專利名稱：評(píng)估施用自身或者其代謝中間物被ugt1a1酶代謝的化合物引起嚴(yán)重毒性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過分析編碼參與藥物新陳代謝的酶的基因的多態(tài)性，評(píng)估藥物的不良藥物反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法。本發(fā)明也涉及用于評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒。而且，本發(fā)明涉及根據(jù)藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估結(jié)果降低藥物的不良藥物反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法。
更具體地，本發(fā)明涉及通過分析編碼UGT的基因的多態(tài)性，評(píng)估化合物施用引起藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，該化合物或者本身被UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)新陳代謝，或其代謝中間物被UGT新陳代謝；還涉及評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，及降低藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法。
背景技術(shù)：
在人類中有兩種類型的UDP-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)，UGT1和UGT2，UGT1家族由一個(gè)基因以及多個(gè)啟動(dòng)子和與共同外顯子2進(jìn)行拼接的第一外顯子組成(Ritter，J.K.，Chen，F(xiàn).，Sheen，Y.Y.，Tran，H.M.，Kimura，S.，Yeatman，M.T.，和Owens，I.S.，J.Biol.Chem.，2673257-3261，1992)。因此，酶的底物特異性取決于第一外顯子。
UGT1家族之一的UGT1A1基因由啟動(dòng)子和最接近外顯子2到5的第一外顯子組成。
主要負(fù)責(zé)綴合膽紅素的UGT1A1酶能使藥物(例如乙炔基雌二醇)、異生物素化合物(例如，酚，蒽醌和黃酮)和內(nèi)源類固醇葡糖醛酸化(Senafi，S.B.，Clarke，D.J.，Bruchell，B.，Biochem.J.，303233-240，1994)。目前，已知在啟動(dòng)子區(qū)和外顯子中有可以降低酶活性和引起體質(zhì)性未結(jié)合型黃疸、克-納(Crigler-Najjar)綜合癥或吉爾伯特病(Gilbert’s)綜合癥的不少于30種遺傳多態(tài)性(Mackenzie，P.I.，等，Pharmacogenetics，7255-269，1997)。最近的體外分析表明UGT1A1同工型負(fù)責(zé)SN-38的葡糖醛酸化，而且此遺傳多態(tài)性與降低的SN-38葡糖醛酸化活性及膽紅素葡糖醛酸化活性有關(guān)(Iyer，L.，等，J.Clin.Invest.，101847-854，1998，Iyer，L.，等，Clin.Pharmacol.Ther.，65576-582，1999)。此外，本發(fā)明人提出了根據(jù)UGT1A1基因型的不同，個(gè)體間在SN-38和SN-38葡糖苷酸的藥物代謝動(dòng)力學(xué)方面存在差異(Ando，Y.，Saka，H.，Asai，G.，Sugiura，S.，Shimokata，K.，和Kamataki，T.，Ann.Oncol.，9845-847，1998)。
中間代謝物被UGT1A1酶代謝(綴合)的化合物之一是依立替康(irinotecan)(CPT-11)。羧酸酯酶使依立替康代謝形成活性的SN-38，SN-38進(jìn)一步與UGT1A1綴合并被解毒產(chǎn)生其β-葡糖苷酸。然后葡糖苷酸通過膽汁排泄到小腸，細(xì)菌葡糖醛酸酶分解此葡糖苷酸為前體SN-38和葡糖醛酸(Takasuna，K.，Hagiwara，T.，Hirohashi，M.，Kato，M.，Nomura，M.，Nagai，E.，Yokoi，T.，和Kamataki，T.，Cancer Res.，563752-3757，1996)。SN-38藥物代謝動(dòng)力學(xué)的個(gè)體間差異被認(rèn)為可以引起藥物效果的變化(Gupta，E.，Lestingi，T.M.，Mick，R.，Ramirez，J.，Vokes，E.E.，和Ratain，M.J.，Cancer Res.，543723-3725，1994，Kudoh，S.，F(xiàn)ukuoka，M.，Masuda，N.，Yoshikawa，A.，Kusunoki，Y.，Matsui，K.，Negoro，S.，Takifuji，N.，Nakagawa，K.，Hirashima，T.，Yana，T.，和Takada，M.，Jap.J.Cancer Res.，86406-413，1995)。
依立替康是喜樹堿類似化合物，而且，已知其通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I具有強(qiáng)的抗腫瘤活性。盡管現(xiàn)在，特別是對(duì)于結(jié)腸直腸癌和肺癌治療，廣泛使用依立替康，但是存在對(duì)引起白細(xì)胞減少和/或腹瀉的依立替康劑量限制性毒性的擔(dān)憂(Negoro，S.等，J.Natl.Cancer Inst.，831164-1168，1991，Akabayashi，A.，Lancet，350124，1997，Pharmaceuticals and CosmeticsDivision，Pharmaceutical Affairs Bureau，Ministry of Health andWelfare(編輯)，Summary basis of Approval(SBA)NO.1(修訂版)irinotecan hydrochloride.TokyoYakuji Nippo，Ltd.，1996)。依立替康的藥物不良反應(yīng)偶爾是致命的(Rougier，P等，Lancet，3521407-1412，1998，Kudoh，S.等，J.Clin.Oncol.，161068-1674，1998，Masuda，N.等，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，18459a，1999，Negoro，S.等，J.Natl.Cancer Inst.，831164-1168，1991)，而且，在依立替康臨床試驗(yàn)期間，實(shí)際上據(jù)報(bào)告1245例患者中有55例因依立替康藥物不良反應(yīng)而死亡(Akabayashi，A.，Lancet，350124，1997，Pharmaceuticals and Cosmetics Division，PharmaceuticalAffairs Bureau，Ministry of Health and Welfare(主編)，Summary Basis ofApproval(SBA)No.1(修訂版)irinotecan hydrochloride.TokyoYakujiNippo，Ltd.，1996)。
Retain等建議了一種通過利用可以增強(qiáng)UGT活性的化合物降低依立替康藥物不良反應(yīng)的方法(美國專利號(hào)5786344)。
發(fā)明的公開如上所述，其代謝與UGT1A1酶有關(guān)的藥物的不良藥物反應(yīng)是一個(gè)嚴(yán)重問題。然而，沒有評(píng)估這種藥物不良反應(yīng)的已知有效方法。另一方面，因?yàn)樵诎┌Y化療中在許多情況下會(huì)限制治療指數(shù)，所以根據(jù)個(gè)體制定藥物劑量以降低藥物的不良反應(yīng)及增強(qiáng)其效果變得非常重要。
鑒于這種情況，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供降低化合物，如依立替康的施用的藥物不良反應(yīng)的劃時(shí)代方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝。即，本發(fā)明的目的是提供評(píng)估由化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝；利用該方法的試劑盒；降低化合物的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法。
為了解決上述問題，本發(fā)明人致力于研究編碼UGT1A1酶的基因的多態(tài)性。更具體地，調(diào)查研究了在癌癥化療期間接受依立替康給藥的患者的UGT1A1基因多態(tài)性與依立替康藥物不良反應(yīng)間的相關(guān)性。特別地，研究了UGT1A1基因的啟動(dòng)子區(qū)、外顯子1、外顯子4和外顯子5中的多態(tài)性。結(jié)果，認(rèn)識(shí)到依立替康藥物不良反應(yīng)和多態(tài)性間的相關(guān)性，所述多態(tài)性為由于啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)目的不同引起的多態(tài)性或由于外顯子1中的單堿基置換(211位置的堿基，686位置的堿基)引起的兩種多態(tài)性。這些發(fā)現(xiàn)表明在UGT1A1基因的這些多態(tài)性與化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)程度之間存在相關(guān)性，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝。因此，分析這些UGT1A1基因多態(tài)性被認(rèn)為是評(píng)估化合物，如依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的有效方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝。特別地，對(duì)于啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性和由于外顯子1中686位置堿基置換引起的多態(tài)性，認(rèn)識(shí)到這些多態(tài)性的每一個(gè)都單獨(dú)地與依立替康藥物不良反應(yīng)具有相關(guān)性，因此，這兩個(gè)多態(tài)性的分析被認(rèn)為可以獨(dú)立地成為評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的有效方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝。本發(fā)明是根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)和研究結(jié)果進(jìn)行的，有下列特征1、評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法包括至少(a)分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的步驟。
