專利名稱：調(diào)節(jié)擬南芥蛋白降解的泛素特異性c末端水解蛋白酶基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種調(diào)節(jié)擬南芥蛋白降解的泛素特異性C末端水解蛋白酶基因。
泛素特異性C末端水解蛋白酶(Ubiquitin-C-terminal hydrolases)對(duì)于體內(nèi)游離Ub循環(huán)是必需的。它可分為兩大類(Hochstrasser，1995)第一類分子量相對(duì)較小(α-氨基-Ub-C末端水解酶)，約20kD，主要負(fù)責(zé)移去Ub-C末端的小分子物(如短肽，Lys，Glu等)，第二類分子量較大(ε-氨基-U-C末端水解酶)，50～300kD，有兩個(gè)保守區(qū)，一個(gè)含有必需的Cys，另一個(gè)含有兩個(gè)對(duì)催化活性必需的His，它們主要負(fù)責(zé)移去泛肽化蛋白(Ubiquitinated protein)中的泛肽鏈。
在植物抽提液中已查明有幾種Ub-C末端水解酶。有的對(duì)肽特異，有的對(duì)異構(gòu)肽鍵特異，對(duì)微量的高鐵血紅素(hemin)抑制劑很敏感(Huang等，1995；Vierstra等，1988)。另外還有一類Ub-C末端水解酶功能很特異，它只識(shí)別Ub部分，而快速清除掉Ub-C末端任何額外的氨基酸和多肽(那些以脯氨酸pro為第一個(gè)殘基的除外)，利用這個(gè)特性，可以構(gòu)建Ub-外源蛋白融合基因，在真核生物體內(nèi)得到已加工的外源蛋白(Sullian等，1990)。
Ub-C末端水解酶的可能功能如下(Hershko等，1992)1.蛋白降解從末端產(chǎn)物的Lys殘基處釋放Ub；拆散泛肽鏈；“校正閱讀”(proofreading)，釋放被錯(cuò)誤泛肽化的蛋白；加工不正常的泛肽鏈。
2.在泛肽生物合成中加工前體加工多聚泛肽鏈成單體泛肽；加工泛肽-核糖體蛋白融合物，釋放單體Ub和核糖體蛋白；移去Ub-C末端附加的氨基酸。
3.從蛋白降解副產(chǎn)物中回收Ub。
4.逆轉(zhuǎn)對(duì)非降解性蛋白的泛肽化修飾。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下擬南芥中沒有內(nèi)源的標(biāo)簽因子，T-DNA整合成為主要的插入誘變方法。擬南芥已經(jīng)通過T-DNA標(biāo)簽得到了成千上萬(wàn)的突變體。經(jīng)過TAIL-PCR(ThermalAsymmetric Interlaced PCR，Yaoguang Liu et al，1998，Plant Molecular BiologyReporter 16175-181，熱不對(duì)稱交錯(cuò)多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)擴(kuò)增并測(cè)定標(biāo)簽插入位點(diǎn)的兩端序列，用Blast2.0軟件將測(cè)定序列和擬南芥的全基因組序列比較，找出突變位點(diǎn)，種植突變體，其中通過表型分析以及各種不同的環(huán)境條件的篩選，在大量突變體當(dāng)中篩選到了該突變體為泛素特異性C末端水解蛋白酶基因。T-DNA插入了擬南芥第4染色體的第5502902堿基處，插入了基因At4g10590啟動(dòng)子區(qū)。
基因AT4G10590的cDNA序列見序列表1(SEQ ID No.1)。
基因At4g10590編碼的蛋白質(zhì)序列見序列表2(SEQ ID No.2)。
一、材料擬南芥生態(tài)型(Columbia)；質(zhì)粒pSKI015(Weigel，D.，et al 2000)；各種常用抗生素；根癌土壤農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)為GV3101。
二、方法1.植物生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化擬南芥在溫室中22℃生長(zhǎng)，每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí)。含有pSKI015的農(nóng)桿菌GV3101，先用PCR反應(yīng)鑒定質(zhì)粒中的四個(gè)CaMV35S增強(qiáng)子完整存在(Weigel，D.，et al 2000)。
我們采用的Ti質(zhì)粒是pSKI015，質(zhì)粒中的T-DNA區(qū)域含有BAR基因，賦予除草劑抗性。還含有在原核系統(tǒng)中用來(lái)篩選的Amp抗性基因，在T-DNA右邊緣附近有串聯(lián)的4個(gè)35S增強(qiáng)子，有可能在插入擬南芥基因組后增強(qiáng)側(cè)翼或附近某個(gè)基因的表達(dá)，從而獲得某種功能，做為插入基因失活的一個(gè)額外的補(bǔ)充。
