專利名稱：大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法及其應(yīng)用，屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
為使大麻紡紗成為可能，只能用其工藝?yán)w維，這就既要去除纖維束間的膠質(zhì)適度分解大麻的纖維束，又不能脫膠太多。采用酶法脫膠須有幾種酶的聯(lián)合作用，并能有效控制酶水解的程度和改進(jìn)梳理技術(shù)，使大麻纖維的長度、細(xì)度符合紡織工藝的要求。山東大學(xué)2001年9月26日提出的001127440.9號專利申請中已提到用No.13菌株來進(jìn)行大麻脫膠酶的生產(chǎn)，但沒有脫膠的具體步驟。
大麻脫膠十余年來一直“移植”苧麻脫膠工藝，其缺陷是環(huán)境污染和脫膠纖維“生、熟”不勻，且制成率偏低。酶法脫膠工藝可以使其得到根本性改進(jìn)?，F(xiàn)有技術(shù)中曾有利用自然空氣微生物菌群或原麻上的微生物群落進(jìn)行脫膠，但由于菌種混雜，脫膠效果不穩(wěn)定，脫膠時間長達(dá)數(shù)天，難以工業(yè)化。專利1089669提供了大麻酶解脫膠技術(shù)，其內(nèi)容是控制一定條件讓大麻原麻附著的厭氧菌群生長，以達(dá)到對大麻脫膠的目的。很明顯，這仍是人工控制條件下的自然漚麻，效果難以穩(wěn)定，工業(yè)應(yīng)用十分困難。
本發(fā)明選用枯草芽孢桿菌No.13菌株，其生物特性菌體桿狀、革蘭氏染色陽性(G+)，內(nèi)生孢子近端生，孢子囊小于或等于菌體，孢子橢圓形、好氧、過氧化氫酶陽性，對葡萄糖、果糖、蔗糖等能發(fā)酵產(chǎn)酸、對乳糖、半乳糖不產(chǎn)酸，能水解淀粉，在含7％NaCl的肉湯中生長良好。根據(jù)伯杰細(xì)菌鑒定手冊(第八版1984科學(xué)出版社)及相關(guān)文獻(xiàn)鑒定該菌為枯草芽孢桿菌No.13(Bacillus subtilis)。
按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，在濟(jì)南近郊采集土壤樣品，選擇分離、經(jīng)搖瓶發(fā)酵進(jìn)行初、復(fù)篩，然后經(jīng)紫外線和氯化鋰復(fù)合誘變以及原生質(zhì)體融合等處理，并根據(jù)脫膠效果和酶活性高低二項標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行篩選，獲得一株實驗室編號No.13的菌株，已于2000年11月20日將該菌提交給中國典型培養(yǎng)物保藏，保藏號為CCTCC NO.M200038。
大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法包括高酶活菌種的斜面培養(yǎng)和保存、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐生產(chǎn)。
高酶活菌種的斜面培養(yǎng)和保存條件土豆培養(yǎng)斜面或者牛肉蛋白胨瓊脂斜面。PH7.2～7.4，100Pa滅菌20～30分鐘，放置成斜面，用接種環(huán)劃線接種該菌種，30℃～34℃培養(yǎng)24～48小時，保存?zhèn)溆谩?br> 土豆培養(yǎng)斜面的培養(yǎng)基重量百分比10～20％土豆汁100份，蔗糖1.0～2.0份，果膠0.2～0.4份，酵母膏0.03～0.1份，瓊脂1.5～1.8份，均為重量份，下同。
牛肉蛋白胨瓊脂斜面的培養(yǎng)基牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，瓊脂1.8～2.0份，水100份。
搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基(1)麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，(NH4)2SO40.5～1.5份，K2HPO40.05～0.1份，MgSO4·7H2O 0.1～0.2份，酵母膏0.02～0.05份?；蛘?2)牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，蔗糖0.5～1.0份，水100份。消前PH7.5～8.5。培養(yǎng)條件30～34℃，180～220轉(zhuǎn)/分鐘，時間48～72小時。
