專利名稱：用于制備遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的方法,以及將其用于生產(chǎn)異源結(jié)合蛋白 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及遺傳工程和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域。具體地講，它涉及遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的制備，所述淋巴細(xì)胞具有分化成更成熟的淋巴系細(xì)胞的能力，并且涉及將其用于生產(chǎn)任何異源抗體或結(jié)合蛋白的用途。
背景技術(shù)：
業(yè)已證實(shí)單克隆抗體對(duì)于疾病的診斷、預(yù)防和治療來說都是有效的制劑(Glennie和Johnson，Immunol.Today，21，p.403-410，2000)。這是由于它們通過其可變區(qū)非常特異地結(jié)合在靶分子(抗原)上的特定表位上的獨(dú)特能力，同時(shí)，還由于能通過它們的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)效應(yīng)物功能(Frazer和Capra，F(xiàn)undamental Immunology，W.E.Paul(Ed.)，F(xiàn)ourth Edition，p.37-74，1999)(圖1)。這使得單克隆抗體能夠特異性地鑒定大分子的復(fù)雜混合物中的獨(dú)特抗原，并且產(chǎn)生針對(duì)所述靶分子的效應(yīng)物功能。
抗體(或免疫球蛋白)由通過二硫鍵連接在一起的兩個(gè)相同的重(H)鏈和輕(L)鏈糖蛋白(圖1)組成。每一個(gè)H和L鏈包括在不同的抗體之間是相同的N-末端可變區(qū)和C-末端恒定區(qū)，該區(qū)在屬于相同的免疫球蛋白同種型的不同抗體中是相同的(圖1)。H和L鏈可變區(qū)的組合，產(chǎn)生了抗體的抗原結(jié)合袋，并且決定其特異性(或獨(dú)特型)，而所述恒定區(qū)決定其同種型(Frazer和Capra，s.a.)。由于VH和VL結(jié)構(gòu)域是由被稱為V(可變的)，D(多樣性；僅存在于H鏈基因座上)和J(結(jié)合)基因片段的多個(gè)基因片段編碼的這一事實(shí)，導(dǎo)致了免疫球蛋白的可變性(Tonegawa，Nature，302，p.575-581，1983)(圖1)。在B淋巴細(xì)胞分化期間，在每一個(gè)細(xì)胞中隨機(jī)選擇V，D和J基因片段，進(jìn)行V(D)J重組的位點(diǎn)特異性重組過程，該過程能組裝所述基因片段，以便產(chǎn)生VH或VL結(jié)構(gòu)域的新的編碼區(qū)(Grawunder等，Curr.Opin.Immunol.，10，p.172-180，1998)。由于所述多個(gè)V，D和J基因片段，以及基因片段結(jié)合中的不精確性，免疫系統(tǒng)每天產(chǎn)生的數(shù)百萬個(gè)B淋巴細(xì)胞，能夠產(chǎn)生具有不同V區(qū)特異性的大量所有組成成分(repertoire)(Melchers等，Curr.Opin.Immunol.，7，p.214-227，1995)。
在進(jìn)化期間，在不同的物種之間免疫球基因具有微小的差別，以便不同物種之間的抗體的恒定區(qū)有所不同。其后果是，來自一個(gè)物種的免疫球蛋白如果被導(dǎo)入另一個(gè)物種的血管系統(tǒng)，最常見是免疫原性的。
因此，異種單克隆抗體的免疫原性限制了它們?cè)谥委熑祟惣膊》矫娴膽?yīng)用，因?yàn)榛颊呓佑|異種抗體可能導(dǎo)致負(fù)面作用，甚至是急性毒性，或者可能簡(jiǎn)單地導(dǎo)致所使用的抗體的中和與清除，從而減弱其藥理學(xué)效力(Clark，Immunol Today，21，p.397-402，2000)。相反，給患者施用完全的人抗體，通常不會(huì)導(dǎo)致任何上述并發(fā)癥。
業(yè)已偶爾從各個(gè)患者的血液中分離了人類抗血清或人類多克隆抗體，以便治療或預(yù)防罕見的，并且通常是高度致命的疾病，如埃博拉病毒感染，或者，用于治療接觸蛇毒之后的個(gè)體。不過，由于多種原因，這種方法對(duì)于治療影響較大群體的疾病是不實(shí)用的。另外，出于倫理考慮，不可能為了生產(chǎn)單克隆抗體而用特定抗原對(duì)人類進(jìn)行免疫，因?yàn)槿梭w內(nèi)產(chǎn)生需要的抗體的B系細(xì)胞，是在次級(jí)淋巴器官中發(fā)育和存留的，并且不能方便地獲得。另外，治療性抗體，特別是用于癌癥治療的抗體的很多潛在的靶抗原是人類蛋白(Glennie和Johnson，s.a.)。在正常環(huán)境下，人類不會(huì)產(chǎn)生針對(duì)所述靶的抗體。因此，最近主要的努力一直集中在建立不需要人類免疫系統(tǒng)的開發(fā)治療性人類或人源化抗體的方法。
最簡(jiǎn)單的方法，利用標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)由分泌具有所需特異性的異種抗體的雜交瘤克隆編碼H和L鏈的可變區(qū)(VH和VL結(jié)構(gòu)域)的cDNAs。然后將克隆的可變區(qū)cDNAs克隆到含有人類恒定區(qū)基因的合適的大腸桿菌，酵母，昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體中。這樣可以生產(chǎn)具有與人類CH和CL恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域融合的異種VH和VL的單克隆抗體，從而得到人源化抗體。不過，該方法的缺陷是，異種VH和VL結(jié)構(gòu)域與人類CH和CL恒定區(qū)的融合，可能導(dǎo)致減弱了的親和力或改變了的特異性。另外，所述人源化抗體的異源VH和VL在人體內(nèi)仍然是免疫原性的，因?yàn)閂結(jié)構(gòu)域的構(gòu)架區(qū)在不同物種之間是不同的。在某些場(chǎng)合下，這一問題可以通過將介導(dǎo)直接接觸抗原的各個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)嫁接到H和L鏈可變的人類構(gòu)架區(qū)上而得到克服(Fiorentini等，Immunotechnology，3，p.45-59，1997)。不過，由于未知原因，CDR嫁接通常仍然會(huì)導(dǎo)致免疫原性抗體的產(chǎn)生和/或親和力和特異性的減弱/喪失。
因此，為了制備完整的人類免疫球蛋白，近年來業(yè)已開發(fā)了兩種不同的并且更有效的方法。
第一種方法基于單鏈可變區(qū)(scFv)的表達(dá)(展示)，所述scFv由位于大腸桿菌的絲狀噬菌體表面上的一個(gè)VH和VL結(jié)構(gòu)域組成(Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21，p.371-3818，2000)(還可參見EP 0 585 287B1，EP 0 605 522B1)?？梢詷?gòu)建含有VH和VL鏈的各種所有組成成分的噬菌體展示文庫，可以構(gòu)建包括不同的VH和VL鏈的所有組成成分的噬菌體展示文庫，并且，通過重組噬菌體與固定化抗原的結(jié)合，可以從所述文庫中分離各個(gè)scFv特異性(McCafferty等，Nature，348，p.552-554，1990)。
源于天然人類所有組成成分的scFv結(jié)合蛋白的噬菌體展示文庫具有這樣的缺陷它局限于包含在所述所有組成成分中的特異性，因此，很多人類抗原的特異性最常見的是不存在于所述文庫中。盡管可以利用組合的或合成的噬菌體展示文庫來克服這一問題，該技術(shù)的一般缺陷是，通常不能分離特定抗原的高親和力結(jié)合蛋白。因此，很大的精力一直投入在通過費(fèi)力的克隆或位點(diǎn)特異性重組方法，構(gòu)建非常大的原始文庫。
估計(jì)最佳組合或合成的文庫含有109-1011個(gè)潛在的不同結(jié)合位點(diǎn)，并且可以產(chǎn)生1-200nM范圍內(nèi)的結(jié)合特異性(Hoogenboom和Chames，s.a.)。不過，在體內(nèi)，在生發(fā)中心B細(xì)胞中的免疫球蛋白親和成熟期間，可以達(dá)到的在皮摩爾范圍(10-12M)內(nèi)的較高的親和力，只能在采用額外的煩瑣的遺傳工程方法時(shí)才能產(chǎn)生，包括V基因混排，易錯(cuò)PCR，使用大腸桿菌突變菌株等。
無論噬菌體展示文庫篩選方法的結(jié)果是什么，最終都需要將編碼scFv結(jié)合位點(diǎn)的基因重新克隆到合適的表達(dá)載體中，用于表達(dá)人類免疫球蛋白，并且需要將所述載體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入可以大規(guī)模生產(chǎn)人類抗體的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中，這是另一個(gè)耗費(fèi)時(shí)間和昂貴的過程。
用于生產(chǎn)完全的人單克隆抗體的第二種方法，是基于具有人類免疫球蛋白H和L鏈基因座的構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因小鼠的用途(Jakobovits，Curr.Opin.Biotechnol.，6，p.561-566，1995)。將所述人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因最終轉(zhuǎn)育到不再能組裝內(nèi)源鼠抗原受體基因的遺傳背景中。在所述小鼠中，B系細(xì)胞的發(fā)育取決于來自人類轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的免疫球蛋白H和L鏈的表達(dá)，所述小鼠的B系細(xì)胞只能產(chǎn)生人類抗體。該技術(shù)存在三種變化形式。在一種變化形式中，將人類免疫球蛋白微基因座用作轉(zhuǎn)基因，通過它只能產(chǎn)生人類抗體的有限的所有組成成分(Fishwild等，Nat.Biotechnol.，14，p.845-851，1996)(還可參見EP 0 546 073B1，US 5,874,299)。在第二種變化形式中，使用了包括克隆到酵母人工染色體中的可變區(qū)基因片段的大部分的人類IgH和IgκL鏈基因座的大的區(qū)域。在第三種變化形式中，將含有完整的人類免疫球蛋白H和L鏈基因座的人類染色體片段整合到產(chǎn)生了所謂轉(zhuǎn)染色體動(dòng)物的小鼠種系中。具有所述復(fù)合轉(zhuǎn)基因的小鼠產(chǎn)生了實(shí)際上正常的人類免疫球蛋白的所有組成成分。
對(duì)所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠進(jìn)行免疫，產(chǎn)生了導(dǎo)致完全的人抗體產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答。這種制備人類抗體的方法與噬菌體展示文庫技術(shù)相比具有一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)由于人類免疫球蛋白在生發(fā)中心B細(xì)胞中可以經(jīng)歷作為免疫應(yīng)答進(jìn)程的正常過程的親和力成熟，可以制備針對(duì)特定抗原的高親和力抗體。
不過，該技術(shù)存在一個(gè)重大缺陷首先，轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體小鼠的制備是非常麻煩，困難和耗費(fèi)時(shí)間的，并因此是費(fèi)用較高的。整個(gè)過程需要制備至少四種不同的小鼠株兩種株在內(nèi)源IgH和IgL鏈基因座內(nèi)具有定向破壞，兩種株攜帶編碼部分或全部人類IgH和IgL鏈基因座的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體。另外，所有四種小鼠株都必須同時(shí)繁育，得到了具有攜帶內(nèi)源IgH和IgL鏈基因座的純合破壞的基因型，與此同時(shí)，攜帶編碼異源IgH和IgL鏈的人類轉(zhuǎn)基因。不同剔除和轉(zhuǎn)基因小鼠株的制備，它們的篩選以及最終的雜交是花費(fèi)時(shí)間的過程，它通常需要至少兩年時(shí)間，即使對(duì)每一個(gè)步驟都進(jìn)行全面優(yōu)化也是這樣。因此，培育異種小鼠株所需要的較長(zhǎng)的時(shí)間框架，給設(shè)計(jì)含有修飾過的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體的不同的小鼠株留下了很小的靈活性。因此，這種技術(shù)不適合現(xiàn)有抗體的修飾和改進(jìn)(例如對(duì)它們的親和力進(jìn)行改進(jìn))。因?yàn)樵摲椒ㄐ枰荛L(zhǎng)的時(shí)間來制備生產(chǎn)一種抗體的新型轉(zhuǎn)基因小鼠株。因此，這種技術(shù)基本上局限于人類抗體的從頭制備。
根據(jù)以上事實(shí)，明顯存在對(duì)綜合了噬菌體展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)(即在制備人類抗體方面的速度和靈活性，以及修飾和改進(jìn)現(xiàn)有抗體特性的能力)，和人類免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)(即由于在免疫系統(tǒng)中進(jìn)行的親和力成熟而獲得高親和力抗體的能力，以及具有生理學(xué)和天然結(jié)構(gòu)特征的抗體的產(chǎn)生)的完全的人抗體產(chǎn)生技術(shù)的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了制備脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的手段和方法，可將所述方法用于生產(chǎn)任何異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段。具體地講，本發(fā)明提供了對(duì)脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾并實(shí)現(xiàn)將它們?cè)隗w外或體內(nèi)分化成更成熟的淋巴系細(xì)胞的手段和方法，以便制備能夠產(chǎn)生所有形式的異源免疫球蛋白樣多肽的淋巴細(xì)胞，可以根據(jù)需要表現(xiàn)的特定活性或特征對(duì)所述多肽進(jìn)行考慮和設(shè)計(jì)。另外，本發(fā)明提供了適合實(shí)施本發(fā)明的遺傳元件和構(gòu)建體，以及特殊的淋巴細(xì)胞。
因此，本發(fā)明的方法在制備淋巴系細(xì)胞方面具有很大靈活性，所述細(xì)胞具有在短時(shí)間內(nèi)表達(dá)幾乎所有類型的抗體或結(jié)合蛋白的潛力。與此同時(shí)，將所述細(xì)胞移植到相容性脊椎動(dòng)物宿主中，在這里使所述細(xì)胞參與諸如親和力成熟的特殊免疫功能的可能性，使得能夠利用所述免疫系統(tǒng)的選擇性制備對(duì)任何特定抗原性化合物或組合物具有高的結(jié)合親和力的抗體和免疫球蛋白樣或甚至是人工結(jié)合蛋白。


圖1是免疫球蛋白結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)的示意圖?？贵w或免疫球蛋白(Ig)是糖蛋白，在它們的單體形式下，由通過二硫鍵共價(jià)偶聯(lián)的兩個(gè)相同的重鏈(IgH)和兩個(gè)相同的輕鏈(IgL)組成。根據(jù)抗體的同種型，每一個(gè)IgH鏈包括一個(gè)N-末端可變區(qū)(VH)和3-4個(gè)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域(CH1-3，或4)。另外，在第一和第二CH結(jié)構(gòu)域之間包括鉸鏈區(qū)的抗體賦予了異四聚體糖蛋白的兩個(gè)抗原結(jié)合臂靈活性。輕鏈僅由一個(gè)N-末端可變(VL)和一個(gè)C-末端恒定結(jié)構(gòu)域(CL)組成。兩個(gè)IgH和IgL鏈的排列，導(dǎo)致了具有兩個(gè)抗原的高度可變結(jié)合位點(diǎn)的Y型單體抗體，它是通過IgH和IgL鏈可變區(qū)的締合形成的。在比較不同抗體之間的V區(qū)時(shí)，在所謂高變區(qū)上的可變區(qū)存在很大不同。這種可變性是由于以下事實(shí)V區(qū)不是由單個(gè)基因編碼的，相反，對(duì)于VH區(qū)來說，是由多個(gè)不同的V，D，和J基因片段編碼的，從中隨機(jī)選擇，然后重組，以便形成IgH鏈的可變編碼區(qū)(參見附圖的左上部分)。這一過程被稱為V(D)J重組，并且是在早期B細(xì)胞發(fā)育期間發(fā)生的。IgL鏈基因座只包括多個(gè)不同的V和J基因片段，通過隨機(jī)的V到J重排產(chǎn)生了可變區(qū)的編碼區(qū)(參見附圖的右上部分)。來自相同亞型(同種型)的抗體的所述恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，決定了所述抗體的效應(yīng)物功能，并且在不同的抗體之間沒有差別。不過，在免疫應(yīng)答過程中，可以誘導(dǎo)各個(gè)B淋巴細(xì)胞，以便改變要表達(dá)的抗體的同種型。在這種情況下，在位于不同恒定區(qū)基因的5’末端的轉(zhuǎn)換區(qū)之間發(fā)生了體細(xì)胞DNA重組事件(在附圖的下部通過恒定區(qū)基因的示意圖上的點(diǎn)表示)。例如，μ-和ε-轉(zhuǎn)換區(qū)之間的重組，可能導(dǎo)致來自Cμ-Cγ4的所有恒定區(qū)基因的缺失，正如在附圖中所示出的。其后果是，將VDJ可變編碼區(qū)帶到了Cε恒定區(qū)附近，導(dǎo)致了IgE同種型抗體的表達(dá)。
圖2表示小鼠體內(nèi)的B細(xì)胞發(fā)育。小鼠體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的分化可以細(xì)分成不同的階段，這些階段可以進(jìn)行表型和基因型細(xì)分。存在于野生型小鼠骨髓中的最早定型的前體B(preB)細(xì)胞，源于多能造血干細(xì)胞(HSC，左側(cè))，它不能表達(dá)所有細(xì)胞系特異性標(biāo)記(被稱為L(zhǎng)in-)，不過，以干細(xì)胞抗原1的表面表達(dá)為特征(Sca-1)。從它開始，制備了preB細(xì)胞，它在兩個(gè)IgH鏈等位基因上通常攜帶有DJH重排，并且，以表面表達(dá)B220(泛-B細(xì)胞標(biāo)記)和c-kit為特征。在此階段，所有其他Ig基因座，通常仍然是種系(GL)構(gòu)型。DJH重排的PreB細(xì)胞被命名為preB-I細(xì)胞，并且能夠在特定條件下在組織培養(yǎng)中擴(kuò)增。在所述細(xì)胞中的下一個(gè)重排事件，涉及重排成預(yù)先存在的DJH元件的VH基因片段之一。如果這種重排導(dǎo)致了任何等位基因的生產(chǎn)性重排，使μH鏈可以表達(dá)，所述細(xì)胞接受增殖性信號(hào)，擴(kuò)增并且分化成preB-II細(xì)胞。所述細(xì)胞喪失了c-kit表面標(biāo)記的表達(dá)，但是，獲得了CD25的表達(dá)。在任何IgL鏈等位基因上的其他生產(chǎn)性平臺(tái)，導(dǎo)致了分化成能表達(dá)膜結(jié)合IgM的不成熟B細(xì)胞。這些不成熟的未接觸抗原的B細(xì)胞可以離開骨髓，遷移到外周淋巴器官中，在那里，它們可能最終會(huì)遇到抗原。在免疫應(yīng)答過程中，所述B細(xì)胞隨后可分化成抗體分泌性漿細(xì)胞，在此期間，可能在IgH恒定區(qū)基因座上發(fā)生另一個(gè)DNA重組過程(類別轉(zhuǎn)換重組)，導(dǎo)致由漿細(xì)胞分泌的抗體同種型的改變。
圖3是本發(fā)明用于制備人源化前體B淋巴細(xì)胞(HupreB′s)的方法的示意圖。鼠DJH重排的preB-I細(xì)胞可以從交配后14-19天的小鼠的胎肝中分離，或者從成年小鼠的骨髓中分離(步驟1)。所述細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)需要特殊的組織培養(yǎng)條件，包括基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層和/或諸如IL-7(白介素7)的某些生長(zhǎng)因子的存在。在所述條件下，preB-I細(xì)胞不會(huì)有進(jìn)一步分化(步驟2)。為了將所述細(xì)胞用于生產(chǎn)異源抗體，必須防止在所述細(xì)胞中發(fā)生其他生產(chǎn)性內(nèi)源Ig基因重排。例如，這一目的可以通過在IgH和IgL鏈基因座的兩個(gè)等位基因上導(dǎo)入順式作用突變而實(shí)現(xiàn)(步驟3b)，或者通過導(dǎo)入破壞Ig基因的其他V(D)J重組的反式作用突變，例如，通過缺失兩個(gè)重組激活基因RAG-1或RAG-2(步驟3a)之一而實(shí)現(xiàn)。然后可以用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)所述后一種細(xì)胞，對(duì)于人類來說，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠介導(dǎo)異種IgH和IgL鏈的表達(dá)(步驟4a)。還可將所述逆轉(zhuǎn)錄病毒用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)在內(nèi)源Ig基因座上攜帶有順式作用突變的前一種細(xì)胞。另外，攜帶有順式作用突變的preB細(xì)胞對(duì)于Ig基因重排來說仍然是感受態(tài)的。因此，可以用異源種系Ig基因座穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，所述基因座可能發(fā)生V(D)J重排，并且通過這種重排產(chǎn)生新的異種抗體(步驟4b)。如果所述異源或異種IgH和IgL鏈基因是來自人類，所述preB-I細(xì)胞將僅具有表達(dá)完全的人抗體的潛力，并因此被稱為HupreB細(xì)胞。
圖4是表示利用陽性-陰性基因?qū)蜉d體導(dǎo)向于內(nèi)源基因座的示意圖。為了導(dǎo)向于內(nèi)源基因座，將位于該基因座上游大約1kb的基因組區(qū)(短臂)和位于該基因下游的大約3kb的區(qū)(長(zhǎng)臂)克隆到空的陽性-陰性導(dǎo)向載體上。作為一種例子，示出了DJH3重排IgH鏈基因座的導(dǎo)向策略。將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到preB-I細(xì)胞中，并且選擇和最終篩選通過同源重組進(jìn)行的所述導(dǎo)向載體的整合。所述陽性選擇標(biāo)記允許選擇所述構(gòu)建體向轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞基因組中的穩(wěn)定整合。所述陰性選擇標(biāo)記的表達(dá)對(duì)所述細(xì)胞有毒性，并且只有在穩(wěn)定整合時(shí)喪失了所述陰性選擇標(biāo)記的情況下細(xì)胞才能存活，所述喪失是通過在正確基因座上的兩個(gè)同源重組事件發(fā)生的。內(nèi)源基因座和導(dǎo)向構(gòu)建體之間的發(fā)生同源重組的兩個(gè)可能的位點(diǎn)通過陰影線表示。如果通過所述同源重組事件發(fā)生了所述構(gòu)建體的整合，所述陽性藥物選擇標(biāo)記取代了位于具有同源性的短臂和長(zhǎng)臂之間的內(nèi)源區(qū)。如果如本文所述在所述陽性選擇標(biāo)記的側(cè)翼有兩個(gè)loxP重組信號(hào)，cre重組酶的瞬時(shí)表達(dá)，可能介導(dǎo)所述選擇標(biāo)記的缺失，以便可以將同一個(gè)導(dǎo)向構(gòu)建體用于導(dǎo)向于相同基因座的第二個(gè)等位基因。
圖5a表示用于構(gòu)建IgH鏈基因座導(dǎo)向載體的克隆方法。在這里，以DFL16.1-JH4重排基因座為例，示出了DJH重排鼠IgH鏈基因座的一種可能的導(dǎo)向構(gòu)建體的詳細(xì)的克隆方法。其他DJH重排的IgH鏈基因座可以用相同的導(dǎo)向載體導(dǎo)向。在所述內(nèi)源基因座上示出了獨(dú)特的限制位點(diǎn)(上部構(gòu)建體)，并且示出了通過PCR方法從基因組DNA克隆到空的陽性-陰性導(dǎo)向載體pBSL-flneo-DT4中的1523-3215bp的片段(參見圖6b，選擇pBSL-flneo-DT4作為多種不同的空導(dǎo)向載體的一種例子)。將短臂和長(zhǎng)臂的PCR引物設(shè)計(jì)成包括用于將所述片段克隆到BSL-fineo-DT4上的獨(dú)特的和相容的限制位點(diǎn)上的片段的NotI和AscI限制位點(diǎn)。在底部示出了最終定向構(gòu)建體的組構(gòu)，并且標(biāo)出了選擇的限制位點(diǎn)的位置。
圖5b表示用于構(gòu)建IgκL鏈基因座導(dǎo)向載體的克隆方法。在這里示出了用于構(gòu)建一種可能的導(dǎo)向構(gòu)建體的詳細(xì)克隆方法，這種構(gòu)建體用于被設(shè)計(jì)成用來定向缺失所有種系JK基因片段的鼠IgκL鏈基因座。在所述內(nèi)源基因座上示出了獨(dú)特的限制位點(diǎn)(上部構(gòu)建體)，并且示出了通過PCR方法從基因組DNA克隆到空的陽性-陰性導(dǎo)向載體pBSL-fineo-DT4上的739-3379bp的片段(參見圖6b，選擇pBSL-flneo-DT4作為多種不同空的導(dǎo)向載體的一種例子)，如圖5a所示，將用于短臂和長(zhǎng)臂的PCR引物設(shè)計(jì)成包括用于將短臂和長(zhǎng)臂克隆到所述片段克隆到pBSL-flneo-DT4的相容性限制位點(diǎn)上的NotI和AscI限制位點(diǎn)。在底部示出了最終的定向構(gòu)建體的組構(gòu)，并且標(biāo)出了選擇的限制位點(diǎn)的位置。
圖5c表示用于構(gòu)建RAG基因座導(dǎo)向載體的克隆方法。在這里示出了用于構(gòu)建鼠RAG基因座的一種可能的定向構(gòu)建體的詳細(xì)克隆方法，該構(gòu)建體用于被設(shè)計(jì)成用來定向缺失RAG-1基因。小鼠體內(nèi)的RAG基因座位于2號(hào)染色體上，并且包括兩個(gè)連鎖非常緊密的基因RAG-1和RAG-2，它們都是Ig基因重排所必需的。這兩個(gè)基因的開放讀框(ORFs)是由單個(gè)外顯子編碼的，不過，將每一個(gè)啟動(dòng)子元件下游的短的未翻譯的外顯子(用三角形表示)剪接成一個(gè)含有完整RAG ORFs的大的外顯子。在所述內(nèi)源基因座上示出了獨(dú)特的限制位點(diǎn)(上部構(gòu)建體)。如圖所示，通過PCR方法，分別將位于RAG-1 ORF上游和下游的1078和2950bp的基因組區(qū)從基因組DNA上克隆到空的陽性-陰性導(dǎo)向載體pBSL-flneo-DT4上(有關(guān)pBSL-flneo-DT4，參見圖6b，選擇它作為多種不同的空的導(dǎo)向載體的一種例子)。如圖5a所示，將短臂和長(zhǎng)臂的PCR引物設(shè)計(jì)成包括用于將短臂和長(zhǎng)臂克隆到pBSL-flneo-DT4的相容性限制位點(diǎn)的NotI和AscI限制位點(diǎn)，在下部示出了最終定向構(gòu)建體的組構(gòu)，并且示出了選擇的限制位點(diǎn)的位置。
圖6a表示基于用于基因?qū)虻年栃?陰性載體的有關(guān)DT-α和DT-α(tox176)的詳細(xì)克隆方法(預(yù)備步驟)。制備空的導(dǎo)向載體的先決條件是，延伸諸如pBluescript的常規(guī)克隆質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(MCS)，以便在所述多接頭上增加額外的有用的限制位點(diǎn)，然后可將它用于插入陽性和陰性選擇標(biāo)記的表達(dá)盒，以及通過同源重組插入內(nèi)源基因座的導(dǎo)向所必需的基因組區(qū)。在這里示出了將具有額外限制位點(diǎn)的額外寡聚體插入pBluescript的MCS，以便制備具有延長(zhǎng)的多接頭的質(zhì)粒pBSL。將這種構(gòu)建體用于插入β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒，該表達(dá)盒是用于野生型白喉毒素α或它的減毒形式，表示為DTα(tox176)(參見例5b，步驟2)。將具有延伸的多克隆位點(diǎn)的這兩種構(gòu)建體分別命名為pBSL-DT4(底部，左側(cè))和pBSL-DT4tox176(底部，右側(cè))。如圖所示，用XbaI和BglII限制位點(diǎn)將白喉毒素表達(dá)盒克隆到pBSL上。還示出了減毒的DTtox176表達(dá)盒所特有的診斷性NheI限制位點(diǎn)。
圖6b表示用于基因?qū)虻幕贒T-α和DT-α(tox176)的陽性-陰性載體的詳細(xì)克隆方法(最終的克隆步驟)。披露了空的陽性-陰性導(dǎo)向載體的克隆，所述載體包括新霉素，潮霉素B，或嘌呤霉素作為陽性選擇標(biāo)記，并且包括野生型白喉毒素α表達(dá)盒?？梢詫⑾嗤目寺》椒ㄓ糜诤蠨T-α(tox176)的表達(dá)盒的載體。示出了用于片段克隆和構(gòu)建體線性化的限制酶。將所有陽性選擇標(biāo)記設(shè)計(jì)成其側(cè)翼為loxP位點(diǎn)(floxed)，該位點(diǎn)可以被cre重組酶識(shí)別。盡管floxed新霉素表達(dá)盒可以從現(xiàn)有載體pGL2-neo(m)+(DSM 14705)中再次克隆，floxed潮霉素B和floxed嘌呤霉素表達(dá)盒需要分兩個(gè)步驟插入。為此，將含有通過MluI位點(diǎn)隔開的兩個(gè)loxP位點(diǎn)的合成DNA寡聚體插入pBSL-DT4，以便制備pBSL-DT4-2loxP，如圖所示。在最后的步驟中，將潮霉素B和嘌呤霉素抗性的表達(dá)盒通過PCR方法克隆到pBSL-DT4-2loxP的獨(dú)特的MluI位點(diǎn)。
圖7a表示人IgH鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的示意性組構(gòu)。允許表達(dá)人IgH鏈蛋白的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有包括Ig基因座啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及IgH鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)。IgH表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄方向與逆轉(zhuǎn)錄病毒5′LTR啟動(dòng)子元件的方向相反，以便賦予基于Ig特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的B細(xì)胞特異性表達(dá)模式。所述表達(dá)盒包括鼠VH啟動(dòng)子，具有編碼IgH可變區(qū)的VDJ外顯子的前導(dǎo)(L)序列，鼠內(nèi)含子重鏈增強(qiáng)子(EμH)，編碼異源IgH鏈的恒定區(qū)的外顯子，編碼免疫球蛋白的跨膜區(qū)的外顯子，以及來自鼠IgH 3′α增強(qiáng)子的元件?？梢岳卯a(chǎn)生相容性突出末端的限制酶，將不同的L-VDJ區(qū)，甚至是L-VDJ區(qū)的文庫克隆到IgH表達(dá)載體的獨(dú)特的BamHI和HindIII限制位點(diǎn)。由于所述標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，可以用簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)置換恒定區(qū)外顯子或增強(qiáng)子元件(如圖中所示)。
圖7b表示人IgκL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的示意性組構(gòu)。與圖7a所示載體相同，允許表達(dá)人IgκL鏈蛋白的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有包括IgL鏈特異性基因座啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及IgκL鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)的類似標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)。IgκL表達(dá)盒的轉(zhuǎn)錄方向與逆轉(zhuǎn)錄病毒5′LTR啟動(dòng)子元件的方向相反，以便賦予基于Ig特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件的B細(xì)胞特異性表達(dá)模式。如圖所示，所述表達(dá)盒包括鼠Vκ啟動(dòng)子，具有編碼IgκL可變區(qū)的VJ外顯子的前導(dǎo)(L)序列，鼠κ內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE)，編碼異源IgL鏈的恒定區(qū)的外顯子，來自鼠IgK3′增強(qiáng)子(K3′E)的元件。另外，逆轉(zhuǎn)錄病毒IgκL鏈表達(dá)載體包括完整的嘌呤霉素表達(dá)盒，使得能夠選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的preB細(xì)胞。利用產(chǎn)生相容性突出末端的限制酶，可以將不同的L-VJ區(qū)，甚至是L-VJ區(qū)的文庫，克隆到IgH表達(dá)載體的獨(dú)特的BamHI和HindIII限制位點(diǎn)。由于所述標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，可以利用簡(jiǎn)單的分子生物學(xué)技術(shù)取代修飾過的恒定區(qū)外顯子或增強(qiáng)子元件(如圖所示)。
圖8表示用編碼異源IgH和IgL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)鼠基質(zhì)細(xì)胞/IL7依賴性preB細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的程序。如圖所示，可以用編碼IgL鏈和IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體順序轉(zhuǎn)導(dǎo)具有影響內(nèi)源Ig基因重排的長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞/IL7依賴性preB細(xì)胞系(參見圖3)。在用第一異源IgL和IgH鏈表達(dá)逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體順序轉(zhuǎn)導(dǎo)之后，所述細(xì)胞具有在細(xì)胞在體外和體內(nèi)分化時(shí)表達(dá)異源抗體的潛力(參見圖10)。
圖9是可以分離可變區(qū)編碼區(qū)的來源的示意性概況圖。如圖所示，可變區(qū)編碼區(qū)可以從很多不同的來源分離。所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，使得能夠從現(xiàn)有的有用的單克隆抗體克隆編碼諸如單特異性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。在轉(zhuǎn)導(dǎo)所述載體，并且將轉(zhuǎn)導(dǎo)過的細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)時(shí)(參見圖10)，單特異性然后可能經(jīng)歷親和力成熟。另外，可以從來自健康的，患病的，或免疫過的患者體內(nèi)的外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)中分離完整的VDJ和VJ文庫，然后克隆到IgH和IgL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體中。事實(shí)上，甚至可能制備完全合成的VH和VL區(qū)所有組成成分，可將它克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒Ig表達(dá)載體上，然后可以對(duì)它進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且在體內(nèi)進(jìn)行功能性選擇(參見圖10)。