2、如1的方法，其中分析TA重復(fù)數(shù)的步驟是檢測TA重復(fù)數(shù)為5到8之任何一個(gè)的步驟。
3、如1的方法，其中分析TA重復(fù)數(shù)的步驟是檢測TA重復(fù)數(shù)為6或7的步驟。
4、如1到3任一項(xiàng)的方法，其中進(jìn)一步包括擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)區(qū)的DNA的步驟。
5、如1到4任一項(xiàng)的方法，其是評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法進(jìn)一步包括(b)分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的步驟，和/或(c)分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的步驟。
6、如5的方法，其中分析核苷酸第686位堿基的步驟是分析是否核苷酸第686位堿基是胞嘧啶或腺嘌呤的步驟。
7、如5的方法，其中分析核苷酸第211位堿基的步驟是分析是否核苷酸第211位堿基是鳥嘌呤或腺嘌呤的步驟。
8、如5到7任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括步驟擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA，和/或含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的DNA。
9、評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法包括至少(b)分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的步驟。
10、如9的方法，其中分析核苷酸第686位堿基的步驟是分析是否核苷酸第686位堿基是胞嘧啶或腺嘌呤的步驟。
11、如9或10的方法，其中進(jìn)一步包括擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA的步驟。
12、如1到11任一項(xiàng)的方法，其中化合物是喜樹堿類似化合物。
13、如12的方法，其中喜樹堿類似化合物是喜樹堿衍生物。
14、如13的方法，其中喜樹堿衍生物是拓?fù)涮婵?topotecan)或依立替康。
15、如13的方法，其中喜樹堿衍生物是依立替康。
16、制定化合物劑量的方法，其包括步驟根據(jù)1到15任一項(xiàng)的評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法的結(jié)果制定化合物的劑量。
17、用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的TA重復(fù)區(qū)堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8通過PCR方法擴(kuò)增。
18、用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的TA重復(fù)區(qū)堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10通過PCR方法擴(kuò)增。
19、用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通過PCR方法擴(kuò)增。
20、用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通過PCR方法擴(kuò)增。
21、評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述試劑盒包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸。
22、如21的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，和/或用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸。
23、評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述試劑盒包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸。
24、如21到23任一項(xiàng)的試劑盒，其中化合物是喜樹堿類似化合物。
25、如24的試劑盒，其中喜樹堿類似化合物是喜樹堿衍生物。
26、如25的試劑盒，其中喜樹堿衍生物是拓?fù)涮婵?topotecan)或依立替康。
27、如25的試劑盒，其中喜樹堿衍生物是依立替康。
28、預(yù)先評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其包括至少(a)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，或(b)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸。
29、如28的試劑盒，其是評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸。
30、評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其包括至少(a)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，或(b)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，并且其進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)區(qū)的DNA、或含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA的試劑。
31、如30的試劑盒，其是用于評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸和用于擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的DNA的試劑。
附圖簡述

圖1是概述實(shí)施例中分析的UGT1A1基因多態(tài)性的表。211G→A表示在位置211處腺嘌呤置換鳥嘌呤，686C→A表示在位置686處腺嘌呤置換胞嘧啶，1099C→G表示在位置1099處鳥嘌呤置換胞嘧啶，和1456T→G表示在位置1456處鳥嘌呤置換胸腺嘧啶。此外，G71R表示在密碼子71位精氨酸置換甘氨酸，P229Q表示在密碼子229位谷氨酰胺置換脯氨酸，R367G表示在密碼子367位甘氨酸置換精氨酸，和Y486D表示天冬氨酸置換酪氨酸。
圖2是概述患者臨床信息的表，這些患者是實(shí)施例中的受試者?！癮”基于日本臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)(Japan Society of Clinical Oncology)的標(biāo)準(zhǔn)。此外，“b”表示卡方檢驗(yàn)的結(jié)果，“c”表示Mann-Whitney U檢驗(yàn)的結(jié)果。
圖3是概述患者的依立替康化療信息的表，這些患者是實(shí)施例中的受試者。a日本臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)(Japan Society of Clinical Oncology)的標(biāo)準(zhǔn)，b卡方檢驗(yàn)，c費(fèi)希爾確切檢驗(yàn)(Fisher’s Exact test)。
圖4是概述基因型分布的表。6/6表示TA重復(fù)數(shù)是6的等位基因的純合子，6/7表示TA重復(fù)數(shù)是6的等位基因和TA重復(fù)數(shù)是7的等位基因的雜合子，和7/7表示TA重復(fù)數(shù)是7的等位基因的純合子。Gly/Gly表示71位密碼子是甘氨酸的等位基因的純合子，Gly/Arg表示71位密碼子是甘氨酸的等位基因和71位密碼子是精氨酸的等位基因的雜合子，Arg/Arg表示71位密碼子是精氨酸的等位基因的純合子。Pro/Pro表示229位密碼子是脯氨酸的等位基因的純合子，Pro/Gln表示229位密碼子是脯氨酸的等位基因和229位密碼子是谷氨酰胺的等位基因的雜合子。a日本臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)(Japan Society of Clinical Oncology)的標(biāo)準(zhǔn)，b平均值(四分位間距)。
圖5的表顯示了UGT1A1*28和其它因素對(duì)嚴(yán)重毒性的影響的統(tǒng)計(jì)比較(多重邏輯回歸分析)結(jié)果。a.協(xié)同因素，b依立替康和其它抗癌藥劑(除了鉑制劑外)聯(lián)合的治療方案。
最佳實(shí)施方式本發(fā)明涉及評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法包括(a)分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的步驟。
UGT1A1酶是一種UDP(尿苷二磷酸)-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)分子。UGT是在活體中催化內(nèi)源物質(zhì)如膽紅素和類固醇、有特定結(jié)構(gòu)的藥物等與葡糖醛酸綴合(葡糖苷酸綴合)的酶的總稱，并且其參與許多藥物的解毒作用。如上述，已知UGT1A1積極參與依立替康的代謝。
