGTTGCAGTAG-3’]和[SEQ ID NO12/5’-CAAATGGTAATGGGTCAA-3’]，限制酶Alu I)共隔離。另外還檢測出兩株重組植物，其一在Hd3a基因與25-5UL(引物[SEQ ID NO13/5’-CTGTCTCGAAATCGCCTCTG-3’]和[SEQ ID NO14/5’-TCCAGCACATCACCCACAA-3’]，限制酶Hse III)之間發(fā)生了重組，另一在Hd3a與CP59(引物[SEQ ID NO15/5’-AGCCTCTGCGTCACTGTCATC-3’]和[SEQ ID NO16/5’-GCAGCAGCAAACTCCCAAAG-3’]，限制酶TthH8I)之間發(fā)生了重組(圖1)。據(jù)此，將候選基因組區(qū)界定為近20kb的一個區(qū)域。
用GENSCAN(http//ccR-081.mit.edu/GENSCAN.html)對該候選區(qū)的核苷酸序列進行基因預(yù)測和相似性檢索，結(jié)果在該候選基因組區(qū)內(nèi)檢測出與編碼脂轉(zhuǎn)移蛋白、?；?CoA合成酶的基因，以及與擬南芥的FT基因具有高度相似性的區(qū)域。
Hd3a候選基因的表達分析對Nipponbare以及近似純合系(NIL(Hd3a))的候選基因進行RT-PCR，所述NIL(Hd3a)中的Hd3a基因區(qū)被Kasalath的染色體片段取代。具體地，收集葉片，提取總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，然后使用能特異性擴增Hd3a候選基因組區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的3個基因的引物進行PCR(對FT-樣基因而言正義鏈[SEQ ID NO9/5’-TCAGAACTTCAACACCAAGG-3’]和反義鏈[SEQ IDNO10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’]；對脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因而言正義鏈[SEQ ID NO17/5’-GGGGACGTCGGACCTGT-3’]和反義鏈[SEQ IDNO18/5’-AGTTGAAGTTTGGGCTGGTCG-3’]；對酰基-CoA合成酶的基因而言正義鏈[SEQ ID NO11/5’-GGGAGAATATGTTGCAGTAG-3’]和反義鏈[SEQ ID NO12/5’-CAAATGGTAATGGGTCAA-3’])。用作模板的RNA的量用以下引物對經(jīng)PCR來評估(正義鏈[SEQ ID NO19/5’-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3’]和反義鏈[SEQ ID NO20/5’-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3’])，這對引物能擴增肌動蛋白基因中的一個片段。將Nipponbare和NIL(Hd3a)在長日照條件(光照16.0h)下培養(yǎng)30天后，繼續(xù)在短日照條件(光照10.0h)下培養(yǎng)0，2，6，和10天，或在長日照條件下培養(yǎng)10天。然后，從這些植物收集葉片進行分析。
結(jié)果證實，候選基因區(qū)以內(nèi)的所有這三種預(yù)測基因都發(fā)生表達。FT-樣基因的轉(zhuǎn)錄物可在短日照條件下培養(yǎng)的植物中檢測到，但在長日照條件下培養(yǎng)的植物中未檢測到(圖2)。在短日照條件下培養(yǎng)的Nipponbare與NIL(Hd3a)的轉(zhuǎn)錄量沒有顯著差異(圖2)。脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因的轉(zhuǎn)錄物僅見于Nipponbare，?；?CoA合成酶的基因的轉(zhuǎn)錄物可見于Nipponbare和NIL(Hd3a)，但表達水平在短日照條件和長日照條件下培養(yǎng)的植物之間沒有差異。以上結(jié)果表明，F(xiàn)T-樣基因可作為利用轉(zhuǎn)化進行功能分析時的有效候選基因，因為它在短日照條件下轉(zhuǎn)錄水平增加。
Hd3a候選基因的核苷酸序列分析由Kasalath的基因組DNA制備粘粒文庫，以便篩選對應(yīng)于Hd3a候選區(qū)的克隆H3PZ1-1。更具體地，用Kasalath的基因組DNA以及pPZP2CH-lac載體構(gòu)建基因組DNA文庫。用位于Hd3a鄰接區(qū)的核苷酸序列25-5UL和CP39，從該文庫中選出含有Hd3a候選基因的克隆H3PZ1-1(圖1)。對該克隆的核苷酸序列進行分析，并與Nipponbare的Hd3a進行比較，結(jié)果證實，Nipponbare的核苷酸序列與Kasalath的相比，有32個位點發(fā)生核苷酸取代，有2個位點發(fā)生插入(2bp和3bp)，有7個位點發(fā)生缺失(1bp-50bp)(圖3)。
用于進行cDNA核苷酸序列分析的近似純合系(NIL(Hd3a))經(jīng)過短日照條件的培養(yǎng)后，提取RNA，合成cDNA，實施RT-PCR，所用引物對含有從起始密碼子到終止密碼子的區(qū)域(正義鏈[SEQ ID NO21/5’-GCTGCCTCTATCACAGTATATT-3’]和反義鏈[SEQ ID NO10/5’-ACCTTAGCCTTGCTCAGCTA-3’])。將PCR產(chǎn)物克隆并測序。通過5’-RACE確定轉(zhuǎn)錄起始位點，結(jié)果證實該位點位于預(yù)測的轉(zhuǎn)錄起始密碼子上游152bp處。