圖10表示將HupreBs移植到免疫缺陷型小鼠體內(nèi)，以便生產(chǎn)完全的人單克隆抗體。與正常的鼠preB細(xì)胞類似，HupreB細(xì)胞可以移植到鼠宿主體內(nèi)，在這里，它們能夠參與所述宿主的免疫應(yīng)答。如果將HupreB細(xì)胞移植到缺少內(nèi)源B細(xì)胞的免疫缺陷型宿主體內(nèi)，能夠產(chǎn)生的唯一的抗體，是來自移植的HupreB細(xì)胞的異源(人類)抗體。有很多種不同的宿主株可用于移植HupreB細(xì)胞。例如，缺少B和T淋巴細(xì)胞的株是RAG-1-和RAG-2-缺陷型和scid小鼠株。為了能夠誘導(dǎo)涉及源于移植的HupreB細(xì)胞的B淋巴細(xì)胞的T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，可以分離T輔助淋巴細(xì)胞群，并且共同移植到所述小鼠體內(nèi)(左側(cè))。另外，通過僅移植HupreB細(xì)胞可以重建僅缺乏B淋巴細(xì)胞的小鼠株，如JH缺陷型小鼠(右側(cè))。在移植之后，一旦重建了外周B和T淋巴細(xì)胞區(qū)室，可以用針對(duì)任何需要的抗原的常規(guī)免疫方案對(duì)所述小鼠進(jìn)行免疫。然后可以將源于所述小鼠的漿細(xì)胞永生化，例如，通過與骨髓瘤細(xì)胞融合，以便產(chǎn)生能夠永久性分泌對(duì)注射的免疫原性化合物或組合物特異的異源(人類)單克隆抗體的(雜交瘤)細(xì)胞。
圖11a表示用于抗-細(xì)胞程序死亡基因bcl-2的組成型表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟)。從連續(xù)增殖的體外preB細(xì)胞培養(yǎng)物中除去IL-7，導(dǎo)致了preB細(xì)胞的分化，不過，與此同時(shí)，還導(dǎo)致了細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)。通過抗-細(xì)胞程序死亡基因，如bcl-2的組成型表達(dá)，能夠抑制這種細(xì)胞程序死亡。為了制備bcl-2的可選擇的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，用潮霉素B開放讀框?qū)⑹骲cl-2cDNA依次克隆到雙重基因表達(dá)載體piRES中。該載體包括其側(cè)翼為兩個(gè)多克隆位點(diǎn)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列，可以將兩個(gè)不同的基因克隆到它里面。這使得能夠從一個(gè)啟動(dòng)子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)兩個(gè)基因。示出了用于將bcl-2ORF和潮霉素B選擇標(biāo)記基因克隆到piRES載體中，以便制備pBcl2-IRES-hygroB載體。
圖11b表示用于組成型表達(dá)抗-細(xì)胞程序死亡基因bcl-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(最終的克隆步驟)。在組裝源于bcl-2-IRES-潮霉素B盒的CMV啟動(dòng)子之后，以SalI-ClaI片段形式，將來自pBcl2-IRES-hygroB載體的完整的雙重表達(dá)盒，重新克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體pLIB上，如圖所示。由此產(chǎn)生了重組逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pLIB-Bcl2-IRES-hygroB，可將這種構(gòu)建體用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)preB細(xì)胞，并且賦予bcl-2和對(duì)潮霉素B的抗性的同時(shí)表達(dá)。
圖12a解釋了用于表達(dá)人IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟I)。將各種IgH啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及不同的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)依次克隆到諸如質(zhì)粒pLIB的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體上。這種質(zhì)粒含有逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝和原病毒整合所需要的所有元件，即克隆到細(xì)菌中的5′LTR，包裝信號(hào)，和3′LTR，具有ColE1復(fù)制起點(diǎn)的氨芐青霉素選擇質(zhì)粒主鏈(如圖所示)。圖中示出了用于插入VH啟動(dòng)子，鼠重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(EμH)，包括側(cè)翼基質(zhì)連接區(qū)(MAR)和IgH鏈3′α增強(qiáng)子(3′αE)的第一個(gè)克隆步驟。突出顯示了整合在PCR擴(kuò)增片段末端的限制酶，以及所述質(zhì)粒主鏈上的獨(dú)特的相容性限制酶位點(diǎn)，該位點(diǎn)可用于多個(gè)克隆步驟。
圖12b解釋了用于表達(dá)人IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟II)。IgH 3′α增強(qiáng)子包括四個(gè)功能區(qū)，在末端B細(xì)胞分化期間激活所述增強(qiáng)子時(shí)，這些功能區(qū)變得對(duì)DNaseI消化敏感，并因此被稱為超敏性區(qū)HS1，2，3和4。所述每一個(gè)HS區(qū)賦予了3′αE的增強(qiáng)子活性，不過，大部分增強(qiáng)子活性是由HS1，2區(qū)賦予的。盡管3′αE的HS1，2區(qū)本身能夠啟動(dòng)報(bào)導(dǎo)基因表達(dá)達(dá)到與完整3′αE區(qū)幾乎相同的水平，對(duì)某些逆轉(zhuǎn)錄病毒IgH表達(dá)構(gòu)建體來說，可能需要包括3′αE的其他功能區(qū)。因此，在這里示出了3′αE的HS3和HS4區(qū)的克隆。突出顯示了整合在基因組PCR片段末端的限制酶，以及所述質(zhì)粒主鏈上的相容性限制酶位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可用于多個(gè)克隆步驟。
圖12c表示用于表達(dá)人IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟III)。在將IgH啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體之后，需要插入IgH鏈的編碼區(qū)。為了能夠表達(dá)膜結(jié)合的，以及分泌形式的免疫球蛋白，在所述逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體上需要包括IgH鏈的跨膜區(qū)。在不同的同種型之間，所述跨膜區(qū)在長(zhǎng)度，一級(jí)序列和外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)方面明顯不同。因此，需要克隆IgM，IgG，IgA和IgE重鏈的不同的跨膜區(qū)。作為一種例子，示出了PCR克隆和將四種相應(yīng)的不同的跨膜區(qū)插入質(zhì)粒pAB-3中的過程?？梢杂煤蠭gH3′αE的延伸形式的載體pAB-4和pAB5進(jìn)行相同的克隆方法。突出顯示了整合在基因組PCR片段末端的限制酶，以及質(zhì)粒主鏈上的相容性限制酶位點(diǎn)，這些位點(diǎn)可用于多個(gè)克隆步驟。
圖12d表示用于表達(dá)人IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟IV)。人B淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生四種不同的IgG同種型，IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，這些同種型只是在序列上稍有差別，并且具有不同的生理學(xué)效應(yīng)物功能。圖中示出了將所述恒定區(qū)基因克隆到已經(jīng)包含了IgG跨膜外顯子的中間載體pAB-3.2。示出了內(nèi)源外顯子/內(nèi)含子組構(gòu)，它包括編碼各種IgG同種型的鉸鏈(H)區(qū)的外顯子。示出了整合在基因組PCR片段末端的限制酶，以及位于質(zhì)粒主鏈上的獨(dú)特的相容性限制酶位點(diǎn)，可將所述位點(diǎn)用于多個(gè)克隆步驟。在克隆VDJ重排的可變區(qū)外顯子時(shí)，所述構(gòu)建體能夠表達(dá)完整的IgG鏈(參見圖15)。
圖12e表示用于表達(dá)人IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟V)。圖中示出了編碼其余的人Ig同種型IgM，IgA1，IgA2，和IgE的恒定區(qū)基因的克隆。與圖12d所示的IgG恒定區(qū)基因的克隆方法類似，將這些同種型的基因組區(qū)以NotI消化的PCR片段形式插入所述同種型的相應(yīng)的跨膜外顯子上游的獨(dú)特的NotI限制位點(diǎn)。示出了各種Ig同種型的包括編碼鉸鏈(H)區(qū)的外顯子的內(nèi)源外顯子/內(nèi)含子組構(gòu)。示出了整合在基因組PCR片段末端的限制酶，以及所述質(zhì)粒主鏈上的獨(dú)特的相容性限制酶位點(diǎn)，可將這些位點(diǎn)用于各種克隆步驟中。在克隆VDJ重排的可變區(qū)外顯子時(shí)，所述構(gòu)建體能夠表達(dá)相應(yīng)同種型的完整的IgH鏈(參見圖15)。
圖13a表示用于表達(dá)人1gκL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟I)。與表達(dá)IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建類似，IgκL鏈的表達(dá)載體除了κL鏈蛋白的編碼區(qū)之外，需要κL鏈基因座特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，隨后需要將其克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體上。如圖所示，從基礎(chǔ)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLIB開始，首先將Vκ啟動(dòng)子克隆到pLIB上。隨后插入含有人κ內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE，具有它的上游基質(zhì)相關(guān)區(qū)，MAR)和人κL鏈恒定區(qū)基因(圖的左側(cè))的PCR產(chǎn)物，或者插入具有人κL鏈恒定區(qū)基因(圖的右側(cè))的小鼠κiE的融合PCR片段，該片段是通過單一重疊延伸(SOE)PCR制備的。將含有鼠κ3′增強(qiáng)子(κ3′E)的PCR產(chǎn)物插入這兩種構(gòu)建體中。示出了整合在各種基因組PCR片段末端的限制酶，以及位于所述質(zhì)粒主鏈上的獨(dú)特的相容性限制酶位點(diǎn)，可將這些位點(diǎn)用于多個(gè)克隆步驟中。
圖13b表示用于表達(dá)人1gκL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟II)。然后將用于人IgH和IgκL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)到preB細(xì)胞中，并且因此希望在用IgκL鏈表達(dá)載體進(jìn)行第一輪轉(zhuǎn)導(dǎo)之后能夠選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。為此，如圖所示，將SV40啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的嘌呤霉素表達(dá)盒插入兩種可能的IgκL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體中間體pAB-7.1和pAB-8.1中。在將VκJκ重排的可變區(qū)外顯子克隆到所述載體上時(shí)，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體能夠表達(dá)人IgκL鏈(參見圖15)。
圖14a表示用于表達(dá)人1gλL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟I)。通過以下方法克隆用于人IgλL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體體首先，將嘌呤霉素盒和Vλ啟動(dòng)子的融合PCR產(chǎn)物插入pLIB(所述PCR融合是通過單一重疊延伸(SOE)PCR進(jìn)行的，正如在實(shí)施例部分所述)。如圖所示，在下一個(gè)步驟中，將兩個(gè)鼠λL鏈增強(qiáng)子元件，λ2-4和λ3-1增強(qiáng)子的SOE-PCR融合構(gòu)建體插入所述構(gòu)建體。最后，使用所標(biāo)明的限制酶，通過PCR克隆將所述人Cλ1區(qū)的編碼區(qū)插入該逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體。在將VλJλ重排的可變區(qū)外顯子克隆到所述載體上時(shí)，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體能夠表達(dá)人IgλL鏈(參見圖15)。
圖14b表示用于表達(dá)人1gλL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建(預(yù)備步驟II)。如圖所示，通過用獨(dú)特的MluI-NotI限制酶簡(jiǎn)單地克隆，將其他的人IgλL鏈恒定區(qū)基因用于取代Jλ編碼區(qū)。在將VλJλ重排的可變區(qū)外顯子克隆到所述載體上時(shí)，這些逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體能夠表達(dá)不同的人IgλL鏈同種型(參見圖15)。
圖15a表示將V-區(qū)基因插入逆轉(zhuǎn)錄病毒人IgH，IgκL和IgλL鏈表達(dá)載體中。迄今為止業(yè)已披露的用于人IgH和L鏈的所有逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體都不包括所述可變區(qū)的編碼區(qū)。所述結(jié)構(gòu)域可以通過PCR克隆從各種來源中分離(例如，參見圖9)，并且可以作為編碼單一特異性的V區(qū)外顯子或作為編碼不同特異性的文庫插入所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(它需要用簡(jiǎn)并引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增)。如圖所示，V區(qū)是與它們的特有前導(dǎo)(L)序列一起通過PCR方法擴(kuò)增的。示出了可用于克隆可變區(qū)外顯子的限制酶。該附圖示出了某些特定的最終逆轉(zhuǎn)錄病毒IgH和IgL鏈表達(dá)載體。由于所述載體的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，可以使用不同的編碼區(qū)和啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件。
在本說明書中所使用的術(shù)語的定義親和力抗原受體(或任何受體)與它的關(guān)聯(lián)抗原(或它的配體或結(jié)合配偶體)的結(jié)合強(qiáng)度，是通過受體-配體相互作用的締合速度與解離速度的比例而確定的。
親和力成熟在生發(fā)中心通過抗原刺激的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性的抗原驅(qū)動(dòng)的改良的高度調(diào)控的免疫學(xué)過程。這一過程是通過與選擇性擴(kuò)增和產(chǎn)生較高親和力抗體的B淋巴細(xì)胞的存活相關(guān)的抗體的可變區(qū)的編碼區(qū)內(nèi)的體細(xì)胞超變引起的。
抗體通過B淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞產(chǎn)生的糖基化多肽，它的單體形式包括兩個(gè)相同的重(H)鏈和兩個(gè)相同的輕鏈，每一條鏈包括一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)(L鏈)或若干(H鏈)恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。兩個(gè)H和兩個(gè)L鏈組裝成對(duì)稱的Y型二硫鍵連接的抗體分子，它具有通過H和L鏈的可變區(qū)組合形成的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
抗原能夠通過免疫球蛋白(或抗體)的可變區(qū)結(jié)合的任何生物分子或化學(xué)實(shí)體。
抗原受體抗原受體由可變區(qū)和恒定區(qū)組成，前者具有結(jié)合抗原的能力，而后者能介導(dǎo)效應(yīng)物功能或?qū)⑿盘?hào)傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)?？乖荏w包括T細(xì)胞受體和膜結(jié)合免疫球蛋白。
人工結(jié)合蛋白包括不是來自天然基因或它的片段的多肽序列(例如合成的間隔區(qū)序列)的結(jié)合蛋白。
結(jié)合蛋白具有選擇性地結(jié)合抗原或配體能力，有或沒有額外效應(yīng)物功能的所有類型多肽的最通用的術(shù)語。結(jié)合蛋白包括人工結(jié)合蛋白，抗體的片段，例如單鏈可變片段(scFv)，還包括組合了免疫球蛋白的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域和T細(xì)胞受體的融合產(chǎn)物，或者反之亦然。另外，結(jié)合蛋白可以是具有其他受體分子的功能性部分的可變區(qū)的融合產(chǎn)物。相反，結(jié)合蛋白可以是來自非-Ig或TCR相關(guān)受體的結(jié)合部分與抗原受體的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的融合體。
順式作用只對(duì)相同等位基因上的或附近的遺傳元件和基因座有影響。
編碼區(qū)具有能夠表達(dá)成多肽的具有開放讀框的遺傳元件。
互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)可變抗原受體結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)上的可直接建立與抗原的聯(lián)系的區(qū)。CDRs通常是抗原受體的最多變的部分。
結(jié)構(gòu)域生物分子的結(jié)構(gòu)部分，它以特殊的三維結(jié)構(gòu)為特征(例如，免疫球蛋白的可變區(qū)或恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上是相關(guān)的，如Ig-樣結(jié)構(gòu)域可以在免疫系統(tǒng)的很多分子中見到，它屬于所謂的Ig-超家族)。
效應(yīng)物功能免疫球蛋白恒定區(qū)在免疫系統(tǒng)內(nèi)的功能，例如，激活互補(bǔ)體的能力，或通過與恒定區(qū)的特異性受體(Fc受體)結(jié)合激活某些免疫細(xì)胞。
內(nèi)源的某些細(xì)胞或生物自身的。
增強(qiáng)子可以在大的距離上，不依賴于方向或位置刺激啟動(dòng)子元件的活性的遺傳元件。
表位由抗體的可變結(jié)合區(qū)識(shí)別的抗原的三維結(jié)構(gòu)實(shí)體。
(抗體，抗原受體或結(jié)合蛋白的)功能性片段。功能性片段可源于選自下組的特定多肽抗體，抗原受體和結(jié)合蛋白，就特定的應(yīng)用領(lǐng)域而言，它們共有所述多肽所固有的至少一種需要的特征。例如，功能性片段可以是保留了所述多肽結(jié)合某些抗原和/或配體的能力的多肽或寡肽。相同的原理適用于能介導(dǎo)所述多肽所特有的特異性效應(yīng)物功能的片段。與片段相關(guān)的其他例子能夠激活或抑制抗體，抗原受體和常規(guī)受體-配體系統(tǒng)的特殊免疫原性和/或生理學(xué)效應(yīng)物功能。
遺傳元件獨(dú)立的或任何功能性或非功能性組合形式的基因，基因座，或其片段，如啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，和編碼區(qū)。
生發(fā)中心外周淋巴器官(例如淋巴結(jié)或脾臟)中的獨(dú)特的組織結(jié)構(gòu)，其中，發(fā)生了抗原呈遞細(xì)胞和不同的淋巴細(xì)胞群之間的關(guān)聯(lián)的相互作用，導(dǎo)致了抗原反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的增殖性擴(kuò)增，以及通過抗原反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體的親和力成熟和類別轉(zhuǎn)換重組。
種系構(gòu)型基因和基因座的天然構(gòu)型，它是從親本那里遺傳下來的，并且通過種系可以傳遞給下一代。發(fā)生在體細(xì)胞內(nèi)的DNA重組事件，如發(fā)生在淋巴細(xì)胞內(nèi)的V(D)J重組，導(dǎo)致了某些基因座上的遺傳信息的重新改組或喪失，從而改變所述基因的種系構(gòu)象。
異源的是與內(nèi)源不同的。
人源化抗體通過將非人抗體的可變區(qū)融合在人恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域上制備的人工抗體。
雜交瘤通過融合永生化骨髓瘤細(xì)胞系(不能分泌抗體)和永生化漿細(xì)胞(可以分泌大量抗體)而制備的永生化細(xì)胞系。
獨(dú)特型抗原受體的結(jié)合特征(特異性)。
同種型由決定其(效應(yīng)物)功能的抗原受體的恒定區(qū)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)特征。
免疫球蛋白(Ig)是抗體的同義詞。
免疫球蛋白微基因座包括若干(即單一位數(shù))V，D和/或J基因片段的人工遺傳構(gòu)建體，它能夠進(jìn)行V(D)J重組，以便產(chǎn)生可變編碼區(qū)的有限的寡克隆所有組成成分。
文庫不同遺傳元件的總稱。
單克隆抗體具有由所述抗體的可變抗原結(jié)合區(qū)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)決定的一種確定的特異性的抗體。
骨髓瘤細(xì)胞源于處在漿細(xì)胞分化階段的細(xì)胞的永生化細(xì)胞，它沒有表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的能力。
多克隆抗體具有不同的可變抗原結(jié)合區(qū)結(jié)構(gòu)的抗體的混合物，因此，很有可能具有不同的結(jié)合特異性。
PreB淋巴細(xì)胞前體B淋巴細(xì)胞的特征是能表達(dá)與V(D)J重組相關(guān)的淋巴特異性因子(例如RAG-1，RAG-2)，通常在至少一個(gè)免疫球蛋白重鏈等位基因上啟動(dòng)了V(D)J重組，但是，仍然具有種系構(gòu)型中的輕鏈基因座，因此，不能表達(dá)完整的抗體。
初級(jí)淋巴器官一種器官，造血干細(xì)胞在其中發(fā)育成淋巴細(xì)胞，在小鼠和人體中，例如骨髓，胸腺，和在胎兒生命階段，如肝臟。
所有組成成分不同(結(jié)合)特異性的集合。
體細(xì)胞超變?cè)隗w細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的誘導(dǎo)以高頻率(＞10-4突變/堿基對(duì)/細(xì)胞分裂)將點(diǎn)突變導(dǎo)入基因組的特定區(qū)域的一種過程。
基質(zhì)細(xì)胞源于骨髓的增殖性粘附細(xì)胞，在存在額外preB細(xì)胞生長(zhǎng)因子的條件下具有支持preB細(xì)胞增殖的能力。
反式作用對(duì)位于不同染色體上的遺傳元件和基因座具有影響。
轉(zhuǎn)染將核酸序列導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程，通常與使用化學(xué)和物理方法相關(guān)。
轉(zhuǎn)化使細(xì)胞永生化的過程，以便建立連續(xù)增殖的細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)基因?qū)雱?dòng)物種系的人工遺傳元件。因此，所述轉(zhuǎn)基因可以從一代遺傳到下一代。
轉(zhuǎn)導(dǎo)通過重組病毒的產(chǎn)生將DNA送遞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的過程。為此，用重組病毒DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)染表達(dá)病毒顆粒結(jié)構(gòu)蛋白的包裝細(xì)胞系，所述構(gòu)建體包括用于將所述病毒DNA構(gòu)建體包裝到病毒結(jié)構(gòu)蛋白中的調(diào)節(jié)元件。通過這種方法，生產(chǎn)了重組病毒，可將這種病毒用于感染哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞，以便導(dǎo)入克隆到所述重組病毒基因組中的遺傳信息。
V(D)J重組DNA重組過程，在該過程中，很多V(可變的)，有時(shí)D(多樣性)，和J(連接)基因片段之一組裝至抗原受體的可變區(qū)的編碼區(qū)。
載體人工制備的核酸構(gòu)建體，可將其用于在不同的生物和物種之間轉(zhuǎn)運(yùn)核酸元件，并且，還可將它用于繁殖，擴(kuò)增和保持基因組信息。
異種的源于不同物種的(通常作為異源的同義詞使用)。
在本說明書中所引用的所有參考文獻(xiàn)都被收作本文參考。
發(fā)明詳述根據(jù)第一方面，本發(fā)明提供了一種用于制備脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞的方法，可將其用于生產(chǎn)任何異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段，包括以下步驟(a)通過導(dǎo)入編碼至少一種異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的至少一種外源遺傳元件對(duì)脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，所述淋巴細(xì)胞(i)源于初級(jí)淋巴器官，和(ii)具有分化成成熟的淋巴系細(xì)胞的潛力；以及(b)在體外或體內(nèi)實(shí)現(xiàn)將所述遺傳修飾過的前體淋巴細(xì)胞分化成成熟的淋巴系細(xì)胞，以便制備能夠生產(chǎn)所述異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的淋巴細(xì)胞。
為了實(shí)現(xiàn)上述異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的大規(guī)模生產(chǎn)，優(yōu)選將能生產(chǎn)感興趣的多肽的最終分化的淋巴細(xì)胞永生化，或者分離編碼所述異源抗體或結(jié)合蛋白的遺傳信號(hào)，并且從所述細(xì)胞中轉(zhuǎn)移到不同的表達(dá)系統(tǒng)中。在這里可以保持，擴(kuò)增所述遺傳信號(hào)和/或用于生產(chǎn)相應(yīng)的免疫球蛋白樣蛋白或其功能性片段。
所述淋巴細(xì)胞的永生化，優(yōu)選可以通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(a)將所述淋巴細(xì)胞與永生的骨髓瘤細(xì)胞融合，以便制備雜交瘤細(xì)胞；(b)用轉(zhuǎn)化病毒，如Abelson鼠白血病病毒(A-MuLV)轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞；或(c)用合適的載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，確保至少一種轉(zhuǎn)化癌基因的表達(dá)，如v-ab1，或SV40大T抗原，在所述基因超量表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的永生化。
以便制備能夠永久性生產(chǎn)所述異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞能夠表達(dá)淋巴V(D)J重組機(jī)制的至少一種成分，并且源于有顎脊椎動(dòng)物，包括軟骨魚，硬骨魚，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥類，哺乳動(dòng)物，包括豬，綿羊，牛，馬和嚙齒動(dòng)物，包括小鼠，大鼠，兔和豚鼠，優(yōu)選來自小鼠的鼠前體(pre)B淋巴細(xì)胞。
在從人類到進(jìn)化上最原始的軟骨魚類的所有有顎的脊椎動(dòng)物物種的原始前體B淋巴細(xì)胞的特征，不僅是能表達(dá)特殊類型的細(xì)胞表面標(biāo)記(如在小鼠體內(nèi)B220和c-kit的組合)，而且還在于它們組裝編碼抗體的可變區(qū)的基因片段的潛力，對(duì)所述抗體來說，它們表達(dá)V(D)J重組機(jī)制的淋巴特異性成分，如RAG-1，RAG-2，和TdT(末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶)。盡管諸如鳥類的某些物種具有不同的初級(jí)淋巴器官(例如，法氏囊)，在這里產(chǎn)生了所述前體B淋巴細(xì)胞，盡管事實(shí)是，除了V(D)J重組之外，其他物種還利用不同的機(jī)制使抗體多樣化，如體細(xì)胞超變(如綿羊)或基因轉(zhuǎn)化(例如兔)，來自所有脊椎動(dòng)物物種的前體B淋巴細(xì)胞能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且具有分化成更成熟的B系細(xì)胞的潛力，以便能夠表達(dá)通過VDJ重排的免疫球蛋白基因座產(chǎn)生的抗體。因此，如果所述分離或制備的脊椎動(dòng)物前體B淋巴細(xì)胞不能表達(dá)內(nèi)源抗體，并且如果編碼異源免疫球蛋白基因座的所有部分的遺傳元件被穩(wěn)定導(dǎo)入所述淋巴細(xì)胞，它們將獲得生產(chǎn)異源抗體的潛力，因此，屬于本發(fā)明的范圍。
本發(fā)明的方法利用了存在于初級(jí)淋巴器官中的脊椎動(dòng)物前體B(preB)淋巴細(xì)胞。對(duì)于小鼠來說，所述細(xì)胞可以從胎肝或成體骨髓中分離，例如，通過用常規(guī)標(biāo)記的抗體進(jìn)行制備性細(xì)胞分選，結(jié)合到小鼠preB細(xì)胞上的諸如細(xì)胞表面標(biāo)記B2和C-kit上；或者，由于它們對(duì)骨髓衍生的飼養(yǎng)(基質(zhì))細(xì)胞，和諸如白介素-7和白介素-3的生長(zhǎng)因子的強(qiáng)的增殖反應(yīng)，它們能夠從鼠胎肝或骨髓細(xì)胞中選擇性地生長(zhǎng)。
就V(D)J重組細(xì)胞系的淋巴成分的表達(dá)而言，分化成成熟淋巴系細(xì)胞的潛力和抗原受體蛋白多樣化的遺傳學(xué)機(jī)制，T系淋巴細(xì)胞與B系淋巴細(xì)胞非常相似。因此，可以理解的是，本文所披露的用于對(duì)前體B淋巴細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便生產(chǎn)異源抗體或結(jié)合蛋白的方法，同樣可應(yīng)用于前體T淋巴細(xì)胞。因此，本發(fā)明的方法主要是結(jié)合鼠preB淋巴細(xì)胞披露的，但它還可應(yīng)用于源于如上文所述的所有有用脊椎動(dòng)物的所有脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解的是，將任何其他前體淋巴細(xì)胞系用于實(shí)施本發(fā)明的原理僅僅取決于抑制內(nèi)源抗體表達(dá)和將編碼異源抗體或結(jié)合蛋白的內(nèi)源遺傳元件導(dǎo)入所述細(xì)胞的可行性。由于本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解所述原理的廣泛的可應(yīng)用性，支持本發(fā)明的一般概念，主要是結(jié)合鼠前體B(preB)淋巴細(xì)胞的應(yīng)用進(jìn)行說明的。
在小鼠體內(nèi)，從造血干細(xì)胞發(fā)育成抗體分泌性漿細(xì)胞，是一個(gè)高度調(diào)控的過程，并且，在體內(nèi)，取決于基因片段在免疫球蛋白受體基因座上的有序重排和來自生產(chǎn)性重排的Ig基因座的免疫球蛋白的受控表達(dá)(圖2)。通常，重排首先發(fā)生在IgH鏈基因的兩個(gè)等位基因上，首先是D到JH基因片段的重排，隨后是VH到DJH基因的重排(圖2)。如果在一個(gè)等位基因上發(fā)生了生產(chǎn)性VHDJH重排，μH鏈可以作為與替代L鏈配對(duì)的preB細(xì)胞受體在所述細(xì)胞表面上表達(dá)(由preB細(xì)胞特異性基因λ5和VpreB編碼)(Karasuyama等，Adv.Immunol.，63，1-41，1996)。PreB細(xì)胞受體的表達(dá)，使得preB細(xì)胞分化到一種階段，在此階段，啟動(dòng)了VL到JL的重排，這種重排通常首先發(fā)生在κL鏈等位基因上，隨后發(fā)生在λL鏈等位基因上(Melchers等，Ann.Rev.Immunol.，12，p.209-225，1994)。如果發(fā)生了生產(chǎn)性IgL鏈表達(dá)，可以通過所謂的不成熟的B細(xì)胞，表達(dá)膜結(jié)合IgM和/或IgD抗體。用合適的信號(hào)刺激外周IgM/IgD陽性成熟的B細(xì)胞，可以導(dǎo)致在IgH鏈等位基因上發(fā)生類型轉(zhuǎn)變重組，這種重組能使所表達(dá)的抗體的同種型改變成任何IgG，IgA，IgE亞型(在小鼠體內(nèi)IgG1，IgG2a，IgG2e，IgG3，IgA，IgE，在人體內(nèi)IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1，IgA2，IgE)(圖1)。