編碼UGT1A1酶的基因(此后稱為“UGT1A1基因”，Gen Bank記錄號(hào)AF297093)有啟動(dòng)子區(qū)、外顯子1、和外顯子1后排列的外顯子2到外顯子5。已知在啟動(dòng)子區(qū)和外顯子1到外顯子5中存在大量多態(tài)性。啟動(dòng)子區(qū)的多態(tài)性是由于一對(duì)堿基(TA)的重復(fù)(TA重復(fù))數(shù)目的差異引起的，而且存在稱為(TA)5，(TA)6，(TA)7和(TA)8(分別表示存在的TA重復(fù)數(shù)為5，6，7，8)的多態(tài)性(Monaghan，G.等，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995，Lampe JW等，Pharmacogenetics，9，341-349，1999)。
本發(fā)明中“分析TA重復(fù)數(shù)”意思是檢測試驗(yàn)基因的啟動(dòng)子區(qū)中的TA重復(fù)數(shù)其包括檢測為5到8之任一個(gè)的TA重復(fù)數(shù)；檢測為6或7的TA重復(fù)數(shù)。
另一方面，可以制定出評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被酶代謝，該方法包括(b)分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的步驟。
此外，可以通過包括上述步驟(a)和(b)構(gòu)成本發(fā)明的方法。并且，可以通過包括上述步驟(a)和步驟(c)分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的步驟構(gòu)成本發(fā)明的方法。而且，可以通過包括上述步驟(a)，(b)和(c)構(gòu)成本發(fā)明的方法。這里，核苷酸第686位的堿基是UGT1A1基因中按下游方向從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)計(jì)算的第686位堿基；核苷酸第211位堿基是以同樣方法計(jì)算的第211位堿基。
步驟(b)是分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的步驟。已知在核苷酸位置686存在多態(tài)性，即兩種堿基胞嘧啶(C)或腺嘌呤(A)(Aono，S.等，Lancet，345958-959，1995)。因此，“分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基”特別指檢測核苷酸位置686的堿基是否胞嘧啶或腺嘌呤。
步驟(c)是分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的步驟。已知在核苷酸位置211存在堿基多態(tài)性，即兩種堿基鳥嘌呤(G)或腺嘌呤(A)(Aono，S.等，Lancet，345958-959，1995)。因此，“分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基”特別指檢測核苷酸位置211的堿基是否鳥嘌呤或腺嘌呤。
如上所述，在檢測核苷酸位置686的堿基、核苷酸位置211的堿基和/或啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)時(shí)，兩個(gè)等位基因都可以是分析的靶。
對(duì)分析TA重復(fù)數(shù)的方法和分析核苷酸位置686或211的堿基的方法并不進(jìn)行特別限定，但是可以利用已知的分析方法如利用PCR方法的PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性片段長度多態(tài)性)方法，PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)，(Orita，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86，2766-2770(1989)等)，PCR-SSO(序列特異性寡核苷酸)方法，ASO(等位基因特異性寡核苷酸)雜交方法(其中聯(lián)合PCR-SSO方法和點(diǎn)雜交方法(Saiki，Nature，324，163-166(1986)等))，TaqMan-PCR方法(Livak，KJ，Genet Anal，14，143(1999)，Morris，T.等，J.Clin.，Microbiol.，34，2933(1996))，侵入者(Invader)方法(Lyamichev V等，Nat Biotechnol，17，292(1999))，利用引物延伸方法的MALDI-TOF/MS(矩陣)方法(Haff LA，Smirnov IP，Genome Res 7，378(1997))，RCA(滾環(huán)擴(kuò)增)方法(LizardiPM等，Nat Genet 19，225(1998))，利用DNA芯片或微陣列的方法(WangDG等，Science 280，1077(1998)等)，引物延伸方法，Southern印跡雜交方法，點(diǎn)雜交方法(Southern，E.，J.Mol.Biol.98，503-517(1975))等等。而且，通過直接對(duì)這些序列的相關(guān)部分測序，也可以進(jìn)行分析。這些方法可以通過和其它方法任意組合使用。此外，當(dāng)至少進(jìn)行(a)到(c)中兩個(gè)步驟來評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，當(dāng)然不僅可以對(duì)所有步驟使用相同分析方法，也可以對(duì)每個(gè)步驟使用任意選定的不同方法。
從檢測靈敏度或精確性的角度考慮，當(dāng)試驗(yàn)DNA量少的時(shí)候，優(yōu)選通過利用PCR方法的PCR-RFLP方法等進(jìn)行分析。作為替代方案，可以在通過PCR方法或根據(jù)PCR方法的基因擴(kuò)增方法提前擴(kuò)增試驗(yàn)DNA后，應(yīng)用上述分析方法的任何一種。另一方面，當(dāng)分析多種試驗(yàn)DNA時(shí)，特別優(yōu)選利用TaqMan-PCT方法，侵入者(Invader)方法，利用引物延伸方法的MALDI-TOF/MS(基質(zhì))方法，RCA(滾環(huán)擴(kuò)增方法)，或利用DNA芯片或微陣列的方法。
通過公知的提取方法或純化方法，可以從試驗(yàn)者的血液，皮膚細(xì)胞，粘膜細(xì)胞，頭發(fā)等等得到UGT1A1基因。此外，含有本發(fā)明分析的堿基部分的任何基因，無論其DNA是全長還是部分，都可以用做本發(fā)明的UGT1A1基因。換而言之，在分析啟動(dòng)子區(qū)中(TA)重復(fù)數(shù)的步驟中，可以利用任意長度的DNA片段，只要其含有此重復(fù)部分即可。此外，在分析核苷酸位置686的堿基的步驟中，也可以利用任意長度的DNA片段，只要其含有此相關(guān)堿基部分即可。類似地，在分析核苷酸位置211的堿基的步驟中，也可以使用任意長度的DNA片段，只要其含有此相關(guān)堿基部分即可。
而且，在每一步驟中亦可以用UGT1A1基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA進(jìn)行分析。在這種情況下，例如，從試驗(yàn)者血液或類似物提取和純化UGT1A1基因的mRNA，之后通過反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。通過分析cDNA的堿基序列，可以提前評(píng)估與基因組DNA多態(tài)性有關(guān)的部分的序列。
并且，通過利用UGT1A1基因的表達(dá)產(chǎn)物，可以檢測外顯子1中的兩種多態(tài)性。即，通過分析外顯子1多態(tài)性部分的表達(dá)產(chǎn)物(氨基酸)，可以檢測其基因型。在這種情況下，只要此外顯子1的多態(tài)性部分含有相應(yīng)的氨基酸，甚至可以檢測部分肽。具體地，因?yàn)橥怙@子1位置211的多態(tài)性可以改變71位密碼子(產(chǎn)生甘氨酸或精氨酸)，故可以利用至少含有對(duì)應(yīng)于密碼子71的氨基酸的肽作為檢測的對(duì)象。類似地，因?yàn)橥怙@子1位置686的多態(tài)性可以改變229位密碼子(產(chǎn)生脯氨酸或谷氨酰胺)，故可以利用至少含有對(duì)應(yīng)于密碼子229的氨基酸的肽作為檢測的對(duì)象。當(dāng)利用含有對(duì)應(yīng)于密碼子71的氨基酸和對(duì)應(yīng)于密碼子229的氨基酸的肽或蛋白質(zhì)時(shí)，同時(shí)分析兩種多態(tài)性是可能的。
作為利用肽或蛋白質(zhì)分析對(duì)應(yīng)于多態(tài)部分的氨基酸的方法，可以利用熟知的氨基酸序列分析方法(利用Edaman法的方法)。此外，估計(jì)由于氨基酸的改變，UGT1A1基因的表達(dá)產(chǎn)物構(gòu)象將改變，由此通過免疫方法可以分析氨基酸的種類。免疫方法的例子包括ELISA方法(酶聯(lián)免疫吸附測定法)，放射免疫測定法，免疫沉淀方法，免疫擴(kuò)散方法等等。
“本身被UGT1A1酶代謝或其代謝中間物被該酶代謝的化合物”指當(dāng)向活體給藥時(shí)在體內(nèi)直接被UGT1A1酶代謝的化合物；或指這樣的化合物，其曾被酶或類似物進(jìn)行過代謝，而由此產(chǎn)生的代謝物(中間代謝物)被UGT1A1酶代謝。只要化合物有這種屬性，不對(duì)其作特別限定；例如，對(duì)應(yīng)于此化合物的喜樹堿類似化合物。任何化合物都是適宜的并不存在限制，只要該化合物是有上述屬性的喜樹堿類似化合物即可；例如，已知的喜樹堿衍生物，如拓?fù)涮婵?topotecan)，依立替康(CPT-11)等等。而且，在保持上述屬性的情況下，所述化合物可以是在公共已知的喜樹堿類似化合物和喜樹堿衍生物(拓?fù)涮婵?topotecan)，依立替康等)中將一個(gè)或幾個(gè)取代基替代為其它原子或原子基團(tuán)的化合物。
本身被UGT1A1酶代謝或其代謝中間物被該酶代謝的化合物的適宜例子是依立替康。
本發(fā)明中藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)指由化合物給藥引起藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這里，藥物不良反應(yīng)指當(dāng)施予本發(fā)明化合物后與預(yù)期效果(藥物效力)不同的作用或效果，不僅包括對(duì)活體的有害影響，也包括化合物固有作用的降低。因此，在本發(fā)明的方法中，化合物給藥時(shí)出現(xiàn)固有作用降低的風(fēng)險(xiǎn)也包括在藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)中。
