專利名稱：與精神分裂癥相關(guān)的電壓門控離子通道基因及蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及電壓門控離子通道基因和蛋白質(zhì)及其在疾病中的作用。本發(fā)明涉及編碼CanIon多肽的多核苷酸以及位于所述編碼區(qū)5’-和3’-端的調(diào)節(jié)區(qū)。本發(fā)明還涉及CanIon基因編碼的多肽。本發(fā)明同時(shí)提供了篩選CanIon通道調(diào)節(jié)劑(如拮抗劑)的方法以及使用這種調(diào)節(jié)劑治療或預(yù)防各種疾病或癥狀的方法。本發(fā)明還涉及專門針對此類多肽故可用作診斷試劑的抗體。本發(fā)明進(jìn)一步包括在基因分析中有用的CanIon基因的雙等位基因標(biāo)記。
背景技術(shù)：
基礎(chǔ)和臨床研究人員使得他們能夠?qū)】岛突疾≈械哪X及神經(jīng)系統(tǒng)功能進(jìn)行越來越深入的研究。關(guān)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病包括精神病和神經(jīng)退化疾病有關(guān)的神經(jīng)化學(xué)和遺傳機(jī)理，業(yè)已提出了神經(jīng)生物學(xué)及藥理學(xué)的許多假設(shè)。然而，CNS疾病很復(fù)雜，病原學(xué)知之甚少以及癥狀重疊，特征顯著，故而難以判斷。所以，對進(jìn)一步的治療方案和藥物開發(fā)的努力會更加復(fù)雜，并集中在多基因病因上，而且需要一些新嘗的去驗(yàn)給疾病分類，為患有CNS疾病的病人提供更準(zhǔn)確的診斷和預(yù)后信息。
CNS疾病包括的范圍很廣，和相應(yīng)地范圍很廣的遺傳原因。CNS病的例子包括神經(jīng)退化性疾病、精神病(psychotic disorders)、情緒失常(mood disorders)、自閉病、藥物成癮和酗酒、癲癇、弱智及其它精神疾病(psychiatric diseases)，包括認(rèn)知能力(cognitive)、焦慮、飲食、沖動控制(impulse-control)及人格障礙(personality disorders)。可采用精神病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(Diagnosis andStatistical Manual of Mental Disorders)第四版(DSM-IV)的分類給這些疾病作定義。
即使只考慮一個(gè)小亞組的CNS疾病，由于對精神分裂癥和雙極情感障礙缺乏足夠的治療方法和對此病的分子基礎(chǔ)缺乏了解，很顯然，需要在治療發(fā)明上有新目標(biāo)及改進(jìn)的治療方法。對于精神分裂癥和雙極情感障礙，所有用于治療它們的現(xiàn)有已知分子都有副作用，而且只對癥狀起作用。故目前迫切需要沒有伴隨副作用、并針對涉及精神分裂癥和雙極情感障礙病源機(jī)制的目標(biāo)的新分子。所以，有助發(fā)現(xiàn)和特征鑒定這些目標(biāo)的工具是必要的和有用的。
電壓門控離子通道電壓門控離子通道是大分子大家族的一部分，這些大分子的作用包括控制t保持跨越細(xì)胞膜的電勢、分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。這些通道蛋白質(zhì)參與控制神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)，并在許多細(xì)胞功能包括膜興奮性、肌肉收縮和突觸傳遞的調(diào)控中起著重要作用。Na+通道主要的α-亞基和Ca+通道主要的α-1亞基由大約2000個(gè)氨基酸組成并包括離子傳導(dǎo)通路。生化分析揭示，具有生理學(xué)活性的離子通道由幾種不同的亞基組成。有兩種與Na+通道的α亞基、β-1和β-2亞基共純化的輔助亞基。對Ca+通道還鑒定了具有調(diào)節(jié)作用的其它亞基(α-2、β、γ和δ)。α-2和β亞基似乎可增強(qiáng)Ca+通道α-1亞基的功能活性。K+通道的α亞基與β亞基的比例為1∶1，可導(dǎo)致K+通道復(fù)合體呈現(xiàn)(α)4(β)4化學(xué)計(jì)量(Terlau等，Naturwissenschaften 85437-444(1998))。例如，Williams等Science 257389-395(1992)；Mori等Nature 350398-402(1991)；以及Koch等J.Biol.Chem.265(29)17786-17791(1990)中進(jìn)一步討論了鈣和鈉離子通道的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)和例子。Lee等FEBS Lett.445231236(1999)進(jìn)一步描述了與CanIon通道具有高度序列同源性水平的大鼠Ca+和Na+離子通道的核酸序列。
