專利名稱：抗人端粒重復序列結(jié)合因子(trf1的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及一種抗人端粒重復序列結(jié)合因子單克隆抗體的制備，尤其是涉及抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備及應用。
當正常人體細胞的端?？s短至一定程度時，啟動停止細胞分裂的信號。正常人的細胞開始衰老死亡，稱之為第一死亡期(M1)或危險期(crisis)。而另一些組織細胞由于癌基因、抑癌基因p53和Rb的突變等能逃逸M1期，獲得一定的額外增殖能力，進入第二死亡期(M2)。此時端粒酶仍為陰性，端粒進一步縮短。大部分細胞壽命達到極限而死亡，而生存下來的細胞具有無限增殖的能力，端粒酶檢測陽性，成為永生化細胞。
研究表明，端粒序列的復制依賴與一種特殊的DNA聚合酶即端粒酶(telomerase)的作用。該酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白復合物(RNP)。目前研究普遍認為通常DNA復制后，起始復制的RNA引物被降解，引物段留下的空缺有上游引物延伸合成的DNA序列填補替代。但與模板3’端配對的引物降解后，則沒有上游引物延伸序列填補。因此，DNA每復制一次，其子鏈即縮短一次。經(jīng)若干次分裂周期后，當染色體端?？s短至臨界長度時，細胞即進入“程序性死亡”。但癌細胞則是在某些機制的作用下啟動端粒酶表達而使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長度，從而使癌細胞得以持續(xù)增殖、轉(zhuǎn)移并獲得永生化。
研究表明有超過85％的惡性腫瘤，其端粒酶活性高于正常組織，而且增高的程度與疾病預后有關。目前，人們已克隆的人端粒酶基因組密碼，主要有人端粒酶RNA部分(telomerase RNA component hTR)、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerasereverse transcriptase hTERT)及端粒酶相關結(jié)合蛋白(telomerase-associatedprotein TEP1)。1995年Chong首次在Science雜志報道了人端粒重復序列結(jié)合因子(Telomere Repeat Binding Factor hTRF)，并克隆了cDNA序列。迄今為止，人們已發(fā)現(xiàn)的端粒重復序列結(jié)合因子有TRF1、TRF2、tankyrase、PinX等，它們與細胞周期、細胞惡變、衰老等有關?，F(xiàn)已明確hTRF1全長為439個氨基酸，羧基端與Myb原癌基因DNA結(jié)合區(qū)同源，具有HTH(helix-turn-helix)結(jié)構(gòu)，稱Myb區(qū)。蛋白質(zhì)的中間約包含200個氨基酸，比較保守，稱TRF特異保守區(qū)。TRF1蛋白可特異地結(jié)合于端粒TTAGGG重復片斷。近年來，國外對TRF的結(jié)構(gòu)和及相關基因進行了大量的研究，現(xiàn)一般認為TRF1通過抑制端粒酶活性而起負調(diào)控作用。在體外實驗中，Elizabeth等發(fā)現(xiàn)TRF1蛋白也參與了端粒長度的調(diào)節(jié)，它通過與DNA雙鏈的結(jié)合而阻斷了端粒C末端的合成，從而起到使端粒逐漸縮短，維持正常的細胞周期的作用。有研究表明，在急性白血病中TRF1和TRF2 mRNA的表達明顯低于正常細胞。對HL-60細胞株應用腫瘤壞死因子471和全反式維甲酸促其分化，隨著細胞分化，端粒酶活性明顯降低，TRF1和TRF2mRNA的表達增加。2000年，Aragona等應用TRF1多克隆抗體對消化道腫瘤進行免疫組織化學染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TRF1的表達在惡性腫瘤中的表達明顯低正常、炎癥組織及良性腫瘤；次年，Aragona等對顱腦腫瘤進行了檢測，也得到了相同的實驗結(jié)果。
但迄今為止，對抗TRF1單克隆抗體的研究國內(nèi)外均未見報道。同時，對TRF1蛋白表達也僅有少數(shù)的應用抗TRF1多克隆抗體進行免疫組織化學定性研究的報道，而無定量檢測的報道。
本發(fā)明目的通過以下方案實現(xiàn)運用雜交瘤技術，以谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶-端粒重復序列結(jié)合因子133-277(GST-TRF133-277)融合蛋白為抗原，制備抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體，并應用該單抗作Western-blot及免疫組化對臨床標本進行檢測。
本發(fā)明的抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備主要有以下步驟①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予細胞融合，融合時脾細胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細胞數(shù)量為3.0×107個。