正如前面已經(jīng)提到過的，適合實(shí)施本發(fā)明的鼠preB細(xì)胞具有以下特征表達(dá)B220和C-kit表面標(biāo)記，表達(dá)淋巴V(D)J重組基因RAG-1和RAG-2的至少一種，以及反應(yīng)于基質(zhì)細(xì)胞和/或IL7或IL3的較長(zhǎng)時(shí)間增殖的能力(Rolink等，EMBO J.，10，p.327-336，1991；Winkler等，Blood，85，p.2045-2051，1995)。如果preB細(xì)胞系和克隆是用野生型小鼠建立，它們通常攜帶位于兩個(gè)IgH鏈等位基因上的DJH重排(Alt等，EMBO J.，3，p.1209-1219，1984)，或者在某些場(chǎng)合下，具有非生產(chǎn)性VHDJH重排(圖2)。不過，它們的IgH鏈等位基因的重排不是用具有preB細(xì)胞表型的小鼠建立基質(zhì)細(xì)胞，IL7或IL3反應(yīng)性細(xì)胞所必需的，因?yàn)樗黾?xì)胞還可以用V(D)J重組缺陷型突變小鼠株建立(Grawunder等，International Immunology，7，p.1915-25，1995)。在任何場(chǎng)合下，無論Ig基因重排preB細(xì)胞的潛力如何，都保留了在體外分化成更成熟的B系細(xì)胞的潛力，并最終分化成同種型-轉(zhuǎn)換的漿細(xì)胞(Rolink等，Immunity，5，p.319-330，1996)。
可以用小鼠的各種淋巴器官建立長(zhǎng)期增殖的鼠preB細(xì)胞系和克隆，包括胎肝，胎血，胎脾和成體骨髓，不過，還包括具有基質(zhì)細(xì)胞，IL7或IL3反應(yīng)性preB細(xì)胞的其他胚胎或成體器官，特別是在生命的早期階段(小于4周齡)(Rolink等，Blood，81，p.2290-2300，1993)。
用于產(chǎn)生上述preB細(xì)胞的小鼠可以是野生型小鼠，嵌合小鼠，移植過的小鼠或具有妨礙內(nèi)源鼠Ig基因座上V(D)J重組的突變的小鼠株。上述突變可以是順式的，包括以下片段的缺失或發(fā)生在以下片段上的缺失IgH多樣性(D)基因片段，IgHJ基因片段(Chen等，Int.Immunol.，5，p.647-656，1993)，μH鏈恒定區(qū)，包括編碼μH跨膜錨的兩個(gè)外顯子(Kitamura和Rajewsky等，Nature，356，p.154-156，1992)，Igκ和IgλJ基因片段，κL鏈恒定區(qū)(Cκ)(Chen等，EMBO J.，12，p.821-830，1993)，λL鏈恒定區(qū)(Cλ1-4)和各種IgH和L鏈增強(qiáng)子，包括重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(EμH)，κ內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE)，3’κ增強(qiáng)子(3’κE)和兩個(gè)λ增強(qiáng)子(Eλ2-4和Eλ3-1)。
根據(jù)本發(fā)明，可以將攜帶上述任何順式作用突變的preB細(xì)胞用于導(dǎo)入包括部分或全部異源，特別是非重排的，即種系構(gòu)型的人免疫球蛋白基因座。可以將所述遺傳修飾過的preB細(xì)胞用于抗體特異性的從頭生產(chǎn)，因?yàn)樗鲂绿禺愋詢H在異源遺傳學(xué)免疫球蛋白基因座上發(fā)生的V(D)J重組時(shí)產(chǎn)生。
另外，合適的preB細(xì)胞還可以用由于反式作用突變而不能重排內(nèi)源免疫球蛋白基因座的小鼠制備，所述突變例如，發(fā)生在淋巴特異性重組激活基因RAG-1和RAG-2上的突變(Mombaerts等，Cell，68，p.869-877，1992；Shinkal等，Cell，68，p.855-867，1992)，或發(fā)生在普遍表達(dá)的DNA修復(fù)因子Ku70，Ku86，XRCC4，DNA連接酶IV，DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PKcs)的Artemis或催化性亞基上的突變，它們參與非同源性DNA末端連接，并且還是V(D)J重組所需要的。為了在具有所述反式作用突變的preB細(xì)胞中生產(chǎn)異源抗體和結(jié)合蛋白，所使用的表達(dá)構(gòu)建體不需要V，(D)和J基因片的DNA重排(參見下文)。
對(duì)于鼠類體內(nèi)的順式作用突變來說，在免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白κL鏈基因座上優(yōu)選必須最少包括(a)純合的突變。對(duì)于反式作用突變來說，特定preB細(xì)胞系上的一個(gè)上述純合突變，就足以排除作為本發(fā)明方法的基本要求的內(nèi)源免疫球蛋白的表達(dá)。
具有干擾內(nèi)源免疫球蛋白表達(dá)的順式或反式作用遺傳修飾的前體B淋巴細(xì)胞，可以從具有天然(例如scid小鼠)或人工產(chǎn)生的突變的小鼠體內(nèi)分離。另外，可以篩選來自野生型小鼠的preB淋巴細(xì)胞的位于它們的免疫球蛋白等位基因上的突變，排除內(nèi)源抗體的表達(dá)，例如位于兩個(gè)重鏈等位基因上的末端框外DJH重排?？梢詫⑵茐膬?nèi)源鼠抗體表達(dá)的突變導(dǎo)入造血干細(xì)胞或?qū)朐缙谧婕?xì)胞，可以用所述細(xì)胞通過體外或體內(nèi)分化制備合適的長(zhǎng)期增殖的preB細(xì)胞。
另外，前面所提到的遺傳學(xué)效應(yīng)，還可以直接導(dǎo)入要進(jìn)行遺傳修飾的前體淋巴細(xì)胞的至少一個(gè)等位基因。一個(gè)等位基因的失活，可以足以實(shí)施本發(fā)明，因?yàn)榭梢苑蛛x突變的克隆，它們?cè)谒銎渌任换蛏弦呀?jīng)具有了某些突變(雜合突變)，以便在本發(fā)明使用的所述前體淋巴細(xì)胞內(nèi)建立純合基因座。
盡管可以理解的是，本發(fā)明可以通過野生型前體淋巴細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，優(yōu)選的是，在本發(fā)明的方法中，所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞喪失了它們的表達(dá)內(nèi)源抗體和/或抗原受體或其功能性片段的潛力，這一目的是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的分離/選擇表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白或其片段缺陷的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，和/或?qū)⒅辽僖环N載體構(gòu)建體導(dǎo)入所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，所述載體構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成能功能性地使至少一個(gè)遺傳元件的至少一個(gè)等位基因失活，所述遺傳元件選自下組(a)免疫球蛋白重鏈基因座的編碼區(qū)，包括V，D，和J基因片段的全部或部分，以及μ，δ，γ，ε，和α重鏈的恒定區(qū)外顯子的任何編碼區(qū)，有或沒有它們的跨膜外顯子；(b)免疫球蛋白κ和/或λ輕鏈基因座的編碼區(qū)，包括V和J基因片段編碼區(qū)的任意一種，以及所述恒定區(qū)外顯子的任意一種；(c)T細(xì)胞受體α，β，γ，和δ基因座的編碼區(qū)，包括V，D和J基因片段的全部或部分，以及α，β，γ，和δ恒定區(qū)外顯子的任何編碼區(qū)；(d)順式作用免疫球蛋白重鏈基因座增強(qiáng)子元件，包括重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子和3′α增強(qiáng)子；(e)順式作用免疫球蛋白輕鏈基因座增強(qiáng)子元件，包括κ輕鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE)，3′κ增強(qiáng)子，和λ2-4和λ3-1增強(qiáng)子；(f)順式作用T細(xì)胞受體基因座增強(qiáng)子元件，包括TCRα，β，γ，和δ增強(qiáng)子；(g)反式作用重組激活基因，RAG-1和RAG-2，包括它們的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及它們的編碼區(qū)；和(h)V(D)J重組所需要的反式作用DNA修復(fù)基因，包括Ku70，Ku86，DNA-依賴性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化性亞基，DNA連接酶IV，XRCC4和Artemis，包括它們的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及所述基因的編碼區(qū)。
上述載體構(gòu)建體優(yōu)選包括基因?qū)蜉d體，該載體包括與所述至少一個(gè)遺傳元件同源的DNA序列區(qū)，優(yōu)選位于能夠選擇陽性轉(zhuǎn)染子的陽性選擇標(biāo)記側(cè)翼。例如，合適的導(dǎo)向載體包括具有高度序列同源性(＞99％)的兩個(gè)區(qū)，或與所導(dǎo)向的基因座具有序列同一性，優(yōu)選位于陽性選擇標(biāo)記(如抗生素抗性標(biāo)記)側(cè)翼，以便在每一個(gè)所述序列同源區(qū)上發(fā)生的雙交換事件能導(dǎo)致所述陽性選擇標(biāo)記的定向整合，并因此導(dǎo)致內(nèi)源基因的定向破壞(圖4a-c)。在所述導(dǎo)向載體中采用的陽性選擇標(biāo)記可以包括賦予諸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，組胺醇，霉酚酸，和zeocin等的抗生素抗性的表達(dá)盒。
所述基因?qū)蜉d體優(yōu)選還包括位點(diǎn)特異性DNA重組酶的一對(duì)DNA識(shí)別序列，位于所述陽性選擇標(biāo)記側(cè)翼，在編碼所述關(guān)聯(lián)(cognate)重組酶的至少一種的核酸序列轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，能夠缺失所述陽性選擇標(biāo)記。例如，所述陽性選擇標(biāo)記的側(cè)翼可以是分別由cre-重組酶或FLP重組酶識(shí)別的loxP或FLP序列(Kuhn和Schwenk，Curr.Opin.Immunol.，9，p.183-188，1997)，可以通過cre-或flp-重組酶表達(dá)載體的順式轉(zhuǎn)染，從基因?qū)騪reB細(xì)胞的基因組中位點(diǎn)特異性除去所述選擇標(biāo)記表達(dá)盒(圖6a，b)。這一方法允許反復(fù)使用采用了相同的陽性選擇標(biāo)記的導(dǎo)向載體。
在一種優(yōu)選實(shí)施方案中，所述基因?qū)蛸|(zhì)粒載體還包括能夠篩選轉(zhuǎn)染物的陰性選擇標(biāo)記，在所述轉(zhuǎn)染物中，所述基因?qū)蜉d體通過非同源重組隨機(jī)地整合到它的基因組中。例如，篩選導(dǎo)向構(gòu)建體的隨機(jī)整合的合適的陰性選擇標(biāo)記可以包括單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的表達(dá)盒，白喉毒素基因(DT)的表達(dá)盒(McCarrick等，TransgenicRes.，2，p.183-190，1993)，或它的減毒形式DTtox176的表達(dá)盒(Maxwell等，Mol.Cell.Biol.，7，p.1576-1579，1987)。所述陰性選擇標(biāo)記位于所述導(dǎo)向構(gòu)建體上，以便所述陽性/陰性導(dǎo)向構(gòu)建體的定向整合導(dǎo)致了所述陰性選擇標(biāo)記的去除(圖6a，b)。因此，只有通過同源重組整合所述導(dǎo)向載體，才能使所述細(xì)胞存活，并且，其后果是，選擇通過同源重組導(dǎo)致的內(nèi)源基因座的一部分的定向和破壞。
應(yīng)當(dāng)理解的是，使用喪失了它們的表達(dá)內(nèi)源抗體和/或抗原受體或其功能性片段的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞是優(yōu)選的。不過，具有表達(dá)抗體和/或抗原受體或其片段的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞同樣可用于本發(fā)明中。無論所述前體淋巴細(xì)胞的實(shí)際遺傳學(xué)背景如何，都必須對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便能夠生產(chǎn)異源抗體或結(jié)合蛋白。可以理解的是，所述修飾優(yōu)選是在通過上述方法選擇和/或制備鑒定了合適的靶細(xì)胞或克隆之后進(jìn)行的。不過，還可以在使得所述細(xì)胞不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白或它的一部分之前，對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾。另外，同時(shí)進(jìn)行這兩個(gè)步驟可能也是合適的。
因此，在另一種實(shí)施方案中，優(yōu)選的是將編碼異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的用于實(shí)施所述需要的遺傳修飾的至少一種外源遺傳元件，攜帶在選自下組的遺傳構(gòu)建體上(a)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA構(gòu)建體，包括可操作地連接的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和編碼核酸序列，以便能夠表達(dá)至少一種異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變，或者是人工的；(b)重組的基于質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，包括可操作地連接的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，和編碼核酸序列，以便能夠表達(dá)至少一種異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變，或者是人工的；(c)重組的基于質(zhì)粒的小免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座，具有可操作地連接的未重排的V，D和J基因片段，以便能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(d)細(xì)菌，酵母或脊椎動(dòng)物人工染色體，包括可操作地連接的種系構(gòu)型的部分或全部免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座，以便能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(e)細(xì)菌，酵母或脊椎動(dòng)物人工染色體，在修飾過的排列中包括至少一種異源免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座的部分或全部，所述修飾過的排列被設(shè)計(jì)成能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(f)跨染色體元件，它是異源染色體的片段，具有種系構(gòu)型中的免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座的部分或全部，使得能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且，隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，就其一級(jí)氨基酸序列而言，它是野生型的；其中，所述至少一種外源遺傳元件最優(yōu)選編碼天然的或修飾過的人工抗體，人類結(jié)合蛋白，人類抗原受體，或(a)其功能性片段。
另外，優(yōu)選的是，至少一種外源遺傳元件編碼能夠進(jìn)行所述結(jié)合區(qū)的親和力成熟的異源或人工受體。
為了實(shí)施遺傳修飾的步驟，根據(jù)本發(fā)明，可以采用若干不同的方法，這些方法將在下文進(jìn)行說明。
第一種方法基于編碼非重排的，種系構(gòu)型的部分異源抗原受體基因座的重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建體的穩(wěn)定導(dǎo)入，類似于以前在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)所獲得的結(jié)果。所述異源抗原受體基因座，可以包括免疫球蛋白H，κL和λL鏈基因座的V，D和J基因片段，以及來自任何T細(xì)胞受體(TCR)α，β，γ或δ基因座的基因片段。
第二種方法涉及兆堿基大小的異源抗原受體基因座的穩(wěn)定整合，包括非重排的、種系構(gòu)型的免疫球蛋白和/或TCR基因座的全部或一部分，作為轉(zhuǎn)染色體片段，或克隆到細(xì)菌人工染色體(BACs)，酵母染色體(YACs)，或脊椎動(dòng)物人工染色體(VACs)上，所述整合也是在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)進(jìn)行的(Green等，Nat.Genet.，7，p.13-21，1994；Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，p.722-727，2000)。
這兩種方法的遺傳元件，都必須穩(wěn)定地整合到在它們的內(nèi)源鼠Ig基因座上具有順式作用突變的preB細(xì)胞中，這種整合只會(huì)干擾內(nèi)源Ig基因座的重排，但仍然可以由非重排的和/或種系異源抗原受體基因座制備各種抗體所有組成成分。編碼人Ig基因座的DNA構(gòu)建體的構(gòu)建，取決于對(duì)所有人Ig基因座及其幾乎完全公開的DNA序列的組構(gòu)的了解，以上知識(shí)是人類基因組工程的結(jié)果。例如，人類IgH鏈基因座位于染色體14q32.33上的1.25Mbp片段上。它包括123-129個(gè)(取決于等位基因變異)VH基因片段(所述功能的41-47)，位于所述恒定區(qū)基因簇上游的27D和6JH基因片段。人類IgκL鏈基因座位于染色體2p12上，包括1.82Mbp，并且包括40或76個(gè)(取決于等位基因)VK基因片段(分別為所述功能的34或64)，以及位于單一Cκ區(qū)上游的5個(gè)Jκ基因片段。所述人類IgλL鏈基因座位于染色體22q11.2上，跨越1.05Mbp的長(zhǎng)度，并且包括70或71Vλ(31或32個(gè)功能性)基因片段，位于7-11串聯(lián)重復(fù)的Jλ-Cλ基因片段上游。
攜帶部分或全部種系異源免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座的DNA構(gòu)建體存在于跨染色體片段上，或可以克隆到BAC，YAC，或VAC載體構(gòu)建體上，可以用標(biāo)準(zhǔn)基因轉(zhuǎn)移方法，將所述DNA構(gòu)建體穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入長(zhǎng)期增殖的靶preB細(xì)胞中，例如，包括電穿孔，磷酸鈣或DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，原生質(zhì)球或原生質(zhì)體融合，彈道轉(zhuǎn)移，顯微注射，或特異性蛋白-加成物形成，或上述方法的組合?？梢酝ㄟ^包含在YAC，BAC和VAC載體主鏈上的合適的(藥物)選擇標(biāo)記，選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體，包括賦予對(duì)諸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，組胺醇，霉酚酸，和zeocin等的抗性的基因。
可以將第三種概念上不同的方法用于導(dǎo)入編碼異源的，優(yōu)選人類抗體或結(jié)合蛋白的異源遺傳元件。根據(jù)這種替代方法，利用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，將異源遺傳元件穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入鼠preB細(xì)胞。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體只能容納7-10kb的外源DNA，它明顯有利于異源的，優(yōu)選人類抗體和結(jié)合蛋白的表達(dá)載體的克隆。因此，通過標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體，可以方便地并且快速地修飾異源抗體和結(jié)合蛋白的所有特性。相反，在轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)中導(dǎo)入對(duì)異源抗體表達(dá)的修飾，是非常麻煩的和花費(fèi)時(shí)間的過程，因此，在實(shí)踐上是不可行的。用轉(zhuǎn)基因小鼠改變轉(zhuǎn)基因編碼的異源抗體的功能，會(huì)需要制備若干新的轉(zhuǎn)基因小鼠株，包括將其轉(zhuǎn)育到免疫缺陷型遺傳學(xué)背景中。
編碼異源抗體或結(jié)合蛋白的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體，可以作為表達(dá)單克隆結(jié)合特異性的克隆生產(chǎn)，或者可以以編碼多克隆結(jié)合特異性文庫的形式制備。因?yàn)槟孓D(zhuǎn)錄病毒載體，沒有大到足以整合種系抗原受體基因座的較大的片段，所述異源編碼區(qū)需要包括編碼可變區(qū)的已經(jīng)V(D)J重排的基因片段，與異源抗體和結(jié)合蛋白的恒定區(qū)的編碼區(qū)組合。因此，異源抗體或結(jié)合蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的克隆或文庫的表達(dá)，不需要V(D)J重組的功能性細(xì)胞機(jī)制，并且，因此可以與具有順式和/或反式作用突變的preB淋巴細(xì)胞組合使用，正如上文所指出的，它能破壞內(nèi)源免疫球蛋白基因表達(dá)。
首先，將賦予異源抗體或結(jié)合蛋白對(duì)鼠preB細(xì)胞表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染到逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系，有很多種所述細(xì)胞系都可以通過商業(yè)渠道獲得，具有產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的能力，所產(chǎn)生的逆轉(zhuǎn)錄病毒具有感染性的親嗜性，兼嗜性或泛嗜性所有組成成分。用逆轉(zhuǎn)錄病毒gag，pol和env基因的表達(dá)構(gòu)建體，穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染所述包裝細(xì)胞系。用編碼異源抗體或結(jié)合蛋白的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞，隨后會(huì)導(dǎo)致能感染preB細(xì)胞，并且將異源遺傳學(xué)信息穩(wěn)定地轉(zhuǎn)導(dǎo)到preB細(xì)胞系和克隆中的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的形成(圖8)。用于上述方法的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，是用通過商業(yè)渠道獲得的空的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建的，所述載體包括最低必需逆轉(zhuǎn)錄病毒因子，包括5′-LTR，Psi包裝信號(hào)和3′-LTR(圖11a)。
用于異源抗體或結(jié)合蛋白表達(dá)的最終的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，可以包括任何以下以一種方式可操作地連接的遺傳元件，以便確保異源抗體和結(jié)合蛋白在B系細(xì)胞中的表達(dá)，所述遺傳元件選自(a)啟動(dòng)子元件，包括組成型啟動(dòng)子，如CMV(巨噬細(xì)胞病毒)，SV40(猿猴病毒40)，β-肌動(dòng)蛋白或PGK(磷酸甘油激酶)啟動(dòng)子，或B系特異性啟動(dòng)子，如CD19啟動(dòng)子，或IgH和IgL鏈基因啟動(dòng)子；(b)來自任何抗原受體基因座的可變(V)區(qū)外顯子，包括免疫球蛋白和TCR基因座；(c)使異源抗體或結(jié)合蛋白能夠進(jìn)行高水平的和B系特異性表達(dá)的增強(qiáng)子，如EμH或κiE內(nèi)含子增強(qiáng)子元件；(d)恒定區(qū)外顯子，包括編碼分泌形式和膜結(jié)合形式的抗體和結(jié)合蛋白的外顯子(圖7a，b)；和(e)重鏈和輕鏈基因座的任何3′免疫球蛋白基因增強(qiáng)子，(即3′α，3′κ或λ3-1和λ2-4增強(qiáng)子)，這些增強(qiáng)子是編碼異源抗體或結(jié)合蛋白的外顯子的可變區(qū)的細(xì)胞超變所必須的(圖7a，b)。
另外，諸如嘌呤霉素，潮霉素B，新霉素(G418)，組胺醇，霉酚酸，zeocin的合適的(藥物)選擇標(biāo)記的表達(dá)盒，或諸如EGFP(強(qiáng)化綠色熒光蛋白)及其突變體YFP(黃色熒光蛋白)，CFP(青色熒光蛋白)，和BFP(蘭色熒光蛋白)，或RFP(紅色熒光蛋白)的合適的報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)盒，可以是所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一部分，可以分別選擇，或分離穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)過的細(xì)胞(圖7b)。所有所述編碼區(qū)和控制元件的排列和存在需要加以認(rèn)真設(shè)計(jì)，以便能夠分別表達(dá)膜或分泌形式的異源Ig糖蛋白，以及在體內(nèi)，在生發(fā)中心驅(qū)動(dòng)異源抗體和結(jié)合蛋白的親和力成熟的抗原。如果需要，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域外顯子可以在同種型之間交換，或者導(dǎo)入影響表達(dá)的異源抗體的效應(yīng)物功能的設(shè)計(jì)的突變(圖7a，b)。提到所述非限定性例子，是為了說明該系統(tǒng)可以對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒編碼的異源抗體或結(jié)合蛋白的所有區(qū)進(jìn)行快速修飾。
所述重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上的編碼所述可變區(qū)的外顯子可以是單克隆的，以便表達(dá)一種特定的特異性，如現(xiàn)有抗體的特異性，它的抗原結(jié)合特異性，希望在將穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的preB細(xì)胞移植到鼠宿主中之后通過親和力成熟進(jìn)行修飾，并且隨后免疫(圖9)。另外，所述外顯子編碼可變區(qū)可源于多種V(D)J重排的文庫。所述V區(qū)文庫可以從異源的，優(yōu)選人B淋巴細(xì)胞中分離，通過PCR方法，使用簡(jiǎn)并引物對(duì)，擴(kuò)增多種不同的VH基因家族和JH基因片段(圖9)。所述B淋巴細(xì)胞可源于免疫過的或未免疫過的個(gè)體(激發(fā)的與未接觸過抗原的所有組成成分)，或源于患有自身免疫病的患者(自身免疫所有組成成分)。另外，可以利用體外組裝的V結(jié)構(gòu)域特異性基因片段，構(gòu)建全合成的V區(qū)結(jié)構(gòu)域的文庫，所述片段在相當(dāng)于互補(bǔ)決定區(qū)的區(qū)域具有隨機(jī)的核苷酸序列(圖9)。
可以將逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的組合，同時(shí)或依次轉(zhuǎn)導(dǎo)到preB細(xì)胞中，當(dāng)所述preB細(xì)胞在體外或體內(nèi)分化時(shí)，可以表達(dá)并且分泌完整的異源免疫球蛋白和二聚結(jié)合蛋白(圖8)。
通過上述任何方法進(jìn)行過遺傳修飾，以便它們業(yè)已獲得了表達(dá)異源抗體或結(jié)合蛋白的潛力的脊椎動(dòng)物preB細(xì)胞，需要分化成成熟的B系細(xì)胞，并最終分化成漿細(xì)胞，以便所述異源抗體或結(jié)合蛋白可以表達(dá)并最終分泌。這一目的可以通過在體外組織培養(yǎng)物中分化實(shí)現(xiàn)，或通過將遺傳修飾過的preB細(xì)胞移植到合適的脊椎動(dòng)物宿主體內(nèi)實(shí)現(xiàn)。
因此，優(yōu)選通過以下方法實(shí)現(xiàn)脊椎動(dòng)物前體B淋巴細(xì)胞的體外分化(a)通過在缺少任何前體淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子的情況下培養(yǎng)，阻止所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)它分化成成熟的淋巴系細(xì)胞，和(b)通過在存在至少一種選自下組的成分的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞，誘導(dǎo)最終的淋巴細(xì)胞分化(i)可溶性T細(xì)胞相關(guān)的刺激因子，包括白介素-2，白介素-4，白介素-5，白介素-6，白介素-10，白介素-13，TGF-β，和IFN-γ；(ii)激活B細(xì)胞的共刺激受體的因子，包括對(duì)以下成分具有特異性的激動(dòng)性抗體或活性重組配體CD40，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，補(bǔ)體受體1(CD35)和2(CD21)，LFA-1(CD11a)，LFA-3(CD58)，CD19，CD20，CD30，CD32，CD37，CD38，CD70，CD71，Igα(CD79α)，Igβ(CD79β)，TAPA-1(CD81)，F(xiàn)as(CD95)，TNF-受體1(p55，CD120a)，TNF-受體2(p75，CD120b)，Ox-40(CD134)，和淋巴毒素-β受體；和(iii)B細(xì)胞促細(xì)胞分裂因子，1型T細(xì)胞非依賴性抗原，和其他多克隆激活劑，包括脂多糖(LPS)，源于格蘭氏陰性細(xì)菌的脂蛋白，聚陰離子，poly-dldC，美洲商陸有絲分裂原(PWM)，和抗-免疫球蛋白試劑；以及它們的組合。
在組織培養(yǎng)物中進(jìn)行的體外分化，可以通過兩個(gè)步驟的方法實(shí)現(xiàn)，包括(a)從組織培養(yǎng)基中除去preB細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如IL7，或IL3，這樣能抑制preB細(xì)胞的增殖，與此同時(shí)，能誘導(dǎo)分化成具有成熟的B細(xì)胞表型的細(xì)胞，并且包括(b)通過所述T細(xì)胞相關(guān)的和/或有絲分裂原性的，T細(xì)胞獨(dú)立性刺激刺激所述分化的B細(xì)胞，以便誘導(dǎo)最終的漿細(xì)胞分化。通過除去preB細(xì)胞生長(zhǎng)因子，使preB細(xì)胞最初分化成具有B細(xì)胞表型的細(xì)胞，伴隨著細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)。因此，它是使用超量表達(dá)bcl-2或bcl-xL的抗細(xì)胞程序死亡基因的優(yōu)選實(shí)施方案?？梢酝ㄟ^使用從bcl-2，或bcl-xL轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)分離的preB細(xì)胞，將所述抗-細(xì)胞程序死亡基因?qū)雙reB細(xì)胞，或者通過用任何抗細(xì)胞程序死亡基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)preB細(xì)胞。
作為遺傳修飾過的前體淋巴細(xì)胞的體外分化的一種替代，所述細(xì)胞在移植到合適的脊椎動(dòng)物宿主中之后，還可以在體內(nèi)分化，導(dǎo)致所述細(xì)胞轉(zhuǎn)移到次級(jí)淋巴器官，并且分化成更成熟的淋巴系細(xì)胞。優(yōu)選將所述淋巴細(xì)胞與未接觸過抗原的或抗原激發(fā)的T輔助淋巴細(xì)胞共同移植到所述宿主中，其中，術(shù)語′共同移植的′被理解成不局限于確實(shí)在同一時(shí)間同時(shí)移植。根據(jù)另一種優(yōu)選實(shí)施方案，在所述體內(nèi)分化之后，用至少一種需要的免疫原性化合物或組合物對(duì)所述宿主進(jìn)行免疫。
另外，所述脊椎動(dòng)物宿主優(yōu)選是相容性宿主，就內(nèi)源B細(xì)胞，T細(xì)胞，和/或NK(天然殺傷)細(xì)胞，或它們的組合的產(chǎn)生而言，是缺陷型的。
正如以前業(yè)已針對(duì)脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的合適的來源的選擇所作的說明，所述脊椎動(dòng)物宿主優(yōu)選選自有顎脊椎動(dòng)物，包括軟骨魚，硬骨魚，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥類和哺乳動(dòng)物，包括豬，綿羊，牛，馬，以及嚙齒動(dòng)物，包括小鼠，大鼠，兔，豚鼠，小鼠是優(yōu)選的宿主物種。
用作遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的移植的受體的合適的宿主，相對(duì)淋巴細(xì)胞的發(fā)育而言，可以是野生型的，或者它們可能優(yōu)選獲得了能抑制內(nèi)源鼠Ig基因重排的多種順式作用突變中的任意一種。所述突變可以包括在Ig基因座的增強(qiáng)子元件上發(fā)生的突變，如上述EμH和KiE增強(qiáng)子元件，在Ig基因編碼區(qū)內(nèi)的缺失，如DH，JH或JL基因片段，和IgC區(qū)，包括它們的跨膜外顯子，另外，可以使用攜帶能選擇性地抑制B(和T)淋巴細(xì)胞發(fā)育的反式作用突變的合適的宿主，例如，在所有組成成分系或淋巴細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子或RAG-1和RAG-2基因上的突變，這些突變是啟動(dòng)V(D)J重組所必需的(Mombaerts等，s.a.；Shinkai等，s.a.)。
另外，導(dǎo)致免疫缺陷型宿主的反式作用突變，包括在普遍表達(dá)的DNA修復(fù)基因上的突變，還需要V(D)J重組，如Ku70，Ku86，DNA-依賴性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化亞基，XRCC4，DNA連接酶IV和Artemis。然后，可以用所述遺傳修飾過的preB細(xì)胞移植具有上述任何突變的僅缺乏B淋巴細(xì)胞群，或同時(shí)缺乏B和T淋巴細(xì)胞的脊椎動(dòng)物宿主，并且，對(duì)于B-和T細(xì)胞缺陷型小鼠來說，可以用組織相容性T輔助細(xì)胞群共同移植。所述T輔助細(xì)胞群優(yōu)選包括原始T輔助細(xì)胞，抗體激發(fā)的效應(yīng)物T細(xì)胞群，或記憶T細(xì)胞，或它們的任意組合。T輔助細(xì)胞群的共同移植可以同時(shí)進(jìn)行，在遺傳修飾過的preB細(xì)胞移植的實(shí)際時(shí)間點(diǎn)之前或之后。
然后，可以將其外周淋巴細(xì)胞群業(yè)已通過移植修飾過的preB細(xì)胞和選擇性地共同移植T輔助細(xì)胞群部分或完全重構(gòu)的鼠或脊椎動(dòng)物宿主用于用任何需要的抗原免疫，以便引起針對(duì)所述抗原的免疫應(yīng)答，并且刺激所述淋巴細(xì)胞表達(dá)合適的異源受體特異性，這種表達(dá)會(huì)導(dǎo)致B細(xì)胞克隆的增殖性擴(kuò)增，所編碼的異源抗體或結(jié)合蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力成熟，以及最終分化成能分泌所述異源抗體或結(jié)合蛋白的漿細(xì)胞。