α亞基具有所有電壓依賴的陽離子通道的序列特征，并利用了同樣的結(jié)構(gòu)基序，該基序包括一6-螺旋束的潛在跨膜域。在鈉和鈣通道中，這一基序在序列中都重復(fù)了4次，產(chǎn)生一24螺旋束。其氨基酸序列在物種之間(如人類和果蠅)和不同離子通道之間是高度保守的。
多基因家族中存在幾種由分離基因編碼的組織特異性藥理學(xué)和電生理學(xué)上懷質(zhì)不同的鈣通道同種型，它們是由骨骼肌中，每個(gè)緊密結(jié)合的α、β和γ亞基的裝配體聯(lián)合其它4個(gè)裝配體形成一種五聚體大分子。例如，神經(jīng)元鈣通道α-1亞類是至少7種不同名為α-1A-H基因的產(chǎn)物。免疫細(xì)胞化學(xué)研究顯示了α-1鈣通道亞基的不同分布。α-1A和α-1B主要在樹突和突觸前末稍表達(dá)，與α-1B相比，α-1A通常集中在大量的神經(jīng)末稍中。在大鼠和人類的神經(jīng)肌肉連接處，α-1A定位在突觸前，而α-1B和α-1A都存在于軸突相關(guān)的施萬細(xì)胞中。α-1E主要位于胞體中，某些情況下在近端樹突中以及浦肯雅細(xì)胞的遠(yuǎn)端分支中。α-1C和α-1D位于胞體和中央神經(jīng)元的近端樹突中。
業(yè)已按照藥理和/或電生理學(xué)特性將天然的鈣通道分類。電壓依賴的鈣通道可分類為高電壓活化(HVA)型，包括L-、N-、P-和Q-型；中間類型(IVA，R-型)；和低電壓活化(LVA，T-型)型。(Morena等，Annals NY Acad.Sci.102-117(1999)。
主要的亞類(α-1)屬于一基因家族，當(dāng)在異源表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，這一家族的成員可自身形成功能性通道。(Zhang等，Neuropharmacology 32(11)1075-1088(1993)，納入?yún)⒖嘉墨I(xiàn))。在天然細(xì)胞中，α-1亞基以多亞基復(fù)合體的形式和輔助亞基一起表達(dá)，其中輔助亞基可修飾α-1亞基的功能特性。在許多情況下，輔助亞基的共表達(dá)會影響這些通道的生物物理特性。特別是β亞基對α-1亞基有重要的影響；已顯示β亞基可改變活化特征、穩(wěn)態(tài)失活、失活動力學(xué)和峰電流。
多種形式α-1亞基的存在造成了這些通道的眾多分子多樣性。例如，已顯示鈣通道的不同剪接形式是差異性表達(dá)的，對絲氨酸-蘇氨酸激酶的磷酸化有不同的敏感性(Hell等，Annals N.Y.Acad.Sci.747282-293(1994))。已證明離子通道基因的突變與許多疾病有關(guān)，包括一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Bulman等在Hum.Mol.Gen.6(10)1679-1685(1997)綜述了造成許多外鈉性紊亂(eposodic disorder)的離子通道突變的例子，這些疾病包括周期性癱瘓、外鈉性共濟(jì)失調(diào)(eposodicataxia)、偏頭痛、長QT間期綜合征和陣發(fā)性運(yùn)動障礙(paroxysmal dyskenesia)。表A(引自Morena，同上)中列出了一些Ca+通道突變疾病。
表A

通常聯(lián)用鈣和鈉通道調(diào)節(jié)劑治療各種疾病和癥狀。例如，已證明鈣和/或鈉通道阻斷劑可有效用于治療或預(yù)防一種或多種與許多疾病或病癥有關(guān)的癥狀，這些疾病或病癥有各種心臟疾病和病癥(如心絞痛和心律失常)、高血壓、偏頭痛、中風(fēng)的神經(jīng)影響、躁狂癥、安定藥誘導(dǎo)的遲發(fā)性運(yùn)動障礙、雙相極感障礙、疼痛、癲癇等。
已知不同離子通道之間神經(jīng)系統(tǒng)存在顯著功能差異。此外，功能差異還存在于同一離子通道基因的不同突變體以及同一離子通道的剪接變體之間。因此，盡管CNS疾病中牽涉到離子通道，但很難預(yù)測哪個(gè)離子通道是治療性干涉特定疾病的有效靶標(biāo)。已提出的一個(gè)問題牽涉到精神分裂癥、雙極情感障礙或有關(guān)疾病的離子通道基因。
本發(fā)明報(bào)告了這些需要以及其它需要。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及核酸分子，其包含編碼稱為CanIon的電壓門控離子通道蛋白質(zhì)的新型人基因的基因組序列。CanIon基因組序列還包括位于所述基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的上游(5’端)和下游(3’端)的調(diào)節(jié)序列，這些調(diào)節(jié)序列也是本發(fā)明的一部分內(nèi)容。
本發(fā)明還提供編碼CanIon蛋白質(zhì)的完整cDNA序列以及相應(yīng)的翻譯產(chǎn)物。