分析結(jié)果表明，所有突變中，位于外顯子內(nèi)部的突變僅限于N末端側(cè)的一個單-核苷酸取代和一個兩-核苷酸取代。后一種取代被證實導(dǎo)致天冬酰胺(Kasalath)變成脯氨酸(Nipponbare)(圖3)。
通過轉(zhuǎn)化鑒定候選基因的功能將來自粘?？寺3PZ1-1的僅含有所述候選基因區(qū)的8.7kb SpeI片段克隆至載體pPZP2H-lac中(pPZHd3aK)，該載體可利用土壤桿菌進行轉(zhuǎn)化。類似地，將Nipponbare的8.7kb SpeI片段插入pPZP2H-lac中(pPZHd3aN)。用包含這些片段的載體和單獨的載體按照Toki的方法(Plant Mol.Biol.Rep.1516-21，1997)進行轉(zhuǎn)化。用Nipponbare作為接受轉(zhuǎn)化的水稻品系。結(jié)果，用pPZHd3aK進行轉(zhuǎn)化獲得了21株潮霉素抗性植株(用單獨的載體進行轉(zhuǎn)化獲得17株)，用pPZHd3aN進行轉(zhuǎn)化獲得20株潮霉素抗性植株(用單獨的載體進行轉(zhuǎn)化獲得20株)。
在pPZHd3aK的情況中，用CAPS標記物25-5UL通過CAPS分析來確定是否已實現(xiàn)目標區(qū)的插入，對pPZHd3aN的情況而言，采用對應(yīng)于載體的引物M13 Primer RVand TAKARA以及對應(yīng)于基因的引物[SEQ ID NO22/5’-CGCTCAGCAACGAGTTTC-3’]進行PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用pPZHd3aK和pPZHd3aN轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)化體都摻入了候選基因。
及時將這些再生的植物轉(zhuǎn)移至短日照(光照10h)或長日照(光照13.5h)溫室中，研究到達抽穗所需的天數(shù)。在引入了pPZHd3aK和pPZHd3aN的植物中，短日照或長日照條件下培養(yǎng)后，都發(fā)現(xiàn)了抽穗期大大提前的植株(表1)。在僅引入了單獨的載體的植物中，沒發(fā)現(xiàn)抽穗期有明顯改變的植株(表1)。
表1到達抽穗的天數(shù)a4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64 68 72 76 80 84 88 92 96 未出穗SD pPZHd3aK 12 4 2單獨載體 2 5 3 1LD pPZHd3aK 1 1 1 1 1 1 1 1 4單獨載體 6SD pPZHd3aN 1 1 2 3 3單獨載體 2 3 5LD pPZHd3aN 1 1 2 2 1 12單獨載體1 3 15a從將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)移至土壤中的當日到抽穗日的天數(shù)未抽穗97天內(nèi)未能抽穗的植株SD和LD分別指短日照培養(yǎng)(光照10.5小時)和長日照(光照13.5小時)培養(yǎng)pPZHd3aK和pPZHd3aN分別與Nipponbare和Kasalath的Hd3a基因一起插入的載體另外，對提早抽穗的轉(zhuǎn)化植物(pPZHd3aK)的自花授粉后代進行短日照條件培養(yǎng)，檢查達到抽穗期所需天數(shù)的分布，發(fā)現(xiàn)天數(shù)的變化是連續(xù)分布的，但比對照植物Nipponbare提早抽穗的植物是散在的，這些植物包含轉(zhuǎn)基因(圖4)。
另一方面，將自花授粉后代在長日照條件下進行類似的培養(yǎng)，其中出現(xiàn)與Nipponbare和NIL(Hd3a)截然不同的抽穗植物，Nipponbare和NIL(Hd3a)甚至在100天后都未能抽穗。所有抽穗植物都保留了插入的DNA片段(圖4)。
這些結(jié)果表明，F(xiàn)T-樣基因，即所述候選基因，具有促進短日照條件下抽穗的功能，并且可將該基因確定為Hd3a。預(yù)測Kasalath的等位基因的抽穗作用比Nipponbare的更強。但Nipponbare的等位基因也提示能在一定程度上維持該功能。長日照條件下觀察到的提早抽穗很可能歸因于通過轉(zhuǎn)化新引入的Hd3a基因?qū)е碌腍d3a表達水平的升高。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明提供了誘導(dǎo)植物開花的基因。本發(fā)明使得有可能控制水稻的抽穗期，這對于育種意義重大。水稻植物抽穗期的控制尤其可用于培育適應(yīng)特定地區(qū)和季節(jié)的水稻品種。此外，利用本發(fā)明的基因培育水稻的方法與傳統(tǒng)方法相比的優(yōu)勢在于，可以在較短周期內(nèi)以較高的可靠性獲得目標植物。
序列表<110>矢耶昌裕(Yano Masahiro)，小島晶子(Kojima Shoko)<120>誘導(dǎo)植物開花的HD3A基因及其應(yīng)用<130>
<140>
<141>
<150>JP 2000-356839<151>2000-11-24<160>24<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4229<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<223>基因組DNA<220>
<221>exon<222>(825)..(1184)<220>
<221>intron<222>(1185)..(1346)<220>
<221>exon<222>(1347)..(1408)<220>
<221>intron<222>(1409)..(1541)<220>
<221>exon
<222>(1542)..(1582)<220>
<221>intron<222>(1583)..(2889)<220>