正如通過以上說明可以了解的，本發(fā)明的另一種優(yōu)選實(shí)施方案，涉及將可以通過任何上述方法獲得的遺傳修飾過的和分化的脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞，用于以本身已知的方法生產(chǎn)任何異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其片段。就此而言，在上述任何用于制備遺傳修飾過的和分化的脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞的方法之后，優(yōu)選進(jìn)行以下步驟(a)從所述分化的淋巴細(xì)胞中分離至少一種外源遺傳元件，和(b)將所述遺傳元件置于能夠生產(chǎn)所述至少一種異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的環(huán)境中。
為了實(shí)現(xiàn)所需要的免疫球蛋白或免疫球蛋白-樣蛋白或其功能性片段的大規(guī)模生產(chǎn)，編碼感興趣的多肽的遺傳學(xué)信息可以從所述細(xì)胞中提取，并且轉(zhuǎn)移到不同的表達(dá)系統(tǒng)中，在這些系統(tǒng)中，所述遺傳信息可以保持，擴(kuò)增和/或用于生產(chǎn)需要的蛋白或它的一部分。
更具體地講，體現(xiàn)所述異源抗體或結(jié)合蛋白的編碼區(qū)的開放讀框，可以通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法分離，包括用特殊的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且轉(zhuǎn)入不同表達(dá)系統(tǒng)的環(huán)境中，以便能夠連續(xù)生產(chǎn)所述異源抗體或結(jié)合蛋白。所述表達(dá)系統(tǒng)包括體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)，原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌或真核表達(dá)系統(tǒng)，如在酵母細(xì)胞，使用桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞，或哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)。
上述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段可以具有一種獨(dú)特的特異性，并且因此可能是單克隆的，或者可以是由一種以上獨(dú)特的特異性編碼的，并因此可能是多克隆的。
根據(jù)一種優(yōu)選實(shí)施方案，所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段完全或部分類似于可以根據(jù)人類遺傳學(xué)所有組成成分組裝的人類抗體，抗原受體，或結(jié)合蛋白或它們的一部分。
另外，要生產(chǎn)的所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其片段優(yōu)選選自下組(a)膜結(jié)合或分泌的抗體，并且包括存在于天然抗體中的化學(xué)計(jì)量組合物中的異源重鏈和輕鏈多肽，并且包括任何已知的重(μ，δ，γ，α，ε)和/或輕(κ和λ)鏈同種型；(b)具有重鏈和輕鏈多肽組合的抗體，就所述一級(jí)氨基酸序列而言，它是完全的人抗體；(c)含有來自不同脊椎動(dòng)物物種的異源重鏈或輕鏈多肽的雜合抗體；(d)全部或部分異源的分泌型Fab，scFv和F(ab′)2抗體片段；(e)通過接頭肽共價(jià)偶聯(lián)的抗體片段，得到了雙特異性或多特異性抗體片段；(f)α，β，γ，和δ同種型的T細(xì)胞受體，抗原受體，以及其他與所述免疫球蛋白超家族的蛋白結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合蛋白；以及其功能性片段。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，和源于它們的更成熟的淋巴系細(xì)胞，以及能生產(chǎn)異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的永生化細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞可以或者業(yè)已通過上文所述任何方法獲得。
另外，提供了適合至少部分激活脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，以便表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白或它的一部分的載體構(gòu)建體，以及具有編碼上文所定義的異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的至少一種外源遺傳元件的遺傳構(gòu)建體。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供了藥用或診斷制劑，包括通過上述任意一種方法獲得的至少一種抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它具有野生型免疫效應(yīng)物功能，或不是源于種系編碼的異源免疫球蛋白或抗原受體的修飾過的或人工效應(yīng)物功能。
正如可以理解的，可以將完全的人或人源化抗體或其功能性片段用于人類疾病的診斷，預(yù)防和治療，例如，它們的與特殊抗原的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域結(jié)合的能力，因此，利用的是通過它們的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)免疫效應(yīng)物功能的能力。下面將詳細(xì)說明可以按照本發(fā)明生產(chǎn)的人類單克隆抗體用于人類疾病診斷，預(yù)防和治療的可能的用途。對(duì)于診斷用途來說，可以將人類單克隆抗體用于鑒定和觀察某些病理學(xué)條件，包括將標(biāo)記過的抗體導(dǎo)入個(gè)體的血管系統(tǒng)，在這里可以檢測(cè)特殊疾病相關(guān)的抗原性結(jié)構(gòu)(例如，在某些病理學(xué)細(xì)胞上表達(dá))。在預(yù)防人類疾病方面的用途包括具有抑制某些細(xì)胞表面受體-配體系統(tǒng)在病理學(xué)狀態(tài)(拮抗性抗體)的相互作用的能力的抗體，或者相反，在缺少配體的病理學(xué)狀態(tài)下，模擬配體與細(xì)胞表面受體(激動(dòng)性抗體)的結(jié)合作用。另外，可以將人類單克隆抗體用于抑制毒性物質(zhì)，或病原體的作用，例如，在中毒，炎癥或感染期間使用。就此而言，人類抗體具有特殊用途，因?yàn)樗鼈兡芙閷?dǎo)所述物質(zhì)和抗原的標(biāo)記，以便被天然免疫系統(tǒng)的特化細(xì)胞除去。還可將人類單克隆抗體用于導(dǎo)向?qū)Π┘?xì)胞的免疫功能，利用特殊結(jié)合改變?cè)趷盒阅[瘤細(xì)胞表面上表達(dá)的自身結(jié)構(gòu)。對(duì)自身免疫癥狀來說，還可以利用人類單克隆抗體中和或?qū)棺陨砻庖咭蜃?自身抗體，過敏性抗體)的病理學(xué)作用。人類單克隆抗體可用于人類疾病的診斷，預(yù)防和治療，因?yàn)榭梢詫⑺鼈儗?dǎo)入個(gè)體的血管系統(tǒng)，而又不會(huì)導(dǎo)致任何負(fù)面影響，因?yàn)榭贵w是血漿和人類的液體成分(例如，黏液，唾液，淋巴液等)的正常組成成分。
生物材料的保藏根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，業(yè)已將攜帶用于本發(fā)明的遺傳元件的質(zhì)粒交由德意志微生物保藏中心(DSMZ)保藏(Braunschweig，Germany)，保藏日期為2001年12月17日，獲得以下保藏號(hào)質(zhì)粒 保藏號(hào)pBS-DT4 DSM 14703pPGK-hygroDSM 14704pGL2neo(m)+ DSM 14705pBS-DT4-tox176DSM 14706以下實(shí)驗(yàn)方法，詳細(xì)披露了利用鼠preB細(xì)胞制備人類單克隆抗體的方法，所述細(xì)胞是進(jìn)行過遺傳修飾的，以便賦予人類抗體生產(chǎn)的潛力。方法的特定例子如下文所披露的，以便可以對(duì)鼠preB細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，以便內(nèi)源抗體不再能表達(dá)，不過，所述人類抗體可以由穩(wěn)定送遞的異源逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體生產(chǎn)。另外，提供了與將所述遺傳修飾過的鼠preB細(xì)胞移植到合適的鼠宿主中的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，以及與所述移植小鼠的免疫相關(guān)的方法，抗體分泌細(xì)胞的分離，及其作為永生化單克隆人類抗體分泌型雜交瘤細(xì)胞系的建立。盡管所提供的方法是完整的，并且足以用遺傳修飾過的鼠preB細(xì)胞生產(chǎn)異源的，特別是人類單克隆抗體，不應(yīng)當(dāng)將所述方法視為限制性的，而應(yīng)當(dāng)視為說明性的。
實(shí)施例實(shí)施例1具有分化成成熟的B系細(xì)胞潛力的長(zhǎng)期增殖的，鼠前體B細(xì)胞的建立基質(zhì)細(xì)胞和IL7反應(yīng)性鼠前體B細(xì)胞存在于交配后15-18天的小鼠胚胎的胎肝中，存在于成年小鼠的骨髓中，以及存在于新生動(dòng)物(＜3周齡)的脾臟中(Rolink等，Blood，81，2290-2300，1993)。為了分離所述preB細(xì)胞，通過CO2窒息處死小鼠，并且在無菌條件下取出相應(yīng)的器官。通過取出股骨和脛骨，用消毒過的剪刀打開所述骨的兩端，并且使用5ml的一次性注射器和25或26號(hào)針頭，用2-5ml磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)沖洗所述骨髓，獲得全骨髓細(xì)胞。將同樣在無菌條件下制備的分離的脾臟或胎肝放置在裝有5-10ml PBS的petri培養(yǎng)皿中的無菌200目不銹鋼網(wǎng)格上。將所述器官切成碎片，并且用5ml塑料注射器的柱塞輕輕地?cái)D壓通過所述金屬網(wǎng)格。通過離心洗滌細(xì)胞懸浮液1次(200g，10分鐘，4℃)，并且重新懸浮在10-20ml PBS中。所有細(xì)胞制備是用冰冷的溶液進(jìn)行的，并且將細(xì)胞懸浮液保持在冰上，直到轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)物中。
各個(gè)preB細(xì)胞克隆的建立，是通過在用生長(zhǎng)在特殊基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基中的半鋪滿的，3000rad γ-輻射的ST-2(Ogawa等，EMBO J.，7，1337-1343，1988)或PA-6(Kodama等，J.Cell.Physiol.，118，233-240，1984)鼠基質(zhì)細(xì)胞(參見下文)包被的96孔平板上進(jìn)行限制稀釋進(jìn)行的。對(duì)于限制稀釋鋪板來說，可以使用總的器官細(xì)胞群，或者使用B220+或CD19+表面標(biāo)記陽性B系細(xì)胞，所述細(xì)胞是通過使用對(duì)所述標(biāo)記特異的商業(yè)化抗體，通過熒光或磁性珠活化的細(xì)胞分選(FACS或MACS)富集的。
鼠preB細(xì)胞的長(zhǎng)期培養(yǎng)物，是在含有100單位的重組白介素-7(IL-7)的特殊無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行的(參見下文)。在限制稀釋條件下，在37℃下，在10％CO2氣體的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-7天內(nèi)，在基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上形成了各個(gè)preB細(xì)胞集落。首先將單個(gè)preB細(xì)胞集落轉(zhuǎn)移到24孔平板上，然后依次擴(kuò)增到25cm2，并最終擴(kuò)增到75cm2的組織培養(yǎng)燒瓶上，一直用3000radγ-輻射過的基質(zhì)細(xì)胞預(yù)先包被。在最初的擴(kuò)增之后，需要將preB細(xì)胞密度保持在1×105-2×106preB細(xì)胞/ml組織培養(yǎng)基的范圍內(nèi)，需要每隔2-3天對(duì)所述細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。
建立長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞，IL-7依賴性鼠preB細(xì)胞所需要的特殊的無血清組織培養(yǎng)基(Iscove和Melchers，J.Exp.Med.，147，923-933，1978)如下(1升培養(yǎng)基的配方)·11g DMEM-粉(不含碳酸氫鹽)·10ml 1M HEPES，pH7.3·33.3ml7.5％NaHCO3溶液·8ml氨基酸儲(chǔ)液，含有以下成分-L-丙氨酸 600mg-L-天冬酰胺 520mg-L-天冬氨酸 720mg-L-谷氨酸 1800mg-L-脯氨酸 960mg-丙酮酸鈉 2640mg+1.6ml生物素/維生素B12儲(chǔ)液，它含有-維生素B12 5.0mg-D-生物素 5.0mg溶解在20ml+10μl1M HCl中所有成分都溶解在240ml超純凈水中·4ml 半胱氨酸儲(chǔ)液，它含有-L-半胱氨酸 1.4g溶解在150ml H2O，50ml 1M HCl中·5ml 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液·0.15ml人類運(yùn)鐵蛋白儲(chǔ)液，包括-10ml溶液a)和80μl溶液b)a)溶解在10ml DMEM中的1g人運(yùn)鐵蛋白(1.3g/100ml H2O)+100μl 1M HEPES，pH7.3b)440mmg FeCl3×6H2O+185ml H2O+200μl 1M HCl·5ml 大豆-脂類儲(chǔ)液-與45ml DMEM混合的200mg大豆脂(1.3g/100ml H2O)+5ml10％BSA。在冰水中超聲波處理3×15分鐘。
·20ml卡那霉素(5000μg/ml)·30μl 2-巰基乙醇(1.43M)·105U 重組小鼠白介素-7(IL7)所有成分都溶解在最終體積為1000ml的三重蒸餾的超純凈水中，過濾消毒，并且在4℃下保存待用。
ST-2或PA-6基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞，需要生長(zhǎng)在以下特殊的含有低濃度血清的培養(yǎng)基中(1升體積的配方)·17.7g IMDM-粉(無碳酸氫鹽)·3gNaHCO3·10ml 100×非必需氨基酸(GIBCO-BRL)·10ml 100×青霉素/鏈霉素(GIBCO-BRL)·1ml 5mg/ml豬胰島素溶液·1ml 50mM 2-巰基乙醇·3ml 10％ primatone(超濾，以便排除＞10kD的蛋白)(來源Quest International，Naarden，NL)·20ml 胎牛血清將所有成分溶解在最終體積為1000ml的三重蒸餾的超純凈水中，過濾消毒，并且在4℃下保存待用。
實(shí)施例2在體外將鼠前體B細(xì)胞逐步分化成抗體分泌型漿細(xì)胞長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞，保留了它們的分化成更成熟的B系細(xì)胞的潛力(Rolink等，EMBO J.，10，327-336，1991)，所述細(xì)胞可以在體外獲得。這種分化可以分兩個(gè)步驟進(jìn)行，首先，誘導(dǎo)分化成具有成熟的B細(xì)胞表型的細(xì)胞，其次，通過誘導(dǎo)分化成具有抗體分泌型漿細(xì)胞表型的細(xì)胞。
第一個(gè)分化階段，是通過在連續(xù)存在基質(zhì)細(xì)胞的條件下，從preB細(xì)胞中除去IL7實(shí)現(xiàn)的。為此，從增殖的培養(yǎng)物中收獲preB細(xì)胞，用缺少IL7的無血清preB細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌3次，以1-2x106細(xì)胞/ml的密度鋪板到不存在IL7的新的3000radγ-輻射的基質(zhì)細(xì)胞上。在3天時(shí)間內(nèi)，preB細(xì)胞停止增殖，并且分化成具有不成熟的B細(xì)胞表型的細(xì)胞。所述表型改變包括，例如，c-kit的喪失，λ5和VpreB表達(dá)，以及獲得CD25和CD40的表達(dá)。在來自野生型小鼠的preB細(xì)胞中，這種分化還伴隨著在IgH鏈基因座上發(fā)生的VH到DJH的重排，隨后是在IgL鏈基因座上進(jìn)行的VL到JL的重排，這可能導(dǎo)致表面結(jié)合的IgM抗體在分化的B系細(xì)胞上的表達(dá)(Rolink等，EMBO J.，10，327-336，1991)。不過，必須指出的是，IgH和L基因片段的有序的重排，不是所述preB細(xì)胞在體外進(jìn)行表型分化的先決條件(Grawunder等，Int.Immunol.，7，1915-1925，1995)。
第二個(gè)分化階段可以用激動(dòng)性抗-CD40抗體或LPS與諸如IL4，IL5，IL10或TGF-β的細(xì)胞因子組合刺激缺少IL7的細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。這種處理會(huì)誘導(dǎo)增殖，與各種Ig基因同種型的類別轉(zhuǎn)換重組(取決于所采用的細(xì)胞因子組合)，并最終分化成抗體分泌型漿細(xì)胞。在諸如抗-CD40/IL4刺激的場(chǎng)合下，在preB細(xì)胞組織培養(yǎng)基中洗滌細(xì)胞3次，在存在100U/ml IL4和5μg/ml抗-CD40單克隆抗體的前提下鋪板到新的，亞鋪滿的3000radγ-輻射的基質(zhì)細(xì)胞上，培養(yǎng)4-6天。通過激活的細(xì)胞分選(FACS)，根據(jù)導(dǎo)致明顯增加的正向散射值的它們的大的體積，鑒定并且分離增殖的漿細(xì)胞階段細(xì)胞。
野生型preB細(xì)胞的體外分化，通常伴隨著由于取消生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞程序死亡而造成的細(xì)胞的大量減少。通過諸如bcl-2或bcl-xL的抗細(xì)胞程序死亡基因在所述細(xì)胞中的超量表達(dá)，可以克服這一問題(Rolink等，J.Exp.Med.，178，1263-1270，1993)。這一目的可以通過從含有B系特異性表達(dá)的bcL-2轉(zhuǎn)基因的小鼠中分離preB細(xì)胞(Strasser等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，166，175-181，1990)，或通過將bcl-2編碼重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞中而實(shí)現(xiàn)(參見下文)。
實(shí)施例3克隆用于鼠Bcl2超量表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體將基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)到長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞中的先決條件是，構(gòu)建含有感興趣的基因表達(dá)盒的重組逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移載體。逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒5′和3′長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列，其側(cè)翼為逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝信號(hào)Psi(+)，多克隆位點(diǎn)(MCS)，可以將異源序列插入該位點(diǎn)，以及在大腸桿菌中復(fù)制和保持所述載體所需要的細(xì)菌質(zhì)?？刂圃??？盏哪孓D(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體的例子，是可以通過商業(yè)渠道獲得質(zhì)粒pLIB(Clontech)(圖11a)。
為了構(gòu)建含有抗細(xì)胞程序死亡基因bcl-2的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，采用了共同表達(dá)鼠bcl-2cDNA和潮霉素B藥物選擇標(biāo)記的方法，包括用內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列(IRES)連鎖bcl-2和潮霉素B的表達(dá)，使兩種構(gòu)建體能夠同時(shí)表達(dá)，可以用能同時(shí)選擇表達(dá)抗-細(xì)胞程序死亡基因bcl-2的細(xì)胞的抗生素藥物潮霉素B進(jìn)行選擇。用于bcl-2和潮霉素BcDNAs連鎖表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備分兩個(gè)階段進(jìn)行，首先，組裝啟動(dòng)子-bcl-2-IRES-潮霉素B表達(dá)盒，其次，將該表達(dá)盒克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體pUB的MCS上(圖11a+b)。
(a)啟動(dòng)子-bcl-2-IRES-潮霉素B表達(dá)盒的構(gòu)建將鼠bcl-2cDNA和潮霉素B藥物抗性標(biāo)記的開放讀框(ORF)克隆到通過商業(yè)渠道獲得的CMV-啟動(dòng)子/IRES載體pIRES(Clontech)上。為此，使用以下引物對(duì)，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)由質(zhì)粒pPGK-hygro(SEQ ID NO 1)擴(kuò)增潮霉素B ORFSEQ ID NO.5(P001) 5′-cgTCTAGAccatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctg-3′，和SEQ ID NO.6(P002) 5′-catGCGGCCGCtattcctttgccctcggacgagtgctgggg-3′還添加了含有限制性內(nèi)切核酸酶XbalI和NotI的其他限制酶識(shí)別位點(diǎn)(用大寫字母表示)(位于所述限制酶識(shí)別序列5’的2-4個(gè)隨機(jī)的核苷酸)，這是因?yàn)槿绻鲎R(shí)別序列直接位于PCR擴(kuò)增的DNA片段末端，大部分限制酶不能有效消化DNA。這些側(cè)翼核苷酸是用小寫字母表示的，以便突出顯示所述限制酶識(shí)別位點(diǎn)。位于突出顯示的限制位點(diǎn)下游或3’的序列相當(dāng)于待擴(kuò)增的片段的DNA序列。在對(duì)實(shí)驗(yàn)性實(shí)施例的說明中保持引物序列的這種表示方式。用引物P001和P002進(jìn)行的PCR，能擴(kuò)增具有1017個(gè)堿基對(duì)(bp)的DNA片段，它含有位于該片段末端的限制性內(nèi)切核酸酶XbalI和NotI的獨(dú)特的識(shí)別位點(diǎn)。用XbalI和NotI限制酶對(duì)所述PCR片段進(jìn)行雙重消化，然后定向克隆到XbalI/NotI雙重消化過的pIRES質(zhì)粒上，以便制備質(zhì)粒構(gòu)建體plRES-hygroB(圖11a)。從小鼠脾臟mRNA中分離鼠bcl-2αcDNA的ORF，并且通過逆轉(zhuǎn)錄酶偶聯(lián)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，使用根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列M16506和L31532設(shè)計(jì)的以下引物(結(jié)合在M16506的1821-53號(hào)位置上的引物P003，和結(jié)合在L31532的506-535號(hào)位置上的引物P004)進(jìn)行擴(kuò)增SEQ ID NO.7(P003) 5′-attGCTAGCatggcgcaagccgggagaacagggtatgataac-3′和SEQ ID NO.8(P004) 5′-cgcACGCGTcacttgtggcccaggtatgcacccagagtg-3′它們含有NheI和MluI的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(用大寫字母表示)。然后將大小為699bp的NheI/NotI雙重消化的PCR產(chǎn)物，直接克隆到NheI/MluI雙重消化的載體pIRES-hygroB上，以便制備pBcl2-IRES-hygroB。
(b)逆轉(zhuǎn)錄病毒Bcl-2表達(dá)轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建由于在空的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體pLIB和雙重bcl-2/潮霉素B表達(dá)載體pBcl2-IRES-hygroB上的多克隆位點(diǎn)上缺少相容性限制酶位點(diǎn)，通過PCR方法，使用合適的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，將包括組成型CMV啟動(dòng)子和聚腺苷酸化位點(diǎn)的Bcl-2-IRES-潮霉素B的完整的表達(dá)盒克隆到pLIB上。為此，通過PCR擴(kuò)增CMV-bcl2-IRES-潮霉素B表達(dá)盒，用pBcl2-IRES-hygroB作為PCR模板，使用以下引物SEQ ID NO.9(P005) 5′-atatGTCGACtcaatattggccattagccatattattcattg-3′和SEQ ID NO.10(P006) 5′-ccggATCGATccttatcggattttaccac-3′它們含有SalI和ClaI的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(用大寫字母表示)。然后，將SalI/ClaI雙重消化過的大小為3714bp的PCR產(chǎn)物直接克隆到SalI/ClaI雙重消化過的pLB載體上，從而產(chǎn)生能夠連鎖表達(dá)bc1-2和潮霉素B的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體pLIB-bcl2-IRES-hygroB。
實(shí)施例4長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)將遺傳元件穩(wěn)定轉(zhuǎn)入鼠preB細(xì)胞的一種方法，是使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖8)。對(duì)于該方法來說，將含有逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包裝所必需的逆轉(zhuǎn)錄病毒序列(5′LTR，包裝信號(hào)Psi(+)，3′LTR)以及感興趣的異源序列或基因的重組DNA構(gòu)建體，瞬時(shí)或穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染到能以組成型形式表達(dá)生產(chǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒所需要的表達(dá)基因的包裝細(xì)胞系中。
對(duì)于基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)來說，可以使用親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系GPE(Markowitz等，J.Virol.，62，p.1120-1124，1988)，它通常會(huì)導(dǎo)致preB細(xì)胞以50-80％的效力穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)。這種親嗜性包裝細(xì)胞系與(重組)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移載體的組合，只會(huì)產(chǎn)生能夠鼠細(xì)胞的復(fù)制缺陷型(重組)逆轉(zhuǎn)錄病毒。正如以下詳細(xì)說明的，為了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染親嗜性GPE包裝細(xì)胞系，使用標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣轉(zhuǎn)染(a)親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系GPE的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將在基于IMDM的低濃度血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的GPE細(xì)胞同樣用于ST-2和PA-6基質(zhì)細(xì)胞，并且如實(shí)施例1所述。在轉(zhuǎn)染之前1天，通過胰蛋白酶化，收獲貼壁GPB包裝細(xì)胞，并且以50％的鋪滿度接種到新的基于IMDM低濃度血清培養(yǎng)基中，并且，在10％CO2中，在37℃下培養(yǎng)。次日，通過標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣沉淀方法，用20μg逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA轉(zhuǎn)染每一個(gè)T75(75cm2)組織培養(yǎng)燒瓶的GPE細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，可以將轉(zhuǎn)染過的GPE細(xì)胞用于將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染到preB細(xì)胞中。
(b)用轉(zhuǎn)染過的GPE細(xì)胞培養(yǎng)物上清液對(duì)preB細(xì)胞進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或用轉(zhuǎn)染的GPE細(xì)胞共培養(yǎng)可以將兩種方法相互交換地用于轉(zhuǎn)導(dǎo)通過轉(zhuǎn)染過的GPE細(xì)胞產(chǎn)生的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒第一種方法取決于用調(diào)節(jié)過的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液感染preB細(xì)胞。為此，在轉(zhuǎn)染之后24小時(shí)，更換來自轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基，并且在細(xì)胞培養(yǎng)另外24小時(shí)之后收獲。然后在8μg/mlpolybrene存在下，將含有細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒以1∶8(體積)-1∶1(體積)的比例添加到增殖的preB細(xì)胞培養(yǎng)物中，并且在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3-6小時(shí)。然后收獲細(xì)胞，除去含有polybrene/逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，并且將細(xì)胞以1-2×105的密度，鋪板到含有100UrIL7的preB細(xì)胞培養(yǎng)基中的新的3000radγ-輻射過的基質(zhì)細(xì)胞上。在24小時(shí)之后，收獲逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的preB細(xì)胞。
第二種方法取決于preB細(xì)胞與轉(zhuǎn)染過的，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)性GPE細(xì)胞的共培養(yǎng)。為此，收獲對(duì)數(shù)期preB細(xì)胞，并且以2-4×105細(xì)胞的密度，重新懸浮在含有100U rIL7和8μg/ml polybrene的新的preB細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且在用逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體轉(zhuǎn)染之后24小時(shí)，鋪板到轉(zhuǎn)染過的preB細(xì)胞上。在37℃下，將preB細(xì)胞共培養(yǎng)6小時(shí)，然后收獲所述細(xì)胞，并且鋪板到在含有100U rIL7培養(yǎng)基中的新的3000radγ-輻射過的基質(zhì)細(xì)胞上，以便回收。然后，收獲逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的preB細(xì)胞，并且可以在24小時(shí)之后使用。
實(shí)施例5內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座在長(zhǎng)期增殖的鼠前體B細(xì)胞中的失活用鼠前體B細(xì)胞制備異源的，優(yōu)選人類抗體的第一個(gè)步驟，是使內(nèi)源的小鼠IgH和IgL失活，除其他方法之外，這一步驟可以通過在preB細(xì)胞內(nèi)的免疫球蛋白基因座內(nèi)的基因?qū)驅(qū)崿F(xiàn)。理論上講，可能需要使所有三個(gè)鼠免疫球蛋白基因座，即IgH，IgκL和IgλL鏈基因座失活。不過，鼠λL鏈基因座只包括三個(gè)功能性V-J-C簇，各自具有一個(gè)基因片段，和包括在λL鏈上的非常有限的多樣性。另外，低于5％的鼠B細(xì)胞表達(dá)λL鏈基因座。因此，在實(shí)際上，它足以使內(nèi)源的，鼠IgH和κL鏈基因座失活，以便確保在轉(zhuǎn)移異源IgH和IgκL鏈基因或基因座時(shí)，由preB細(xì)胞產(chǎn)生的大量B細(xì)胞(＞95％)能表達(dá)異源抗體。
(a)具有天然存在的不能恢復(fù)的非功能性IgH等位基因的preB細(xì)胞的分離一般來說，使內(nèi)源IgH和κL鏈基因座失活的控制最好的方式，是使用基因?qū)?參見下文)。不過，對(duì)于IgH鏈基因座來說，可以采用另一種方法長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞IL7依賴性鼠preB細(xì)胞，在它們的兩個(gè)重鏈等位基因上都具有DJH重排。由于D與JH結(jié)合過程的不精確性，可以發(fā)生所述DJH重排，以便D基因片段能夠相對(duì)JH基因片段的固定的讀框以三種可能的讀框形式讀出。以上讀框被隨意命名為讀框I，II和III(Kaartinen和Makela，Immunol.Today，6，p.324-330，1985)。如果DJH連接發(fā)生在讀框III上(Kaartinen和Makela，s.a.)，大部分D基因片段包括終止密碼子，以便功能性H鏈絕對(duì)不可能由重鏈等位基因表達(dá)。
