專利名稱：人腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白編碼序列、其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法，以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
cAMP是信號通路中的眾多傳遞者之一，在細胞信號傳導中起重要作用。腺苷酸環(huán)化酶(Adenylate cyclase)是細胞中cAMP信號通路的催化單位。它結合在質(zhì)膜上并跨越質(zhì)膜十二次，是由大約1100個氨基酸殘基組成的糖蛋白。該酶含有兩個功能域一個N末端的催化功能結構域和一個C末端的調(diào)控結構域。有兩個高度保守區(qū)域第一個位于催化結構域中，第二個在調(diào)節(jié)結構域中，后者含有一個保守的組氨酸，該組氨酸可被PTS系統(tǒng)的IIA酶磷酸化，從而激活整個環(huán)化酶。腺苷酸環(huán)化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的條件下催化ATP生成3’，5’-環(huán)腺苷酸(cAMP)。作為cAMP信號通路的胞內(nèi)第二信使的cAMP，在細胞內(nèi)的濃度(正常狀況下≤10-6mol/L)應該被嚴格的控制，并且能夠對細胞外信號產(chǎn)生快速的應答。例如當刺激型激素存在時，cAMP水平在1秒鐘內(nèi)增加5倍以上。細胞內(nèi)另一種類型的酶即環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)可快速的降解cAMP生成5’-腺苷酸(5-AMP)，使細胞內(nèi)cAMP水平下降。
cAMP信號通路的最后一個化學反應是通過蛋白激酶A完成的。CAMP特異性的活化蛋白激酶A，活化的蛋白激酶A即可使特殊的蛋白磷酸化。依賴于cAMP的蛋白激酶A將ATP末端的磷酸轉移到底物蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基上。許多酶被蛋白激酶A磷酸化后，酶的活性提高；另一些酶被磷酸化后，酶活性降低。
每個蛋白激酶A由兩部分組成兩個催化亞基和兩個調(diào)節(jié)亞基。不存在cAMP時，催化亞基和調(diào)節(jié)亞基形成一個鈍化復合物。cAMP與調(diào)節(jié)亞基結合，改變了調(diào)節(jié)亞基的構象，使調(diào)節(jié)亞基和催化亞基解離，催化亞基釋放。被釋放的蛋白激酶A的催化亞基轉為到細胞核中并磷酸化一種稱為CREB的蛋白(binding protein of cAMP-responseelement，與cAMP應答元件結合的蛋白)的絲氨酸殘基。被磷酸化的CREB作為基因調(diào)節(jié)蛋白識別靶基因上的基因調(diào)節(jié)序列CRE(cAMP-response element，cAMP應答元件)并與之結合調(diào)節(jié)靶基因的表達。通過靶基因表達產(chǎn)物把外界刺激轉變?yōu)樾盘栔鸺墏鬟f，進而影響整個生物體的生理活動。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的轉運蛋白家族成員，該蛋白被命名為人hACL。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術生產(chǎn)所述的人hACL的方法。
本發(fā)明還提供了hACL基因序列和多肽的應用。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.1中從1040-1519位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的hACL蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ IDNO.2序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有hACL蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成hACL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hACL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達hACL蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hACL蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為2013個核苷酸，其詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于1040-1519位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術語“hACL蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中1040-1519位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的編碼框1040-1519位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.1中1040-1519位核苷酸序列同源性低至約90％的簡并序列也能編碼出SEQID NO.2所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術語還包括與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列的同源性至少90％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與人hACL相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度?；炯兊亩嚯幕旧喜缓烊粻顟B(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術語“hACL蛋白多肽”指具有hACL蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與人hACL相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括hACL蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹度條件下能與hACL DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗hACL多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含hACL多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括hACL多肽的可溶性片段。通常，該片段具有hACL多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供hACL蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然hACL多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
本發(fā)明還包括hACL多肽編碼序列的反義序列。這種反義序列可用于抑制細胞內(nèi)hACL的表達。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有hACL多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼hACL的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測hACL核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結合。