培養(yǎng)結(jié)束后，按Somogyi氏法測定果膠酶(以Sigma聚半乳糖醛酸為底物)、木聚糖酶(以Sigma木聚糖為底物)、甘露聚糖酶(以Sigma槐豆膠為底物)的酶活力。酶活力單位定義為在測定條件下，由底物每分鐘釋放1μmol產(chǎn)物所需的酶量即一個酶活力單位，用μ/ml表示。
種子罐培養(yǎng)可以分一、二級，和發(fā)酵罐(三級)生產(chǎn)的培養(yǎng)基相同。培養(yǎng)基麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，豆餅粉0.5～1.5份，(NH4)2SO40.5～1.0份，K2HPO40.05～0.10份，MgSO4·7H2O 0.10～0.20份，消前PH7.5～8.5。一、二級種子及發(fā)酵產(chǎn)酶控制條件罐壓0.03Mpa，溫度32℃～34℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.3～0.5，培養(yǎng)時間一、二級種子均為8～14小時，發(fā)酵罐時間12～18小時。
發(fā)酵生產(chǎn)過程注意測定和記錄罐溫、PH、菌成長狀況、有無雜菌，酶活增長狀況及碳氮代謝變化等。
大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的應(yīng)用，包括使用上述產(chǎn)品對大麻進(jìn)行酶法脫膠。大麻脫膠常規(guī)工藝步驟為原麻→切根→扎把→軟麻→裝籠→預(yù)煮→脫膠→打麻→水洗→脫水→抖松→上油→脫水→抖松→烘干→軟麻→堆倉養(yǎng)生，本發(fā)明對大麻進(jìn)行酶法脫膠具體步驟如下(1)發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵酶液經(jīng)板框過濾或離心除渣，用水稀釋酶液3～6倍，放入脫膠罐中，將稀釋酶液的PH調(diào)至7.5～9.0，作為脫膠液待用。
(2)原麻預(yù)處理可按常規(guī)進(jìn)行，切根處158～162mm，扎把，軟麻采用干軟1～2遍，80～100℃水浸1～1.5小時，準(zhǔn)備脫膠。
(3)脫膠液與原麻浴比(10～20)∶1(體積L重量KG)，PH兵7.5～9.0，脫膠溫度控制在40℃～50℃，脫膠酶液保持靜態(tài)或動態(tài)，脫膠時間2～10小時。脫膠酶液由于酶活損失不大可重復(fù)使用。
脫膠麻經(jīng)洗麻機(jī)洗麻，后續(xù)工序按常規(guī)進(jìn)行。
制成的大麻麻條平均長度90～95mm(化學(xué)法86mm)，平均細(xì)度19dtex～20dtex(化學(xué)法14.29dtex)，斷裂強(qiáng)度3.5～3.7g/D(化學(xué)法為3.12g/D)。不經(jīng)任何處理完全能夠紡8～24Nm純大麻紗及32～80Nm大麻混紡麻。另外與化學(xué)法相比，本發(fā)明還具有對環(huán)境無污染，改善工人勞動條件等優(yōu)點。
具體實施方式
實施例1大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法脫膠酶液按三級發(fā)酵工藝生產(chǎn)一級種子罐50L，二級種子罐500L，發(fā)酵罐10M3。
CCTCC No.M200038菌斜面菌種接種入搖瓶產(chǎn)酶培養(yǎng)基中。其制備方法為300ml搖瓶裝產(chǎn)酶培養(yǎng)基50ml置32℃±1℃，200轉(zhuǎn)/分鐘搖床培養(yǎng)72小時。
土豆培養(yǎng)斜面的培養(yǎng)基重量百分比20％土豆汁100份，蔗糖1.5份，果膠0.3份，酵母膏0.05份，瓊脂1.6份。均為重量份，下同。
搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基(1)麩皮3.0份，玉米粉1.0份，(NH4)2SO41.0份，K2HPO40.1份，MgSO4·7H2O 0.1份，酵母膏0.03份。消前PH8.0。