當(dāng)本發(fā)明化合物是依立替康時(shí)，藥物不良反應(yīng)的例子是白細(xì)胞減少和腹瀉。這些癥狀對(duì)服用依立替康的患者偶爾有致命的有害作用。
可以利用藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估結(jié)果來設(shè)定化合物的劑量。這樣，本發(fā)明的另一方面是制定化合物劑量的方法，其包括步驟根據(jù)上述評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法的結(jié)果制定化合物的劑量。根據(jù)這種劑量制定方法，通過比較化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的程度和最初預(yù)期的化合物給藥的效果程度，對(duì)每個(gè)服藥的受試者(患者)制定適合的劑量是可能的。因此，用化合物進(jìn)行有效的治療并同時(shí)抑制藥物不良反應(yīng)的出現(xiàn)是可能的。換而言之，本發(fā)明提供了降低化合物的藥物不良反應(yīng)的方法。
本發(fā)明的另一方面提供了用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸(此后稱為“TA重復(fù)數(shù)分析核酸”)，用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸(此后稱為“686位置分析核酸”)和用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸(此后稱為“211位置分析核酸”)。
TA重復(fù)數(shù)分析核酸的例子包括這樣的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的TA重復(fù)區(qū)堿基的區(qū)域的DNA片段特異雜交，并可以利用下列兩個(gè)引物組中的任一組通過PCR方法擴(kuò)增引物組SEQ IDNo.7和SEQ ID No.8，或引物組SEQ ID No.9和SEQ ID No.10。
正向引物(SEQ ID No.7)5’-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3’反向引物(SEQ ID No.8)5’-CCACTGGGATCAACAGTATCT-3’正向引物(SEQ ID No.9)5’-GTCACGTGACACAGTCAAAC-3’反向引物(SEQ ID No.10)5’-TTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3’686位置分析核酸的例子包括這樣的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的區(qū)域的DNA片段特異雜交，并可以利用引物組SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通過PCR方法擴(kuò)增。
正向引物(SEQ ID No.3)5’-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3’反向引物(SEQ ID No.4)5’-GTCCCACTCCAATACACAC-3’211位置分析核酸的例子包括這樣的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的區(qū)域的DNA片段特異雜交，并可以利用引物組SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通過PCR方法擴(kuò)增。
正向引物(SEQ ID No.1)5’-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3’反向引物(第393-412位)(SEQ ID No.2)5’-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3’本發(fā)明的另一方面提供了用于評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝，所述試劑盒包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸(TA重復(fù)數(shù)分析核酸)。
另一方面，通過包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸(686位置分析核酸)，亦可以構(gòu)建用于評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝。
作為替代方案，可以通過包括TA重復(fù)數(shù)分析核酸及686位置分析核酸，構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。而且，除了包括TA重復(fù)數(shù)分析核酸外，通過進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸(211位置分析核酸)，亦可以構(gòu)成本發(fā)明的試劑盒。此外，上述各試劑盒可以根據(jù)使用每個(gè)試劑盒的方法，通過一個(gè)試劑或2個(gè)或多個(gè)試劑聯(lián)合而構(gòu)成。例如，通過聯(lián)合用于擴(kuò)增含有UGT1A1酶的編碼基因的TA重復(fù)區(qū)的DNA的試劑、用于擴(kuò)增含有UGT1A1酶的編碼基因的686位置堿基區(qū)的DNA的試劑和/或用于擴(kuò)增含有UGT1A1酶的編碼基因的211位置堿基區(qū)的DNA的試劑，可以構(gòu)成試劑盒。
上述核酸是可以用在前述各分析方法，PCR-RFLP(限制性片段長度多態(tài)性)方法、PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)方法(Orita，M等，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.86，2766-2770(1989))等中的核酸，在各試劑盒中其用作引物和探針。引物的例子包括可以特異擴(kuò)增含有將要分析的多態(tài)性位點(diǎn)(啟動(dòng)子區(qū)，686位置堿基，211位置堿基)的區(qū)域的引物。此外，當(dāng)組成用于進(jìn)行PCR-RFLP方法的試劑盒時(shí)，可以例如，利用設(shè)計(jì)的引物，這樣具有特定多態(tài)性時(shí)在多態(tài)性部分中將形成特定限制性位點(diǎn)；由此當(dāng)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶處理時(shí)，即可區(qū)分出基因型。當(dāng)組成用于進(jìn)行TaqMan-PCR方法，侵入者(Invader)方法或類似方法的試劑盒時(shí)，核酸的例子包括用在各方法中的引物和/或探針。
作為探針或引物，根據(jù)分析方法，可以適當(dāng)使用DNA片段或RNA片段。探針或引物的堿基長度可以是能發(fā)揮其各自功能的長度，引物的堿基長度的例子是約15到30bp，優(yōu)選約20到25bp。
如上述，為了容易實(shí)施本發(fā)明的方法，優(yōu)選利用適合這個(gè)方法的基因型檢測試劑盒。根據(jù)上述說明，可以容易地設(shè)計(jì)這種試劑盒，我們將通過侵入者(invader)方法作為例子進(jìn)一步說明這種試劑盒，所述侵入者方法可以用基因組DNA進(jìn)行實(shí)施，但基本上不必通過PCR方法或類似方法擴(kuò)增試驗(yàn)DNA。
當(dāng)根據(jù)侵入者(invader)方法構(gòu)成試劑盒時(shí)，利用兩種非熒光標(biāo)記的寡核苷酸(1)和(2)，一種熒光標(biāo)記的寡核苷酸(3)及具有識(shí)別和切割DNA結(jié)構(gòu)的特異內(nèi)切核酸酶活性的酶(4)。兩種非熒光標(biāo)記的寡核苷酸分別稱作“等位基因探針(或信號(hào)探針或報(bào)告探針)”和“侵入者(invader)探針”，熒光標(biāo)記的寡核苷酸稱作“FRET探針”，有識(shí)別和切割DNA結(jié)構(gòu)的特異內(nèi)切核酸酶活性的酶稱作“切割酶”。
(1)設(shè)計(jì)等位基因探針使它具有與作為模板的UGT1A1酶編碼基因(此后縮寫為“UGT1A1基因”)中待分析的多態(tài)性位點(diǎn)(此后稱為“多態(tài)性位點(diǎn)”)5’側(cè)互補(bǔ)的堿基異列，并具有不能與多態(tài)性位點(diǎn)3’側(cè)一個(gè)堿基互補(bǔ)結(jié)合的任意堿基序列(稱為“副翼”)。更具體地，當(dāng)觀察等位基因探針本身時(shí)，它從5’-末端開始按照下列順序組成副翼部分，與多態(tài)性位點(diǎn)5’-側(cè)的模板序列互補(bǔ)的序列部分。作為副翼序列，所用的是不能與樣品中的UGT1A1基因序列、等位基因探針或侵入者(invader)探針及除了UGT1A1基因以外的任何DNA互補(bǔ)結(jié)合的序列。
(2)設(shè)計(jì)侵入者(invader)探針使它互補(bǔ)結(jié)合模板UGT1A1基因中多態(tài)性位點(diǎn)3’側(cè)的序列，而對(duì)應(yīng)于多態(tài)位點(diǎn)的序列可以是任意堿基(N)。更具體地，當(dāng)觀察侵入者(invader)探針本身時(shí)，它從5’-末端開始按照下列順序組成與多態(tài)性位點(diǎn)3’-側(cè)的模板序列互補(bǔ)的序列部分和在3’-末端的N。
以這種方式組成的(1)和(2)對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的“TA重復(fù)數(shù)分析核酸”，“686位置分析核酸”或“211位置分析核酸”。當(dāng)兩種探針(1)與(2)和UGT1A1基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，侵入者(invader)探針能侵入兩者間的多態(tài)性位點(diǎn)，它的單堿基(N)造成具有堿基對(duì)重疊的結(jié)構(gòu)。