<221>exon<222>(2890)..(3274)<220>
<221>CDS<222>(978)..(1184)<220>
<221>CDS<222>(1347)..(14 08)<220>
<221>CDS<222>(1542)..(1582)<220>
<221>CDS<222>(2890)..(3119)<400>1gataagttgc ggaaaaacca acaaattagc aacaaatatg agtaaaactt gtatacatgt 60gtcttcttag cgatttaaaa atcaatgctg aaaataaatt ataataaaat taaaaatctc 120aagataatct ctaaaatgta gttttaaaat ttaaattttg attgcgactg ataagaaaaa 180aaaacaaatg atgggaggct atatcaactg tcaaactggc taatttagaa agacgacatc 240gaattcctac agattggagg cagcaaaaga gagcctgtct ctgccgggtg cgtgcatgat 300gctcgatcat atcccatctc tcctcacttc atcatcaaca agaacaagag gaactatata 360gctgcaagat ctagactgaa actactatag caactaactg tactgtagct agattacgct 420tagctatagc tgctgctgca gctgctgctg catctatctg taaattccaa ctacgacgtc 480gactgctgca agctagcttg accggctagc tagatagcta gctagctcaa aagagaaagc 540
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agt gac cct aac ctt agg gag tat cta cat tg gtaagcacac taatgttaag 1428Ser Asp Pro Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp80 85 90ctagcgcact tgttttcatg caatgatcaa aataatcact gctagctgat ttacatacat 1488aaccacatct tgactgcatg atgggttgat catcttaatt tgtttgtcca cag g ttg 1545Leugtc act gat att cct ggt act act gca gcg tca ttt g gtcagtatta 1592Val Thr Asp Ile Pro Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe95 100aacgatcaaa tggtttagat tgatttgatt tcccacttaa atacattgca gtataaaact 1652aacagaggta aattgtcttt ccatactatt gtttgggggg gggggggggg ggcagtgagt 1712tgttgagcat tttccctcac tcgcgagccc ccagtttgcc gcattaattc cccatcatcc 1772ttcaccacca ccaaaaataa aaagtgattt ggagaaggat acgctcctcc aaataatttt 1832taacaagttc accaccacaa cgaggcaccg ataaccgcca tgagtccacg caccctgcag 1892ctagtcgtgc caccagcacc acagtttgcc acaccgcgag caatccacgc catcacttgc 1952cgctgtgagt ccacgatcac acgcctcgat cagccagctg ccatgatatg tcggcttggg 2012cttggattcc gcaacatacc atgtccccat cgatggcacc acactctaat tcgccaacac 2072aacactgaag ggatcggacc gggagggcta gctcactcaa gatagtgacg ggatgattcg 2132atgggaattc catggggaac aaagcacaaa atcatgaaaa tgtccttttc aattccatgg 2192caaattccta aagcaatact ctctctccat tctataatgt aggttgcaca ctcatttcaa 2252gattcaactt tcaaaacatt tgactaacga tttgtataat ataaattgaa ttttatttga 2312tagaaataat attattggat tgatatttca atatactttc atatggttat aattttgtta 2372ctacaaactt tatagtatat tagaaattat aaataaaaaa ttagttttat agaccgtaca 2432tgccaagttt gaccatacca taatatgaaa aagagggagt agtaaccttg tttatattgg 2492
