專利名稱：一種診斷α－地中海貧血病的試劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種疾病診斷試劑及其應(yīng)用，特別是涉及一種診斷α-地中海貧血病的試劑及其應(yīng)用。
成人血紅蛋白(HbA)由2條α-珠蛋白鏈和2條β-珠蛋白鏈與一個(gè)原子Fe結(jié)合而成，即α2β2，具有很好的輸送氧氣的功能。胎兒早期血紅蛋白由2條ξ鏈和2條γ鏈組成(ξ2γ2)，后期ξ珠蛋白的基因表達(dá)逐漸關(guān)閉，α-珠蛋白基因開(kāi)始表達(dá)，故胎兒血紅蛋白(HbF)組成為α2γ2。出生后，γ-珠蛋白的鏈又逐漸被β-珠蛋白鏈取代，故HbA由α2β2組成。
α-地中海貧血患者α鏈和β鏈?zhǔn)テ胶?，相?duì)過(guò)多的β鏈自己聚合成β4聚體，但β4不穩(wěn)定，容易解聚形成H包涵體沉積在紅細(xì)胞內(nèi)，附著在紅細(xì)胞膜上，使紅細(xì)胞變形性降低，易遭破壞產(chǎn)生溶血，患者表現(xiàn)為紅細(xì)胞不均(又稱為異型紅細(xì)胞癥)中度或嚴(yán)重貧血，肝脾腫大。從分子病理學(xué)的角度來(lái)看，編碼α-珠蛋白鏈的α-珠蛋白基因是位于人類16號(hào)染色體上的一個(gè)基因簇，從5’至3’依次為ξ-ψξ(假ξ)-ψα2-ψα1-α2-α1-θ1，其中ξ產(chǎn)生胎兒血紅蛋白的組成成分ξ珠蛋白鏈，在胎兒早期表達(dá)。后期至出生后，逐漸被α2，α1所代替。α2，α1是兩個(gè)重要的功能基因，雖然二者的序列99.99％都完全相同，但研究表明，α2基因的表達(dá)要比α1強(qiáng)。由于α1與α2之間的高度同源性，故兩條染色體上的4個(gè)α基因之間很可能發(fā)生不等交換，造成例如一條染色體上三個(gè)α基因串聯(lián)，而另一條染色體上只剩下一個(gè)α基因(-α3.7或-α4.2)等α基因的多種大片段缺失。導(dǎo)致我國(guó)α-地中海貧血的α基因的缺失，除-α37和-α4.2外，還有一種缺失范圍長(zhǎng)達(dá)20Kb的包括α2，α1在內(nèi)的嚴(yán)重缺失，稱為東南亞型缺失(--SEA)。α-地中海貧血在臨床上劃分為4型靜止型，輕型，標(biāo)準(zhǔn)型(血紅蛋白病，HbH病)，以及Bart’s水腫胎兒(巴氏水腫胎兒)。靜止型又稱為地中海貧血2或α+-地中海貧血，基本無(wú)癥狀，是缺失一個(gè)α-基因的攜帶者。輕型α-地中海貧血又稱為α-地中海貧血1或α0-地中海貧血，有輕微貧血癥狀，多是因缺失2個(gè)α基因所致。HbH病是臨床上最常見(jiàn)的α-地中海貧血類型，有明顯甚至嚴(yán)重的貧血癥狀?；純簭?歲左右即出現(xiàn)貧血，嚴(yán)重者肝脾腫大及黃疸，面黃肌瘦并伴骨骼變化，靠輸血維持生命，HbH病患者共缺失或相當(dāng)于缺失三個(gè)α基因。其基因型為-α3.7/--SEA或-α4.2/--SEA或αTα/--SEA(αTα為非缺失型，在我國(guó)只發(fā)現(xiàn)二種點(diǎn)突變，其功能相當(dāng)于缺失一個(gè)α基因，比缺失型少見(jiàn)得多)。巴氏水腫胎兒是最嚴(yán)重的一種，胎兒4個(gè)有功能的α基因全部缺失(--SEA/--SEA)，生下來(lái)就是死胎或很快就死亡。
迄今為止，醫(yī)學(xué)上對(duì)于α-地中海貧血尚無(wú)有效的根治方法，因此開(kāi)展基因診斷、攜帶者檢查及產(chǎn)前診斷，是預(yù)防新生患兒出生，阻斷有害基因下傳，提高人口素質(zhì)的唯一有效措施。1980年起國(guó)際上開(kāi)始應(yīng)用限制性內(nèi)切酶加Southern印跡雜交技術(shù)診斷缺失型α-地中海貧血，用放射性同位素標(biāo)記的α、ξ珠蛋白基因探針進(jìn)行雜交，根據(jù)顯帶圖譜，可鑒別診斷α-地中海貧血1、α-地中海貧血2、HbH病和Bart’s水腫胎等。早期對(duì)非缺失型α-地中海貧血的基因診斷主要利用限制性內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)連鎖分析來(lái)作出的，有9個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)能提供較好的多態(tài)信息。自1984年P(guān)CR技術(shù)問(wèn)世后，該技術(shù)即被迅速?gòu)V泛用于多種遺傳病的基因診斷。1990年Lebo等應(yīng)用PCR檢測(cè)α-地中海貧血1，Dode和Baysal等則應(yīng)用PCR檢測(cè)α-地中海貧血2，雖然PCR的基本操作技術(shù)已有許多報(bào)道，但目前用PCR技術(shù)檢測(cè)α-地中海貧血仍然存在著一些亟待解決的技術(shù)難題，例如不易區(qū)別缺失純合子與雜合子，重復(fù)性較差，不能同時(shí)針對(duì)多種缺失進(jìn)行檢測(cè)等。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種診斷α-地中海貧血病的試劑，它基本上是由引物、(NH4)2SO4、dATP、dCTP、dTTP、dGTP、deaza-dGTP、二甲基亞砜、β-巰基乙醇、小牛血清白蛋白和TaqDNA聚合酶組成的。