(3)可以由與UGT1A1基因沒有關(guān)系的序列構(gòu)成FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)探針，該FRET探針的序列可以是普通的且不依賴于要檢測的多態(tài)性位點(diǎn)。FRET探針在其自身5’側(cè)具有可以與探針本身互補(bǔ)結(jié)合的序列，并且在3’側(cè)具有與副翼互補(bǔ)的序列。此外，用熒光色素標(biāo)記FRET探針的5’-末端，而在其上游位點(diǎn)處結(jié)合猝滅劑。
(4)切割酶是有特異內(nèi)切核酸酶活性的酶，其分類為結(jié)構(gòu)特異性副翼內(nèi)切核酸酶(FEN)；識(shí)別和切割DNA結(jié)構(gòu)；檢測排列有3個(gè)堿基的部分，其中所述堿基各自屬于模板DNA、侵入者(invader)探針和等位基因探針，且等位基因探針5’末端為副翼樣的；切割副翼部分。
當(dāng)利用上述三種探針(1)到(3)和切割酶(4)時(shí)，可以概略地產(chǎn)生下面兩個(gè)階段反應(yīng)。
首先，當(dāng)?shù)任换蛱结?1)和UGT1A1基因互補(bǔ)結(jié)合時(shí)，侵入者(invader)探針(2)的3’-末端(N)侵入它們的多態(tài)性位點(diǎn)。切割酶(4)識(shí)別這三個(gè)堿基排列處的多態(tài)性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，切割等位基因探針(1)的副翼部分，釋放副翼部分。然后，因?yàn)楦币聿糠钟信cFREP探針(3)互補(bǔ)的序列，所以從等位基因探針(1)釋放的副翼部分與FREP探針(3)互補(bǔ)結(jié)合。于是，在副翼部分3’-末端存在的多態(tài)性位點(diǎn)侵入FRET探針(3)的自我互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)中。接著，切割酶(4)識(shí)別該結(jié)構(gòu)，切割與熒光色素結(jié)合的位點(diǎn)。由此，熒光色素與猝滅劑分離，發(fā)出熒光?？梢詼y定熒光強(qiáng)度以檢測和分析多態(tài)性。
例如，可以通過聯(lián)合(1)和(2)或(3)和(4)作為兩種試劑的組合物而利用(1)到(4)，或可以提前干燥(3)和(4)以包封到微滴定板中。這樣，可以減少用于測定的步驟數(shù)。而且，可以適當(dāng)?shù)貙㈡V，緩沖液等加入到含有(1)和(2)的試劑組合物中以優(yōu)化反應(yīng)。而且，除了(1)到(4)外，可以混入防止樣品在測定期間蒸發(fā)的礦物油，從而獲得試劑盒。
此外，如果針對(duì)等位基因探針(1)制備了兩種探針，則可以區(qū)別出UGT1A1基因是純合子或是雜合子。因?yàn)樵跍y序后基因組科學(xué)“用于SNP基因多態(tài)性的策略”，Yozo Onishi，94-135，Nakayamashoten，2000；Treble，M.，等，Genetic Medicine，468-72，2000，提綱；及國際公布WO97/27214和WO98/42873中圖解和描述了這些，故通過參考這些公開出版物進(jìn)行最佳設(shè)計(jì)是可能的。
因?yàn)榭梢杂帽景l(fā)明試劑盒提前評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，所以可以根據(jù)評(píng)估結(jié)果，制定針對(duì)每個(gè)用藥個(gè)體的適宜化合物劑量，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝。換而言之，可以用本發(fā)明試劑盒制定化合物的劑量，所述化合物或者其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被此酶代謝。
通過向接受化合物給藥的患者的細(xì)胞中，特別是在UTG1A1酶對(duì)化合物進(jìn)行代謝和解毒的位點(diǎn)向細(xì)胞中引入具有遺傳多態(tài)性的UGT1A1基因，其中該遺傳多態(tài)性經(jīng)測定具有較小的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)(換而言之，在啟動(dòng)子區(qū)中有6個(gè)TA重復(fù)，在外顯子1位置211為鳥嘌呤(G)，和/或在外顯子1位置686為胞嘧啶)，或引入含有這些多態(tài)性位點(diǎn)中至少一個(gè)的DNA片段，可以降低化合物的藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。在化合物給藥前、給藥期間或給藥后，可以進(jìn)行基因的引入。例如，可以通過方法，如用質(zhì)?；虿《据d體引入基因的方法，電穿孔(Potter，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81，7161-7165(1984))、脂轉(zhuǎn)染(Felgner，P.L.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7413-7417(1984))、微注射的方法(Graessmann，M.&Graessmann，A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.73，366-370(1976))等等進(jìn)行基因的引入。
通過實(shí)施例將更詳細(xì)地闡述本發(fā)明。在實(shí)施例中，統(tǒng)計(jì)分析了依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)和UGT1A1基因多態(tài)性間的相關(guān)性。
患者和臨床信息受試者是在1994年7月到1999年6月的化療中接受依立替康給藥的日本患者。為了確定患者的安全性，首先確保每個(gè)患者在使用依立替康前有足夠的骨髓功能白細(xì)胞數(shù)3×109/升或更高，血小板數(shù)100×109/升或更高。此外，有水瀉、麻痹性腸梗阻、間質(zhì)性肺炎或肺纖維化、大量腹水或胸腔積液、顯性黃疸或依立替康過敏癥的既往病歷的患者排除在依立替康應(yīng)用外。結(jié)果，用118位患者作為本實(shí)施例的受試者。
為了證實(shí)對(duì)依立替康的適應(yīng)性，一周至少進(jìn)行一次全血計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)和血清化學(xué)。而且也一直測定膽紅素水平。
我們回顧地檢查了臨床記錄，包括患者的特征(例如，年齡，性別等)、依立替康給藥的劑量和進(jìn)度表、其它藥物或放射療法應(yīng)用的記錄和觀察到的依立替康(輸注)引起的藥物不良反應(yīng)。我們計(jì)數(shù)了患者接受粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSFs)或鹽酸氯苯哌酰胺的天數(shù)，其中在日本后者通常是針對(duì)依立替康引起的腹瀉的處方藥。G-GSF的預(yù)防性給藥防止了中性粒細(xì)胞減少的明顯發(fā)作。因?yàn)橐阎懒⑻婵档膭┝肯拗菩远拘詴?huì)引起白細(xì)胞減少和腹瀉，我們將4級(jí)白細(xì)胞減少(≤0.9×109個(gè)/升)和3級(jí)或更嚴(yán)重的腹瀉(對(duì)于水瀉，3級(jí)是5天或更多天；4級(jí)，伴有出血或脫水的腹瀉，此為根據(jù)日本癌癥治療協(xié)會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)所分級(jí))定義為“嚴(yán)重毒性”。在本實(shí)施例中不包括其它藥物不良反應(yīng)，因?yàn)檫@些藥物不良反應(yīng)受各種患者背景影響。用剛好在依立替康給藥前的分?jǐn)?shù)和依立替康治療后的最高分?jǐn)?shù)記錄血清總的膽紅素水平。
基因型分析在將依立替康給予每位患者后，從每個(gè)患者(118位患者)中取血樣，分析他們的基因型。首先，用QIAamp血液試劑盒(QIAGEN GmbH，Hilden，德國)從全血(100-200μl)制備基因組DNA。然后，根據(jù)所附的手冊(cè)進(jìn)行測定。
對(duì)于每個(gè)基因組DNA，我們分析了下列變異序列(見圖1)在TATA盒子中兩個(gè)額外核苷酸(TA)的插入，其導(dǎo)致在位置-39到-53產(chǎn)生了序列(TA)7TAA，該類型稱為UGT1A1*28；(Monaghan，G.，Ryan，M.，Seddon，R.，Hume，R.，和Bruchell，B.，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995)；外顯子1中密碼子71位甘氨酸改變?yōu)榫彼岬霓D(zhuǎn)換(在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游區(qū)域+211位從(G)到(A))(用G71R表示，該類型稱為UGT1A1*6)；外顯子1中密碼子229位脯氨酸改變?yōu)楣劝滨０返念崜Q(用P229Q表示，該類型稱為UGT1A1*27)；外顯子4中在位置+1099從(C)到(G)的顛換使密碼子367位由精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼?用R367G表示，該類型稱為UGT1A1*29)；外顯子5中密碼子486位使酪氨酸(Y)轉(zhuǎn)化為天冬氨酸(D)的顛換(+1456，T到G)(用Y486D表示，該類型稱為UGT1A1*7)。(Monaghan，G.，Ryan，M.，Seddon，R.，Hume，R.，和Bruchell，B.，Lancet，347578-581，1996，Bosma，P.J.等，N.Engl.J.Med.，3331171-1175，1995，Aono，S等，Lancet，345958-959，1995，Aono，S 等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1971239-1244，1993)。
用以前報(bào)道過的方法(Monaghan，G.，等，Lancet，347578-581，1996，Ando，Y.等，Pharmacogenetics，8357-360，1998)，通過直接測序用PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的253-255堿基對(duì)，從最普通的等位基因(UGT1A1*1)中識(shí)別出UGT1A1*28。