因此，從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度講，所有基質(zhì)細(xì)胞，IL7依賴性preB細(xì)胞的大約1/9(11.1％)，在讀框III上都具有DJH重排，在它們的兩個(gè)IgH鏈等位基因上具有終止編碼序列?？梢酝ㄟ^在限制稀釋條件下亞克隆分離所述preB細(xì)胞，并且篩選需要的非功能性重排。為了確保穩(wěn)定克隆的分離，需要對(duì)重排進(jìn)行篩選，篩選兩種非功能性DJH4基因重排，這種重排不能通過二次重排恢復(fù)，因?yàn)樽詈蟮腏H基因片段業(yè)已被用完?？梢詫⑺隹寺∮糜讦蔐鏈等位基因的其他定向失活。
(b)鼠IgH和IgκL鏈基因座的定向構(gòu)建體的制備提供了導(dǎo)致內(nèi)源IgH和IgκL鏈基因座的基因?qū)蚴Щ罘椒ǖ膬煞N例子，作為很多順式作用突變的例子，它們都能類似地導(dǎo)致沒有表達(dá)內(nèi)源IgH和IgκL鏈蛋白潛力的preB細(xì)胞(圖5a，b)。對(duì)于兩種定向方法來說，首先，需要構(gòu)建空的陽性-陰性基因?qū)蜉d體，它包括獨(dú)特的克隆位點(diǎn)，可以插入與靶基因座同源的DNA序列，陽性藥物選擇標(biāo)記，如新霉素或嘌呤霉素，其側(cè)翼為loxP位點(diǎn)和陰性選擇標(biāo)記，如白喉毒素，或單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)，它可以對(duì)所述基因?qū)蜉d體隨機(jī)整合到細(xì)胞的基因組進(jìn)行篩選。LoxP側(cè)翼(floxed)陽性選擇標(biāo)記的存在，使得可以用相同的抗生素，在相同的細(xì)胞克隆中進(jìn)行兩個(gè)等位基因的順序基因?qū)?，因?yàn)樵诘谝粋€(gè)等位基因的成功定向之后，在去除位于關(guān)聯(lián)的loxP識(shí)別位點(diǎn)之間的所有核苷酸序列的cre重組酶瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，可以將抗生素抗性標(biāo)記從細(xì)胞中去除。所述空的陽性-陰性導(dǎo)向載體是按以下方法構(gòu)建體的(圖6a，b)步驟1延伸pBluescript SK(+)的多克隆位點(diǎn)通過在50μl的50mM Tris/HCl，100mM NaCl，pH8.0中混合100pmol的以下兩個(gè)互補(bǔ)的合成DNA寡聚體的每一個(gè)寡聚體進(jìn)行退火SEQ ID NO.11(P007)5′-TCGAccggtacctaggcgcgccatcgatatcgctagctcgagctcagatctGTAC-3′和SEQ ID NO.12(P008)5′-agatctgagctcgagctagcgatatcgatggcgcgcctaggtaccgg-3′。
然后，在95℃下使該混合物變性2分鐘，并且，在20分鐘之內(nèi)，從65℃緩慢冷卻到室溫。由此會(huì)產(chǎn)生具有XhoI和KpnI相容性突出末端的以下雙鏈DNA接頭(用大寫字母表示)5′-TCGAccggtacctaggcgcgccatcgatatcgctagctcgagctcagatctGTAC-3′|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||3′-ggccatggatccgcgcggtagctatagcgatcgagctcgagtctaga-5′然后將退火的合成DNA接頭連接到XhoI-KpnI線性化的，通過商業(yè)渠道獲得的pBluescriptSK(+)(Stratagene)上，得到了含有以下克隆步驟所需要的延伸的多克隆位點(diǎn)(MCS+，參見圖6a)的質(zhì)粒pBSL。
步驟2插入野生型或減毒的白喉毒素α的表達(dá)盒，作為定向構(gòu)建體隨機(jī)整合的陰性選擇標(biāo)記作為能夠?qū)驅(qū)驑?gòu)建體的隨機(jī)染色體整合進(jìn)行選擇的陰性選擇標(biāo)記，可以使用受組成型β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子控制的白喉毒素α(McCarrick等，s.a.)或它的減毒形式白喉毒素α(DT-αtox176)(Maxwell等，s.a.)的表達(dá)盒。盡管諸如單純皰疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)的其他陰性選擇標(biāo)記，通常被用于使用小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行的基因?qū)驅(qū)嶒?yàn)中，業(yè)已證實(shí)白喉毒素α及其減毒的突變體tox176能夠在基質(zhì)細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)基因?qū)?Grawunder等，Mol.Cell，2，p.477-484，1998)。所述白喉毒素表達(dá)盒是以2.1kbBg lII-XbalI片段形式，從質(zhì)粒pBS-DT4(SEQ ID NO.2)或pBS-DT4 tox176(SEQ ID NO.3；參見圖6a)中分離的，并且連接到BglII-NheI線性化的pBSL上，分別得到了質(zhì)粒pBSL-DT4和pBSLDT4tox176(參見圖6a)。
步驟3將loxP側(cè)翼的陽性藥物選擇標(biāo)記插入pBSL-DT4和pBSLDT4tox176上，以便制備空的基因?qū)蜉d體制備陽性/陰性基因?qū)蜉d體的下一個(gè)步驟是將陽性藥物選擇標(biāo)記插入pBSL-DT4或pBSL-DT4-tox176載體，位于白喉表達(dá)盒的上游。作為典型例子，示出了將側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的新霉素，嘌呤霉素和潮霉素B表達(dá)盒插入pBSL-DT4的白喉毒素α表達(dá)盒的上游。不過，應(yīng)當(dāng)指出的是，相同的克隆方法可應(yīng)用于pBSL-DT4tox176載體，它含有減毒形式的白喉毒素α。另外，可以使用能夠產(chǎn)生對(duì)組胺醇，霉酚酸，博萊霉素或zeocin的抗性的其他陽性藥物選擇標(biāo)記。
在每一種情況下，所述陽性抗生素選擇標(biāo)記盒的側(cè)翼都是loxP位點(diǎn)，所述位點(diǎn)可以由cre重組酶識(shí)別，并且可將其用于通過cre重組酶表達(dá)載體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，消除位于loxP位點(diǎn)之間的藥物選擇標(biāo)記，以便隨后使用相同的選擇標(biāo)記。
i)floxed新霉素抗性盒的插入側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的新霉素抗性盒，能夠以1497bp Bsp1201-Xba1消化過的DNA片段形式，從質(zhì)粒pGL2neo(m)+(SEQ ID NO.4)中分離，并且連接到NotI-XbalI線性化的pBSL-DT4上，以便制備空的空導(dǎo)向載體pBSL-fineo-DT4。
ii)floxed嘌呤霉素和潮霉素B盒的克隆(圖6b)由于除了新霉素之外的floxed抗生素選擇標(biāo)記是很罕見的，將側(cè)翼為loxP的嘌呤霉素或潮霉素B標(biāo)記的片段插入pBSL-DT4的必須步驟，是插入兩個(gè)loxP位點(diǎn)的預(yù)備步驟。這一目的可以通過插入pBSL-DT4退火的合成DNA寡聚體而實(shí)現(xiàn)。合成的loxP位點(diǎn)包含在以下兩種互補(bǔ)性DNA寡聚體上SEQ ID NO.13(P009) 5′-CTAGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACGCGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3′和SEQ ID NO.14(P010) 5′-
CTAGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATACGCGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′按實(shí)施例5(b)步驟1所述方法對(duì)這兩種DNA寡聚體進(jìn)行退火，得到了雙鏈DNA片段，該片段包括由獨(dú)特的MluI限制位點(diǎn)隔開的兩個(gè)loxP位點(diǎn)。另外，退火的合成DNA寡聚體包括兩個(gè)5′-CTAG單鏈突出末端，可將其直接連接到相容性限制位點(diǎn)突出末端上(例如，通過SpeI，NheI，XbalI，或AvrII限制酶產(chǎn)生)。
然后，將含有退火的兩個(gè)loxP位點(diǎn)的DNA片段連接到SpeI線性化的pBSL-DT4上，得到了載體pBSL-DT4-2loxP(圖6b)。
嘌呤霉素或潮霉素B抗性的表達(dá)盒可以分別用質(zhì)粒pPur(Clontech)或pPGK-hygro(SEQ ID NO.1)作PCR模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用于從pPur(包括受猴病毒40早期啟動(dòng)子控制的嘌呤霉素ORF)擴(kuò)增1366bp的嘌呤霉素表達(dá)盒的引物是SEQ ID NO.15(P011) 5′-tcgACGCGTggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaag-3′和SEQ ID NO.16(P012) 5′-tcgACGCGTttggacaaaccacaactagaatgcagtg-3′兩種引物都包括限制性內(nèi)切酶MluI的識(shí)別位點(diǎn)(用大寫字母表示)，以便所得到的PCR產(chǎn)物，可以用這種限制酶克隆。
在對(duì)分離的PCR產(chǎn)物進(jìn)行MluI消化之后，將嘌呤霉素標(biāo)記片段連接到MluI線性化的pBSL-DT4-2loxP上，制備空的導(dǎo)向載體pBSL-flpur-DT4(圖6b)。
用于由pPGK-hygro(SEQ ID NO.1；包括受磷酸甘油酸激酶啟動(dòng)子控制的潮霉素B ORF)PCR擴(kuò)增2007bp的潮霉素B表達(dá)盒的引物是SEQ ID NO.17(P013) 5′-tcgACGCGTgaattctaccgggtaggggaggcgcttttc-3′和SEQ ID NO.18(P014) 5′-tcgACGCGTggaattagaacttggcaaaacaatactgag-3′兩種引物都包括所述限制性內(nèi)切酶MluI的識(shí)別位點(diǎn)(用大寫字母表示)，以便可以消化所得到的PCR產(chǎn)物，并且用該限制酶連接。
在對(duì)分離的PCR產(chǎn)物進(jìn)行MluI消化之后，將潮霉素B標(biāo)記片段連接到MluI線性化的pBSL-DT4-2loxP上，制備空的導(dǎo)向載體pBSL-flpur-DT4(圖6b)。
步驟4克隆鼠IgH和κL鏈基因座，以及RAG1基因的最終的導(dǎo)向載體作為克隆內(nèi)源基因座的導(dǎo)向載體的典型例子，披露了用于在鼠preB細(xì)胞中進(jìn)行的內(nèi)源IgH和IgκL鏈基因座的順式作用定向突變，以及RAG1基因的反式作用突變的基因?qū)蜉d體的克隆方法。
i)IgH鏈導(dǎo)向載體的構(gòu)建(圖5a)內(nèi)源鼠IgH鏈基因座在preB細(xì)胞中的失活，可以通過在兩個(gè)IgH鏈的等位基因上產(chǎn)生很多不同的順式作用定向缺失而實(shí)現(xiàn)。例如，一種IgH失活缺失，是缺失所有DH和JH基因片段，在這里它是作為使內(nèi)源IgH等位基因不能生產(chǎn)內(nèi)源免疫球蛋白的可能性之一披露的。在這里，用″floxed″新霉素定向構(gòu)建體作例子，說明了導(dǎo)向載體的構(gòu)建(參見圖5a)。為了克隆含有諸如嘌呤霉素或潮霉素B的其他陽性抗生素選擇標(biāo)記的基因?qū)蜉d體，可以采用類似方法。
基質(zhì)細(xì)胞，IL7依賴性鼠preB細(xì)胞，通常在兩個(gè)等位基因上具有DJH重排(參見上文)。在設(shè)計(jì)導(dǎo)向載體時(shí)，需要考慮這一事實(shí)。無論DJH重排的類型如何，在所有preB細(xì)胞中的兩個(gè)IgH等位基因上仍然存在介入可變基因片段和D基因片段簇之間的DNA，以及位于JH基因簇和Cμ編碼區(qū)之間的介入序列。因此，DJH重排等位基因的導(dǎo)向載體，必須包括位于大部分5′定位的D因子(DFL16.1)上游和大部分位于3′JH基因片段(JH4)下游的同源區(qū)。
在圖5a中示出了一種可能的DFL16.1-JH4重排的等位基因與周圍的基因組DNA序列的基因組組構(gòu)。作為基因?qū)虻囊话惴椒ǎ瑢⒈粍h除的位于所述區(qū)或基因上游的DNA序列同源性的短的片段(1-1.5kb)克隆到位于″floxed″陽性選擇標(biāo)記上游的獨(dú)特的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(這里是NotI)上，并且將要?jiǎng)h除的位于所述區(qū)或基因下游的DNA序列同源性的較長(zhǎng)的片段(＞2.5kb)克隆到位于″floxed″陽性選擇標(biāo)記和白喉毒素α表達(dá)盒之間的獨(dú)特的限制酶識(shí)別位點(diǎn)上(圖5a)(這里是AscI)。因此，如果同源重組發(fā)生在所述導(dǎo)向載體的DNA序列同源性的長(zhǎng)的片段和所述內(nèi)源基因座上，僅僅抑制了所述陽性選擇標(biāo)記(白喉毒素α)的表達(dá)，以便在所述導(dǎo)向載體定向整合到所述染色體DNA上時(shí)，所述DT-α表達(dá)盒會(huì)丟失。如果同源重組還發(fā)生在所述短的同源臂上，位于所述雙交換之間的片段會(huì)被所述陽性藥物篩選標(biāo)記所取代。因此，在用所述定向構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的preB細(xì)胞上使用抗生素篩選，得到了通過同源重組進(jìn)行的所述導(dǎo)向載體的定向整合的有效選擇，導(dǎo)致了所述內(nèi)源基因座的缺失。
可以用以下引物，由小鼠基因組通過PCR擴(kuò)增位于大部分5′D因子(DFL16.1)上游的同源性的短的片段，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列AF018146設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.19(P015) 5′-aatGCGGCCGCgaacctcctgtgttgcaagcacaaatggg-3′和SEQ ID NO.20(P016) 5′-aatGCGGCCGaggcagcacggttgagtttcagttgtcatc-3′為了克隆目的而導(dǎo)入的附加的NotI限制酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸序列，用大寫字母表示。所述引物能夠擴(kuò)增可以用NotI限制酶消化的1465bp的基因組PCR片段，并且連接到NotI線性化的pBSL-flneo-DT4上，制備pBSL-5′JH-flneo-DT4(圖5a)。位于JH基因片段簇下游的序列同源性長(zhǎng)片段，還包括EμH重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子，可以用以下引物由小鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列文件J00440設(shè)計(jì)的(附加的AscI限制酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸用大寫字母表示)SEQ ID NO.21(P017)5′-ttGGCGCGCCgtaagaatggcctctccaggtctttatttt-3′和SEQ ID NO.22(P018) 5′-ttGGCGCGCCagctcagctcagctcaccccagctcagctc-3′可將所述引物用于通過PCR方法擴(kuò)增來自小鼠基因組DNA的3215bp的基因組PCR片段，可以用AscI限制酶消化所述片段，并且連接到AscI線性化的pBSL-5′JH-fineo-DT4上，得到最終的JH導(dǎo)向載體pBSL-5′JH-flneo-3′JH-DT4，可將該載體用于刪除DJH重排的preB細(xì)胞中的所有其余的DH和JH基因片段(圖5a)。
ii)κL鏈導(dǎo)向載體的構(gòu)建(圖5b)與IgH鏈基因座的情形類似，κL鏈基因座可以通過若干順式作用突變激活，例如，包括刪除所有的JK基因片段，KL鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(KiE)，恒定KL鏈區(qū)(CK)，或3′K增強(qiáng)子(3′KE)。作為一種例子，可以將本文所披露的定向構(gòu)建體和方法，用于定向刪除所有JK基因片段。另外，本文所披露的定向構(gòu)建體的構(gòu)建，只是為了提供包括″floxed″新霉素抗性標(biāo)記的定向構(gòu)建體。含有″floxed ″嘌呤霉素或潮霉素B表達(dá)盒的定向構(gòu)建體，是以類似方式進(jìn)行的。使用以下引物，由小鼠基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增JK基因片段簇上游的同源性短的片段，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank條目V00777設(shè)計(jì)的(用于克隆目的的附加的NotI限制酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸用大寫字母打印)SEQ ID NO.23(P019) 5′-tatGCGGCCGcttatctttctcctttattaacggttgctg-3′和SEQ ID NO.24(P020) 5′-tatGCGGCCGCacagtggtagtactccactgtctggctg-3′引物P019與NCBI-Genbank條目V00777的1-30號(hào)位置結(jié)合，而引物P020與711-738號(hào)位置結(jié)合。所得到的738bp PCR片段用NotI限制酶消化，并且連接到NotI線性化的空導(dǎo)向載體pBSL-flneo-DT4上，制備pBSL-5′JK-flneo-DT4上(圖5b)。位于JK基因片段簇下游的DNA序列同源性的長(zhǎng)的片段包括κiE和恒定κL鏈區(qū)(Ck)，該片段是用以下引物由小鼠基因組DNA通過PCR擴(kuò)增的，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank條目V00777設(shè)計(jì)的(附加的AscI限制酶識(shí)別位點(diǎn)的核苷酸用大寫字母打印)SEQ ID NO.25(P021) 5′-ttGGCGCGCCtgtgtaagacacaggttttcatgttaggag-3′和SEQ ID NO.26(P022) 5′-ttGGCGCGCCtgcttcgccaagtttactgggtaggttg-3′引物P021能結(jié)合NCBI-Genbank序列V00777的2129-2158號(hào)位置，而引物P022能結(jié)合它的5456-5483號(hào)位置。用AscI限制酶消化所得到的3379bp PCR片段，并且連接到AscI線性化的載體pBSL-5′JK-flneo-DT4上，制備pBSL-5′JK-flneo-3′JK-DT4上(圖5b)。
iii)RAG基因座導(dǎo)向載體的制備(圖5c)作為通過在IgH和IgκL鏈基因座內(nèi)導(dǎo)入順式作用突變使preB細(xì)胞表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白潛力失活的一種替代方案，還可以通過導(dǎo)入反式作用突變，使得preB細(xì)胞不能對(duì)它們的內(nèi)源Ig基因進(jìn)行重排。例如，這一目的可以通過導(dǎo)向Ig基因重排所必需的兩個(gè)重組激活的(RAG)基因之一而實(shí)現(xiàn)。在它的RAG-1或RAG-2基因上具有缺失的鼠preB細(xì)胞，不能夠重排免疫球蛋白基因片段，并因此不能表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白。
為了一種例子，披露了導(dǎo)向載體的構(gòu)建，以便能夠完全刪除RAG-1基因的ORF。通過以下引物對(duì)擴(kuò)增位于RAG-1編碼區(qū)上游的大約1kb的基因組序列的DNA序列同源性的短臂，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列AC084753設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.27(P023)5′-tataGCGGCCGcttctgctcctcttctttagtactggattc-3′和SEQ ID NO.28(P024) 5′-tataGCGGCCGCgttggctaagctacctgggaacaatggggg-3′用大寫字母突出表示附加在每一種引物5’末端的NotI克隆位點(diǎn)，并且將其用于克隆包括位于RAG-1開放讀框上游的基因組區(qū)的1095bp的PCR片段(圖5c)。用NotI消化所述PCR產(chǎn)物，并且連接到陽性-陰性導(dǎo)向載體，例如，pBSL-fineo-DT4的獨(dú)特的NotI位點(diǎn)上。分別包括處在正確方向的位于RAG-1編碼區(qū)上游的短的同源性臂的質(zhì)?？寺?，并且命名為DBSL-5′R1-fineo-DT4。
為了克隆RAG-1基因的定向構(gòu)建體的所述長(zhǎng)臂，通過以下引物對(duì)擴(kuò)增直接位于RAG-1編碼區(qū)下游的大約3kb的基因組區(qū)(圖5c)，所述引物對(duì)是根據(jù)Genbank序列AC084753設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.29(P025) 5′-ttGGCGCGCCataggatctccacatagaagttggtatttgcc-3′和SEQ ID NO.30(P026)5′-ttGGCGCGCCgtgggcacacatatgtcatcccagttaccc-3′將AscI限制酶的識(shí)別序列附加在每一種引物的5’末端，并且用于克隆含有位于RAG-1開放讀框下游的DNA序列同源性的長(zhǎng)臂的2954bp的長(zhǎng)的PCR片段。在AscI消化之后，將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到載體pBSL-5′R1-flneo-DT4的獨(dú)特的AscI限制位點(diǎn)上。分離含有正確取向的位于RAG-1編碼區(qū)下游的同源性長(zhǎng)臂的質(zhì)?？寺?，并且命名為pBSL-5′R1-fineo-3′R1-DT4(圖5c)，并且能夠直接用于定向刪除preB細(xì)胞中的內(nèi)源RAG-1基因。
步驟5導(dǎo)向長(zhǎng)期增殖的基質(zhì)細(xì)胞，IL7依賴性鼠preB細(xì)胞中的內(nèi)源基因座為了依次定向刪除內(nèi)源基因座的兩個(gè)等位基因，可以采用兩種不同的方法。一種方法是使用對(duì)導(dǎo)向于所述兩種不同等位基因的不同陽性選擇標(biāo)記的導(dǎo)向載體?；蛘?，另一種方法是將相同的定向構(gòu)建體兩次用于依次導(dǎo)向于兩個(gè)內(nèi)源等位基因。不過，對(duì)于后一種方法來說，對(duì)第一個(gè)等位基因的導(dǎo)向，必須緊跟著進(jìn)行轉(zhuǎn)入preB細(xì)胞的編碼cre-重組酶的表達(dá)載體的瞬時(shí)表達(dá)，這將導(dǎo)致側(cè)翼為loxP位點(diǎn)的藥物選擇標(biāo)記的永久性刪除，以便可以將相同的抗生素藥物選擇用于其他等位基因的第二次定向。
作為一種例子，披露了按照第一種方法依次導(dǎo)向內(nèi)源基因的兩個(gè)等位基因的實(shí)驗(yàn)方法，即使用具有兩種不同抗生素抗性標(biāo)記(嘌呤霉素和潮霉素B)的導(dǎo)向載體。
為了導(dǎo)向于第一個(gè)等位基因上的基因座，將20μg線性化的具有嘌呤霉素抗性標(biāo)記的導(dǎo)向載體轉(zhuǎn)染到懸浮在PBS中的107preB細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染是通過使用BioRad電穿孔儀和0.4cm的電穿孔儀樣品池，在350V的電壓下，以960μF的電容，通過電穿孔進(jìn)行的。然后將所述細(xì)胞以5×104細(xì)胞/孔的密度鋪板到96孔平板培養(yǎng)物的IL7生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述平板是用3000rad輻射的嘌呤霉素抗性ST-2基質(zhì)細(xì)胞的亞鋪滿層覆蓋的。在轉(zhuǎn)染之后30小時(shí)，以2μg/ml的最終濃度添加嘌呤霉素。在轉(zhuǎn)染之后7-10天，分離嘌呤霉素抗性集落，并且在用2μg/ml嘌呤霉素連續(xù)選擇的條件下，在新的，輻射過的和嘌呤霉素抗性ST-2基質(zhì)細(xì)胞上擴(kuò)增。通過標(biāo)準(zhǔn)PCR和基因組southern印跡雜交分析，分析單一嘌呤霉素抗性PreB細(xì)胞克隆的所述導(dǎo)向載體向一個(gè)等位基因中的定向整合。然后再次轉(zhuǎn)染在一個(gè)等位基因上具有定向整合的所述導(dǎo)向載體的PreB細(xì)胞克隆，這一次轉(zhuǎn)染是使用20μg線性化的包括潮霉素B抗性標(biāo)記的導(dǎo)向載體在與上文所述相同的條件下進(jìn)行的。然后以5×104細(xì)胞/孔的密度，將轉(zhuǎn)染過的PreB細(xì)胞鋪板到96孔平板培養(yǎng)物上的IL7生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，所述平板是用3000rad輻射過的嘌呤霉素和潮霉素B雙重抗性ST-2基質(zhì)細(xì)胞亞鋪滿層覆蓋的。在轉(zhuǎn)染之后30小時(shí)，通過添加2μg/ml嘌呤霉素和400μg/ml潮霉素B，選擇雙重抗性PreB細(xì)胞克隆。在轉(zhuǎn)染之后7-10天，分離嘌呤霉素和潮霉素B雙重抗性克隆，并且在用2μg/mL嘌呤霉素和400μg/ml潮霉素B連續(xù)選擇的條件下，在新的，輻射過的和嘌呤霉素/潮霉素B雙重抗性ST-2基質(zhì)細(xì)胞上擴(kuò)增。分析單個(gè)嘌呤霉素/潮霉素B雙重抗性PreB細(xì)胞克隆的所述導(dǎo)向載體通過標(biāo)準(zhǔn)基因組PCR和/或southern印跡分析向所述第二個(gè)等位基因的定向整合。
然后，可以用組成型cre-重組酶表達(dá)載體，瞬式轉(zhuǎn)染具有兩個(gè)定向等位基因的嘌呤霉素/潮霉素B雙重抗性PreB細(xì)胞克隆，以便在其他基因座和等位基因上重復(fù)基因?qū)驅(qū)嶒?yàn)。這一目的可以通過用10μg超螺旋cre-重組酶表達(dá)載體，通過電穿孔按上述方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PreB細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)。然后，在IL-7生長(zhǎng)培養(yǎng)基中限制稀釋條件下，將所述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過的細(xì)胞鋪板到若干個(gè)96孔平板上的3000rad輻射過的亞鋪滿的ST-2基質(zhì)細(xì)胞上。在培養(yǎng)7天之后，將一組48個(gè)克隆復(fù)制鋪板到正常ST-2基質(zhì)細(xì)胞上，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，并且在相應(yīng)的選擇條件下，鋪板到嘌呤霉素抗性或潮霉素B單一抗性ST-2細(xì)胞上。變得對(duì)兩種抗生素藥物敏感的以前的嘌呤霉素/潮霉素B雙重抗性PreB細(xì)胞克隆，有可能發(fā)生了cre-重組酶介導(dǎo)的兩個(gè)loxP側(cè)翼抗性標(biāo)記的缺失。一旦通過southern印跡分析證實(shí)了有cre-重組酶介導(dǎo)的所述兩個(gè)抗性標(biāo)記的缺失，所述克隆可以進(jìn)行針對(duì)其他內(nèi)源基因座和等位基因的其他基因?qū)蚍椒ā?br> 實(shí)施例6人免疫球蛋白多肽逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體的構(gòu)建為了對(duì)鼠基質(zhì)細(xì)胞，IL7依賴性preB細(xì)胞的人免疫球蛋白的生產(chǎn)進(jìn)行重新編程，可以使用編碼人抗體多肽的新型逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。披露了用于制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的方法，可以根據(jù)B細(xì)胞分化階段，首先作為膜結(jié)合蛋白，隨后作為分泌型免疫球蛋白調(diào)控表達(dá)人IgH和L鏈蛋白。應(yīng)當(dāng)指出的是，可以將任何類型的異源結(jié)合蛋白克隆到所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體上，以便能夠表達(dá)任何類型的異源和人類結(jié)合蛋白。因此，本文所披露的對(duì)表達(dá)人IgH和IgL鏈的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)移載體的克隆的說明，僅僅被視為是說明性質(zhì)的，而不是排他性質(zhì)的。重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以容納高達(dá)7-10kb的異源DNA序列，它需要設(shè)計(jì)IgH和L鏈糖蛋白的獨(dú)立的構(gòu)建體，包括所有需要的細(xì)胞類型和分化階段特異性啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和控制元件，以及內(nèi)源Ig基因剪接信號(hào)。所述控制元件是確保在各種B細(xì)胞分化階段的正確表達(dá)，免疫球蛋白的膜沉積和分泌，它們的親和力成熟，以及異源抗體在漿細(xì)胞中的高水平分泌所必需的?？梢詫gH和L鏈的獨(dú)立的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體共同轉(zhuǎn)導(dǎo)到preB細(xì)胞中，由此使所述構(gòu)建體穩(wěn)定地整合到感染過的preB細(xì)胞的基因組上。如果使用喪失了表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白的潛力的鼠preB細(xì)胞(參見上文的說明)，在逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的preB細(xì)胞分化時(shí)，就只有異源或人類抗體或結(jié)合蛋白能夠在B系細(xì)胞中表達(dá)。
(a)用于IgH鏈的調(diào)控表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的制備由于編碼各種IgH和L鏈蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體最終會(huì)轉(zhuǎn)導(dǎo)到鼠細(xì)胞中，控制Ig表達(dá)的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件可以來自鼠類起源，以便確定與B系特異性鼠轉(zhuǎn)錄因子的最佳相互作用。
制備所述逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體的起始載體，是空的逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體pLIB(Clontech)(圖12a)。編碼人免疫球蛋白重鏈的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的制備，是一個(gè)多步驟的克隆過程，它涉及將啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及編碼人類抗體的各種可變的和恒定的區(qū)依次克隆到空的逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆載體pLIB中的步驟。在第一個(gè)步驟中，通過PCR方法將鼠VH啟動(dòng)子克隆到pLIB的多克隆位點(diǎn)的獨(dú)特的ClaI限制位點(diǎn)上。這一目的是通過PCR方法擴(kuò)增來自鼠基因組DNA的鼠VH啟動(dòng)子元件而實(shí)現(xiàn)的，使用了以下引物，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank數(shù)據(jù)庫保藏號(hào)X71119設(shè)計(jì)的。
SEQ ID NO.31(P027)5′-ccATCGATtgactggatgcttgttaattctaataag-3′，和SEQ ID NO.32(P028) 5′-ccATCGATGGATCCtgtgtgccagtaactgtagagagaac-3′所述引物能夠通過PCR方法擴(kuò)增394bp的VH啟動(dòng)子片段，該片段包括位于它們的5′和3′末端的ClaI的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(ATCGAT)，因?yàn)樗鼈冋显谝颬027和P028的5′末端。除了這兩種引物上的ClaI位點(diǎn)之外，反向引物P028包括將另一個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)導(dǎo)入PCR產(chǎn)物的額外的BamHI限制位點(diǎn)(GGATCC，加下劃線)(參見圖12a)，該位點(diǎn)是其他克隆步驟所必須的。在對(duì)所述PCR片段進(jìn)行ClaI限制酶消化之后，將包括新的BamHI位點(diǎn)的擴(kuò)增的VH啟動(dòng)子PCR片段，連接到ClaI線性化的pLIB載體上。通過診斷性限制酶消化和DNA測(cè)序，鑒定含有沿需要方向的(與5′LTR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向相反)的VH啟動(dòng)子的連接產(chǎn)物，并且命名為pAB-1(圖12a)。
第二個(gè)步驟，是將鼠內(nèi)含子重鏈增強(qiáng)子(EμH)與它的側(cè)翼基質(zhì)連接區(qū)(MARs)克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pAB-1上。已知具有它的側(cè)翼(MARs)的EμH增強(qiáng)子元件，是免疫球蛋白在B系細(xì)胞中有效表達(dá)所需要的。EμH增強(qiáng)子克隆是通過使用以下引物擴(kuò)增來自鼠基因組DNA的983bp的PCR片段而實(shí)現(xiàn)的，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列J00440設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.33(P029) 5′-cgGGATCCAAGCTTagagaggtctggtggagcctgcaaaagtcc-3′和SEQ ID NO.34(P030) 5′-gatcGCGGCCGCtctagataattgcattcatttaaaaaaaaaatatttc-3′附加在每一個(gè)引物上的限制位點(diǎn)(對(duì)于P029來說是BamHI/HindIII，而對(duì)于P030來說是NotI)用大寫字母突出表示。然后用BamHI和NotI限制酶消化所述PCR產(chǎn)物，并且定向連接到BamHI/NotIII線性化的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pAB1上，得到了載體pAB-2。所述有義引物P029包括編碼其他HindIII位點(diǎn)的序列(加下劃線)，它將能夠在pAB-2上產(chǎn)生隨后的克隆步驟所需要的獨(dú)特的限制酶識(shí)別位點(diǎn)上。