②細胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達98％。以TRF1蛋白包被作ELISA篩選陽性克隆細胞，獲得一株雜交瘤細胞株，部分液氮凍存，部分進行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，連續(xù)亞克隆3次，第3次亞克隆陽性反應率達100％。此株雜交瘤細胞液氮凍存一年，復蘇后仍生長良好，并能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
③誘生腹水，雜交瘤細胞株(1×104～1×105/只)接種Balb/c小鼠腹腔誘生腹水，約2周后采集腹水，均呈血性。
本發(fā)明的抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的一個應用是以TRF1單克隆抗體對臨床標本作組織免疫印跡法(Western-blot)，設純化GST蛋白為陰性對照，純化的TRF1為陽性對照，結(jié)果顯示TRF1單克隆抗體對TRF1蛋白具有高度特異性，可用于定量檢測組織細胞表達的TRF1蛋白。
本發(fā)明的抗人端粒重復序列結(jié)合因子單克隆抗體的另一個應用是用TRF1單克隆抗體對臨床待檢組織標本作免疫組織化學法，不經(jīng)胰酶及微波修復，直接進行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體，可用于檢測腫瘤細胞表達的TRF1蛋白。
圖2為正常及急性白血病骨髓細胞、腸癌組織及近旁正常組織提取蛋白的Western-blot分析圖。
圖3為組織細胞免疫組化染色圖。
(2) 細胞、動物和組織樣本 Balb/c小鼠(雌性，20g，8-12W)購自上海必凱實驗動物中心，SP2/0小鼠骨髓瘤細胞(浙江大學醫(yī)學院傳染病研究所惠贈)，正常及急性白血病骨髓和大腸癌組織取自浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院臨床標本。
(3) 小鼠免疫、細胞融合及克隆化培養(yǎng) 以純化的GST-TRF133-277融合蛋白為抗原免疫Balb/c小鼠，時間為第0、28、42天，所用總蛋白量為20-50ug。初次免疫用完全福氏佐劑與抗原1∶1制成乳狀液，皮內(nèi)多點接種Balb/c小鼠；加強免疫用抗原加福氏不完全佐劑皮下多點注射，2周后接種純抗原，共接種3次。末次免疫后3天，無菌取Balb/c小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0在50％聚乙二醇作用下進行細胞融合，融合時脾細胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細胞數(shù)量為3.0×107個。細胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達98％。用含20％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞融合第10天，以純化的TRF1蛋白為抗原，作ELISA間接法檢測培養(yǎng)上清液中的抗體，選取OD值最大的分泌抗體的雜交瘤細胞培養(yǎng)孔，部分液氮凍存，部分予以有限稀釋克隆化培養(yǎng)，直到克隆化細胞抗體陽性率為100％。
(4) 雜交瘤細胞染色體檢測 細胞培養(yǎng)至對數(shù)期，棄原培養(yǎng)液，換含秋水仙素至終濃度0.3ug/ml的培養(yǎng)基，經(jīng)低滲處理，加入37℃預熱的0.075mol/L的KCL溶液，37℃30min后離心收集細胞，滴片，自然干燥后Giemsa染色，計數(shù)分析。
(5) 誘生腹水 給Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5ml/鼠。1-2周后，將擴大培養(yǎng)的陽性雜交瘤細胞以無血清1640細胞培養(yǎng)液重懸，接種到經(jīng)石蠟預處理過的Balb/c小鼠腹腔(1×104～1×105/只)，1-2周后收集腹水，均呈血水，離心后取上清，凍存于-80℃。
(6) 抗TRF1 單抗腹水效價檢測及亞類鑒定 TRF1重組蛋白(5ug/ml)每孔0.1ml包被酶標板作ELISA間接法檢測抗體滴度。一抗為經(jīng)倍比稀釋的腹水，二抗為1∶800稀釋的羊抗鼠IgG/HRP，經(jīng)顯色液顯色，450nm測定光密度?？贵w亞類取雜交瘤細胞培養(yǎng)上清以單抗亞類試劑盒確定?？筎RF1單抗效價為1∶3200。TRF1單克隆抗體亞類取雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清確定，屬IgG1亞類。參見

圖1。