利用ABI PRISM 310遺傳分析器(ABI Prism DNA Sequencing Kit，Perkin-Elmer，F(xiàn)oster City，CA)，用染料終止測序反應(yīng)進(jìn)行循環(huán)測序。
通過PCR-RFLP分析從UGT1A1*1中識(shí)別出剩余的變異序列(如UGT1A1*6)。對(duì)于外顯子1的分析，根據(jù)以前報(bào)道過的方法(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol. Int.，4621-26，1998)，進(jìn)行含有外顯子1的923bp片段的第一步PCR擴(kuò)增。
隨后，對(duì)于UGT1A1*6分析，用設(shè)計(jì)以擴(kuò)增235bp片段的嵌套引物進(jìn)行第二組PCR擴(kuò)增。錯(cuò)配的正向和反向引物如下(下劃線表示錯(cuò)配位點(diǎn))正向引物(+178到+210) (SEQ ID NO.1)5’-CTAGCACCTGACGCCTCGTTGTACATCAGAGCC-3’反向引物(+393到+412) (SEQ ID NO.2)5’-CCATGAGCTCCTTGTTGTGC-3’設(shè)計(jì)正向引物以在UGT1A1*1中，而不是UGT1A1*6中引入MspI(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)限制位點(diǎn)(+209到+212)。利用嵌套PCR，用1000倍稀釋的第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行第二步PCR，其中50μl體積的樣品含有每種脫氧核糖核苷三磷酸各0.2mM，50Mm KCl，10mM Tris-HCl(pH 8.3)，1.5mM MgCl2，每種引物各0.5μM，和1.3單位Taq聚合酶(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)。PCR條件如下95℃，5分鐘，隨后25個(gè)循環(huán)(94℃，30秒；60℃，40秒；及72℃，40秒)(PCR Thermal Cycler MP，Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)。在37℃，用4單位MspI消化1μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1小時(shí)。消化來源于UGT1A1*1的DNA產(chǎn)生203和32bp的片段，而消化來源于UGT1A1*6的DNA產(chǎn)生了未被消化的235bp片段，來源于雜合基因型的DNA產(chǎn)生了所有的三個(gè)片段。
為了對(duì)UGT1A1*27測序，用下面設(shè)計(jì)以擴(kuò)增399堿基對(duì)片段的半嵌套引物進(jìn)行另一組第二步PCR正向引物(+485到+503) (SEQ ID NO.3)5’-AGTACCTGTCTCTGCCCAC-3’反向引物(+865到+867和內(nèi)含子1)(SEQ ID NO.4)5’-GTCCCACTCCAATACACAC-3’在UGT1A1*27中存在兩個(gè)BsrI(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)限制位點(diǎn)(+552到+556和+684到+688)，但是在UGT1A1*1中僅有一個(gè)位點(diǎn)(+552到+556)。一系列PCR擴(kuò)增反應(yīng)與上述用于MspI RFLP的PCR擴(kuò)增反應(yīng)相同。在65℃，用2.5單位Bsr I消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1小時(shí)。結(jié)果，從UGT1A1*27產(chǎn)生了199，132和68堿基對(duì)片段，而從UGt1A1*1生產(chǎn)了331和68堿基對(duì)。雜合基因型DNA產(chǎn)生了所有上述四個(gè)片段。
用嵌套引物，利用PCR-RFLP測定法也鑒定了UGT1A1*29的序列。根據(jù)略作修改的報(bào)道方法(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol.Int.，4621-26，1998)進(jìn)行包含外顯子2，3和4的第一步PCR擴(kuò)增反應(yīng)。對(duì)于第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增285堿基對(duì)片段的包含錯(cuò)配序列的正向和反向引物如下(下劃線表示錯(cuò)配位點(diǎn))正向引物(內(nèi)含子3和+1085到+1098)(SEQ ID NO.5)5’-TCCTCCCTATTTTGCATCTCAGGTCACCCGATGGCC-3’反向引物(內(nèi)含子4)(SEQ ID NO.6)5’-TGAATGCCATGACCAAA-3’所設(shè)計(jì)的正向引物可以向UGT1A1*1但不是UGT1A1*29中引入Cfr13I(Takara Shuzo Co.，Ltd.，Otsu，日本)限制位點(diǎn)(+1095到+1099)。所用PCR反應(yīng)試劑混合物與上述UGT1A1*6的第二步PCR反應(yīng)中所用的PCR反應(yīng)試劑混合物相同。用Cfr13 I酶消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。來源于UGT1A1*1的DNA被消化為252和33堿基對(duì)的片段，來源于UGT1A1*29的DNA產(chǎn)生了未消化的285堿基對(duì)的片段。
為了UGT1A1*7的檢測，用以前報(bào)道的引物(Akaba，K.等，Biochem.Mol.Biol.Int.，4621-26，1998)，通過PCR方法，擴(kuò)增外顯子5的579堿基對(duì)片段。
所用PCR反應(yīng)試劑混合物與UGT1A1*6的第二步PCR反應(yīng)中所用的PCR反應(yīng)試劑混合物相同。在UGT1A1*1序列中而不是UGT1A1*7中存在Bsr I限制位點(diǎn)(+1452到+1456)。因此，通過與Bsr I酶溫育，來源于UGT1A1*1的DNA被消化為365和214堿基對(duì)的片段，來源于UGT1A1*7的DNA產(chǎn)生了未消化的579堿基對(duì)的片段。
通過4％瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色分析上述過程產(chǎn)生的限制性片段。通過直接測序分析證實(shí)了上述每種變異基因型的基因型分析結(jié)果。
鑒于獲得的結(jié)果，確定了每位患者中UGT1A1基因的類型。
統(tǒng)計(jì)分析通過下面的統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行依立替康的嚴(yán)重毒性和UGT1A1基因型(基因多態(tài)性)間相關(guān)性的分析和評(píng)估。
下面為可能因素性別，年齡，身體狀況(PS)，主要疾病，遠(yuǎn)距離轉(zhuǎn)移的存在，治療史，糖尿病或肝病并發(fā)癥，化療方案，同時(shí)的放射治療，和依立替康輸注的計(jì)劃進(jìn)度表和每次劑量?；煼桨阜譃?類；單獨(dú)依立替康，依立替康加鉑(順鉑或卡鉑)，依立替康加其它藥劑(紫杉醇，docetaxel，足葉乙甙，絲裂霉素C或5-氟尿嘧啶)。用卡方檢驗(yàn)評(píng)估潛在變量間的相關(guān)性或關(guān)聯(lián)性，或用費(fèi)希爾確切檢驗(yàn)(Fisher’s Exact test)評(píng)估分類變量，或?qū)ann-Whitney U檢驗(yàn)用于連續(xù)變量。在無條件多重邏輯回歸分析(unconditional multiple logistic regression analysis)中包括看似與嚴(yán)重毒性相關(guān)聯(lián)(P＜0.1)的可能變量。在多變量分析中，我們沒有包括下面的因素，因?yàn)樗鼈兏叨纫蕾囉诨煹慕Y(jié)果粒細(xì)胞集落刺激因子和鹽酸氯苯哌酰胺兩者的總實(shí)際劑量和應(yīng)用。分別在0.25和0.1顯著性水平，用正向和反向逐步程序選擇最終統(tǒng)計(jì)模型中的變量。當(dāng)控制其它變量時(shí)，驗(yàn)證了遺傳多態(tài)性對(duì)嚴(yán)重毒性出現(xiàn)的重要性。
用JMP版本3.0.2軟件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，我們進(jìn)行了這些分析。當(dāng)雙尾P值在0.05以下時(shí)，認(rèn)為該差異有統(tǒng)計(jì)顯著性。
藥物不良反應(yīng)和臨床信息我們?cè)u(píng)述了118位患者的臨床信息。9位(8％)和38位(32％)患者分別經(jīng)歷了4級(jí)(≤0.9×109/升)和3級(jí)(1.9-1.0×109/升)白細(xì)胞減少。據(jù)報(bào)告，3位(3％)患者有4級(jí)腹瀉(出血或脫水)，19位(16％)有3級(jí)腹瀉(5天或更多天的水瀉)。有4級(jí)白細(xì)胞減少的9位患者中，5位患者還有3/4級(jí)腹瀉，有3/4級(jí)腹瀉的22位患者中有16位患者遭受到3/4級(jí)白細(xì)胞減少。然后，我們鑒定了26位經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者(此后稱為“經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者”)和92位沒有經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者(此后稱為“未經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者”)，并且在圖中分別于表2和3中概括了這些臨床信息和嚴(yán)重毒性數(shù)據(jù)。在未經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者中觀察到較低的依立替康實(shí)際總量和粒細(xì)胞集落細(xì)菌因子或鹽酸氯苯哌酰胺的更頻繁的應(yīng)用。