較佳地，該樣品是PCR擴增后的產(chǎn)物，其中PCR擴增引物對應于hACL多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是真核細胞，如CHO細胞、COS細胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對hACL DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于hACL基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與hACL基因產(chǎn)物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制hACL蛋白的分子，也包括那些并不影響hACL蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的hACL基因產(chǎn)物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab＇或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的hACL基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達hACL或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，2013；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，2013；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷hACL功能的抗體以及不影響hACL功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用hACL基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與hACL基因產(chǎn)物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人hACL核苷酸序列全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按已知方法制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。當然，通過先合成多個小片段，然后再進行連接而獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明中，hACL的cDNA核苷酸序列是如此獲得的以人腦λgt11cDNA文庫(Clontech公司)為模板，用兩對寡核苷酸為引物A15＇-CTACCG AGTCCTCAGTGAACC-3‘為正向引物；寡核苷酸A25＇-CTG ACGGAGGTGC CTTCACTT-3’為反向引物，進行PCR。PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)所得片段長度為六百個堿基左右。將上述的擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后獲得全長cDNA序列，共1700bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于1040-1519位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導出hACL的氨基酸序列，共159個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
通過同源檢索發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的hACL蛋白質(zhì)序列中具有腺苷酸環(huán)化酶的典型序列及兩個跨膜區(qū)域。腺苷酸環(huán)化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的條件下催化ATP生成3’，5’-環(huán)腺苷酸(cAMP)，并與環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)一起調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的cAMP水平，進而影響整個生物體的生理活動。表達譜分析表明，本發(fā)明在腦中表達量最高，這暗示本發(fā)明的hACL可能參與大腦細胞信號傳導，在人類大腦發(fā)育、記憶、學習、神經(jīng)傳導、維持正常精神和生理狀態(tài)中起到重要作用。將本發(fā)明人hACL核酸(編碼序列或反義序列)引入細胞，可以提高人hACL的表達水平或者抑制人hACL的過度表達。本發(fā)明的人hACL蛋白或其活性多肽片段也可以施用于病人，以治療或減輕因人hACL缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
2.PCR產(chǎn)物的測序將上述的擴增產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega)連接，轉化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進行快速鑒定及排序。用SequiThermEXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共1700bp，詳細序列見SEQ ID NO.1，其中開放讀框位于1040-1519位核苷酸。根據(jù)得到的全長cDNA序列推導出hACL的氨基酸序列，共159個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO.2。
實施例2結構分析用hACL的全長cDNA序列及其編碼蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進行核酸和蛋白同源檢索。結果發(fā)現(xiàn)hACL的蛋白質(zhì)序列中具有腺苷酸環(huán)化酶(AC)的典型序列及兩個跨膜區(qū)域。
腺苷酸環(huán)化酶的作用是在Mg2+或Mn2+存在下的條件下催化ATP生成3’，5’-環(huán)腺苷酸(cAMP)，并與環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(PDE)一起調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的cAMP水平，進而影響整個生物體的生理活動，包括生物體的生長、發(fā)育、神經(jīng)傳導、激素和內(nèi)分泌作用、學習與記憶、疾病、衰老與死亡等等。
腺苷酸環(huán)化酶的典型保守序列為E-Y-F-G-[SA](2)-L-W-x-L-Y-K和Y-R-N-x-W-[NS]-E-[LIVM]-R-T-L-H-F-x-G，其中[NS]表示所列2種氨基酸中任選一種，Xn表示n個任意氨基酸。本發(fā)明的hACL中符合腺苷酸環(huán)化酶保守序列的部分為SNAEQPFFKDLYGAVNAESTSPFLHCLREVIGEYSVHEFSLLGKTESQGIGLWIALVVFLS(SEQ ID NO 2中從第64-128位)。典型的腺苷酸環(huán)化酶有12個跨膜區(qū)域，本發(fā)明的hACL也有兩個跨膜區(qū)GIGLWIALVVFLSFLIFSTSFYI(SEQ ID NO 2中從第45-67位)和GIGLWIALVVFLSFLIFSTSFYI(SEQ ID NO 2中從第116-138位)。因此，本發(fā)明可能具有腺苷酸環(huán)化酶的功能，通過對本發(fā)明的深入研究，一定能發(fā)現(xiàn)它與許多臨床病例的關系，并最終為解決這些問題開拓新的思維與方法。
本發(fā)明的人hACL除了可作為腺苷酸環(huán)化酶家族一員用于進一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人hACL還可以與該家族的其他成員進行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。
針對本發(fā)明人hACL的抗體，用于篩選具有類似結構域的其他蛋白，或者用于親和純化相關蛋白。
例如，本發(fā)明人hACL核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細胞，以提高人hACL的表達水平或者抑制人hACL的過度表達。本發(fā)明的人hACL蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人hACL缺失、無功能或異常而導致的有關病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進行有關的診斷或預后判斷。
實施例3表達譜分析從Clontech公司購得多種組織Northern印跡膜(MTN，16種組織)，以引物A1(5＇-CTACCG AGTCCTCAGT GAACC-3＇)和A2(5＇-CTG ACGGAGGTGC CTTCACTT-3＇)從人腦cDNA文庫(Clontech)中擴增得到約六百個堿基對的片段，以此片段為探針，用α-32P-dATP(DuPont公司)對其進行隨機引物標記，條件為37℃1小時，具體操作見MegaprimeDNA標記系統(tǒng)說明書(Amersham)。Northern雜交按用戶手冊操作。主要步驟如下(1)配制MTN雜交液(終濃度如下5XSSPE，10Xdenhardt′s，100μg/mlCTDNA，50％甲酰胺，2％SDS)，68℃預熱雜交液，徹底溶解沉淀物。(2)燙膜，倒入少許燒開的0.05％SDS溶液于膜上，震蕩、冷卻后測信號。(3)將尼龍膜放在雜交管中，加入預雜交液，42℃預雜交12小時。(4)變性后探針加入雜交管中，42℃雜交24小時。(5)洗膜，42℃，用2XSSC，0.05％SDS溶液洗兩次，每次20分鐘。(6)用X光片進行放射自顯影。