轉(zhuǎn)化擬南芥的方法主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法。十多年前科學(xué)家發(fā)明了種子侵染轉(zhuǎn)化法，后來(lái)采用農(nóng)桿菌培養(yǎng)侵染植物莖尖成整株植物進(jìn)行真空抽濾，這些方法都代替了以前組織培養(yǎng)和植物再生方法，縮短了組織培養(yǎng)的步驟。我們實(shí)驗(yàn)使用的轉(zhuǎn)化方法是花浸法(flaral dip)，比真空抽濾更為簡(jiǎn)便，轉(zhuǎn)化效率也不會(huì)降代低。野生的擬南芥(Columbia)長(zhǎng)到一定階段，有一些未成熟的花苞，將已開的花剪掉，做為待轉(zhuǎn)化植物。帶有pSKI015的農(nóng)桿菌經(jīng)鑒定后28℃搖到穩(wěn)定期(0.06≈2.0)離心后重新懸浮在浸染培養(yǎng)基中。浸染培養(yǎng)基中必不可少的提高轉(zhuǎn)化效率的是蔗糖和Surfactant兩種物質(zhì)。將含有大量未開花苞的擬南芥倒置在農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基的浸泡液中十五分鐘，然后暗培養(yǎng)一定時(shí)間后繼續(xù)開花，結(jié)籽，將種子收集，其中就有轉(zhuǎn)基因株系。
2.轉(zhuǎn)基因植物的篩選和PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化植物的子代用抗生素等標(biāo)記篩選出來(lái)。我們使用的是除草劑PPT，采用一定濃度的PPT(100mg/ml)加入培養(yǎng)基中，使不含有T-DNA插入的種子不萌發(fā)或不生長(zhǎng)，而含有T-DNA插入的種子因?yàn)楹型暾腂AR基因而正常生長(zhǎng)起來(lái)。在這些植物中，T-DNA插入一般為單倍體，是隱性突變，所以表型一般不易發(fā)現(xiàn)。
用CATB法提取植物葉片的總DNA，利用pSKI015載體上BAR基因的引物進(jìn)行PCR檢測(cè)5’引物5’-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3’，3’引物5’-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3’；并用擬南芥中COP1的引物同時(shí)進(jìn)行PCR作為正對(duì)照5’引物5’-TGACTATGCTCTGTTTCAGCT-3’，3’引物5’-TTAGTAAACCAAGGAAACACCA-3’反應(yīng)條件為94℃ 50s，60℃ 60s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。
3.T-DNA插入側(cè)翼序列的擴(kuò)增和測(cè)序我們采用TAIL-PCR，即熱不對(duì)稱性交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetry InterlacePCR)，TAIL-PCR包含三輪連續(xù)的半嵌套式插入序列特異引物和一個(gè)小的可退火在附近側(cè)翼序列上的隨機(jī)引物，很容易擴(kuò)增出插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，這種方法不需要在PCR之前進(jìn)行很多復(fù)雜的操作，而且產(chǎn)生高純度的特異產(chǎn)物，可以直接用作雜交探針和測(cè)序模板，即具有高效、靈敏、簡(jiǎn)便、特異的優(yōu)點(diǎn)。
將確定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列(Liu，1995)，所用的三個(gè)特異引物是根據(jù)T-DNA的左邊緣附近的序列設(shè)計(jì)的，分別為DL15’-GACAACATGTCGAGGCTCAGCAGG-3’；DL25’-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3’；DL35’-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3’。
所用的任意兼并引物有兩個(gè)AD25’-NGTCGA(G/C)(A/T)GANA(A/T)GAA-3’；AD2-25’-NGTGCA(G/C)(A/T)GTNT(A/T)GAA-3’。