然后，將含有3′α增強(qiáng)子的DNA片段添加到構(gòu)建體pAB-2上。已知3′α增強(qiáng)子是在漿細(xì)胞的分化階段抗體的最佳的和高水平表達(dá)和分泌所必需的。已知所述3′α增強(qiáng)子包括四個(gè)DNAseI超敏性位點(diǎn)(HS1，HS2，HS3，和HS4)，所述位點(diǎn)包括對(duì)晚期B細(xì)胞/漿細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的各種結(jié)合位點(diǎn)。在報(bào)導(dǎo)基因分析中，證實(shí)了HS1和2位于0.6kb基因組DNA片段上，能產(chǎn)生3′α增強(qiáng)子活性的至少80％，而在DNA序列上高度同源的HS3和4的作用很小。
所有四個(gè)3′α增強(qiáng)子成分，HS1，2，3和4，組成了所謂的基因座控制區(qū)(LCR)，它能夠不依賴于側(cè)翼DNA序列地調(diào)控特定基因座的轉(zhuǎn)錄活性。因此，免疫球蛋白重鏈的基礎(chǔ)逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，將至少包括3′α增強(qiáng)子的HS1，2區(qū)，該區(qū)可以使用根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列進(jìn)入X96607設(shè)計(jì)的引物由鼠基因組DNA通過PCR方法擴(kuò)增(克隆所述PCR片段或隨后的克隆步驟所需要的其他限制酶位點(diǎn)的識(shí)別序列用大寫字母突出表示)SEQ ID NO.35(P031) 5′-
gcatGTCGACACGCGTgggggctcagatatcagtaccagaaacaagg-3′，和SEQ ID NO.36(P032) 5′-cgatGTCGACCTCGAGttggagtcacaggcctgtctccatgtgg-3′除了在每一個(gè)引物上的5′末端SalI位點(diǎn)(GTCGAC)之外，所述正向引物P031包括額外的MluI位點(diǎn)(加下劃線)，而反向引物P028包括其他XhoI位點(diǎn)(加下劃線)。引物P031和P032能夠擴(kuò)增可以用SalI限制酶消化的644bp的PCR片段，并且連接到SalI線性化的載體pAB-2上。通過診斷性限制酶消化和DNA測(cè)序，確定具有沿需要的方向的插入片段的克隆(參見圖12b)，并且命名為pAB-3(圖12b)。
在IgH表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建體上，可以選擇性地包括其他3′α增強(qiáng)子成分HS3和4。對(duì)于包括所述3′α增強(qiáng)子HS4區(qū)的466bp片段來說，可以用小鼠基因組DNA作模板，使用以下引物通過PCR方法擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目S74166設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.37(P033)5′-gcaCTCGAGgggtagatgcagcctgtgttccgtttactg-3′，和SEQ ID NO.38(P034) 5′-gctCTCGAGCATGCctgagcccaccaggaagtcctctgtg-3′附加在每一種引物的5′末端的限制酶位點(diǎn)用大寫字母突出表示。除了存在于兩種引物中的XhoI限制位點(diǎn)(CTCGAG)之外，反向引物P034包括額外的SphI限制位點(diǎn)(GCATGC，加下劃線)，含有隨后的克隆用途所必需的其他獨(dú)特的限制位點(diǎn)。用引物對(duì)P033和P034在基因組小鼠DNA上進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，得到了466bp的PCR片段，所述PCR片段可以用限制酶XhoI消化，并且隨后將它連接到XhoI線性化的載體pAB-3上。通過診斷性限制酶消化和DNA測(cè)序，確定具有沿需要的方向的SH4插入片段的克隆，并且命名為載體構(gòu)建體pAB-4(圖12b)。最后的3′α增強(qiáng)子片段HS3，可以用鼠基因組DNA作模板，使用以下引物通過PCR方法擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目X96607用設(shè)計(jì)的(限制酶SphI的識(shí)別序列同樣用大寫字母突出表示)SEQ ID NO.39(P035) 5′-ttaaGCATGCaaccacatgcgatctaagggatattgggg-3′和SEQ ID NO.40(P036)
5′-ttaaGCATGCgatcattgagctccggctctaacaactggg-3′用SphI限制酶消化PCR擴(kuò)增的HS33′α增強(qiáng)子區(qū)，并且連接到SphI線性化的載體pAB-4上，以便制備pAB-5?？梢詫⑤d體pAB-3，4，或5中的任意一種用于插入異源免疫球蛋白重鏈的編碼區(qū)(圖12b)。
所述人免疫球蛋白同種型的每一種可以作為膜結(jié)合表面免疫球蛋白或作為分泌型抗體表達(dá)，所述表達(dá)是通過交替的剪接事件調(diào)控的，要么保持，要么從mRNA轉(zhuǎn)錄物上缺失跨膜外顯子。盡管每一種免疫球蛋白同種型具有它自身的編碼跨膜外顯子的編碼區(qū)，所有人IgG，IgA和IgE抗體的所述跨膜區(qū)，對(duì)于所述獨(dú)特的亞型來說實(shí)際上是相同的。因此，可以將相同的IgG膜外顯子用于膜錨定IgG1，IgG2，IgG3和IgG4抗體，將不同類型的外顯子用于IgA1和IgA2，并且每一個(gè)不同的外顯子，是每一種IgE和IgM抗體所必需的。
因此，朝向制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒Ig表達(dá)構(gòu)建體的克隆方法的下一個(gè)步驟，是將編碼人IgG，IgA，IgM和IgE抗體的各種跨膜區(qū)插入載體pAB-3，4，或5中的任一個(gè)上。作為一種典型例子，披露了基礎(chǔ)逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-3的其他克隆方法，該構(gòu)建體包括VH啟動(dòng)子，EμH增強(qiáng)子和最低3′αE增強(qiáng)子(HS1，2)因子(圖12c)。
μH鏈跨膜區(qū)是由位于CμH恒定區(qū)外顯子CμH1-CμH4下游1.85kb的兩個(gè)外顯子μM1和μM2編碼的。包括所述內(nèi)源聚腺苷酸化位點(diǎn)的μM1和μM2外顯子包括在773bp的基因組片段上，該片段可以用以下引物，通過PCR方法由小鼠基因組DNA擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank重疊群序列NT010168設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.41(P037) 5′-catACGCGTcgctgcatcaggctttcaggggcccagccc-3′和SEQ ID NO.42(P038) 5′-catACGCGTccctcaccagaaagcagtttcatggataaaatg-3′附加在每一種引物5’末端的MluI限制位點(diǎn)，用大寫字母突出表示。所得到的PCR產(chǎn)物可以用MluI限制位酶消化，并且將所得到的773bp的片段連接到MluI線性化的載體pAB-3上。將通過限制酶作圖和DNA測(cè)序證實(shí)的含有正確方向的μM1和μM2外顯子的克隆，命名為構(gòu)建體pAB-3.1(圖12c)。
例如，IgG抗體的膜沉積，可以通過IgG1基因的跨膜外顯子實(shí)現(xiàn)。IgG1跨膜區(qū)是由位于跨越1.9kb的片段的Cγ1H外顯子的下游1.25kb的兩個(gè)外顯子編碼的。為了縮短γ1M1和γ1M2之間的內(nèi)含子，使用了單一重疊延伸(SOE)PCR方法，通過該方法，將以上兩個(gè)外顯子融合在較小的PCR片段上。一般來說，如果所述上游PCR產(chǎn)物的反向引物和下游PCR產(chǎn)物的有義引物具有大約30-40bp的互補(bǔ)性，可以實(shí)現(xiàn)兩種PCR產(chǎn)物的融合。所述完全互補(bǔ)性的區(qū)域能夠以15-20個(gè)核苷酸的形式附加在所述反向引物和正向引物的5′末端，分別用于擴(kuò)增所述上游和下游PCR產(chǎn)物。不過，對(duì)于兩個(gè)外顯子γ1M1和γ1M2的融合來說，巧合的是，兩個(gè)完全相同的28bp的序列存在于γ1M1的下游78bp處，和γ1M2外顯子的上游256bp處。可以通過SOE-PCR，將所述序列用于制備較短的PCR片段，所述片段含有編碼γH鏈的跨膜區(qū)的γ1M1和γ1M2外顯子。因此，使用以下引物在人基因組DNA上同時(shí)進(jìn)行了兩種PCRs，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列AL122127設(shè)計(jì)的。使用以下引物如人基因組DNA，擴(kuò)增了包括γ1跨膜外顯子1(γ1 M1)的315堿基對(duì)的PCR片段SEQ ID NO.43(P039) 5′-catACGCGTacagagggaatcacccccagaggcccaagccc-3′和SEQ ID NO.44(P040) 5′-gacagcgtcagggacaggtggggacagc-3′，使引物P039結(jié)合在NCBI-Genbank序列條目AL122127的9710-9741號(hào)位置上，而引物P040結(jié)合在9435-9462號(hào)位置上。
可以用以下引物由人基因組DNA擴(kuò)增包括所述跨膜外顯子2(γ1M2)的A555堿基對(duì)的PCR片段SEQ ID NO.45(P041) 5′-gctgtccccacctgtccctgacgctgtc-3′，和SEQ ID NO.46(P042)5′-catACGCGTttatttggaaggggggcgtgtcaggtgtgtcagggtc-3′使引物P041結(jié)合在NCBI-Genbank序列條目AL122127的8137-8164號(hào)位置上，而引物P042結(jié)合在7624-7654號(hào)位置上。通過將1/100的γ1M1外顯子PCR產(chǎn)物與1/100的γ1M2外顯子PCR產(chǎn)物混合，并且用有義引物P039和反向引物P042重復(fù)進(jìn)行PCR，可以將所述兩種PCR產(chǎn)物與822bp PCR融合產(chǎn)物融合。除了存在于引物P039和P042上的MluI限制酶識(shí)別位點(diǎn)之外(用大寫字母突出表示)，這些位點(diǎn)是克隆SOE融合PCR產(chǎn)物所必須的，引物P042還包括人工聚腺苷酸化信號(hào)的互補(bǔ)序列(加下劃線)，使得在最終地逆轉(zhuǎn)錄病毒免疫球蛋白表達(dá)載體上，所述免疫球蛋白轉(zhuǎn)錄物能夠正確的轉(zhuǎn)錄終止。然后，用MluI限制酶消化832bp的γ1M1γ1M2-polyA信號(hào)PCR片段，并且連接到載體pAB-3上。將通過限制酶作圖和DNA測(cè)序證實(shí)的具有正確取向的插入片段的克隆，命名為克隆pAB-3.2(圖12c)。
α1跨膜編碼區(qū)的克隆，可以通過用人基因組DNA PCR擴(kuò)增含有編碼包括它的內(nèi)源polyA位點(diǎn)的α1M的單一外顯子的片段而實(shí)現(xiàn)?？梢詫⒁韵乱镉糜谠揚(yáng)CR擴(kuò)增，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目M60193設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.47(P043)5′-atcACGCGTctcaggccttagatggggacccagaccc-3′和SEQ ID NO.48(P044)5′-attACGCGTgacccccgtctcctcattcagagtctgtg-3′兩種引物都包括附加在每一種引物的5′末端的MluI克隆位點(diǎn)(用大寫字母突出表示)，并且能夠擴(kuò)增可以用MluI限制酶消化的768堿基對(duì)的PCR產(chǎn)物，然后將該產(chǎn)物連接到MluI線性化的pAB-3上。將通過限制酶作圖和DNA測(cè)序證實(shí)的具有正確取向的插入片段的克隆，命名為克隆pAB-3.3。
為了表達(dá)膜結(jié)合IgE抗體，通過PCR方法克隆由兩個(gè)外顯子ε1M1和ε1M2編碼的ε1H鏈的跨膜區(qū)。為此，用以下引物由人類基因組DNA擴(kuò)增了858bp的PCR產(chǎn)物，所述引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目X63693設(shè)計(jì)的SEQ ID NO.49(P045)5′-catACGCGtcgggacctgggtgcccaccctcagggctgg-3′和SEQ ID NO.50(P046)5′-aatACGCGTttatttgtgccctgggctgggtgccgggccctccttgg-3′這兩種引物都含有附加在每一個(gè)引物末端的MluI克隆位點(diǎn)(用大寫字母突出表示)，得到了858bp的PCR產(chǎn)物，可以用MluI限制酶消化該產(chǎn)物。另外，將反向引物P046設(shè)計(jì)成包括人工polyA信號(hào)的互補(bǔ)序列(加下劃線)，確保在最終的表達(dá)構(gòu)建體上mRNA轉(zhuǎn)錄的正確終止。將MluI消化過的PCR片段連接到MluI線性化的pAB-3上。通過限制酶作圖和DNA測(cè)序證實(shí)具有正確取向的插入片段的克隆，并且命名為克隆pAB-3.4。
在對(duì)IgG，IgA，IgM和IgE同種型的各種跨膜外顯子進(jìn)行克隆之后，必須將編碼人類恒定區(qū)的外顯子，插入逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-3.1至3.4。為此，將編碼所述恒定區(qū)外顯子的DNA片段克隆到pAB-3.1至4構(gòu)建體中每一個(gè)的獨(dú)特的NotI限制酶識(shí)別位點(diǎn)上。
在圖12d中示出了編碼所有免疫球蛋白H鏈同種型γ1，γ2，γ3和γ4的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的克隆。用人基因組DNA作PCR模板，可以將以下引物用于通過PCR擴(kuò)增四種不同的IgG重鏈亞型對(duì)于γ1來說(根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列AL122127設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.51(P047)5′-gcatGCGGCCGCcctgggcccagctctgtcccacacc-3′，和SEQ ID NO.52(P048)5′-gcatGCGGCCGCtgggtgctttatttccatgctgggtg-3′對(duì)于γ2來說(根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列J00230設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.53(P049)5′-tataGCGGCCGCagggagtgggctaaggtgaggcaggtgg-3′和SEQ ID NO.54(P050)5′-attaGCGGCCGCctcagactcggcctgacccacggaaagaac-3′對(duì)于γ3來說(根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列AL122127設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.55(P051)5′-gcatGCGGCCGCccagctctgtcccacaccgcagtcacatgg-3′和SEQ ID NO.56(P052)5′-gctaGCGGCCGCtcgcaggggcccagggcagcgctgggtgctt-3′對(duì)于γ4來說(根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列K01316設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.57(P053)5′-attaGCGGCCGCggatagacaagaaccgaggggcctctg-3′和SEQ ID NO.58(P054)5′-taatGCGGCCGCccagggcagtggtgggtgctttatttcc-3′
在每一種情況下，可以用NotI限制酶消化編碼γ1H的1788bp的PCR產(chǎn)物，編碼γ2H的1959bp的PCR產(chǎn)物，編碼γ3H的2374bp的PCR產(chǎn)物，和編碼γ4H的1820bp的PCR產(chǎn)物，將消化過的片段連接到NotI線性化的pAB-3.2上(圖12d)。將通過限制酶作圖和DNA測(cè)序確定的含有正確取向的并且沒有任何突變的插入片段的構(gòu)建體，并且分別命名為pAB-3.2-G1，pAB-3.2-G2，pAB-3.2-G3，和pAB-3.2-G4。
為了克隆編碼μH，α1H，α2H，和εH鏈的恒定區(qū)外顯子，采用了相同的方法(圖12e)。將以下引物用于使用人基因組DNA作模板，通過PCR方法擴(kuò)增不同的IgH同種型對(duì)于μH來說(按照公開的NCBI-Genbank序列AB019441設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.59(P055)5′-attaGCGGCCGCcaccccagtaggccagagcatcgtgcac-3′和SEQ ID NO.60(P056)5′-taatGCGGCCGCcacccctgatagccatgacagtctggg-3′對(duì)于α1H和α2H來說(按照公開的NCBI-Genbank序列J00220，和J00221設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.61(P057)5′-attaGCGGCCGCtgtcaccaggcctctctgtgctgggttcc-3′和SEQ ID NO.62(P058)5′-tattGCGGCCGCcggatggaagcgtggggctgcttgggg-3′對(duì)于εH來說(按照公開的NCBI-Genbank序列L00022設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.63(P059)5′-taatGCGGCCGCcacggggtccccagctcccccatccagg-3′和SEQ ID NO.64(P060)5′-atatGCGGCCGCtcccaagaatgggtgtactggggctc-3′在每一種情況下，可以用NotI限制酶消化編碼μH的2229bp的PCR產(chǎn)物，編碼α1H和α2H的1667bp的PCR產(chǎn)物，以及編碼εH的1908bp的PCR產(chǎn)物，并且分別連接到用NotI線性化的pAB-3.1，pAB-3.3，和pAB-3.4上(圖12e)。通過限制酶作圖和DNA測(cè)序確定了包括含有沿正確方向的插入片段的構(gòu)建體，并且分別被命名為pAB-3.1-M，pAB-3.3-A1，pAB-3.3-A2，和pAB-3.4-E。
由天然IgH鏈啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件控制的不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒H鏈表達(dá)構(gòu)建體仍然需要插入可變區(qū)編碼區(qū)，將在對(duì)克隆逆轉(zhuǎn)錄病毒IgL鏈載體的方法進(jìn)行說明之后，對(duì)此加以說明，因?yàn)閷⒁峁┯嘘P(guān)完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒IgH和IgL鏈表達(dá)構(gòu)建體的表達(dá)獨(dú)特的或不同特異性的類似方法。
(b)用于調(diào)控IgκL鏈表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的制備與設(shè)計(jì)用于IgκL鏈表達(dá)的構(gòu)建體類似，為了IgκL鏈的不同的分化階段特異性表達(dá)而設(shè)計(jì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體需要存在特定的KL鏈特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件。其中包括VK啟動(dòng)子，K輕鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(KiE)，和K3′增強(qiáng)子(K3′E)因子。所述因子的順序克隆可以按以下方式實(shí)現(xiàn)(圖13a，b)。
使用以下引物，由小鼠基因組DNA以290bp PCR片段形式PCR擴(kuò)增Vκ啟動(dòng)子(引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目X52768設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.65(P061)5-ccATCGATcctggtctacagtgtgaggtactggac-3′，和SEQ ID NO.66(P062)5′-ccATCGATGGATCCtctgagagctggaagagaggatgctttattagg-3′附加在每一種引物5’末端的限制位點(diǎn)用大寫字母突出表示。除了存在于這兩種引物5′末端的ClaI位點(diǎn)之外，反向引物P062包括額外的BamHIII限制位點(diǎn)(GGATCC，加下劃線)，將另一個(gè)獨(dú)特的限制位點(diǎn)導(dǎo)入所述PCR產(chǎn)物，該位點(diǎn)被用于隨后的克隆目的。在對(duì)所述PCR片段進(jìn)行ClaI限制酶消化之后，將擴(kuò)增的Vκ啟動(dòng)子連接到ClaI線性化的pLIB載體上。通過診斷性限制酶作圖和DNA測(cè)序鑒定含有沿需要方向的(與5′LTR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向相反)Vκ啟動(dòng)子的連接產(chǎn)物，并且得到構(gòu)建體pAB-6(圖13a)。
κiE和κL鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼區(qū)位于緊靠人和小鼠κL鏈基因座的地方，并且所述增強(qiáng)子似乎在不同物種中起作用。因此，披露了編碼κL鏈的兩種不同逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的選擇性的克隆方法，一種方法采用所述人的，而另一種方法采用所述鼠的K內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE)。應(yīng)當(dāng)指出的是，這兩種構(gòu)建體可以交替使用。含有所述人KiE的構(gòu)建體的克隆可以通過用以下引物，通過擴(kuò)增含有人κiE和位于5′的MAR的CK外顯子的基因組人DNA的PCR片段而實(shí)現(xiàn)的(引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目AF017732設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.67(P063)5′-cgGGATCCTGACGCGTaccagggagaagactgatttattagagatttc-3′，和SEQ ID NO.68(P064)5′-gatGCGGCCGCaaagattcactttatttattcattctcc-3′附加在每一種引物的5’末端的其他限制位點(diǎn)，同樣是用大寫字母突出表示的(引物P063中的BamHIII和P064中的NotI)。引物P063包括編碼用于隨后的克隆步驟的額外MluI限制位點(diǎn)的序列。所述PCR引物擴(kuò)增的2359bp的片段可以用BamHI和NotI消化，并且可將其直接克隆到用BamHI-NotI線性化的pAB-6上，制備逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-7(圖13a)。
對(duì)于使用鼠κiE的構(gòu)建體，通過前面所披露的SOE-PCR方法將含有鼠κiE的PCR產(chǎn)物融合到含有人Cκ區(qū)的PCR產(chǎn)物上。為此，首先同時(shí)進(jìn)行鼠κiE和人CK區(qū)的PCR擴(kuò)增，使κiE反向引物和CK區(qū)正向引物具有36bp的互補(bǔ)性區(qū)。在第二次PCR中，將其用于這兩種PGR產(chǎn)物，將1/100的每一種PCR反應(yīng)產(chǎn)物混合在一起，并且用κiE正向(P065)和CK區(qū)反向引物(P064)進(jìn)行擴(kuò)增，得到了這兩種PCR產(chǎn)物在36bp的末端互補(bǔ)性區(qū)的融合。
可以將以下引物用于用小鼠基因組DNA作模板擴(kuò)增鼠κiE(引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目V00777設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.69(P065)5′-cgGGATCCAAGCTTgaaaaatgtttaactcagctactataatccc-3′SEQ ID NO.70(P066)5′-gttttgttggagctcccctttgaagatattctcaggcttccttc-3′用基因組DNA作模板，可以將以下引物用于擴(kuò)增人Cκ區(qū)(根據(jù)公開的NCBI Genbank序列條目AF017732設(shè)計(jì)的引物)SEQ ID NO.71(P067)5′-aatatcttcaaaggggagctccaacaaaacaatttagaactttattaag-3′SEQ ID NO.68(P064)5′-gatGCGGCCGCaaagattcactttatttattcattctcc-3′
在引物P066和P067的末端互補(bǔ)性區(qū)下面加下劃線，所述互補(bǔ)性區(qū)能介導(dǎo)在用引物P065和P064以及用兩種第一次PCR產(chǎn)物的混合物作模板進(jìn)行的第二次PCR中介導(dǎo)兩種PCR產(chǎn)物的融合。可以用BamHI和NotI消化所得到的1524bp的鼠κiE-人Cκ融合PCR產(chǎn)物，然后直接克隆到用BamHI-NotI線性化的載體pAB-6上，制備載體pAB-8(圖13a)。
然后將鼠κ3′E克隆到pAB-7和pAB-8上的人Cκ區(qū)的下游，分別制備構(gòu)建體pAB-7.1和pAB-8.1。用于由小鼠基因組DNA克隆κ3′E的引物如下(根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目X15878設(shè)計(jì))SEQ ID NO.72(P068)5′-acgcGTCGACtagaacgtgtctgggccccatgaaacatc-3′，和SEQ ID NO.73(P069)5′-cgatGTCGACagctcaaaccagcttaggctacacagagaaac-3′兩種引物都包括SalI限制位點(diǎn)(用大寫字母突出表示)，以便所得到的827bp的PCR產(chǎn)物可以克隆到pAB-7和pAB-8的相容性SalI限制位點(diǎn)上。將通過限制酶作圖和DNA測(cè)序，確定的具有沿正確方向的插入片段和具有正確DNA序列的載體克隆，并且命名為pAB-7.1和pAB-8.1(圖13a)。在下一個(gè)克隆步驟中，將受組成型SV40啟動(dòng)子控制的嘌呤霉素抗性標(biāo)記，克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒κL鏈表達(dá)構(gòu)建體上。優(yōu)選包括編碼嘌呤霉素抗性的表達(dá)盒，因?yàn)镮gH和IgL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體需要穩(wěn)定地共轉(zhuǎn)導(dǎo)到鼠pre前B細(xì)胞內(nèi)，以便能夠表達(dá)完整的異源抗體。為了提高逆轉(zhuǎn)錄病毒共轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率，首先轉(zhuǎn)導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄病毒IgL鏈構(gòu)建體，并且通過嘌呤霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的IgL鏈構(gòu)建體的整合。IgH鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的二次轉(zhuǎn)導(dǎo)將會(huì)得到具有在用IgH鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)過的每一種細(xì)胞中產(chǎn)生抗體的潛力的細(xì)胞。
可以從所述嘌呤霉素抗性載體pPur(Clontech)上克隆嘌呤霉素表達(dá)盒，通過SOE-PCR刪除某些不想要的內(nèi)部限制位點(diǎn)，并且在擴(kuò)增的PCR片段末端添加合適的ClaI克隆位點(diǎn)。
用于SOE融合PCR的引物是
SEQ ID NO.74(P070)5′-ccATCGATctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg-3′SEQ ID NO.75(P071)5′-tcaggggatggtggcggccctaggcctccaaaaaagcctcctcactacttc-3′SEQ ID NO.76(P072)5′-cttttttggaggcctagggccgccaccatcccctgacccacgcccctgacc-3′SEQ ID NO.77(P073)5′-ccATCGATccagacatgataagatacattgatgag-3′首先，用引物對(duì)P070/P071和P072/P073同時(shí)進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，將相同的pPur模板用于所述PCRs。設(shè)計(jì)反向引物P071和正向引物P072，以便包括36bp的完全互補(bǔ)的區(qū)(加下劃線)，所述互補(bǔ)區(qū)使得通過第二次PCR產(chǎn)生的兩種PCR產(chǎn)物融合，在另一次PCR過程中使用等分的前面的PCR片段，單獨(dú)使用引物P070和P073。包括ClaI限制位點(diǎn)(大寫字母)的后一種引物使得可以將所得到的1351bp嘌呤霉素表達(dá)盒克隆到pAB-7.1和pAB-8.1的相容性ClaI位點(diǎn)上。由此分別產(chǎn)生了逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-7.1 Pur和pAB-8.1 Pur(圖13b)，可以將分別編碼κL鏈的獨(dú)特的和多樣性的可變區(qū)的單一的VJκ或VJκ區(qū)文庫插入所述構(gòu)建體中。下面將提供用于克隆所述可變區(qū)外顯子的方法，同時(shí)提供H鏈和λL鏈可變區(qū)的克隆，隨后還披露了異源人λL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的克隆。
(c)用于IgλL鏈的調(diào)控表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體的制備在某些場(chǎng)合下，需要生產(chǎn)含有λL鏈而不是KL鏈的異源抗體。不過，可能足以用任何人Cλ編碼區(qū)取代所述逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-7.1Pur和pAB-8.1Pur上的人Cκ編碼區(qū)，完整的內(nèi)源λL鏈表達(dá)形式只能通過控制λL鏈的表達(dá)，通過λL鏈基因座特異性啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件實(shí)現(xiàn)。這種情況特別適合所述鼠系統(tǒng)，其中，在B細(xì)胞分化期間，κL鏈基因重排和表達(dá)在λL鏈的重排和表達(dá)之前進(jìn)行。
鼠λL鏈基因座特異性增強(qiáng)子元件是λ2-4增強(qiáng)子和λ3-1增強(qiáng)子，它們位于緊靠Cλ2，Cλ4，和Cλ1，Cλ3恒定區(qū)外顯子的地方，并且分別調(diào)控λ2，λ4，和λ3輕鏈同種型的表達(dá)。
對(duì)于κL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體來說(參見上文)，將逆轉(zhuǎn)錄病毒λL鏈表達(dá)載體設(shè)計(jì)成包括嘌呤霉素抗性基因表達(dá)盒。因此，在第一個(gè)克隆步驟中，通過SOE-PCR將SV40啟動(dòng)子控制的嘌呤霉素表達(dá)盒融合在Vλ啟動(dòng)子上，將小鼠基因組DNA和pAB-7.1Put作為模板分別用于PCR擴(kuò)增。用于兩次同時(shí)進(jìn)行的SOE-PCR反應(yīng)的引物如下(Vλ啟動(dòng)子特異性引物P076和P077是根據(jù)公開的NCBI-Genbank數(shù)據(jù)庫序列條目J00591設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.78(P074)5′-ccATCGATctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtgg-3′SEQ ID NO.79(P075)5′-gatgtcacgtgagatcccagacatgataagatacattgatgagtttg-3′SEQ ID NO.80(P076)5′-tcttatcatgtctgggatctcacgtgacatcttataataaacctg-3′SEQ ID NO.81(P077)5′-ccATCGATACGCGTaattcacaaaccaagtctattattttcaata-3′對(duì)于前面所披露的SOE融合PCRs來說，首先，平行進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，在pAB-7.1 Pur上的嘌呤霉素表達(dá)盒用引物P074和P075作模板，而小鼠基因組DNA上的Vλ啟動(dòng)子用引物P076和P077作模板。然后，混合每一個(gè)1/100體積的第一次平行PCRs的等分樣品，并且再次用引物P074和P077擴(kuò)增。因此，將所述嘌呤霉素表達(dá)盒融合在Vλ啟動(dòng)子的5′末端，因?yàn)樵诜聪蛞颬075和有義引物P076上設(shè)計(jì)的完全互補(bǔ)的36bp的區(qū)(加下劃線)被用于第一輪平行的PCRs。