與CanIon基因組或cDNA序列特異性雜交的寡核苷酸探針或引物、用所述引物和探針進(jìn)行DNA擴(kuò)增和檢測方法也是本發(fā)明的一部分內(nèi)容。
本發(fā)明的另一個(gè)目的包括含有上述任何核酸序列的重組載體，特別是含有CanIon調(diào)節(jié)序列或編碼CanIon蛋白質(zhì)的序列的重組載體，以及含有所述核酸序列或重組載體的細(xì)胞宿主和轉(zhuǎn)基因非人動物。
本發(fā)明還涉及CanIon基因的雙等位基因標(biāo)記及其應(yīng)用。
最后，本發(fā)明涉及可調(diào)節(jié)CanIon表達(dá)或活性的物質(zhì)或分子的篩選方法，以及與CanIon多肽反應(yīng)的物質(zhì)或分子的篩選方法。同時(shí)提供了在這些方法中用于鑒定物質(zhì)的方法。例如，提供了用CanIon通道拮抗劑治療或預(yù)防精神分裂癥或雙極精神妨礙(bipolar)疾病或病癥的方法。
因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種分離、純化或重組的多核苷酸，它包含如SEQ ID NO1-4或6所示的任何核苷酸序列，或任何這些序列的互補(bǔ)序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離、純化或重組的多核苷酸，它包含SEQ ID NO4中至少50個(gè)核苷的毗鄰鏈，其中所述多核苷酸編碼具有生物學(xué)活性的CanIon多肽。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離、純化或重組的多核苷酸，它編碼的人CanIon多肽包含SEQ ID NO5的氨基酸序列或其生物學(xué)活性片段。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所描述的多核苷酸都附著在一固體支持物上。在另一實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含一標(biāo)記。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸陣列，它包含至少一種本文所述的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述陣列是可尋址的。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種重組載體，它包含與啟動子可操作性連接的本文所述的多核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸在細(xì)胞中的存在會造成CanIon基因表達(dá)水平的變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸插入CanIon基因中，或插入CanIon基因組區(qū)域中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸插入CanIon基因啟動子中。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是通過同源重組插入的，例如通過置換內(nèi)源CanIon啟動子或增強(qiáng)子區(qū)域的一個(gè)或多個(gè)元件而插入。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所述重組載體或多核苷酸的宿主細(xì)胞或非人的宿主動物。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種哺乳動物宿主細(xì)胞或非人宿主哺乳動物，它包含敲除載體的同源重組而受到破壞的CanIon基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，此宿主細(xì)胞含有本文所述的多核苷酸。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離、純化或重組的多肽，它包含如SEQ ID NO5所示的氨基酸序列，或其生物學(xué)活性片段。
在另一方面，本發(fā)明提供了制造多肽的方法，所述方法包括a)提供含有編碼如權(quán)利要求13所述多肽的多核苷酸的細(xì)胞群，所述多核苷酸與啟動子可操作連接；b)在所述細(xì)胞中可制造所述多肽的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞群；以及c)體化所述細(xì)胞群產(chǎn)生的所述多肽。
在另一方面，本發(fā)明提供了使抗CanIon的抗體與CanIon多肽結(jié)合的方法，所述方法包括，在所述抗體可與所述多肽特異性結(jié)合的條件下使所述抗體與本文所描述的CanIon多肽接觸。在另一方面，還提供了特異性識別CanIon蛋白質(zhì)或表位的抗體或其免疫學(xué)活性片段。