大量擴(kuò)增第三輪PCR產(chǎn)物，用低熔點(diǎn)瓊脂糖將每條條帶進(jìn)行回收，加兩倍體積的水在65℃溫浴使膠塊熔化，用酚、氯仿各抽提一遍。再用2-2.5倍體積乙醇和1/10體積醋酸鈉(NaAC)沉淀。12,000轉(zhuǎn)，離心20分鐘后沉淀，用70％、100％乙醇各洗一遍，抽干。溶于水中，定量后可用來(lái)測(cè)序。
還可將第三輪PCR產(chǎn)物直接與pBS產(chǎn)生的T-vector用T4_DNA連接酶連接，篩選出有插入的陽(yáng)性克隆。提質(zhì)粒測(cè)序。
4.序列的比對(duì)和分析得到大量的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，就需要進(jìn)行序列分析，首先用BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，到EMBL或GENBANK中比對(duì)出匹配的序列，從而確定T-DNA插入位點(diǎn)究竟在哪條染色體的什么部位，附近的開放讀碼框架(Open Reading Frame，ORF)，已經(jīng)翻譯出蛋白質(zhì)的可能功能，與已知蛋白的同源比較等等，由此得到我們尋找的泛素特異性C末端水解蛋白酶基因AT4G10590突變的突變體。
5.表型分析種植突變體，同時(shí)種植野生型擬南芥為對(duì)照。如附

圖1和附圖2所示，圖1為擬南芥突變體植株在開花期和結(jié)莢期的形態(tài)照片；圖2為野生擬南芥在開花期和結(jié)莢期的形態(tài)照片。由圖中可以看出，突變體在開花期和結(jié)莢期與野生型比較，表現(xiàn)出明顯的植株發(fā)育遲緩。
本發(fā)明采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，將農(nóng)桿菌的T-DNA插入到擬南芥的基因組DNA當(dāng)中，從而產(chǎn)生插入突變體。轉(zhuǎn)化植物的種子在含有PPT(100mg/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。用CATB法提取植物葉片的總DNA，利用pSKI015載體上BAR基因的引物進(jìn)行PCR。將確定含有BAR基因的植株用TAIL-PCR擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列。大量擴(kuò)增第三輪PCR產(chǎn)物用低熔點(diǎn)瓊脂糖將每條條帶進(jìn)行回收。測(cè)序后進(jìn)行BLAST的比對(duì)與分析，由此找到T-DNA的插入位點(diǎn)，經(jīng)大量篩選擬南芥的突變株，得到T-DNA的插入點(diǎn)恰好是插在泛素特異性C末端水解蛋白酶DNA的序列上。該基因位于擬南芥第四染色體長(zhǎng)臂上。該基因與已克隆的泛素特異性C末端水解蛋白酶基因AtUBP1，AtUBP2，AtUBP3有較高的同源性。它的功能與植物細(xì)胞的發(fā)育、分化與程序性細(xì)胞死亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞周期調(diào)控等均有著密切的關(guān)系。
序列表1(SEQ ID No.1)1 ATGACGATCC CTAATTCCGA TTTCATGATC GAGAACGGAG TCTGTGATTT TCCGACTACT61 CCTGAAGAAG AGAAACGGAT TGTATCGGAG CTGATTACCG AATCGGAGGA TAATTTGAAG121 GAAGGGAACT TGTATTTTGT CATCTCTAAA AGGTGGTATA CAAGCTGGGA GAAATATGTT181 GAGCAATCGA CAAAAGAATA TATAAGTGGA GAGTCCTCTG AAGCTTCAAG GCCAGGACCG241 ATTGATAACC ATGATATTAT CGAAAGTGAA AGCGACGTTA ATGATCCACA ACTTCGTAGA301 TTGTTGATGG AACGGGTTGA CTACGTTTTA GTTCCTCAAG AAGTTTGGAA AAGACTTGTT361 GAATGGTATA GCGGAGGTCC TCCGATAGAA AGGAAGTTGA TCTGTCAAGG ATTTTATACT421 AGGAGTTATA GTGTAGAGGT TTACCCACTC TGCCTTATGT TGACGGACGG ACGAGATGAA481 AGTAGAACTG TAATACGGTT GGGAAAACAG GCCTCTATAA GGGAACTTTA TGAGAAGGTT541 TGTGCTTTGA CAGGGGTACC ACAAGAAAAG TTTTTGCTGA TGAAGGACGC ATTGTTTCGT601 TATGAAGACT TTGCAGCTTT GCCTCACATT GATATTTTTT TTTATAAGCA GGCTCATATC661 