16種組織的Northern雜交結果顯示，hACL在腦、胸腺、前列腺、胎盤、卵巢、小腸、外周血白細胞、胎盤、骨骼肌、肝和睪丸等種組織中均有表達，其中屬腦中表達量最高。
實施例4hACL在大腸桿菌中的表達在該實施例中，用對應于編碼hACL的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得hACL的cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5＇寡核苷酸引物序列為5＇-A CTTGGATCC ATGGAGCCTGT TGAGCCAC-3＇該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點，接之是hACL編碼序列氨基端的部分核苷酸序列；3＇端引物序列為5’-CGCAAAGCTTCAGACT GAGTTCCTTA GCA-3’該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，一個翻譯終止子和hACL的編碼序列的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于細菌表達載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細菌復制起點(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結合位點(RBS)、一個6-組氨酸標記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點。
用BamHI和HindIII消化pQE-9載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細菌RBS起始。隨后用連接混合物轉化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，抽提質(zhì)粒，并測序驗證hACL的cDNA片段已正確插入了載體。
在補加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的陽性轉化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細胞生長至600光密度(OD600)達0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導啟動P/O導致基因表達水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細胞并將細胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標記物蛋白緊密結合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的hACL。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫hACL?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘撸褂猛肝霾襟E除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例5hACL在真核細胞(CHO細胞株)中的表達在該實施例中，用對應于編碼hACL的cDNA序列的5＇和3＇端的PCR寡核苷酸引物進行擴增，獲得hACL cDNA作為插入片段。
PCR反應中使用的5’寡核苷酸引物序列為5＇-A CTTAAGCTT ATGGAGCCTGT TGAGCCAC-3＇該引物含有HindIII限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在該酶切位點之后是hACL編碼序列的氨基端部分核苷酸序列；3’端引物序列為5’-CGCAGGATCCCAGACT GAGTTCCTTA GCA-3’該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點、一個翻譯終止子和hACL的部分核苷酸序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點對應于CHO細胞表達載體pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復制起點(f1 ori)、一個病毒復制起點(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應的polyA順序。
用BamHI和HindIII消化pcDNA3載體以及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉化子，在補加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗證hACL的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉染CHO細胞是采用脂轉染法，用Lipofectin試劑盒(GiBco Life)進行的。轉染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細胞及細胞上清測定表達肽轉運蛋白活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細胞及上清。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達蛋白溶液進行透析。最后凍干保存。
此外，用常規(guī)方法對表達蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.2的序列一致。
實施例6制備抗體將實施例4和5中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體如下。重組蛋白用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內(nèi)注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀人hACL基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。
序列表<210>1<211>1700<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(1040)..(1519)<223><400>1cggaagatgg tccgaatcaa ctggatagga ttgttaattt ccgaaggcac gagctcgcct 60ggcatccgca aatgtgaccc gcaatttaga gaggaagagg agcgcagacc ctacctgtcc120ggagtaacgg tcaggagaga ggtggggaag ggctgggccc ctctcggtgt cccgggttcc180cggcagaagt ctccaggact gaggcagtct gcagacacgg agtttccgtg ccagaggaga240gggtccacgc ggacaggcag ttccagctcc gggacatact ttattcagct gggtgctgaa300aaagaatctt ggaaattagg aaactgaatg aggcctcatt tcacactcag aatgtgggtt360gcaatagtca cttcctctgc tgctgggaaa gaaagaatta tactaccttt tgaattttgg420attaaggaga gaggtgttgg cttgtcaaac taccatgtat tcctcaagac atatttttgt480ggctttataa aattcaatat atatgtctaa attcaaaaat attttgttgc aatctggccc540ttggacaaac tgaggcccta gcaactgatg tttatggctt tccgtagaac ctttcagata600aaatttacac agcattttac tgcagctatt tcacacaaag cagaggattt tgccacaaaa660ctgaaagaaa aaagaaactg cattcttaaa tttttcataa atcaaaaggt ataaaaatat720ctacctaaac gataaaggag atgagaaacc ccacccatga tgggaagaaa gcctatttca780gttttgcctt tacttcaagt tcttttttcc atatctggaa tgcaatcaga attttaatct840tgccttgggt