基因型的分布用上文的方法檢測了所有118位患者的基因型，其結(jié)果如圖4所示。沒有具有UGT1A1*29或UGT1A1*7的患者。此外，對(duì)于9位患者，利用已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果(UGT1A1*28)(Ando Y.，Saka，H.，Asai，G.，Sugiura，S.，Simotaka，K.，和Kamataki，T.，Ann.Oncol.，9845-847，1998)。此外，測定了117位患者的化療前總膽紅素水平和化療期間總膽紅素水平的最大值，在圖4的表中也描述了其結(jié)果。
如圖4表中所示，在5位患者中發(fā)現(xiàn)了基因型多態(tài)性的同時(shí)出現(xiàn)；其中兩位(用箭頭A表示)是UGT1A1*28和UGT1A1*6均雜合，其中3位是UGT1A1*27雜合并同時(shí)出現(xiàn)純合(兩個(gè)用箭頭C表示)或雜合(一個(gè)用箭頭B表示)UGT1A1*28。
UGT1A1*28和UGT1A1*6均雜合的兩位患者(用箭頭A表示)有正常范圍內(nèi)的膽紅素水平；分別地，在治療前是13.9μmol/升和15.4μmol/升，依立替康化療后是10.3μmol/升和15.4μmol/升。除了這兩位患者外，在治療前(P＝0.031，Kruskal-Wallis檢驗(yàn))和依立替康治療后(P＜0.001)，各基因型間膽紅素水平的差異具有統(tǒng)計(jì)顯著性。
對(duì)于經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者和未經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者，UGT1A1*28等位基因的頻率分別是0.308(95％ CI，0.004-0.149)和0.087(95％ CI，0.046-0.128)；而且UGT1A1*6等位基因的頻率分別是0.077(95％ CI，0.004-0.149)和0.136(95％ CI，0.086-0.185)。
對(duì)于UGT1A1*28，在有嚴(yán)重毒性經(jīng)歷的患者和無嚴(yán)重毒性經(jīng)歷的患者間等位基因分布差異有統(tǒng)計(jì)顯著性(P＜0.001)，而對(duì)于UGT1A1*6沒有顯著性(P＞0.2，GENEPOP 3.1版本軟件，Laboratoire de Gén étiqueet Environment，Montpellier，法國)。
基因型和藥物不良反應(yīng)的相關(guān)性邏輯回歸分析表明，UGT1A1*28的雜合或純合基因型被證明是嚴(yán)重毒性的有效預(yù)測器(優(yōu)勢比，5.21；95％CI，1.98-13.96；P＜0.001；表4)。相反地，沒有觀察到UGT1A1*6和嚴(yán)重毒性之間有統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)性(優(yōu)勢比，0.55；95％CI，0.15-1.61；P＞0.2)。
然后，我們對(duì)在引起嚴(yán)重毒性方面有影響的其它因素和基因型的突變進(jìn)行了比較。
如圖2和圖3的表中所示，看似不利影響嚴(yán)重毒性的因素是依立替康輸注的計(jì)劃進(jìn)度表、“性別”，“化療方案”。評(píng)估這些因素的相關(guān)性或關(guān)聯(lián)性。在“化療方案”和“計(jì)劃進(jìn)度表”間發(fā)現(xiàn)了顯著關(guān)聯(lián)性(P＜0.001，卡方檢驗(yàn))，換而言之，用依立替康以3或4周為周期進(jìn)行治療的19位患者中的12位(63％)除了接受依立替康外，曾接受過額外的其它抗癌藥物。因?yàn)椤盎煼桨浮笔呛鸵懒⑻婵祰?yán)重毒性具有較強(qiáng)關(guān)系的變量，在統(tǒng)計(jì)模型中我們考慮包括“化療方案”。
在“化療方案”，“性別”和“UGT1A1*28基因型”間未觀察到顯著的其它相關(guān)性和關(guān)聯(lián)性。女性和使用其它抗癌藥物(除了鉑以外)被發(fā)現(xiàn)是除了UGT1A1*28基因型外引起嚴(yán)重毒性出現(xiàn)的重要因素。這兩個(gè)因素和UGT1A1*28的比較如圖5的表中所示。如圖5的表中所示，具有UGT1A1*28將增加依立替康嚴(yán)重毒性多達(dá)7倍。此外，在女性和依立替康嚴(yán)重毒性間未發(fā)現(xiàn)顯著水平的相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)闡明了UGT1A1*28的臨床重要性，其可以作為UGT1A1綴合活性及急性暴露于依立替康的指標(biāo)。
在同時(shí)有4級(jí)白細(xì)胞減少和3級(jí)或更嚴(yán)重腹瀉的5位患者中，2位有UGT1A1*28和UGT1A1*27，其它兩位是UGT1A1*6雜合，剩余的1位沒有任何一個(gè)分析的變異基因型(UGT1A1*1純合)。另一方面，值得注意的是同時(shí)在啟動(dòng)子區(qū)(UGT1A1*28)和外顯子1(UGT1A1*6或UGT1A1*27)中有變異序列的5位患者中的4位(80％)遭受到危及生命的毒性。前述結(jié)果提示，UGT1A1*28的擁有將以高概率引起依立替康的嚴(yán)重毒性。因此，可以說，通過分析啟動(dòng)子區(qū)的突變(TA重復(fù)的差異)可以提前評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。此外，還表明同時(shí)具有UGT1A1*28和UGT1A1*6或UGT1A1*27可以以高概率引起依立替康的嚴(yán)重毒性。因此，可以說，通過一起分析啟動(dòng)子區(qū)的突變和外顯子1中的突變可以提前評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。
而且，發(fā)現(xiàn)UGT1A1*6純合的2位患者是未經(jīng)歷嚴(yán)重毒性的患者(圖4中的表，用箭頭D表示)，而且發(fā)現(xiàn)UGT1A1*27雜合的所有3位患者(相同的表，用箭頭B和C表示)經(jīng)歷了嚴(yán)重毒性。這表明具有UGT1A1*27將以高概率引起依立替康的嚴(yán)重毒性。因此，可以說，通過分析UGT1A1*27的存在，即密碼子229位的多態(tài)性可以提前評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。
本發(fā)明不限于上述實(shí)施方案和實(shí)施例。只要不背離權(quán)利要求書的描述和本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易考慮到的范圍，各種方面的變化都包括在本發(fā)明中。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明的方法，可以提前評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，該化合物或者本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被酶代謝，其代表是依立替康。因此，可以根據(jù)引起每位患者藥物不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)來給予化合物(藥物)，并且可以降低藥物不良反應(yīng)。特別地，可以提前評(píng)估藥物不良反應(yīng)，如依立替康給藥引起的白細(xì)胞減少和腹瀉的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，然后可以降低藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。
此外，20％或更多的日本人在UGT1A1中有突變，因?yàn)檫@個(gè)原因，可以認(rèn)為他們有出現(xiàn)依立替康高毒性的高風(fēng)險(xiǎn)，因此，可以說，通過分析UGT1A1基因型，可以降低依立替康藥物不良反應(yīng)，尤其降低日本患者中依立替康的藥物不良反應(yīng)。
序 列 表<110>財(cái)團(tuán)法人名古屋產(chǎn)業(yè)科學(xué)研究所(Nagoya Industrial Science Research Institute)<120>評(píng)估施用自身或者其代謝中間物被UGT1A1酶代謝的化合物引起嚴(yán)重毒性的方法<130>C0000101<140>
<141>
<150>JP P2000-376756<151>2000-12-12<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增235-bp片段以分析UGT1A1*6的引物<400>1ctagcacctg acgcctcgtt gtacatcaga gcc 33<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增235-bp片段以分析UGT1A1*6的引物<400>2ccatgagctc cttgttgtgc20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增399-bp片段以分析UGT1A1*27的引物<400>3agtacctgtc tctgcccac 19<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增399-bp片段以分析UGT1A1*27的引物<400>4gtcccactcc aatacacac 19<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增285-bp以分析UGT1A1*29的引物<400>5tcctccctat tttgcatctc aggtcacccg atggcc 36<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于擴(kuò)增285-bp以分析UGT1A1*29的引物<400>6tgaatgccat gaccaaa17<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒區(qū)域的PCR引物<400>7aagtgaactc cctgctacct t 21<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒區(qū)域的PCR引物<400>8ccactgggat caacagtatc t21<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒區(qū)域的PCR引物<400>9gtcacgtgac acagtcaaac 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述用于分析TATA盒區(qū)域的PCR引物<400>10tttgctcctg ccagaggtt19