TGGGATTACT TCGATAAGAG GAAAAACGGA CTCTTGGATT CTTTATCTTA CAAGAGCCTG721 GAAGAGTCAA GCCTTCATAT GGACCAAGAT ATTCTACTTG AAGTTGATGG GTCGTCTTCC781 TCTCAGTCTG CTATGAGCTC GACAGGAAAT GAGTTAGCTC TGGTACCTCT GGAACCTTCC841 AGGTCGAGTG TTACAATTGC TGGGGGGCCT ACCCTATCAA ATGGTCATTC CACTACGTCC901 AACTTTAGTC TCTTTCCGAG AATAACTTCT GAAGACGACG GCAGCAATTC TTTGAGTATT961 CTTGGAAAAG GAGAAAAGGG AGGATTAGCA GGATTGAGTA ATTTGGGAAA TACCTGCTTT1021 ATGAATAGCG CTCTTCAGTG TTTGGCCCAC ACACCTCCAA TTGTTGAATA CTTCTTGCAA1081 GATTACAGTG ACGACATAAA TAGAGATAAT CCTTTGGGAA TGTGTGGTGA GCTTGCTATC1141 GCGTTTGGTG ATTTGTTGAA GAAATTATGG TCATCAGGAA GGAACTCAGT TGCACCACGC1201 GCATTTAAGA CAAAATTGGC TAGATTTGCT CCACAGTTTA GTGGTTACAA TCAGCATGAT1261 TCTCAAGAAC TGCTTGCTTT CTTATTGGAT GGGCTGCATG AAGATCTGAA TAAGGTCAAA1321 CGAAAACCTT ACATCGAACT TAAAGATTCT GACAGTCGTC CGGATGATGA AGTTGCTGAA1381 GAGCTTTGGA ATTATCATAA GGCCCGAAAT GATTCTGTAA TAGTTGATGT TTGTCAAGGC1441 CAATACAAGT CCACTCTGGT TTGTCCAGCT TGCGGAAAAA TATCAATCAC TTTTGATCCC1501 TTCATGTACT TGTCTGTACC TTTGCCATCA ACACTTACGC GATCCATGAC AGTTACGGTG1561 TTTTATTGCG ATGGAAGTCA TCTTCCGATG CCATACACAG TAATAGTGCC TAAAAATGGA1621 TCTATTAGAG ATCTCATTAC CGCATTAGGT ACTGCTTGTT TATTAGCCGA AGATGAGAGT1681 CTTTTACTTG CAGAGGTATA TGACCACAAG ATTTTTAAAT ATTTTGAGAA TCCCCTGGAT1741 TCACTGAGTT CGATAAAAGA TGATGAGCAT ATTGTAGCCT ATCGGTTAAA TCAGATGCCG1801 AAAGGATCAG GGAAAGCAAA ACTCGAAATT CTTCATGGAG GGCAGAAAAG GCCTATTCTG1861 GAGAGTGTTA GAGGCAGAGA TGTGAAGCTC TTTGGAACTC CTTTTGTGAC TTATGTCAAC1921 ACAGAACCAC TAAGTGGAGC TGACATTGAT GCAGTTCTCT CTCGATTTCT GTCGCCTCTG1981 CACAAGGTCC ATGCCCCATC TAAGATTCAT AACGGAAGTG AAAATGGCCA CCTTCCTGAT2041 GCTACTGTTG ACGAAGCATC CGAAATTTTA TCATCCCCAG ATACCGAGAT AGACGATGCA2101 TCTGATAGAG AGTTATCCTT CAGGATATTC TTGACAGATG AACGTGGTTT GAACTTTAAA2161 CCACTGCAGT CTGAATCTTC CATAAGCCTG GGTATCGCTA CAAGAGTTTT AGTCGAGTGG2221 AATGAGGGTG AGCATGAAAG ATATGATTCC AGCTACTTGA GTGATCTTCC GGAGGTTCAT2281 AAAACAAGTT TCTCTGCAAA GAAGACAAGG CAAGAATCGA TATCCCTGTT TTCGTGTTTG2341 GAGGCGTTTT TAGCAGAAGA ACCTCTGGGA CCAGATGACA TGTGGTTTTG TCCGAGCTGC2401 AAAGAACACA GACAAGCGAA CAAAAAGCTA GACCTGTGGA AGTTACCAGA TATTCTTGTG2461 TTTCATTTAA AAAGGTTCAC TTACAGCAGA