caatatatac ttcctccgtt tctaaatatt tgacgctgtt gactttttaa acatgtttga 2552ccgttcgtct tattaaaaaa taagtaatta ttaattcttt tcctatcatt tgatttattg 2612ttaaatatat ttttatgcag acatatagtt ttacatattt cataaaagtt tttgaataag 2672aagaatgatc gtcaaatatt tagaaacgag gggagtatat tgctagtaaa ttttactgta 2732aagtcatgtt tcttcatgtg tcttttttag aacatttctt cttcatgtgt tccattcaat 2792tttttcgatc tccaccacca ctaccacagt tgtatgtgta gtagctagct gttgcacatg 2852ctcatgttaa tctgaatctg ttcatggttt tttgcag gg caa gag gtg atg tgc 2906Gly Gln Glu Val Met Cys105tac gag agc cca agg cca acc atg ggg atc cac cgg ctg gtg ttc gtg 2954Tyr Glu Ser Pro Arg Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val110 115 120 125ctg ttc cag cag ctg ggg cgt cag aca gtg tac gcg ccc ggg tgg cgt 3002Leu Phe Gln Gln Leu Gly Arg Gln Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg130 135 140cag aac ttc aac acc aag gac ttc gcc gag ctc tac aac ctc ggc tcg 3050Gln Asn Phe Asn Thr Lys Asp Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Ser145 150 155ccg gtc gcc gcc gtc tac ttc aac tgc cag cgc gag gcc ggc tcc ggc 3098Pro Val Ala Ala Val Tyr Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ala Gly Ser Gly160 165 170ggc agg agg gtc tac aac tag ctaacgatga tcccgatcga tctgctgcat 3149Gly Arg Arg Val Tyr Asn175 180gctcactatc atcatccagc atgctataca ttgcaggttc agacaattga aatgattctc 3209gacacacaac atatatatga tggtgtaatt aattatgcaa ttaattagct gagcaaggct 3269aaggtctctc atgaagctag ctttgctcta tatatatata tatatatata tatatatata 3329tatatatata tatatatata tatatatata tagtgaagtg tgcaataagc tgcaggtata 3389
taagactgga tttaaggagc taattaacta aaccatgcat cacgtatatg tgagatgcag 3449tcgtgctctt gcatccaagg atacatacag catatgcatg caatattggt atcatatgca 3509tgcaatattg gtatcatatg cagcggctgc tagctactcc tagaagctat acagcagaat 3569gtaaacatat atgtgtagca gtacttatac gtagcacatc gatctgcaca tgttggatgt 3629agcaagaaat tgctatgaaa tataagtaga gatgtgctta atatcaaatg tgtgtcacat 3689gtgaatctat cagctgggca tatatagtgt ctctttcagg cttccatctc actgtctatc 3749tcgcccccca ctgaatatat atttcgacag ctgtcgcgtt ccgattcgtc gaaatctctc 3809gctagcacag tttaaggaca ggtactacgt gctaatgata tgatatgatg gtgaaaggga 3869ctacagctag ggagtatcaa tcagaaccca tgttttggaa aagctgatac ggatcgatat 3929tgatcatatg catgcgtaga agaattcatc gtcagaaaac gcgtacgatt ggtcgtatgt 3989gaaagaagca tatatatcta gatctgtaac tttaaaatcc actctcctat gatcgatcga 4049catccattg gtgagttata tgttcaaaag catagatcga gatcgtcacg attggtagtg 4109ggtgatcgat gcagctatac tagctccttt tctctcccaa tcgtcgaaga ttcaggcatt 4169cacccaatgc tgttgcaggg atataattgt ctctgttatt ttttattctg acattgtata 4229<210>2<211>179<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>2Met Ala Gly Ser Gly Arg Asp Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val1 5 10 15Val Gly Asp Val Leu Asp Ala Phe Val Arg Ser Thr Asn Leu Lys Val20 25 30Thr Tyr Gly Ser Lys Thr Val Ser Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser35 40 45Met Val Thr His Gln Pro Arg Val Glu Val Gly Gly Asn Asp Met Arg50 55 60Thr Phe Tyr Thr Leu Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser
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85 90tgttttcatg caatgatcaa aataatcact gctagctgat ttacatacat aaccacatct 1484tgactgcatg atgggttgat catcttaatt tgtttgtcca cag g ttg gtc act gat 1540Leu Val Thr Aspatt cct ggt act act gca gcg tca ttt g gtcagtatta aacgatcaaa 1588Ile Pro Gly Thr Thr Ala Ala Ser Phe95100tggtttagat tgatttgatt tcccacttaa atacattgca gtataaaact aacagaggta 1648aattgtcttt ccatactatt gtttgggggg ggggggccag ggggcagtga gttgttgagc 1708attttccctc actcgcgagc ccccagtttg ccgcattaat tccccatcat ccttcaccac 1768cacaaaaaaa aaagtgattt ggagaaggat acgctcctcc aaataatttt taacaagttc 1828accaccacaa cgaggcaccg acaaccgcca tgagtccacg caccctgcag ctagtcgtgc 1888caccagcacc acagttagcc acaccgcgag caatccacgc catcacttgc cgctgtgagt 1948ccacgatcac acgcctcgat cagccagctg ccatgatatg tcggcttggg cttggattct 2008gcaacatacc atgtccccat cgatggcacc acactctaat tcgccaacac aacactgaag 2068ggatcggatc gggagggcta gctcactcaa gatagtgacg ggatgattcg atgggaattc 2128catggggaac aaagcacaaa atcattaaaa tgtccttttc aattccatgg caaattccta 2188aagcaatact ctctctccat tctataatgt aggttgcaca ctcatttcaa gattcaactt 2248tcaaaacatt tgactaacga tttgtataat ataaattgaa ttttatttga tagaaataat 2308attattggat tgatatttca atatactttc atatggttat aattttgtta ctacaaactt 2368tatagtatat tagaaattat aaataaaaaa ttagttttgt agaccgtaca tgccaagttt 2428gaccatacca tattatgaaa aagagggagt agtaaccttg tttatatttg caatatatac 2488tccctccgtt tctaaatatc tgacgctgtt gactttttaa acatgtttga ccgttcgtct 2548tattaaaaaa taagtaatta ttaattcttt tcctatcatt tgatttattg ttaaatatat 2608
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<220>
<223>人工序列的說明人工合成的引物序列<400>22cgctcagcaa cgagtttc18<210>23<211>847<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>23tgcaccacac acagttcagc tagcagatca cctagctaga tagctgcctc tatcacagta 60tatttgctcc ctgcaacttg ctgctgctgc aatagctagc agctgcagct agtaagcaaa 120actatatacc ttcagggttt tttgcaagat cgatggccgg aagtggcagg gacagggacc 180ctcttgtggt tggtagggtt gtgggtgatg tgctggacgc gttcgtccgg agcaccaacc 240tcaaggtcac ctatggctcc aagaccgtgt ccaatggctg cgagctcaag ccgtccatgg 300tcacccacca gcctagggtc gaggtcggcg gcaatgacat gaggacattc tacacccttg 360tgatggtaga cccagatgca ccaagcccaa gtgaccctaa ccttagggag tatctacatt 420ggttggtcac tgatattcct ggtactactg cagcgtcatt tgggcaagag gtgatgtgct 480acgagagccc aaggccaacc atggggatcc accggctggt gttcgtgctg ttccagcagc 540tggggcgtca gacagtgtac gcgcccgggt