罐用產(chǎn)酶培養(yǎng)基麩皮5.0份，玉米粉2.0份，豆餅粉1.0份，(NH4)2SO41.0份，K2HPO40.05份，MgSO4·7H2O 0.10份，消前PH8.0。裝罐體積65％?？刂茥l件罐壓0.03Mpa，溫度33℃±1℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.4，培養(yǎng)時間一、二級種子均為10小時，發(fā)酵罐時間16小時。
放罐標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵液PH5.5，酶活不再上升，果膠酶活力1000μ/ml，木聚糖酶活力60μ/ml，甘露聚糖酶活力50μ/ml。
實施例2大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法。
如實施例1所述，所不同的是斜面的培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨瓊脂斜面的培養(yǎng)基牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl0.5份，瓊脂2.0份，水100份。
搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，蔗糖0.8份，水100份。
脫膠酶液按一級種子罐和發(fā)酵罐工藝生產(chǎn)一級種子罐50L，發(fā)酵罐10M3。
實施例3大麻脫膠步驟如下(1)如實施例1所述的脫膠酶液，經(jīng)水稀釋5倍后，調(diào)PH8.5。(2)大麻切根150mm，扎把，采用干軟2遍，90℃、PH8的水中浸泡1小時。(3)大麻與稀釋后酶液的浴比按1∶18(重量體積)，40℃水浴保溫脫膠6小時，PH8。每籠大麻裝320Kg，共分三籠，三批脫膠計960kg。
取出水洗后，脫水，抖松，上油，脫油，抖松，烘干，軟麻，堆倉養(yǎng)生。按化學(xué)脫膠麻條分析測試方法測試結(jié)果平均長度93mm，平均細(xì)度19.23dtex，斷裂強(qiáng)度3.6g/D。
實施例4如實施例3所述，所不同的是每籠大麻裝160Kg，共分五批，脫膠計800Kg。
酶法脫膠麻條中麻粒、密集等疵點幾乎為零，成紗條干，強(qiáng)力不勻率較好，織造時斷頭率下降10％以上，由于酶法脫膠纖維分離均勻、適中，落麻減少，梳理制成率比化學(xué)法的產(chǎn)品提高7～8個百分點。
權(quán)利要求
1.一種大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，包括高酶活菌種的斜面培養(yǎng)和保存、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐生產(chǎn)，其特征在于，選用枯草芽孢桿菌No.13菌株，保藏號為CCTCC NO.M200038，其生物特性菌體桿狀、革蘭氏染色陽性(G+)，內(nèi)生孢子近端生，孢子囊小于或等于菌體，孢子橢圓形、好氧、過氧化氫酶陽性，對葡萄糖、果糖、蔗糖能發(fā)酵產(chǎn)酸、對乳糖、半乳糖不產(chǎn)酸，能水解淀粉，在含7％NaCl的肉湯中生長良好。
2.如權(quán)利要求1所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，其特征在于，高酶活菌種的斜面培養(yǎng)和保存條件土豆培養(yǎng)斜面或者牛肉蛋白胨瓊脂斜面，PH7.2～7.4，100Pa滅菌20～30分鐘，放置成斜面，用接種環(huán)劃線接種該菌種，30℃～34℃培養(yǎng)24～48小時，保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，其特征在于，土豆培養(yǎng)斜面的培養(yǎng)基重量百分比10～20％土豆汁100份，蔗糖1.0～2.0份，果膠0.2～0.4份，酵母膏0.03～0.1份，瓊脂1.5～1.8份，均為重量份。
4.如權(quán)利要求1所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，其特征在于，牛肉膏蛋白胨瓊脂斜面的培養(yǎng)基牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，瓊脂1.8～2.0份，水100份，均為重量份。