權(quán)利要求
1.評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法包括至少(a)步驟分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中的TA重復(fù)數(shù)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中分析TA重復(fù)數(shù)的步驟是檢測TA重復(fù)數(shù)為5到8之任何一個(gè)的步驟。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中分析TA重復(fù)數(shù)的步驟是檢測TA重復(fù)數(shù)為6或7的步驟。
4.如權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟擴(kuò)增包含編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)區(qū)的DNA。
5.如權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)所述的方法，其是評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法進(jìn)一步包括(b)步驟分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基，和/或(c)步驟分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中分析核苷酸第686位堿基的步驟是分析是否核苷酸位置686的堿基是胞嘧啶或腺嘌呤的步驟。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中分析核苷酸第211位堿基的步驟是分析是否核苷酸位置211的堿基是鳥嘌呤或腺嘌呤的步驟。
8.如權(quán)利要求5到7任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA，和/或含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的DNA。
9.評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述方法包括至少(b)步驟分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中分析核苷酸第686位堿基的步驟是分析是否核苷酸位置686的堿基是胞嘧啶或腺嘌呤的步驟。
11.如權(quán)利要求9或10所述的方法，其進(jìn)一步包括步驟擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA。
12.如權(quán)利要求1到11任一項(xiàng)所述的方法，其中化合物是喜樹堿類似化合物。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中喜樹堿類似化合物是喜樹堿衍生物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中喜樹堿衍生物是拓?fù)涮婵祷蛞懒⑻婵怠?br> 15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中喜樹堿衍生物是依立替康。
16.制定化合物劑量的方法，其包括步驟根據(jù)權(quán)利要求1到15任一項(xiàng)用于評(píng)估藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法的結(jié)果制定化合物的劑量。
17.用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的TA重復(fù)區(qū)堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.7和SEQ ID No.8通過PCR方法擴(kuò)增。
18.用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1的酶的基因的TA重復(fù)區(qū)堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.9和SEQ ID No.10通過PCR方法擴(kuò)增。
19.用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.1和SEQ ID No.2通過PCR方法擴(kuò)增。
20.用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，其與來源于含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的區(qū)域的DNA片段特異性地雜交，并可以利用引物SEQ ID No.3和SEQ ID No.4通過PCR方法擴(kuò)增。
21.評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述試劑盒包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸。
22.如權(quán)利要求21所述的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，和/或用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸。
23.評(píng)估化合物給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，所述化合物或其本身被UGT1A1酶代謝，或其代謝中間物被該酶代謝，所述試劑盒包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸。
24.如權(quán)利要求21到23任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中化合物是喜樹堿類似化合物。
25.如權(quán)利要求24所述的試劑盒，其中喜樹堿類似化合物是喜樹堿衍生物。
26.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中喜樹堿衍生物是拓?fù)涮婵祷蛞懒⑻婵怠?br> 27.如權(quán)利要求25所述的試劑盒，其中喜樹堿衍生物是依立替康。
28.提前評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其包括至少(a)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，或(b)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸。
29.如權(quán)利要求28所述的試劑盒，其是評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸。
30.評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其包括至少(a)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)數(shù)的核酸，或(b)用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的核酸，并且其進(jìn)一步包括用于擴(kuò)增所要分析的含有編碼UGT1A1酶的基因的啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)區(qū)的DNA或含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第686位堿基的DNA的試劑。
31.如權(quán)利要求30所述的試劑盒，其是用于評(píng)估依立替康藥物不良反應(yīng)表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的試劑盒，其進(jìn)一步包括用于分析編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的核酸和用于擴(kuò)增含有編碼UGT1A1酶的基因的核苷酸第211位堿基的DNA的試劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了評(píng)估依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)的方法；和降低依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)的方法。分析了基于UGT1基因啟動(dòng)子區(qū)中TA重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)差異的多態(tài)性和基于外顯子1中單核苷酸多態(tài)性的兩種多態(tài)性(在211和686位置的堿基)。根據(jù)分析的數(shù)據(jù)，可以評(píng)估依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)。而且，依據(jù)藥物不良反應(yīng)的表現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)，可以設(shè)計(jì)針對(duì)每位患者的依立替康給藥劑量，由此降低依立替康給藥引起的藥物不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1547613SQ0182254
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2001年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月12日
發(fā)明者長谷川好規(guī), 安藤雄一, 下方薰, 一 申請(qǐng)人:第一化學(xué)藥品株式會(huì)社