實施例2 組織蛋白提取及免疫印跡法(Western-blot)正常人及急性白血病患者骨髓經(jīng)淋巴細胞分離液分離出單個核細胞，大腸癌組織及近旁正常組織經(jīng)超聲粉碎離心取上清，測定蛋白濃度。細胞和組織提取的總蛋白取20ug作10％SDS-PAGE電泳(200V)、電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(100V，1小時)，以含7％脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉后，在制備的抗TRF1單克隆抗體中室溫反應30min，4℃過夜，洗膜，在羊抗鼠IgG/HRP中反應1小時，TBST洗膜2小時。ECL溫浴1min，X光膠片感光，顯影，定影。并設純化GST蛋白為陰性對照，純化TRF1蛋白為陽性對照。
結(jié)果顯示上述正常人及白血病骨髓細胞、大腸癌組織及近旁正常腸粘膜組織樣本均于約60KD處呈一條陽性帶，與陽性對照純化TRF1蛋白處于同一水平，而純化GST樣本孔顯示陰性結(jié)果，表明TRF1單抗僅針對TRF1蛋白，具有高度的特異性，且與其計算分子量基本一致?？捎糜跈z測組織細胞表達的TRF1蛋白。參見圖2，其中1純化GST蛋白；2純化TRF1蛋白；3正常腸粘膜組織；4大腸癌組織；5正常人骨髓細胞；6急性白血病患者骨髓細胞。
實施例3 免疫組織化學 正常及白血病骨髓細胞、大腸癌組織及近旁正常粘膜組織切片應用抗TRF1單克隆抗體作免疫組化染色，不經(jīng)胰酶及微波修復，直接進行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體。
結(jié)果大腸正常粘膜組織上皮細胞、正常及急性白血病骨髓細胞、大腸癌組織細胞的胞漿呈陽性著色，但大腸正常粘膜組織上皮細胞及正常骨髓細胞陽性率明顯高于腫瘤組織，部分腫瘤細胞細胞漿無著色，細胞核和組織間質(zhì)呈陰性反應。參見圖3。
應用抗TRF1單克隆抗體作免疫組化檢測臨床組織樣本，結(jié)果表明TRF1蛋白定位于骨髓造血細胞及大腸上皮組織的細胞漿，為細胞漿蛋白。免疫組化結(jié)果還顯示TRF1蛋白在正常組織與腫瘤組織中均有表達，但存在明顯差別，正常大腸組織上皮細胞及正常骨髓細胞陽性率明顯高于腫瘤組織，這可能與TRF1對端粒酶的負調(diào)控作用有關，此結(jié)果與Aragona等報道的應用TRF1多抗檢測臨床標本的研究結(jié)果相同。
無需進一步詳細闡述，相信采用前面所公開的內(nèi)容，本領域技術人員可最大限度地應用本發(fā)明。因此，前面的優(yōu)選具體實施方案應理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備及應用，運用雜交瘤技術，以蛋白為抗原，制備單克隆抗體，其特征是以GST-TRF133-277融合蛋白為抗原，制備抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體，并建立了應用該單抗作Western-blot及免疫組化檢測臨床標本的方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的制備方法，其特征是由以下步驟實現(xiàn)①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予細胞融合，融合時脾細胞數(shù)量為1.38×108個，骨髓瘤細胞數(shù)量為3.0×107個；②細胞融合后，接種于96孔板，共接種192孔，融合率達98％。以TRF1蛋白包被作ELISA篩選陽性克隆細胞，獲得一株雜交瘤細胞株，部分液氮凍存，部分進行有限稀釋克隆化培養(yǎng)，連續(xù)亞克隆3次，第3次亞克隆陽性反應率達100％。此株雜交瘤細胞液氮凍存一年，復蘇后仍生長良好，并能持續(xù)穩(wěn)定分泌單克隆抗體；③誘生腹水，雜交瘤細胞株(1×104～1×105/只)接種Balb/c小鼠腹腔誘生腹水，約2周后采集腹水，均呈血性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的應用，其特征是以TRF1單克隆抗體對臨床標本作組織免疫印跡法(Western-blot)，以純化GST蛋白為陰性對照，純化的TRF1為陽性對照，結(jié)果顯示TRF1單克隆抗體對TRF1蛋白具有高度特異性，可用于檢測組織細胞表達的TRF1蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF133-277)單克隆抗體的應用，其特征是應用TRF1單克隆抗體，對臨床待檢組織標本作免疫組織化學法檢測，不經(jīng)胰酶及微波修復，直接進行染色(Envision法)，一抗為1∶100稀釋的抗TRF1單克隆抗體，可用于檢測腫瘤細胞表達的TRF1蛋白。
全文摘要
一種抗人端粒重復序列結(jié)合因子(TRF文檔編號C12P21/08GK1464064SQ0211200
公開日2003年12月31日 申請日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月7日
發(fā)明者黃河, 施繼敏, 陳巧芳 申請人:浙江大學醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院