在另一方面，本發(fā)明提供了檢測細(xì)胞中CanIon基因的表達(dá)的方法，所述方法包括以下步驟a)使所述細(xì)胞或所述細(xì)胞的提取物與以下之一物質(zhì)接觸i)能在嚴(yán)格條件下與本文所述CanIon多核苷酸雜交的多核苷酸；或ii)能特異性結(jié)合本文所述CanIon多肽的多肽；以及b)檢測所述多核苷酸與所述細(xì)胞或提取物的RNA之間雜交存在與否，或者檢測所述多肽與所述細(xì)胞或提取物的蛋白質(zhì)的結(jié)合存在與否；其中，檢測到所述雜交或所述結(jié)合的存在，表明所述CanIon基因在所述細(xì)胞中被表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸是引物，所述雜交是通過檢測包含所述引物的序列擴(kuò)增產(chǎn)物的存在而測得的。在另一個(gè)實(shí)施方案中所述多肽是抗體，例如，抗CanIon抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供了鑒定候選CanIon多肽調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)使本文所述CanIon多肽與測試化合物接觸；以及b)確定所述化合物是否與所述多肽是否特異性結(jié)合；其中，測到所述化合物與所述多肽特異性結(jié)合表明所述化合物是所述CanIon多肽的候選調(diào)節(jié)劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，此方法還包括在所述候選調(diào)節(jié)劑存在時(shí)測定所述CanIon多肽的生物學(xué)活性的變化，其中，當(dāng)所述候選調(diào)節(jié)劑存在時(shí)與所述候選調(diào)節(jié)劑不存在時(shí)所述CanIon多肽生物學(xué)活性的變化說明此候選調(diào)節(jié)劑是所述CanIon多肽的調(diào)節(jié)劑。
在另一方面，本發(fā)明提供了鑒定CanIon多肽調(diào)節(jié)劑的方法，所述方法包括a)使本文所述的CanIon多肽與測試化合物接觸；和b)在所述化合物存在和不存在時(shí)檢測所述多肽的活性；其中，當(dāng)所述化合物存在時(shí)與所述化合物不存在時(shí)所檢測到的所述活性的差異表明所述化合物是所述CanIon多肽的調(diào)節(jié)劑。
在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽存在于細(xì)胞或細(xì)胞膜中，所述生物學(xué)活性包括電壓門控通道活性。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括a)用本文所描述的方法鑒定CanIon多肽的調(diào)節(jié)劑；以及b)將所述調(diào)節(jié)劑與生理學(xué)可接受的載體組合。還提供了使用所述藥物組合物的方法。
還提供了這里所描述的CanIon調(diào)節(jié)劑、多肽、多核苷酸或抗體在藥物制備中的應(yīng)用，例如，治療人體或治療本文所述的疾病或癥狀。
還提供了在體外或體內(nèi)使用和檢測CanIon多核苷酸和多肽存在的試劑盒。
附圖簡述

圖1是含有CanIon基因的染色體13q區(qū)域的BAC圖譜。
圖2是示范性計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的框圖。
圖3是一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，步驟200將新的核苷或蛋白質(zhì)序列與序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，以確定新序列和數(shù)據(jù)庫中序列的同源性水平。
圖4是一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，計(jì)算機(jī)中的步驟250用來確定兩個(gè)序列是否是同源的。
圖5是一個(gè)實(shí)施方案的流程圖，步驟300用來檢測序列中某一特征的存在情況。
簡要說明序列表中提供的序列SEQ ID No 1含有CanIon的基因組序列，包含5’調(diào)節(jié)區(qū)(上游非轉(zhuǎn)錄區(qū))和外顯子1-7。
SEQ ID No 2含有CanIon的基因組序列，包含外顯子8-27。
SEQ ID No 3含有CanIon的基因組序列，包含外顯子28-44和3’調(diào)節(jié)區(qū)(下游非轉(zhuǎn)錄區(qū))。
SEQ ID No 4含有CanIon的cDNA序列。
SEQ ID No 5含有由SEQ ID NO 4的cDNA編碼的氨基酸序列。