tcctcctgga tttggggaga agacaaaacc tgaaaatctc taatctgcat900gtgttcagct gcgtatcttc tggatacgga aggatcacac tgcacagagt gctggacttg960caggagcccc gcttctcaac ctccatcgct ttatgaatga attcaccaga aagaaaagga 1020agaatcaaca ctttcagag atg gag cct gtt gag cca cag tac caa cta gtc1072Met Glu Pro Val Glu Pro Gln Tyr Gln Leu Val1 5 10aat gct gaa tcg act tct ccc ttt cta cat tgc ctg aga gaa gtc att 1120Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu Val Ile15 20 25ggg gaa tac tct gta cac gaa ttt tca ctg ttg ggg aaa aca gag agt 1168Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser30 35 40caa ggg att gga ttg tgg att gca ttg gtg gtt ttc ctc agt ttc ctc 1216Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser Phe Leu45 50 55atc ttc tcc aca agt ttc tac ata tcg aat gca gag cag ccc ttc ttc 1264Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe60 65 70 75aaa gac ctc tac gga gca gtc aat gct gaa tcg act tct ccc ttt cta 1312Lys Asp Leu Tyr Gly Ala Val Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu80 85 90cat tgc ctg aga gaa gtc att ggg gaa tac tct gta cac gaa ttt tca 1360His Cys Leu Arg Glu Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser95 100 105ctg ttg ggg aaa aca gag agt caa ggg att gga ttg tgg att gca ttg 1408Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu110 115 120gtg gtt ttc ctc agt ttc ctc atc ttc tcc aca agt ttc tac ata tcg 1456Val Val Phe Leu Ser Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser125 130 135aat gca gag cag ccc ttc ttc aaa gga cct cct acg gaa gct gct aag 1504Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe Lys Gly Pro Pro Thr Glu Ala Ala Lys140 145 150 155gaa ctc agt ctg tag ctctgcgtgg agccatgtgt aaacactgaa ctgagacctg 1559Glu Leu Ser Leuccacctccta ctacctaagg gcccattttc atctgatatc atcccccaga aacaaactca 1619tgatgacttc catgtttttt ttagattaga tacatggaga attttccttt cccttagaat 1679taaaatcctg cattctaaaa a 1700<210>2<211>159<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Pro Val Glu Pro Gln Tyr Gln Leu Val Asn Ala Glu Ser Thr1 5 10 15Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val20 25 30His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu35 40 45Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser50 55 60Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro Phe Phe Lys Asp Leu Tyr Gly65 70 75 80Ala Val Asn Ala Glu Ser Thr Ser Pro Phe Leu His Cys Leu Arg Glu85 90 95Val Ile Gly Glu Tyr Ser Val His Glu Phe Ser Leu Leu Gly Lys Thr100 105 110Glu Ser Gln Gly Ile Gly Leu Trp Ile Ala Leu Val Val Phe Leu Ser115 120 125Phe Leu Ile Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Ile Ser Asn Ala Glu Gln Pro130 135 140Phe Phe Lys Gly Pro Pro Thr Glu Ala Ala Lys Glu Leu Ser Leu145 150 15權利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列雜交。
2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。
3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.1中核苷酸1040-1519位的序列。
4.一種分離的hACL蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA。
7.一種用權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是大腸桿菌。
9.如權利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，該細胞是真核細胞。
10.一種產(chǎn)生具有hACL蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有hACL蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達調(diào)控序列，形成hACL蛋白表達載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位的核苷酸序列有至少90％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達載體轉入宿主細胞，形成hACL蛋白的重組細胞；(c)在適合表達hACL蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細胞；(d)分離出具有hACL蛋白活性的多肽。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.1中從核苷酸1040-1519位。
12.一種能與權利要求4所述的hACL蛋白多肽特異性結合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權利要求1所述的DNA分子中約8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域,具體地,本發(fā)明涉及一種新的人基因核苷酸序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人腺苷酸環(huán)化酶相關蛋白(hACL)的cDNA序列以及該序列編碼的多肽。本發(fā)明還涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生產(chǎn)方法,以及這些多核苷酸和所述多肽的用途。
文檔編號C12N15/63GK1374405SQ02111410
公開日2002年10月16日 申請日期2002年4月18日 優(yōu)先權日2002年4月18日
發(fā)明者余龍, 唐麗莎 申請人:復旦大學