5.如權(quán)利要求1所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，其特征在于，搖瓶培養(yǎng)的培養(yǎng)基(1)麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，(NH4)2SO40.5～1.5份，K2HPO40.05～0.1份，MgSO4·7H2O 0.1～0.2份，酵母膏0.02～0.05份；或者(2)牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，蔗糖0.5～1.0份，水100份；消前PH7.5～8.5。培養(yǎng)條件30～34℃，180～220轉(zhuǎn)/分鐘，時間48～72小時，均為重量份。
6.如權(quán)利要求1所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法，其特征在于，種子罐培養(yǎng)分一、二級，和發(fā)酵罐生產(chǎn)的培養(yǎng)基相同，培養(yǎng)基麩皮3.0～5.0份，玉米粉1.0～2.0份，豆餅粉0.5～1.5份，(NH4)2SO40.5～1.0份，K2HPO40.05～0.10份，MgSO4·7H2O0.10～0.20份，消前PH7.5～8.5；一、二級種子及發(fā)酵產(chǎn)酶控制條件罐壓0.03Mpa，溫度32℃～34℃，通氣量(空氣體積m3/發(fā)酵液體積m3·分鐘)1∶0.3～0.5，培養(yǎng)時間一、二級種子均為8～14小時，發(fā)酵罐時間12～18小時，均為重量份。
7.大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的應(yīng)用，包括使用權(quán)利要求1～6的產(chǎn)品對大麻進(jìn)行酶法脫膠。
8.如權(quán)利要求7所述的大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的應(yīng)用，包括步驟原麻→切根→扎把→軟麻→裝籠→預(yù)煮→脫膠→打麻→水洗→脫水→抖松→上油→脫水→抖松→烘干→軟麻→堆倉養(yǎng)生，其特征在于具體操作如下(1)發(fā)酵生產(chǎn)的發(fā)酵酶液經(jīng)板框過濾或離心除渣，用水稀釋酶液3～6倍，放入脫膠罐中，將稀釋酶液的PH調(diào)至7.5～9.0，作為脫膠液待用；(2)原麻預(yù)處理可按常規(guī)進(jìn)行，切麻離根處150～160mm，扎把，軟麻采用干軟1～2遍，80～100℃水浸1～1.5小時，準(zhǔn)備脫膠；(3)脫膠液與原麻浴比(10～20)∶1(體積L重量KG)，PH7.5～9.0，脫膠溫度控制在40℃～50℃，脫膠酶液保持靜態(tài)或動態(tài)，脫膠時間2～10小時。
全文摘要
一種大麻脫膠工業(yè)用酶制劑的制備方法及其應(yīng)用,屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域。酶制劑的制備方法包括高酶活菌種的斜面培養(yǎng)和保存、搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐生產(chǎn),選用枯草芽孢桿菌No.13菌株,保藏號為CCTCCNO.M200038。大麻脫膠的方法包括發(fā)酵酶液過濾渣,稀釋酶液3～6倍,放入脫膠罐中,將稀釋酶液的pH調(diào)至7.5～9.0,原麻預(yù)處理,脫膠液與原麻浴比(10～20)∶1,脫膠時間2～10小時。本發(fā)明方法無污染,制成的大麻麻條平均長度、細(xì)度、斷裂強(qiáng)度,均好于化學(xué)法。
文檔編號C12N1/20GK1374398SQ0211015
公開日2002年10月16日 申請日期2002年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者殷立德, 劉自镕, 周明瓊, 孫中愛, 任建平, 劉興榮, 朱林, 孫培敏, 周桂芬, 魏守文, 王俠, 馮瑞良, 金宗武, 謝小濟(jì) 申請人:山東省纖維檢驗局, 山東大學(xué), 山東泰山大麻紡織集團(tuán)總公司