SEQ ID No 6含有擴(kuò)增子的核苷酸序列，包含雙等位基因標(biāo)記A18。
SEQ ID NO 7含有一個(gè)引物，它包含實(shí)施例2所述的附加PU 5’序列。
SEQ ID NO 8含有一個(gè)引物，它包含實(shí)施例2所述的附加RP 5’序列。
根據(jù)序列表的規(guī)則，以下代碼被用于序列表以指明序列中雙等位基因標(biāo)記的位置并鑒定在多態(tài)性堿基中存在的各個(gè)等位基因。代碼“r”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是鳥嘌呤，而另一個(gè)等位基因是腺嘌呤。代碼“y”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是胸腺嘧啶，而另一個(gè)等位基因是胞嘧啶。代碼“m”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是腺嘌呤，而另一個(gè)等位基因是胞嘧啶。代碼“k”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是鳥嘌呤，而另一個(gè)等位基因是胸腺嘧啶。代碼“s”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是鳥嘌呤，而另一個(gè)等位基因是胞嘧啶。代碼“w”在序列中表示多態(tài)性堿基的一個(gè)等位基因是腺嘌呤，而另一個(gè)等位基因是胸腺嘧啶。各個(gè)雙等位標(biāo)記初始等位基因的核苷代碼如下雙等位標(biāo)記初始等位基因5-124-273 A(例如)某些情況下，雙等位基因標(biāo)記的多態(tài)性堿基會改變編碼多肽中氨基酸的相同性。這在附加的序列表中用特征VARIANT表示，在多態(tài)性氨基酸位點(diǎn)用Xaa代替，并將Xaa定義為兩個(gè)可互換的氨基酸。例如，如果雙等基因位標(biāo)記的一個(gè)等位基因是密碼子CAC，它編碼組氨酸，而此雙等位基因標(biāo)記的另一個(gè)等位基因是CAA，它編碼谷氨酸，則編碼多態(tài)的序列表將在此多態(tài)性氨基酸位置含Xaa。這時(shí)，Xaa被定義為組氨酸或谷氨酸。
在其它情況下，Xaa可表示由于核苷酸序列的雙關(guān)性而多份不知道的氨基酸。這時(shí)用特征UNSURE表示，在未知的氨基酸位點(diǎn)用Xaa代替，并將Xaa定義為20種氨基酸或遺傳密碼暗示的有限數(shù)目的氨基酸中的任何一種。
詳細(xì)描述綜合家族成員的精神分裂癥和雙極情感障礙、從雙胞胎和收養(yǎng)研究所得的證據(jù)以及全球發(fā)病沒有差異這些現(xiàn)象，都表明雖然環(huán)境危險(xiǎn)因子在一定程度上是必要、充分或互相作用的原因，但精神分裂癥和雙極情感障礙主要還是遺傳狀況。例如，普通人群1％會發(fā)生精神分裂癥，但若一個(gè)人的祖父母有精神分裂癥，則他患此病的危險(xiǎn)增大至約3％；若父母一方有精神分裂癥，則他患病的危險(xiǎn)增大至約10％；若父母雙方都有精神分裂癥，則他患病的危險(xiǎn)增大至約40％。
鑒定涉及特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如精神分裂癥等特定性狀(trait)的基因，可通過目前用于基因作圖的兩種主要策略進(jìn)行，它們是連鎖分析(linkage analysis)和相關(guān)性研究(association studies)。連鎖分析需要研究其成員有多人患病的家族，這種研究現(xiàn)在用于檢測單基因基因或寡基因固有性狀。與之相反，相關(guān)性研究檢查與性狀陰性(T-)對照相比，無親戚關(guān)系的性狀(T+)個(gè)體的標(biāo)記等位基因的頻率，這種研究通常用于檢測多基因遺傳。
遺傳連接或“連鎖”根據(jù)對染色體上兩個(gè)相鄰序列在減數(shù)分裂過程中通過交換含有最少重組的一個(gè)序列的分析。要進(jìn)行這種分析，已將諸如微衛(wèi)星標(biāo)記等染色體標(biāo)記精確定位于基因組上。遺傳連鎖分析根據(jù)系統(tǒng)樹、疾病的傳遞和標(biāo)記的傳遞計(jì)算帶有所用染色體標(biāo)記的靶基因重組的概率。因此，如果某給定標(biāo)記的特定等位基因與疾病一起傳遞的頻率比帶有該等位基因(重組水平在0和0.5之間)的機(jī)會要多，就可以推斷在該標(biāo)記附近可找到此靶基因。用這種技術(shù)可以確定一些表示家族性癌癥遺傳傾向性基因的位置。為了能包括在遺傳連鎖研究中，受該疾病遺傳影響的家族成員必須符合“信息性”標(biāo)準(zhǔn)每一代有數(shù)個(gè)成員患病(可獲得其結(jié)構(gòu)DNA)，而且該家族最好有眾多兄弟姐妹。