引物P074和P077都包括ClaI限制位點(diǎn)，可將該位點(diǎn)用于將所述PCR融合產(chǎn)物克隆到ClaI線性化的pLIB上。將另一個(gè)MluI限制位點(diǎn)(加下劃線)同樣整合到反向引物P077上，得到的Vλ啟動(dòng)子的3’末端的另一個(gè)獨(dú)特的MluI位點(diǎn)，該位點(diǎn)是其他克隆步驟所必須的。通過限制酶作圖和DNA測(cè)序，證實(shí)了具有沿正確方向插入pLIB上的嘌呤霉素-Vλ啟動(dòng)子融合PCR片段并且具有正確的DNA序列的載體克隆，命名為載體pAB-9(圖14a)。然后，通過PCR擴(kuò)增從小鼠基因組DNA制備兩種鼠λ2-4E和λ3-1E增強(qiáng)子元件，再次通過SOE-PCR融合這兩種序列?？梢允褂靡韵乱?分別根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列條目X54550和X54608設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.82(P078)5′-catGCGGCCGCgagtatccctgtgcagtggggatactcag-3′SEQ ID NO.83(P079)5′-tctcaggagagaCTCGAGactcctttgtgctctgatagcacacatgac-3′SEQ ID NO.84(P080)5′-gcacaaaggagtCTCGAGtctctcctgagatggttcataggcctgcc-3′SEQ ID NO.85(P081)5′-ggGAATTCtctagacataaggaacaaagtcagtgtgcc-3′
與前面的方法類似，首先用引物對(duì)P078/P079和P080/P081，用小鼠基因組DNA作模板擴(kuò)增兩種PCR片段，而在第二輪PCR反應(yīng)中，將所述PCR產(chǎn)物的等分樣品用作模板，并且通過用引物P078和P081進(jìn)行的PCR擴(kuò)增融合，因?yàn)镻079和P080具有36bp的互補(bǔ)性(加下劃線)。
所得到的1513bp的PCR融合產(chǎn)物，可以用NotI和EcoRI限制酶消化(將相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)整合到引物P078和P081上；用大寫字母突出表示)，并且定向克隆到NotI/EcoRI線性化的pAB-9上。將通過限制酶和DNA測(cè)序證實(shí)的具有正確DNA序列的克隆，命名為載體pAB-10(圖14a)。將引物P079和P080上的互補(bǔ)性區(qū)設(shè)計(jì)成包括額外的獨(dú)特的XhoI位點(diǎn)(用大寫字母突出表示)，以便在必要的時(shí)候可以分別除去每一個(gè)增強(qiáng)子元件。
在下一個(gè)步驟中，用以下引物將人Cλ區(qū)克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體pAB-10上(引物是根據(jù)公開的NCBI-Genbank序列D87023和D87017設(shè)計(jì)的)SEQ ID NO.86(P082)5′-ccACGCGTaaaagcttgtctaggtggagcccactccttgcc-3′SEQ ID NO.87(P083)5′-catGCGGCCGccctgtaccccacactgagaaccccgggg-3′如果用人基因組DNA作模板，所述引物能夠以1094bp的PCR片段形式擴(kuò)增任何功能性人Cλ區(qū)。引物P082和P083分別包括ClaI和NotI的限制位點(diǎn)，使得可以對(duì)所述PCR片段進(jìn)行ClaI-NotI雙重消化，并且將它們定向連接到pAB-10上，以便制備(根據(jù)擴(kuò)增的Cλ區(qū))pAB-11-λ1，pAB-11-λ2，pAB-11-λ3，或pAB-λ7(圖14b)。
為了制備完整的IgλL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體，必須將VλJλ重排的可變區(qū)外顯子克隆到各種pAB-11構(gòu)建體的獨(dú)特的MluI和HandIII位點(diǎn)上，將在以下部分結(jié)合完整的IgH和IgκL鏈逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的制備對(duì)此進(jìn)行說明。
實(shí)施例7將VHDJH或VLJL可變區(qū)外顯子克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒IgH和L鏈表達(dá)構(gòu)建體上迄今為止，所披露的不同的人IgH和IgL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體，都包括人抗體表達(dá)的所有編碼區(qū)和控制元件，只有所述可變區(qū)的編碼區(qū)例外。例如，編碼可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的外顯子的不同的所有組成成分(文庫)，可以從人外周血淋巴細(xì)胞的基因組DNA克隆，所述淋巴細(xì)胞包括具有不同VHDJH或VLJLDNA重排的B淋巴細(xì)胞。所述可變區(qū)的編碼區(qū)必須包括位于每一個(gè)VHDJH或VLJL重排外顯子5’末端的不同的前導(dǎo)外顯子(圖15)，它是IgH和IgL鏈通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行正確轉(zhuǎn)運(yùn)所必須的，首先跨過高爾基網(wǎng)絡(luò)，并最終達(dá)到細(xì)胞表面。業(yè)已披露了結(jié)合在大部分人IgH，1gKL和IgλL可變區(qū)前導(dǎo)序列的前導(dǎo)序列上的簡(jiǎn)并引物，并且被用于與簡(jiǎn)并引物組合，以便擴(kuò)增各種人JH和JL基因片段，以便克隆VHDJH或VLJL?？勺兙幋a區(qū)。將用于所述PCR產(chǎn)物的定向克隆的限制酶識(shí)別位點(diǎn)(參見圖15)附加在所述簡(jiǎn)并引物的5′末端，并且用大寫字母突出表示。可能包括一個(gè)以上核苷酸的簡(jiǎn)并引物上的位點(diǎn)用括弧標(biāo)出。
用于由人外周B淋巴細(xì)胞的基因組DNA通過PCR方法擴(kuò)增包括前導(dǎo)序列的人Ig重鏈可變區(qū)的正向引物如下SEQ ID NO.88(P084)5′-gcGGATCCacggaccggacctggagg(ag)tc(ct)tct(gt)c-3′SEQ ID NO.89(P085)5′-gcGGATCCatggag(ct)ttgggctga(cg)ctgg(cg)ttc(ct)t-3′SEQ ID NO.90(P086)5′-gcGGATCCatgga(ac)(ac)(at)act(gc)tg(gt)(at)(cgt)c(at)(ct)(cg)ct(ct)ctg-3′用于由人外周B淋巴細(xì)胞的基因組DNA擴(kuò)增包括前導(dǎo)序列的人Ig輕鏈可變區(qū)的正向引物如下SEQ ID NO 91(P087)5′-gcGGATCCacggacatg(ag)(ag)(ag)(agt)(ct)cc(act)(acg)g(ct)(gt)ca(cg)ctt-3′用于由人外周B淋巴細(xì)胞的基因組DNA擴(kuò)增包括前導(dǎo)序列的人Ig入輕鏈可變區(qū)的正向引物如下SEQ ID NO 92(P088)5′-gcACGCOTatg(ag)cctg(cg)(at)c(ct)cctctc(ct)(ct)ct(cg)(at)(ct)-3′應(yīng)當(dāng)指出的是，與附加在引物P084-P087 5’末端的用于克隆目的BamHI限制酶識(shí)別位點(diǎn)不同，可以使用BglII限制酶的識(shí)別位點(diǎn)(與圖15進(jìn)行比較)，因?yàn)锽glII能產(chǎn)生與BamHI相同的相容性突出末端。在克隆VλJλ區(qū)時(shí)，所述定向引物P088包括MluI位點(diǎn)，因?yàn)樗瞿孓D(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體能接納業(yè)已包含內(nèi)在BamHI限制位點(diǎn)的片段。另外，可以使用類似于P088的引物，它包括AscI位點(diǎn)，能產(chǎn)生與MluI限制酶相同的CGCG突出末端。
用于擴(kuò)增所有六種人IgHJ鏈基因片段的反向引物如下用大寫字母突出表示的HindIII位點(diǎn)附加在所述引物的5′末端，包括用于克隆目的的某些側(cè)翼核苷酸。
使用人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA通過PCR方法擴(kuò)增包括JH1，JH4和JH5基因片段的反向引物如下SEQ ID NO 93(P089)5′-tatAAGCTTacctgaggagacggtgaccagggtgccctgg-3′A用于由人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA擴(kuò)增包括JH2，JH3，和JH6基因片段的可變區(qū)外顯子的簡(jiǎn)并反向引物如下SEQ ID NO 94(P090)5′-tatAAGCTTacctgaggagacggtgacca(tg)(tg)gt(gc)cc(ta)(tc)(gt)g-3′用于由人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA擴(kuò)增包括人JK1-4基因片段的可變K區(qū)外顯子的反向簡(jiǎn)并引物如下SEQ ID NO 95(P091)5′-tatAAGCTTacgtttgatctcca(cg)(ct)ttggtccct(tgc)ggcc-3′用于由人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA擴(kuò)增包括所述人JK5基因片段的可變K區(qū)外顯子的反向引物如下SEQ ID NO 96(P092)5′-tatAAGCTTacgtttaatctccagtcgtgtcccttggcc-3′用于由人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA通過PCR方法擴(kuò)增包括Jλ1-3基因片段的可變區(qū)IgλL外顯子的反向簡(jiǎn)并引物如下SEQ ID NO 97(P093)5′-tatAAGCTTacctaggacggtcagcttggtccc(ta)(cg)c(tg)cc-3′用于由人B淋巴細(xì)胞的基因組DNA通過PCR方法擴(kuò)增包括Jλ7的可變區(qū)IgλL外顯子的反向引物如下SEQ ID NO 98(P094)5′-tatAAGCTTaccgagggcggtcagctgggtgcctcctcc-3′為了用上述引物P084-P094通過PCR方法擴(kuò)增并且克隆包括重排的VHDJH和VLJL基因片段的可變區(qū)外顯子，使用了等摩爾數(shù)量的引物，如果將一種以上正向或反向引物指明用于特定的可變區(qū)。對(duì)于H和KL鏈的可變區(qū)的克隆來說，用BamHI和HindIII消化所述PCR片段，并且定向克隆到BamHI/HindIII雙重消化過載體上，用于IgH和IgκL鏈的表達(dá)。對(duì)于λL鏈的可變區(qū)的克隆來說，用MluI和HindIII消化所述PCR片段，并且克隆到MluI/HindIII雙重消化過的載體上，用于IgλL鏈表達(dá)。
實(shí)施例8將編碼異源IgH和L鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體依次轉(zhuǎn)導(dǎo)到遺傳修飾過的鼠preB細(xì)胞中在實(shí)施例3中業(yè)已詳細(xì)披露了基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性鼠preB細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。對(duì)于編碼IgH和IgL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體的依次轉(zhuǎn)導(dǎo)來說，將相同的方法用于轉(zhuǎn)導(dǎo)親嗜性包裝細(xì)胞，并且使用將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染到preB細(xì)胞中的條件。唯一的不同是，通過下面披露的方法，依次轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)構(gòu)建體。
首先，用業(yè)已用編碼異源IgL鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過的GPE包裝細(xì)胞系的上清液感染基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性preB細(xì)胞。如上文所述，所述IgL鏈表達(dá)載體還包括嘌呤霉素抗性標(biāo)記。因此，可以在轉(zhuǎn)導(dǎo)之后24小時(shí)，通過向組織培養(yǎng)基中添加2μg/ml的嘌呤霉素選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)過的細(xì)胞。在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)導(dǎo)過的細(xì)胞，并且再擴(kuò)增48小時(shí)之間。由于嘌呤霉素的選擇作用，未轉(zhuǎn)導(dǎo)過的preB細(xì)胞將被消除，并且在培養(yǎng)48小時(shí)之后，將獲得preB細(xì)胞的100％的IgL鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)過的群體。
在該時(shí)間點(diǎn)上，用來自業(yè)已用編碼異源IgH鏈的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染過的親嗜性包裝細(xì)胞系GPE的上清液培養(yǎng)細(xì)胞。然后將所述細(xì)胞在培養(yǎng)物中再保持24小時(shí)時(shí)間。此時(shí)，由于所述異源免疫球蛋白重鏈的表達(dá)，使它們停止了增殖。然后收獲所述細(xì)胞，并且可用于移植受到免疫折中的小鼠。在這里，所述細(xì)胞可以重建所述B系區(qū)室，并且在這里，它們能夠參與免疫應(yīng)答，產(chǎn)生異源抗體分泌型細(xì)胞。
實(shí)施例9將長(zhǎng)期增殖的鼠前體B細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)，用于生產(chǎn)異源抗體通過靜脈內(nèi)注射途徑，將能表達(dá)來自穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的異源IgH和L鏈的基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性preB細(xì)胞，注射到B細(xì)胞缺陷型BST小鼠體內(nèi)，或與CD4+T-輔助細(xì)胞一起注射到CB17SCID，RAG-2或RAG-2缺陷型小鼠體內(nèi)，以便在對(duì)所述移植過的小鼠進(jìn)行抗原刺激時(shí)，移植過的小鼠可以產(chǎn)生T細(xì)胞依賴性或非依賴性免疫應(yīng)答。
為此，用300-600radγ-的輻射量對(duì)1.5-3個(gè)月大的小鼠進(jìn)行亞致死性輻射，并且在輻射之后4-6小時(shí)，通過靜脈內(nèi)途徑給所述小鼠注射懸浮在PBS中的5×106-107preB細(xì)胞。為了額外移植CD4+T-輻射細(xì)胞，從同系小鼠的合并的頸部、腋部、腸系膜和腹股溝淋巴結(jié)中分離CD4+細(xì)胞，包括通過使用綿羊抗小鼠Ig抗體包衣的Dynabeads(MilanAnalytic AG，La Roche，Switzerland)消除B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞。將106所述純度通常超過90％的CD4+T-輔助細(xì)胞與preB細(xì)胞同時(shí)注射。在移植之后，讓細(xì)胞群重建所述移植過的宿主的B和T細(xì)胞區(qū)室。
實(shí)施例10preB細(xì)胞移植小鼠的免疫用HupreB細(xì)胞和T輔助細(xì)胞移植和重建的免疫折中小鼠的免疫，基本上是按公開的方法進(jìn)行的(Harlow和Lane，Cold Spring HarborLaboratory Press，p.150-173，1988)。簡(jiǎn)單地講，將10-50μg的抗原溶解在250μl PBS中，并且與250μl全弗氏佐劑劇烈混合，并且，通過腹膜內(nèi)途徑注射所述抗原-佐劑混合物。2周之后，用5-20μg抗原進(jìn)行腹膜內(nèi)注射加強(qiáng)，在這次注射時(shí)與不完全弗氏佐劑混合。在第一次加強(qiáng)10天之后，分析小鼠血清中的抗原特異性異源抗體。在4周之后，用溶解在不完全弗氏佐劑中的5-20μg抗原，通過腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)途徑，對(duì)最佳響應(yīng)小鼠進(jìn)行再次強(qiáng)化免疫。3天之后，從小鼠體內(nèi)分離脾細(xì)胞，并且用于制備能分泌異源抗原-特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。
實(shí)施例11體外刺激HupreB細(xì)胞，以便分化成抗體分泌型漿細(xì)胞在體外組織培養(yǎng)物時(shí)，基質(zhì)細(xì)胞和IL7依賴性HupreB細(xì)胞也能完全分化成抗體分泌型細(xì)胞。為此，首先將連續(xù)增殖的HupreB細(xì)胞培養(yǎng)物分化成表面免疫球蛋白陽性B細(xì)胞，包括從組織培養(yǎng)基中取消IL7，并且在輻射過的基質(zhì)細(xì)胞上繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。在培養(yǎng)基中缺少生長(zhǎng)因子，導(dǎo)致了增殖的抑制，和分化的誘導(dǎo)，同時(shí)伴隨著細(xì)胞程序死亡的誘導(dǎo)，除了諸如bcl-2的抗細(xì)胞程序死亡基因在分化中的細(xì)胞表達(dá)之外。
然后，收獲所述分化的細(xì)胞，并且在存在100U/ml rIL4和20μg/ml激動(dòng)性抗-CD40單克隆抗體的條件下，重新鋪板到新的輻射過的基質(zhì)細(xì)胞上。在培養(yǎng)5-6天期間，所述細(xì)胞分化成具有漿細(xì)胞表型的大細(xì)胞，所述細(xì)胞能夠從所述異源Ig基因座上分泌大量的抗體，并且可將其用于制備能分泌異源單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。
實(shí)施例12融合骨髓瘤細(xì)胞和源于HupreB細(xì)胞的漿細(xì)胞，以便制備能產(chǎn)生人單克隆抗體的雜交瘤為了在體外分化(實(shí)施例11)或在移植過的小鼠免疫之后(實(shí)施例10)使源于HupreB細(xì)胞的漿細(xì)胞永生化，需要將所述漿細(xì)胞與永生化的骨髓瘤細(xì)胞系融合。將所述骨髓瘤細(xì)胞系用于缺少HGPRT基因表達(dá)的細(xì)胞融合，涉及到核苷酸生物合成的挽救途徑。盡管所述細(xì)胞在正規(guī)組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中能無限地生長(zhǎng)，如果通過向所述組織培養(yǎng)基中添加諸如氨基喋呤的藥物，抑制核苷酸的從頭合成，它們將會(huì)死亡。相反，表達(dá)HGPRT基因的細(xì)胞，可以在通過氨基喋呤抑制核苷酸的從頭合成時(shí)存活，特別是如果補(bǔ)充額外的胸苷和次黃嘌呤更是如此，因?yàn)镠GPRT基因產(chǎn)物可以利用所述物質(zhì)分別合成嘧啶和嘌呤核苷酸。因此，在HAT選擇培養(yǎng)基中(含有次黃嘌呤，氨基喋呤和胸苷)，只有這些細(xì)胞存活和增殖，它是由于致命的，但是HGPRT+的抗體分泌型漿細(xì)胞和非致命的，但是HGPRT-的融合所導(dǎo)致的，并因此是氨基喋呤敏感型骨髓瘤細(xì)胞。所述細(xì)胞被稱為雜交瘤細(xì)胞，并且，如果亞克隆，能夠分泌具有由所述漿細(xì)胞融合配偶體編碼的特異性的單克隆抗體。
為了制備雜交瘤細(xì)胞，使用了來自用HupreB細(xì)胞移植的免疫小鼠的脾臟的漿細(xì)胞，或通過抗-CD40和IL4刺激在體外制備的漿細(xì)胞。在每一種情況下，制備了均勻的細(xì)胞懸浮液，并且用沒有任何添加劑的IMDM培養(yǎng)基洗滌2次，通過重復(fù)的離心(500g，5分鐘)和重新懸浮步驟進(jìn)行洗滌。
合并5×108骨髓瘤細(xì)胞(Sp2/0 Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.，6，p.511-519，1976；或X63Ag8.653 Kearney等，J.Immmunol.，123，p.1548-1550，1979)，和5×107脾細(xì)胞(或5×107體外分化的漿細(xì)胞)，混合，并且以500g的速度再次離心5分鐘。將1ml50％聚乙二醇(PEG)1500在IMDM培養(yǎng)基中的稀釋液，緩慢添加到所述細(xì)胞沉淀中，同時(shí)通過輕輕敲擊，重新懸浮所述細(xì)胞。在培養(yǎng)2分鐘之后，緩慢添加10ml沒有添加劑的DMEM培養(yǎng)基，并且以500g的速度將細(xì)胞最終離心5分鐘。在除去上清液之后，將所述細(xì)胞沉淀物重新懸浮在1ml IMDM型基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(如實(shí)施例1所述)，所述培養(yǎng)基含有100U/ml重組IL6和1×濃縮的HAT添加劑。將所述細(xì)胞分配在50個(gè)96孔組織培養(yǎng)平板上，并且在37℃下培養(yǎng)，直到可以識(shí)別獨(dú)立的雜交瘤克隆，并且分離，用于擴(kuò)增和在組織培養(yǎng)物中表征。
序列表<110>Melchers and Grawunder，Georg Friedrich and Ulf<120>用于制備遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的方法，以及將其用于生產(chǎn)異源結(jié)合蛋白的用途<130>異源結(jié)合蛋白<140>
<141>
<160>98<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>4953<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明pPGK-hygro；擴(kuò)增潮霉素B的模板<400>1aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat 60tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga 120tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca 180acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct 240aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 300cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag 360cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca 420cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc aggctacgca 480actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaggggg 540gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 600aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc 660ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttc tgatggaatt agaacttggc aaaacaatac 720tgagaatgaa gtgtatgtgg aacagaggct gctgatctcg ttcttcaggc tatgaaactg 780acacatttgg aaaccacagt acttagaacc acaaagtggg aatcaagaga aaaacaatga 840tcccacgaga atttatagat ctatagatca tgagtgggag gaatgagctg gcccttaatt 900tggttttgct tgtttaaatt atgatatcca actatgaaac attatcataa agcaatagta 960aagagccttc agtaaagagc aggcatttat ctaatcccac cccaccccca cccccgtagc 1020tccatccttc cttcaaaatg taggtactct gttctcaccc ttcttaacaa agtatgacag 1080gaaaaacttc cattttagtg gacatcttta ttgtttaata gatcatcaat ttctgcatac 1140tctattcctt tgccctcgga cgagtgctgg ggcgtcggtt tccactatcg gcgagtactt 1200ctacacagcc atcggtccag acggccgcgc ttctgcgggc gatttgtgta cgcccgacag 1260tcccggctcc ggatcggacg attgcgtcgc atcgaccctg cgcccaagct gcatcatcga 1320
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<223>人工序列說明pBS-DT4；擴(kuò)增野生型白喉毒素A的模板<400>2aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat 60tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga 120tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca 180acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct 240aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 300cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag 360cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca 420cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc aggctacgca 480actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaggggg 540gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 600aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc 660ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt cctgcagccc gggggatcca 720ctagttctag agcttgcaga tctgcattcc accactgctc ccattcatca gttccatagg 780ttggaatcta aaatacacaa acaattagaa tcagtagttt aacacattat acacttaaaa 840attttatatt taccttagag ctttaaatct ctgtaggtag tttgtccaat tatgtcacac 900cacagaagta aggttccttc acaaagagat cgcctgacac gatttcctgc acaggcttga 960gccatatact catacatcgc atcttggcca cgttttccac gggtttcaaa attaatctca 1020agttctacgc ttaacgcttt cgcctgttcc cagttattaa tatattcaac gctagaactc 1080ccctcagcga agggaaggct gagcactaca cgcgaagcac catcaccgaa ccttttgata 1140aactcttccg ttccgacttg ctccatcaac ggttcagtga gacttaaacc taactctttc 1200ttaatagttt cggcattatc cacttttagt gcgagaacct tcgtcagtcc tggatacgtc 1260actttgacca cgcctccagc ttttccagag agcgggtttt cattatctac agagtatccc 1320gcagcgtcgt atttattgtc ggtactataa aaccctttcc aatcatcgtc ataatttcct 1380
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<223>人工序列說明pBS-DT4tox176；擴(kuò)增減毒的白喉毒素A的模板<400>3aaattgtaaa cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa atcagctcat 60tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa tagaccgaga 120tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac gtggactcca 180acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa ccatcaccct 240aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct aaagggagcc 300cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa gggaagaaag 360cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc gtaaccacca 420cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc aggctacgca 480actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaggggg 540gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta 600aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg cgaattgggt accgggcccc 660ccctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt cctgcagccc gggggatcca 720ctagttctag agcttgcaga tctgcattcc accactgctc ccattcatca gttccatagg 780ttggaatcta aaatacacaa acaattagaa tcagtagttt aacacattat acacttaaaa 840attttatatt taccttagag ctttaaatct ctgtaggtag tttgtccaat tatgtcacac 900cacagaagta aggttccttc acaaagagat cgcctgacac gatttcctgc acaggcttga 960gccatatact catacatcgc atcttggcca cgttttccac gggtttcaaa attaatctca 1020agttctacgc ttaacgcttt cgcctgttcc cagttattaa tatattcaac gctagaactc 1080ccctcagcga agggaaggct gagcactaca cggctagcac catcatcgaa ccttttgata 1140aactcttccg ttccgacttg ctccatcaac ggttcagtga gacttaaacc taactctttc 1200ttaatagttt cggcattatc cacttttagt gcgagaacct tcgtcagtcc tggatacgtc 1260
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accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 4200ttgcctgact gcccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 4260gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 4320agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 4380ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 4440ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 4500gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtga aaaaaagcgg 4560ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 4620tgcttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 4680tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct 4740cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca 4800tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 4860gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 4920tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 4980ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 5040attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 5100cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 5130<210>4<211>4514<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明pGL2neo(+)；擴(kuò)增loxP位點(diǎn)側(cè)翼的新霉素的模板<400>4cgacgtcgca tgctcccggc cgccatggcc gcgggatatc actagtgcgg ccgcctgcag 60gtcgaccata tgggagagct cgaattcgag ctcggtaccc tcgacctgca gccaagctag 120cttggctgga cgtaaactcc tcttcagacc taataacttc gtatagcata cattatacga 180agttatatta agggttattg aatatgatcg gaattcctcg agatccgaac aaacgaccca 240acacccgtgc gttttattct gtctttttat tgccgatccc ctcagaagaa ctcgtcaaga 300aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 360cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 420tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 480tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 540ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 600tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 660tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 720gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 780cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 840gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt 900tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 960agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 1020agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatggccgat 1080cccatattgg ctgcagggtc gctcgctcgg tgttcgaggc cacacgcgtc accttaatat 1140