ggcgtcagaa cttcaacacc aaggacttcg 600ccgagctcta caacctcggc tcgccggtcg ccgccgtcta cttcaactgc cagcgcgagg 660ccggctccgg cggcaggagg gtctacaact agctaacgat gatcccgatc gatctgctgc 720atgctcacta tcatcatcca gcatgctata cattgcaggt tcagacaatt gaaatgattc 780tcgacacaca acatatatat gatggtgtaa ttaattatgc aattaattag ctgagcaagg 840ctaaggt 847<210>24<211>847<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>24tgcaccacac acagttcagc tagcagatca cctagctaga tagctgcctc tatcacagta 60tatttgctcc ctgcaacttg ctgctgctgc aatagctagc agctgcagct agtaagcaaa 120actataaacc ttcagggttt tttgcaagat cgatggccgg aagtggcagg gacagggacc 180ctcttgtggt tggtagggtt gtgggtgatg tgctggacgc gttcgtccgg agcaccaacc 240tcaaggtcac ctatggctcc aagaccgtgt ccaatggctg cgagctcaag ccgtccatgg 300tcacccacca gcctagggtc gaggtcggcg gcaatgacat gaggacattc tacacccttg 360tgatggtaga cccagatgca ccaagcccaa gtgaccctaa ccttagggag tatctacatt 420ggttggtcac tgatattcct ggtactactg cagcgtcatt tgggcaagag gtgatgtgct 480
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1.一種編碼植物蛋白的DNA，所述蛋白可誘導(dǎo)植物開花，所述DNA選自(a)編碼含有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)編碼含有SEQ ID NO2或4所示氨基酸序列，但其中一或多個氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；和(c)能在嚴謹條件下與由SEQ ID NO1，3，23或24所示核苷酸序列組成的DNA雜交的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中該DNA來自水稻。
3.一種DNA，其編碼與權(quán)利要求1或2所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物互補的反義RNA。
4.一種DNA，其編碼具有特異性消化權(quán)利要求1或2所述DNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核酶活性的RNA。
5.一種DNA，其編碼能通過在植物細胞中表達而利用共抑制效應(yīng)來抑制權(quán)利要求1或2所述DNA的表達的RNA。
6.權(quán)利要求1或2的DNA，其中所述DNA用來誘導(dǎo)植物開花。
7.權(quán)利要求3至5中任一項的DNA，其中所述DNA用來抑制植物開花。
8.一種載體，其包含權(quán)利要求1至5中任一項的DNA。
9.一種植物細胞，其引入了權(quán)利要求8的載體。
10.一種植物轉(zhuǎn)化體，其包含權(quán)利要求9的植物細胞。
11.權(quán)利要求10的植物轉(zhuǎn)化體，其中所述植物轉(zhuǎn)化體為水稻。
12.一種植物轉(zhuǎn)化體，其為權(quán)利要求10或11的植物轉(zhuǎn)化體的后代或克隆。
13.權(quán)利要求10至12中任一項的植物轉(zhuǎn)化體的育種材料。
14.一種產(chǎn)生權(quán)利要求10或11所述植物轉(zhuǎn)化體的方法，其包括以下步驟(a)將權(quán)利要求1或2的DNA引入植物細胞，和(b)從該植物細胞再生植物。
15.一種誘導(dǎo)植物開花的方法，其中所述方法包括在該植物體的細胞中表達權(quán)利要求1或2的DNA的步驟。
16.一種抑制植物開花的方法，該方法以抑制植物體的細胞中權(quán)利要求1或2的內(nèi)源DNA的表達為特征。
17.權(quán)利要求16的方法，其包括在植物體的細胞中表達權(quán)利要求3至5任一項所述DNA的步驟。
18.權(quán)利要求14至17中任一項的方法，其中所述植物為水稻。
全文摘要
本發(fā)明通過連鎖分析，成功地分離出Hd3a基因。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)植物的開花時間可通過引入Hd3a基因或通過控制其表達來調(diào)整。
文檔編號C12R1/91GK1487997SQ01822257
公開日2004年4月7日 申請日期2001年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月24日
發(fā)明者矢野昌裕, 小島晶子, 子 申請人:獨立行政法人農(nóng)業(yè)生物資源研究所, 生物系特定產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究推進機構(gòu)