以前的連鎖研究結(jié)果支持染色體13可能在13q32上隱藏有一個(gè)精神分裂癥易感性基因座的假設(shè)(Blouin JL等，1998，Nature Genetics，2070-73；Lin MW等，Hum.Genet.，99(3)417-420，1997；Brzustowicz等，Am.J.Hum.Genet.651096-1103(1999))。然而，盡管連鎖分析是檢測性狀有關(guān)基因的有力方法，但其分辨率通常不可能超過兆堿基水平，通常需要進(jìn)行互補(bǔ)研究以細(xì)化對最初用這種方法鑒定的區(qū)域的分析。
采用位于染色體13q31-q33區(qū)的27個(gè)公共序列標(biāo)記位點(diǎn)(STSs)構(gòu)建了覆蓋染色體13q31-q33基因座的候選基因組區(qū)的細(xì)菌人工染色體(BAC)重疊群(contig)，以便篩選一個(gè)7種基因組相當(dāng)?shù)膶Ｓ蠦AC文庫。從這些材料產(chǎn)生了新的STS，使得能構(gòu)建該區(qū)的密集型物理圖譜。通過原位染色體雜交確定BACs的大小并繪圖，以供驗(yàn)證。最小的一組BACs已被鑒定并全部測序，產(chǎn)生幾種重疊群導(dǎo)致一個(gè)4Mb以上的重疊群的最終構(gòu)建物。此圖譜的構(gòu)建導(dǎo)致對CanIon基因的鑒定，定位于與精神分裂癥明顯連鎖的基因組區(qū)域中。
CanIon氨基酸序列的特征是CACHANNEL，一種有7個(gè)元件的指紋，它為鈣通道的α-1亞基提供了信號(Ref.PR00167，BLOCKs+數(shù)據(jù)庫)。該指紋衍生自6個(gè)序列的最初排列對比這些基序出自能夠區(qū)別這些通道和其它陽離子通道的保守環(huán)區(qū)；基序1和2編碼跨膜區(qū)段4和5以及5和6之間的部分(第一次內(nèi)部重復(fù))；基序3相應(yīng)于重復(fù)1的區(qū)段6和重復(fù)2的區(qū)段1之間的部分；基序4編碼重復(fù)2的區(qū)段5和6之間的部分；基序5相應(yīng)于重復(fù)3的區(qū)段6和重復(fù)4的區(qū)段1之間的部分；基序6和7編碼區(qū)段4和5之間以及重復(fù)4區(qū)段的5和6之間的部分。
圖1顯示了覆蓋所關(guān)注的包含CanIon基因的染色體13區(qū)域的BAC重疊群，并顯示了與連鎖研究中最為重要的遺傳標(biāo)記有關(guān)的CanIon基因在基因組上的位置。特別地，Blouin等(1998)用452微衛(wèi)星標(biāo)記物在54個(gè)復(fù)雜系譜上對精神分裂癥的易感性基因座進(jìn)行了基因組的廣泛掃描。發(fā)現(xiàn)家族精神分裂癥之間最顯著的連鎖在染色體13q32上標(biāo)記D13S174附近。Brzustowics等(1999)估計(jì)在21個(gè)加拿大家族中微衛(wèi)星標(biāo)記物跨越染色體8和13。在每個(gè)分析模型中產(chǎn)生正的LOD記分的染色體13q區(qū)域中的標(biāo)記物，采用了常染色體顯性和隱性以及狹義和廣義的精神分裂癥定義。在隱性-廣義模型下，用標(biāo)記物D13S793得到了最大的三點(diǎn)LOD記分在重組部分(θ)為3.92，同質(zhì)性下為0.1，和異質(zhì)性下當(dāng)α＝0.65且θ＝0時(shí)為4.42。參考圖1，CanIon基因部分位于標(biāo)記為‘區(qū)域E’的重疊群上，部分位于標(biāo)記為C0001A10的重疊群上。CanIon基因側(cè)接有兩個(gè)在連鎖研究中意義最為重要的標(biāo)記。標(biāo)記D13S174也位于重疊群C0001A10上，而標(biāo)記D13S793大致位于距CanIon基因3.5Mb的著絲粒上。
目前迫切需要鑒定涉及精神分裂癥、雙極情感障礙以及其它CNS和心血管疾病和癥狀的基因。同時(shí)也需要鑒定涉及這些疾病的新離子通道。這些基因和蛋白質(zhì)在治療精神分裂癥、雙極情感障礙、或其它CNS癥狀以及其它諸如心臟病和高血壓等癥狀中可能提供新的干預(yù)點(diǎn)，而且可以進(jìn)一步研究和特征分析CanIon基因和其相關(guān)生物途徑。認(rèn)識這些基因和涉及這些疾病和癥狀的有關(guān)生物途徑使研究人員能了解精神分裂癥和雙極情感障礙的病原，從而研究出針對這些病因的藥物和治療方案。例如，阻斷CanIon通道的化合物可用于治療任何疾病或癥狀，優(yōu)選精神分裂癥或雙極情感障礙，以及疼痛病、癲癇和各種心血管疾病，如心律失常、心絞痛和高血壓。也急切需要檢測對精神分裂癥、雙極情感障礙和其它癥狀易感性以及預(yù)防或隨訪這些疾病演化的新方法。診斷工具可能也證明極其有用。的確，例如，早鑒定出有產(chǎn)生精神分裂癥危險(xiǎn)的人，就可以早期和/或預(yù)防性給藥。而且，準(zhǔn)確評估藥物的效能以及病人對藥物的耐受性可使臨床醫(yī)生提高精神分裂癥和雙極情感障礙治療方案的效益/風(fēng)險(xiǎn)比。