所述引物為7條，7條引物的核苷酸序列分別是1、5’ctt tcc cta ccc aga gcc agg 3’2、5’gcc caa ggg gca aga agc atg 3’3、5’cag cac ctt ctc ttg agc agg c 3’4、5’ttt gaa tga agt ccg agt agg cag 3’5、5’ccc tgg gtg tcc agg agc aag cc 3’
6、5’gta tcc tct gtc ctg acc gag aa 3’7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’所述7種引物的用量在每25μl的反應(yīng)液中依次為0.04-0.08μg，0.08-0.14μg，0.08-0.14μg，0.04-0.10μg，0.02-0.06μg，0.08-0.15μg，0.08-0.15μg。
本發(fā)明試劑優(yōu)選的各組分含量分別為引物0.42-0.82μg/25μl反應(yīng)液(NH4)2SO420-50mmole/LdATP、dCTP、dTTP0.1-0.3mmole/LdGTP、deaza-dGTP0.05-0.15mmole/L二甲基亞砜 3-7μl/25μl反應(yīng)液β-巰基乙醇 0.01-0.05μl/25μl反應(yīng)液小牛血清白蛋白 0.1-0.5μl/25μl反應(yīng)液TaqDNA聚合酶1-2單位/25μl反應(yīng)液本發(fā)明中優(yōu)選的DNA聚合酶為T(mén)aq DNA聚合酶。
聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)，又稱基因體外擴(kuò)增，是美國(guó)科學(xué)家Mullis于1984年發(fā)明的，能夠在一個(gè)簡(jiǎn)單的試管反應(yīng)中，從極少量基因組DNA合成上百萬(wàn)拷貝數(shù)的靶DNA片段。PCR擴(kuò)增DNA片段的特異性是由兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物的序列決定的。后者分別與待擴(kuò)增的DNA片段的兩條鏈3’末端的DNA序列互補(bǔ)。
本發(fā)明基于PCR技術(shù)，巧妙地設(shè)計(jì)了能夠進(jìn)行α-地中海貧血診斷的多重基因擴(kuò)增的試劑，利用該試劑，可以對(duì)待檢測(cè)全DNA進(jìn)行4重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會(huì)得到4條電泳帶，但每份標(biāo)本只可能出現(xiàn)1至2條帶，籍此可以準(zhǔn)確診斷多種缺失型和非缺失型的α-地中海貧血病，重復(fù)性及準(zhǔn)確率均達(dá)到99.9％以上。
檢測(cè)東南亞型缺失的兩個(gè)引物6、7，分別特異于20Kb缺失片段上游斷點(diǎn)的5’端和下游斷點(diǎn)的3’端。存在東南亞型缺失時(shí)，可擴(kuò)增得到一條0.8Kb的擴(kuò)增帶，但從沒(méi)有該缺失的染色體得不到擴(kuò)增產(chǎn)物，因?yàn)槎呦嗑嗵h(yuǎn)，因此，只要出現(xiàn)0.8Kb帶，即可診斷為有東南亞型缺失。
檢測(cè)-α3.7缺失的二條引物1和2，分別特異于上游斷點(diǎn)的5’端特異區(qū)內(nèi)和下游斷點(diǎn)的3’端，兩個(gè)位點(diǎn)相距約5Kb之遙，只有存在-α3.7Kb缺失時(shí)，二者可以擴(kuò)增得到一條1.6Kb帶。換言之，得到1.6Kb帶，即診斷為有-α3.7Kb缺失。
檢測(cè)-α4.2缺失的二條引物是4和5。引物4設(shè)計(jì)在-α4.2缺失上游斷點(diǎn)的5’端，引物5在下游斷點(diǎn)的3’端。引物4和5從-α4.2缺失的α基因?qū)U(kuò)增出一條1.5Kb帶，從無(wú)此缺失的α基因得不到擴(kuò)增帶。只要電泳圖譜中出現(xiàn)1.5Kb帶，就表示有-α4.2缺失。
引物1還可以和特異于α2基因3’的引物3配對(duì)，從正常或非缺失型的α基因擴(kuò)增出一條1.9Kb帶，這條1.9Kb帶能起到區(qū)分缺失雜合子與純合子的作用，還可以用來(lái)進(jìn)一步查證2種點(diǎn)突變。
用本發(fā)明試劑檢測(cè)包括正常人DNA、α-地中海貧血病患者和攜帶者在內(nèi)的各種DNA標(biāo)本，每個(gè)標(biāo)本至少應(yīng)出現(xiàn)一條帶，如果一條帶也沒(méi)有，就表示實(shí)驗(yàn)失敗，需查找原因。