gcgaagtgga cctgggaccg cgccgccccg actgcatctg cgtgttcgaa ttcgccaatg 1200acaagacgct gggcggggtt tgctcgacat tgggtggaaa cattccaggc ctgggtggag 1260aggctttttg cttcctcttg caaaaccaca ctgctcgaca ttgggtggaa acattccagg 1320cctgggtgga gaggcttttt gcttcctctt gcaaaaccac actgctcgac ctgcagccaa 1380gctagcttgg ctggacgtaa actcctcttc agacctaata acttcgtata gcatacatta 1440tacgaagtta tattaagggt tattgaatat gatcggaatt cctcgagtct agggggatcc 1500tctagagtcg acctgcaggc atgctcccgg ccgccatggc cgcgggatat cactagtgcg 1560gccgcctgca ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat agcttgagta 1620ttctatagtg tcacctaaat agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa 1680attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct 1740ggggtgccta atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 1800agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 1860gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1920ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1980gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 2040aggccgcgtt gctggcgttt ttcgataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 2100gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 2160ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 2220cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2280cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2340gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 2400cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 2460agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 2520ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 2580ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2640gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2700cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2760attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 2820accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 2880ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 2940gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 3000agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 3060ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 3120ttgttggcat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca 3180gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg 3240ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca 3300tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg 3360tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaataccg cgcccggcga ccgagttgct 3420cttgcccggc gtcaatacgg gataatagtg tatgacatag cagaacttta aaagtgctca 3480tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca 3540gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg 3600tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac 3660ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt 3720attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc 3780cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt 3840aaggagaaaa taccgcatca ggcgaaattg taaacgttaa tattttgtta aaattcgcgt 3900taaatatttg ttaaatcagc tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt 3960ataaatcaaa agaatagacc gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc 4020
cactattaaa gaacgtggac tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg 4080gcccactacg tgaaccatca cccaaatcaa gttttttgcg gtcgaggtgc cgtaaagctc 4140taaatcggaa ccctaaaggg agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg 4200tggcgagaaa ggaagggaag aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag 4260cggtcacgct gcgcgtaacc accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt 4320ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct 4380attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg 4440gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata 4500gggcgaattg ggcc4514<210>5<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物001<400>5cgtctagacc atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct g 41<210>6<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物002<400>6catgcggccg ctattccttt gccctcggac gagtgctggg g 41<210>7<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物003<400>7attgctagca tggcgcaagc cgggagaaca gggtatgata ac 42<210>8
<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物004<400>8cgcacgcgtc acttgtggcc caggtatgca cccagagtg 39<210>9<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物005<400>9atatgtcgac tcaatattgg ccattagcca tattattcat tg 42<210>10<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物006<400>10ccggatcgat ccttatcgga ttttaccac 29<210>11<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物007<400>11tcgaccggta cctaggcgcg ccatcgatat cgctagctcg agctcagatc tgtac 55<210>12
<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物008<400>12agatctgagc tcgagctagc gatatcgatg gcgcgcctag gtaccgg 47<210>13<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物009<400>13ctagataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac gcgtataact tcgtatagca 60tacattatac gaagttat 78<210>14<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物010<400>14ctagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatac gcgtataact tcgtataatg 60tatgctatac gaagttat 78<210>15<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物011<400>15tcgacgcgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaag 38
<210>16<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物012<400>16tcgacgcgtt tggacaaacc acaactagaa tgcagtg 37<210>17<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物013<400>17tcgacgcgtg aattctaccg ggtaggggag gcgcttttc 39<210>18<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物014<400>18tcgacgcgtg gaattagaac ttggcaaaac aatactgag 39<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物015<400>19aatgcggccg cgaacctcct gtgttgcaag cacaaatggg 40
<210>20<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物016<400>20aatgcggccg aggcagcacg gttgagtttc agttgtcatc 40<210>21<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物017<400>21ttggcgcgcc gtaagaatgg cctctccagg tctttatttt 40<210>22<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物018<400>22ttggcgcgcc agctcagctc agctcacccc agctcagctc 40<210>23<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物019<400>23tatgcggccg cttatctttc tcctttatta acggttgctg 40
<210>24<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物020<400>24tatgcggccg cacagtggta gtactccact gtctggctg 39<210>25<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物021<400>25ttggcgcgcc tgtgtaagac acaggttttc atgttaggag 40<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物022<400>26ttggcgcgcc tgcttcgcca agtttactgg gtaggttg38<210>27<211>41<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物023<400>27tatagcggcc gcttctgctc ctcttcttta gtactggatt c41
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<223>人工序列說明引物024<400>28tatagcggcc gcgttggcta agctacctgg gaacaatggg gg 42<210>29<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物025<400>29ttggcgcgcc ataggatctc cacatagaag ttggtatttg cc 42<210>30<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物026<400>30ttggcgcgcc gtgggcacac atatgtcatc ccagttaccc 40<210>31<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物027<400>31ccatcgattg actggatgct tgttaattct aataag 36
<210>32<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物028<400>32ccatcgatgg atcctgtgtg ccagtaactg tagagagaac 40<210>33<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物029<400>33cgggatccaa gcttagagag gtctggtgga gcctgcaaaa gtcc 44<210>34<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物030<400>34gatcgcggcc gctctagata attgcattca tttaaaaaaa aaatatttc49<210>35<211>47<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物031<400>35gcatgtcgac acgcgtgggg gctcagatat cagtaccaga aacaagg 47
<210>36<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物032<400>36cgatgtcgac ctcgagttgg agtcacaggc ctgtctccat gtgg 44<210>37<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物033<400>37gcactcgagg ggtagatgca gcctgtgttc cgtttactg 39<210>38<211>40<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物034<400>38gctctcgagc atgcctgagc ccaccaggaa gtcctctgtg 40<210>39<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列說明引物035<400>39ttaagcatgc aaccacatgc gatctaaggg atattgggg 39
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<223>人工序列說明引物036<400>40ttaagcatgc gatcattgag ctccggctct aacaactggg 40<210>41<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.一種用于制備脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞的方法，可將其用于生產(chǎn)任何異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段，包括以下步驟(a)通過導(dǎo)入編碼至少一種異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的至少一種外源遺傳元件對(duì)脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾，所述淋巴細(xì)胞(i)源于初級(jí)淋巴器官，和(ii)具有分化成成熟的淋巴系細(xì)胞的潛力；以及(b)在體外或體內(nèi)實(shí)現(xiàn)將所述遺傳修飾過的前體淋巴細(xì)胞分化成成熟的淋巴系細(xì)胞，以便制備能夠生產(chǎn)所述異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的淋巴細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1的方法，還包括使分化的淋巴細(xì)胞永生化的步驟，包括(a)將所述分化的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以便制備雜交瘤細(xì)胞；(b)用轉(zhuǎn)化病毒感染所述分化的淋巴細(xì)胞；或(c)用載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)染所述分化的淋巴細(xì)胞，確保至少一種轉(zhuǎn)化癌基因的表達(dá)；以便制備能夠永久性生產(chǎn)所述異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞能夠表達(dá)淋巴V(D)J重組機(jī)制的至少一種成分，并且源于有顎脊椎動(dòng)物，包括軟骨魚，硬骨魚，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥類，哺乳動(dòng)物，包括豬，綿羊，牛，馬和嚙齒動(dòng)物，包括小鼠，大鼠，兔和豚鼠，優(yōu)選來自小鼠的鼠前體(pre)B淋巴細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞喪失了它們的表達(dá)內(nèi)源抗體和/或抗原受體或其功能性片段的潛力，這是通過以下步驟實(shí)現(xiàn)的分離/選擇表達(dá)內(nèi)源免疫球蛋白或其片段缺陷的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，和/或?qū)⒅辽僖环N載體構(gòu)建體導(dǎo)入所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞，所述載體構(gòu)建體被設(shè)計(jì)成能功能性地使至少一個(gè)遺傳元件的至少一個(gè)等位基因失活，所述遺傳元件選自下組(a)免疫球蛋白重鏈基因座的編碼區(qū)，包括V，D，和J基因片段的全部或部分，以及μ，δ，γ，ε，和α重鏈的恒定區(qū)外顯子的任何編碼區(qū)，有或沒有它們的跨膜外顯子；(b)免疫球蛋白κ和/或λ輕鏈基因座的編碼區(qū)，包括V和J基因片段編碼區(qū)的任意一種，以及所述恒定區(qū)外顯子的任意一種；(c)T細(xì)胞受體α，β，γ，和δ基因座的編碼區(qū)，包括V，D和J基因片段的全部或部分，以及α，β，γ，和δ恒定區(qū)外顯子的任何編碼區(qū)；(d)順式作用免疫球蛋白重鏈基因座增強(qiáng)子元件，包括重鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子和3′α增強(qiáng)子；(e)順式作用免疫球蛋白輕鏈基因座增強(qiáng)子元件，包括κ輕鏈內(nèi)含子增強(qiáng)子(κiE)，3′κ增強(qiáng)子，和λ2-4和λ3-1增強(qiáng)子；(f)順式作用T細(xì)胞受體基因座增強(qiáng)子元件，包括TCRα，β，γ，和δ增強(qiáng)子；(g)反式作用重組激活基因，RAG-1和RAG-2，包括它們的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及它們的編碼區(qū)；和(h)V(D)J重組所需要的反式作用DNA修復(fù)基因，包括Ku70，Ku86，DNA-依賴性蛋白激酶(DNA-PKcs)的催化性亞基，DNA連接酶IV，XRCC4和Artemis，包括它們的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及所述基因的編碼區(qū)。
5.如權(quán)利要求4的方法，其中，所述載體構(gòu)建體包括基因?qū)蜉d體，該載體包括與所述至少一個(gè)遺傳元件同源的DNA序列區(qū)，優(yōu)選位于能夠選擇陽性轉(zhuǎn)染子的陽性選擇標(biāo)記側(cè)翼。
6.如權(quán)利要求5的方法，其中，所述基因?qū)蜉d體還包括位點(diǎn)特異性DNA重組酶的一對(duì)DNA識(shí)別序列，位于所述陽性選擇標(biāo)記側(cè)翼，使得在編碼關(guān)聯(lián)重組酶的至少一種的核酸序列轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)表達(dá)時(shí)，能夠缺失所述陽性選擇標(biāo)記。
7.如權(quán)利要求5或6的方法，其中，所述基因?qū)蛸|(zhì)粒載體還包括能夠篩選轉(zhuǎn)染物的陰性選擇標(biāo)記，在所述轉(zhuǎn)染物中，所述基因?qū)蜉d體通過非同源重組隨機(jī)地整合到基因組中。
8.如權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)的方法，其中，將編碼異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的至少一種外源遺傳元件，攜帶在選自下組的遺傳構(gòu)建體上(a)重組逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA構(gòu)建體，包括可操作地連接的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子和編碼核酸序列，以便能夠表達(dá)至少一種異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變，或者是人工的；(b)重組的基于質(zhì)粒的DNA構(gòu)建體，包括可操作地連接的啟動(dòng)子，增強(qiáng)子，和編碼核酸序列，以便能夠表達(dá)至少一種異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變，或者是人工的；(c)重組的基于質(zhì)粒的小免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座，具有可操作地連接的未重排的V，D和J基因片段，以便能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(d)細(xì)菌，酵母或脊椎動(dòng)物人工染色體，包括可操作地連接的種系構(gòu)型的部分或全部免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座，以便能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(e)細(xì)菌，酵母或脊椎動(dòng)物人工染色體，在修飾過的排列中包括至少一種異源免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座的部分或全部，所述修飾過的排列被設(shè)計(jì)成能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，或其功能性片段，它們是野生型的或在其一級(jí)氨基酸序列上具有(a)設(shè)計(jì)的突變；(f)跨染色體元件，它是異源染色體的片段，具有種系構(gòu)型中的免疫球蛋白或T細(xì)胞受體基因座的部分或全部，使得能夠進(jìn)行V(D)J重組，并且，隨后表達(dá)至少一種異源抗體或T細(xì)胞受體，就其一級(jí)氨基酸序列而言，它是野生型的。
9.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述至少一種外源遺傳元件編碼天然的或修飾過的人工抗體，人類結(jié)合蛋白，人類抗原受體，或(a)其功能性片段。
10.如權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述至少一種外源遺傳元件編碼能夠進(jìn)行結(jié)合區(qū)的親和力成熟的異源或人工受體。
11.如上述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的分化是通過以下步驟體外實(shí)現(xiàn)的(a)通過在缺少任何前體淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子的情況下培養(yǎng)，阻止所述脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的增殖，并且誘導(dǎo)它分化成成熟的淋巴系細(xì)胞，和(b)通過在存在至少一種選自下組的成分的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)所述細(xì)胞，誘導(dǎo)最終的淋巴細(xì)胞分化(i)可溶性T細(xì)胞相關(guān)的刺激因子，包括白介素-2，白介素-4，白介素-5，白介素-6，白介素-10，白介素-13，TGF-β，和IFN-γ；(ii)激活B細(xì)胞的共刺激受體的因子，包括對(duì)以下成分具有特異性的激動(dòng)性抗體或活性重組配體CD40，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，補(bǔ)體受體1(CD35)和2(CD21)，LFA-1(CD11a)，LFA-3(CD58)，CD19，CD20，CD30，CD32，CD37，CD38，CD70，CD71，Igα(CD79α)，Igβ(CD79β)，TAPA-1(CD81)，F(xiàn)as(CD95)，TNF-受體1(p55，CD120a)，TNF-受體2(p75，CD120b)，Ox-40(CD134)，和淋巴毒素-β受體；和(iii)B細(xì)胞促細(xì)胞分裂因子，1型T細(xì)胞非依賴性抗原，和其他多克隆激活劑，包括脂多糖(LPS)，源于格蘭氏陰性細(xì)菌的脂蛋白，聚陰離子，poly-dldC，美洲商陸有絲分裂原(PWM)，和抗-免疫球蛋白試劑；以及它們的組合。
12.如權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述體內(nèi)分化是在將所述遺傳修飾過的前體淋巴細(xì)胞移植到合適的脊椎動(dòng)物宿主中時(shí)進(jìn)行的。
13.如權(quán)利要求12的方法，其中，將所述淋巴細(xì)胞與未接觸過抗原的或抗原激發(fā)的T輔助淋巴細(xì)胞共同移植到所述宿主中。
14.如權(quán)利要求12或13的方法，其中，在所述體內(nèi)分化之后，用至少一種需要的免疫原性化合物或組合物對(duì)所述宿主進(jìn)行免疫。
15.如權(quán)利要求12-14中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述脊椎動(dòng)物宿主是相容性宿主，就內(nèi)源B細(xì)胞，T細(xì)胞，和/或NK(天然殺傷)細(xì)胞，或它們的組合的產(chǎn)生而言，是缺陷型的。
16.如權(quán)利要求12-15中任意一項(xiàng)的方法，其中，所述脊椎動(dòng)物宿主選自下組有顎脊椎動(dòng)物，包括軟骨魚，硬骨魚，兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物，鳥類和哺乳動(dòng)物，包括豬，綿羊，牛，馬，以及嚙齒動(dòng)物，包括小鼠，大鼠，兔，豚鼠，小鼠是優(yōu)選的宿主物種。
17.將可以通過上述任意一項(xiàng)權(quán)利要求的方法獲得的遺傳修飾過的和分化的脊椎動(dòng)物淋巴細(xì)胞，用于以本身已知的方式生產(chǎn)任何異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的用途。
18.如權(quán)利要求17的用途，其中，在權(quán)利要求1-16的任意一項(xiàng)方法之后，進(jìn)行以下步驟(a)從所述分化的淋巴細(xì)胞中分離至少一種外源遺傳元件，和(b)將所述遺傳元件置于能夠生產(chǎn)所述至少一種異源抗體，抗原受體，人工結(jié)合蛋白，或其功能性片段的環(huán)境中。
19.如權(quán)利要求17或18的用途，其中，所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段具有一種獨(dú)特的特異性，并且因此是單克隆的。
20.如權(quán)利要求17或18的用途，其中，所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段具有一種以上獨(dú)特的特異性，并且因此是多克隆的。
21.如權(quán)利要求17-20中任意一項(xiàng)的用途，其中，所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段完全或部分類似于可以根據(jù)人類遺傳學(xué)所有組成成分組裝的人類抗體，抗原受體，或結(jié)合蛋白或其部分。
22.如權(quán)利要求17-21中任意一項(xiàng)的用途，其中，要生產(chǎn)的所述異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段優(yōu)選選自下組(a)膜結(jié)合或分泌的抗體，并且包括存在于天然抗體中的化學(xué)計(jì)量組合物中的異源重鏈和輕鏈多肽，并且包括任何已知的重(μ，δ，γ，α，ε)和/或輕(κ和λ)鏈同種型；(b)具有重鏈和輕鏈多肽組合的抗體，就所述一級(jí)氨基酸序列而言，它是完全的人抗體；(c)含有來自不同脊椎動(dòng)物物種的異源重鏈或輕鏈多肽的雜合抗體；(d)全部或部分異源的分泌型Fab，scFv和F(ab′)2抗體片段；(e)通過接頭肽共價(jià)偶聯(lián)的抗體片段，得到了雙特異性或多特異性抗體片段；(f)α，β，γ，和δ同種型的T細(xì)胞受體，抗原受體，以及其他與所述免疫球蛋白超家族的蛋白結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合蛋白；以及其功能性片段。
23.可以通過權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)的方法獲得的由其衍生的遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞和更成熟的淋巴系細(xì)胞。
24.可以通過權(quán)利要求2-16中任意一項(xiàng)的方法獲得的產(chǎn)生異源抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段的永生化細(xì)胞。
25.用于權(quán)利要求4-7中任意一項(xiàng)的方法中的載體構(gòu)建體。
26.用于權(quán)利要求8的方法中的遺傳構(gòu)建體。
27.藥用或診斷制劑，包括通過權(quán)利要求17-22中任意一項(xiàng)的方法獲得的至少一種抗體，人工結(jié)合蛋白，抗原受體，或其功能性片段，它具有野生型免疫效應(yīng)物功能，或不是源于種系編碼的異源免疫球蛋白或抗原受體的修飾過的或人工效應(yīng)物功能。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及遺傳工程和抗體生產(chǎn)領(lǐng)域。具體地講，它涉及遺傳修飾過的脊椎動(dòng)物前體淋巴細(xì)胞的制備，所述淋巴細(xì)胞具有分化成更成熟的淋巴系細(xì)胞的能力，并且涉及將其用于生產(chǎn)任何異源抗體或結(jié)合蛋白的用途。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1633448SQ01823956
公開日2005年6月29日 申請(qǐng)日期2001年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月22日
發(fā)明者烏爾夫·格拉溫德, 格奧爾格·弗里德里?！っ窢?申請(qǐng)人:4-抗體股份公司