本發(fā)明涉及與CanIon基因有關(guān)的多核苷酸和多肽。與CanIon的基因組或cDNA序列特異性雜交的寡核苷酸探針和引物也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一個(gè)目的包括含有任何本發(fā)明所述核酸序列的重組載體，尤其是含有CanIon調(diào)節(jié)區(qū)或編碼CanIon蛋白的序列的重組載體，以及含有所述核酸序列或重組載體的細(xì)胞宿主。本發(fā)明還包括能夠調(diào)節(jié)CanIon基因或蛋白質(zhì)表達(dá)或活性的分子的篩選方法，以及使用這些分子治療或預(yù)防精神分裂癥、雙極感情障礙、或任何其它疾病或癥狀的方法。本發(fā)明還涉及特異性抗這種多肽的抗體，可用作診斷試劑。
本發(fā)明還涉及CanIon相關(guān)的雙等位基因標(biāo)記以及它們在遺傳分析分析中的應(yīng)用，這些方法包括家族連鎖分析、人群連鎖失平衡研究以及病例一對照人群的相關(guān)性研究。本發(fā)明一個(gè)重要的方面是，雙等位基因標(biāo)記使得能進(jìn)行相關(guān)性研究以鑒定與復(fù)雜性狀有關(guān)的基因的作用。
定義在詳細(xì)敘述本發(fā)明之前，下面給出一些定義說明和限定了闡述本發(fā)明所用的術(shù)語的含義和范圍。
本文所用的術(shù)語“CanIon基因”包括編碼CanIon蛋白質(zhì)的基因組、mRNA和cRNA序列，包括基因組DNA的非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)。
本文所用的術(shù)語“異源蛋白質(zhì)”意指除CanIon蛋白質(zhì)以外的任何蛋白質(zhì)或多肽。例如，異源蛋白質(zhì)可以是用CanIon調(diào)節(jié)區(qū)進(jìn)行的另外一些實(shí)驗(yàn)中作為標(biāo)記的一種化合物。
術(shù)語“分離的”要求物質(zhì)與其來源環(huán)境(例如，若物質(zhì)是天然存在的，即為其天然環(huán)境)分開。例如，天然存在于活動物中的多核苷酸或多肽不是分離的，但自天然系統(tǒng)中部分或全部共存物質(zhì)分離出來的同一些多核苷酸或DNA或多肽是分離的。這些多核苷酸可以是載體的一部分和/或這些多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，由于載體或組合物不屬于天然環(huán)境的一部分，故這些多核苷酸仍然是分離的。
例如，天然存在于有活動物中的多核苷酸不是分離的，但自天然系統(tǒng)中部分或全部共存物質(zhì)分離出來的同一些多核苷酸或多肽是分離的。特別排除在定義“分離的”之外的是天然存在的染色體(如染色體擴(kuò)散)、人工染色體文庫、基因組文庫及作為體外核酸制品或作為轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞制品存在的cDNA文庫，其中宿主細(xì)胞是體外異質(zhì)制品或作為單個(gè)克隆的異質(zhì)群體而被接種。特別還將上述文庫中其特定多核苷酸占載體分子中核酸插入片段數(shù)小于5％的文庫排除在外。定義“分離的”還尤其不包括全細(xì)胞基因組DNA或全細(xì)胞RNA制品(包括用機(jī)械剪切或酶消化的所述全細(xì)胞制品)?！胺蛛x的”還特別不包括以上所述作為體外制品或通過電泳(包括印跡轉(zhuǎn)移)分離的異質(zhì)性混合物的全細(xì)胞制品，其中本發(fā)明的多核苷酸沒有與電泳媒體中的異源多核苷酸作進(jìn)一步分離(例如，從瓊脂糖凝膠或尼龍印跡的異質(zhì)性條帶群切理一條條帶作進(jìn)一步分離)。
本文所用的術(shù)語“純化的”不要求絕對純；它只作為一個(gè)相對定義。初始材料或天然材料的純化至少是一個(gè)數(shù)量級，優(yōu)選使用兩或三個(gè)數(shù)量級，最好是四或五個(gè)數(shù)量級。例如，從0.1％濃度到純度至10％濃度是兩個(gè)數(shù)量級。為了便于說明，已經(jīng)將與cDNA文庫分離的個(gè)體cDNA克隆用常規(guī)方法純化至電泳均一性。由這些克隆所得的序列不能直接從文庫或整個(gè)人的DNA制得。這些cDNA克隆不是天然存在的，而是通過局部純化天然存在的物質(zhì)(信使RNA)而制得。mRNA轉(zhuǎn)化為cDNA文庫涉及產(chǎn)生合成物質(zhì)(cDNA)，而純的個(gè)體cDNA克隆可通過克隆選擇從該合成文庫分離得到。所以，從信使RNA產(chǎn)生cDNA文庫以及然后從該文庫分離個(gè)體克隆導(dǎo)致天然信使純化大約104-106倍。