α-地中海貧血在我國(guó)南方乃至世界范圍內(nèi)有很高的發(fā)病率，嚴(yán)重威脅著人們的健康和人口素質(zhì)的提高，同時(shí)也是制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展的一個(gè)不利因素。本發(fā)明的試劑使用方便，準(zhǔn)確度高，對(duì)于α-地中海貧血病的診斷在我國(guó)及東南亞各國(guó)均適用，同時(shí)在α-地中海貧血病的基因芯片診斷中也將得到廣泛應(yīng)用，具有重大的社會(huì)效益及經(jīng)濟(jì)效益。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’7條引物在25μl的反應(yīng)液中的量依次為0.06μg，0.11μg，0.11μg，0.07μg，0.04μg，0.12μg，0.12μg實(shí)施例2、用本發(fā)明的試劑診斷α-地中海貧血1、從外周血白細(xì)胞、絨毛或羊水細(xì)胞提取基因組DNA；2、將DNA加入到實(shí)施例1的試劑中，進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為予變性94℃，4分鐘，然后熱變性，94℃，60秒；退火，55℃，30秒；鏈延伸，72℃，60秒，循環(huán)32次，70℃，10分鐘；3、將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)得到的譜帶類型(如表1所示)判斷是否患有α-地中海貧血，作出全面的分子遺傳學(xué)診斷、檢出攜帶者或?qū)μ鹤鞒霎a(chǎn)前診斷。
表1PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳譜帶結(jié)果與相應(yīng)的患病情況
權(quán)利要求
1.一種診斷α-地中海貧血病的試劑，它基本上是由引物、(NH4)2SO4、dATP、dCTP、dTTP、dGTP、deaza-dGTP、二甲基亞砜、β-巰基乙醇、小牛血清白蛋白和TaqDNA聚合酶組成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的診斷α-地中海貧血病的試劑，其特征在于所述引物為7條。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的診斷α-地中海貧血病的試劑，其特征在于所述7條引物的核苷酸序列分別是1、5’ctt tcc cta ccc aga gcc agg 3’2、5’gcc caa ggg gca aga agc atg 3’3、5’cag cac ctt ctc ttg agc agg c 3’4、5’ttt gaa tga agt ccg agt agg cag 3’5、5’ccc tgg gtg tcc agg agc aag cc 3’6、5’gta tcc tct gtc ctg acc gag aa 3’7、5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的診斷α-地中海貧血病的試劑，其特征在于所述7種引物的用量在每25μl的反應(yīng)液中依次為0.04-0.08μg，0.08-0.14μg，0.08-0.14μg，0.04-0.10μg，0.02-0.06μg，0.08-0.15μg，0.08-0.15μg。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3或4所述的診斷α-地中海貧血病的試劑，其特征在于所述各組分的含量分別為引物 0.42-0.82μg/25μl反應(yīng)液(NH4)2SO420-50mmole/LdATP、dCTP、dTTP 0.1-0.3mmole/LdGTP、deaza-dGTP 0.05-0.15mmole/L二甲基亞砜 3-7μl/25μl反應(yīng)液β-巰基乙醇 0.0-0.05μl/25μl反應(yīng)液小牛血清白蛋白 0.1-0.5μl/25μl反應(yīng)液TaqDNA聚合酶 1-2單位/25μl反應(yīng)液
6.權(quán)利要求1的試劑在診斷α-地中海貧血病中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1的試劑在α-地中海貧血病基因芯片診斷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的名稱是一種診斷α－地中海貧血病的試劑及其應(yīng)用。涉及一種疾病診斷試劑及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的是提供一種診斷α－地中海貧血病的試劑，利用該試劑，可以方便準(zhǔn)確地檢測(cè)出缺失型與非缺失型的多種α－地中海貧血病。本發(fā)明的試劑基本上由引物、(NH
文檔編號(hào)C12Q1/25GK1448514SQ02103839
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2002年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月29日
發(fā)明者王立榮 申請(qǐng)人:王立榮