TATCTCAAGA ATAAGATTGA TACGTTTGTG2521 AATTTCCCAG TTCATGATCT AGACTTGAGC AAGTATGTGA AAAACAAGAA TGACCAGTCA2581 TATCTATATG AACTGTATGC CGTTAGTAAT CATTATGGTG GACTTGGTGG TGGCCACTAC2641 ACTGCCTACG CTAAGTTGAT TGATGACAAT GAATGGTACC ATTTCGACGA CAGTCATGTG2701 TCATCTGTAA ATGAATCTGA AATAAAAAAC TCAGCTGGAT ATGTTCTTTT CTACCGAAGA2761 GTGAGAAGTG AAACAGAGAC ACAAACAGTG GAGATGTCGA CTGATATGGA TTAG序列表2(SEQ ID No.2)MTIPNSDFMI ENGVCDFPTT PEEEKRIVSE LITESEDNLK EGNLYFVISK RWYTSWEKYVEQSTKEYISG ESSEASRPGP IDNHDIIESE SDVNDPQLRR LLMERVDYVL VPQEVWKRLVEWYSGGPPIE RKLICQGFYT RSYSVEVYPL CLMLTDGRDE SRTVIRLGKQ ASIRELYEKVCALTGVPQEK FLLMKDALFR YEDFAALPHI DIFFYKQAHI WDYFDKRKNG LLDSLSYKSLEESSLHMDQD ILLEVDGSSS SQSAMSSTGN ELALVPLEPS RSSVTIAGGP TLSNGHSTTSNFSLFPRITS EDDGSNSLSI LGKGEKGGLA GLSNLGNTCF MNSALQCLAH TPPIVEYFLQDYSDDINRDN PLGMCGELAI AFGDLLKKLW SSGRNSVAPR AFKTKLARFA PQFSGYNQHDSQELLAFLLD GLHEDLNKVK RKPYIELKDS DSRPDDEVAE ELWNYHKARN DSVIVDVCQGQYKSTLVCPA CGKISITFDP FMYLSVPLPS TLTRSMTVTV FYCDGSHLPM PYTVIVPKNGSIRDLITALG TACLLAEDES LLLAEVYDHK IFKYFENPLD SLSSIKDDEH IVAYRLNQMPKGSGKAKLEI LHGGQKRPIL ESVRGRDVKL FGTPFVTYVN TEPLSGADID AVLSRFLSPLHKVHAPSKIH NGSENGHLPD ATVDEASEIL SSPDTEIDDA SDRELSFRIF LTDERGLNFKPLQSESSISL GIATRVLVEW NEGEHERYDS SYLSDLPEVH KTSFSAKKTR QESISLFSCLEAFLAEEPLG PDDMWFCPSC KEHRQANKKL DLWKLPDILV FHLKRFTYSR YLKNKIDTFVNFPVHDLDLS KYVKNKNDQS YLYELYAVSN HYGGLGGGHY TAYAKLIDDN EWYHFDDSHVSSVNESEIKN SAAYVLFYRR VRSETETQTV EMSTDMD*
權(quán)利要求
1.一種多核苷酸，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一種蛋白質(zhì)，具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所示的多核苷酸，其為調(diào)節(jié)擬南芥蛋白降解的基因泛素特異性C末端水解蛋白酶基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種一種調(diào)節(jié)擬南芥蛋白降解的泛素特異性C末端水解蛋白酶基因的DNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列。該基因的功能與植物細(xì)胞的發(fā)育、分化與程序性細(xì)胞死亡以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞周期調(diào)控等均有著密切的關(guān)系,在農(nóng)業(yè)、林業(yè)和園藝等的生產(chǎn)實(shí)踐中有巨大的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/57GK1366057SQ0210015
公開日2002年8月28日 申請(qǐng)日期2002年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月16日
發(fā)明者瞿禮嘉, 康定明, 劉鐵, 董一宇, 秦跟基, 申云平, 鄧興旺, 顧紅雅, 陳章良 申請(qǐng)人:北京大學(xué)