本文所用的術(shù)語“純化的”還描述與其它化合物分離的本發(fā)明的多肽或多核苷酸，包括但不限于多肽或多核苷酸、碳水化合物、脂質(zhì)等。術(shù)語“純化的”可用于指定與寡聚形式，如同質(zhì)或異質(zhì)二聚體、三聚體等分離的本發(fā)明的單聚多肽。術(shù)語“純化的”也可用于指定與線性多核苷酸分離的共價(jià)連接的多核苷酸。當(dāng)一個(gè)多核苷酸樣品的至少大約50％，最好60-75％具有單一多核苷酸序列和構(gòu)象(線性對共價(jià)封閉)時(shí)，該多核苷酸基本上是純的?；炯兊亩嚯幕蚨嗪塑账嵬ǔ７謩e約占多肽或多核苷酸樣品的50％，最好為60-90％(重量/重量)，更常見的是純度約為95％，最好是99％以上。眾所周知，多肽或多核苷酸純度或均一度有許多方式測定，如先對樣品進(jìn)行瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后觀察到凝膠染色后為單一條帶。對于某些目的，采用高效液相層析法或本技術(shù)領(lǐng)域熟知的其它方法可獲得高分辨率。作為另一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的多肽或多核苷酸的純度“至少”可表示為相對異質(zhì)性多肽和多核苷酸(DNA、RNA或二者)的一種純度百分比。作為一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，本發(fā)明的多肽或多核苷酸分別相對異質(zhì)性多肽或多核苷酸的純度至少為10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％、100％。作為另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，此多肽或多核苷酸的純度分別相對異質(zhì)性多肽或多核苷酸為90％和100％之間小數(shù)位至第千位的任何一個(gè)數(shù)字的范圍內(nèi)變化(例如，多肽或多核苷酸的純度至少99.995％)，或表示為相對于除運(yùn)載體中的化合物和分子以外的全部化合物和分子的重量/重量比。本發(fā)明權(quán)利要求以每個(gè)小數(shù)位至第千位表示一個(gè)純度百分比的數(shù)字表示的各種純度。
術(shù)語“多肽”指氨基酸的聚合物，不論其長度如何；所以，肽、寡肽和蛋白質(zhì)都包括在多肽的定義中。該術(shù)語也不限于或不排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，與糖基、乙?；?、磷酸基、脂類基團(tuán)等共價(jià)連接的多肽明確包括在術(shù)語多肽中。在該定義內(nèi)還包括含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(例如，包括非天然存在的氨基酸、只在不相關(guān)生物系統(tǒng)中存在的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)經(jīng)修飾的氨基酸等)的多肽、帶有取代鍵以及本領(lǐng)域知道的其它修飾的多肽，無論是天然存在或非天然存在。
本文所用的術(shù)語“重組多肽”指人為設(shè)計(jì)和包括至少兩個(gè)多肽序列的多肽，這兩個(gè)多肽序列作為相鄰多肽序列在初始天然環(huán)境中是找不到的，或者指由重組多核苷酸表達(dá)的多肽。
本文所用的術(shù)語“非人動物”指任何不是人的脊椎動物、鳥類，和更通常指哺乳動物，最好是靈長目動物、家禽，如豬、山羊、綿羊、驢和馬、家兔或者嚙齒目動物，最好是大鼠或小鼠。本文所用的術(shù)語“動物”用于指任何脊椎動物，最好是哺乳動物。術(shù)語“動物”和“哺乳動物”明確包括人，除非前面帶有術(shù)語“非人動物”。
本文所用的術(shù)語“抗體”指由至少一個(gè)結(jié)合區(qū)(binding domain)組成的多肽或多肽群，其中抗體結(jié)合區(qū)通過抗體分子的可變區(qū)折疊而形成，與內(nèi)表面的形狀和電荷分布形成三維結(jié)合空間，該空間與抗原的抗原決定簇的特征互補(bǔ)，可以與抗原進(jìn)行免疫反應(yīng)?？贵w包括重組蛋白質(zhì)，其包括結(jié)合區(qū)，以及片段，而片段包括Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’)2片段。
本文所用的“抗原決定簇”是決定抗原—抗體反應(yīng)特異性的抗原分子的一部分，在本發(fā)明指CanIon多肽。“表位”指多肽的抗原決定簇。一個(gè)表位在空間構(gòu)象中可包括至少3個(gè)氨基酸，此空間構(gòu)象對該表位是唯一的。通常，一個(gè)表位包括至少6個(gè)氨基酸，較常見包括至少8-10個(gè)氨基酸。確定組成表位的氨基酸的方法包括X射線結(jié)晶圖；、二維核磁共振及表位作圖法，例如Geysen等(1984年)、PCT
發(fā)明者D·科恩, I·丘馬科弗, A·－M·西蒙, H·阿布德雷希姆 申請人:塞羅諾遺傳研究所股份有限公司