專利名稱：一種多肽芯片試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)生物樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和/或定量檢測(cè)的試劑盒，特別是一種以低密度多肽芯片探針板和以膠體金屬及銀鹽標(biāo)記物質(zhì)為主要組成，其檢測(cè)結(jié)果可以直接用肉眼、也可用儀器判斷的試劑盒。
本發(fā)明還涉及上述多肽芯片試劑盒的制造方法及其應(yīng)用。
基因芯片又稱DNA芯片，目前是應(yīng)用最為廣泛的一種生物芯片，其探針為DNA。由于DNA分析中往往需要在短時(shí)間內(nèi)獲得極大量的目標(biāo)分子信息，基因芯片通常固定有高密度的探針?lè)肿拥奈Ⅻc(diǎn)陣列，每平方厘米可高達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)探針?lè)肿訕狱c(diǎn)(WO95/11995)。由于基因芯片樣點(diǎn)密度大，精度高，每個(gè)點(diǎn)上捕捉分子數(shù)量少，因此對(duì)點(diǎn)樣儀器、設(shè)備的精度要求非常高。標(biāo)記系統(tǒng)幾乎都為熒光標(biāo)記物。結(jié)果檢出時(shí)，需要高分辨率、高靈敏度的芯片掃描儀。由于微樣點(diǎn)陣列點(diǎn)樣機(jī)械或印刷設(shè)備和高檔芯片掃描儀的價(jià)格非常昂貴，這成了生物芯片推廣應(yīng)用中的一大障礙(WO00/72018；US-5,821,060；WO 95/04160)。因此有人改用比色標(biāo)記物檢測(cè)方法(US-5,270,167；US-4,731,325)。但該方法靈敏度太低，應(yīng)用中難以達(dá)到檢測(cè)效果。
對(duì)于多肽芯片的檢測(cè)，目前基本上仍利用基因芯片的研究成果，即使用熒光標(biāo)記法，因而其標(biāo)記系統(tǒng)仍為熒光標(biāo)記物。為了克服熒光掃描儀價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，已有研究者進(jìn)行了一些改進(jìn)，采用膠體金、銀著色劑對(duì)目標(biāo)分子示蹤，通過(guò)CCD器件或數(shù)碼照相機(jī)進(jìn)行檢測(cè)(WO 00/72018 A1)。但其著重點(diǎn)仍為基因芯片，只應(yīng)用于每平方厘米多于20個(gè)可區(qū)別樣點(diǎn)的高密度芯片，結(jié)果是仍須用高精度點(diǎn)樣印刷設(shè)備和專用信號(hào)檢出設(shè)備。
本發(fā)明中所謂的試劑盒，是指某些定性和/或定量檢測(cè)中必不可少的一種耗材，被用以同目標(biāo)物進(jìn)行反應(yīng)并將反應(yīng)結(jié)果以可確定的方式表達(dá)出來(lái)，其核心部分是含有選擇性反應(yīng)器的探針板，重要部分是含有標(biāo)記物的標(biāo)記系統(tǒng)，此外還有輔助部分(例如緩沖液等)。本發(fā)明中所謂的選擇性反應(yīng)器，是指固定有探針的、可進(jìn)行選擇性反應(yīng)及相關(guān)操作的固定場(chǎng)所，例如反應(yīng)板、反應(yīng)池等等。本發(fā)明中所謂的探針板，是指包含有一個(gè)或多個(gè)選擇性反應(yīng)器的、用于目標(biāo)物定性和/或定量檢測(cè)中的產(chǎn)品，例如8反應(yīng)池芯片板。本發(fā)明中所謂的標(biāo)記系統(tǒng)，是指用于目標(biāo)物定性和/或定量檢測(cè)中的、可對(duì)探針固定的目標(biāo)物進(jìn)行標(biāo)記的有關(guān)物質(zhì)的總和。
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)印刷、掃描和處理掃描結(jié)果的軟、硬件投資較少的多肽芯片試劑盒，以克服現(xiàn)有芯片試劑盒對(duì)印刷，掃描和處理掃描結(jié)果的軟、硬件的高投資的限制。本發(fā)明試劑盒的特征為1)，為降低對(duì)印刷，掃描和掃描結(jié)果處理的技術(shù)要求，探針板上選擇性反應(yīng)器中探針的分布具有低密度的特征，即每平方厘米少于20個(gè)可區(qū)別的探針區(qū)域；2)，標(biāo)記系統(tǒng)采用高靈敏度的膠體金屬及銀鹽等著色劑為標(biāo)記物質(zhì)；3)，對(duì)標(biāo)記結(jié)果的處理，可以不像高密度芯片那樣必須使用專用掃描儀和計(jì)算機(jī)，而可以用肉眼或借助光學(xué)放大系統(tǒng)直接判讀，就像快速試劑條一樣用肉眼或借助光學(xué)放大系統(tǒng)直接觀察陣點(diǎn)的顏色判斷結(jié)果，進(jìn)行定性分析；也可與一些儀器和計(jì)算機(jī)配合使用，得到定量的數(shù)據(jù)處理結(jié)果。
本發(fā)明試劑盒中的探針板的基本特征，是探針板上選擇性反應(yīng)器中探針的分布密度低，即每平方厘米少于20個(gè)可區(qū)別的探針區(qū)域。本發(fā)明中的探針板上的探針，其種類范圍包括所有可以以低密度分布方式固定在固相載體上、且可與樣品中目標(biāo)物發(fā)生選擇性反應(yīng)的多肽，例如人造或天然蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片斷、合成多肽等等。本發(fā)明中的探針板的材料，可以是任何一種可在其上以低密度分布的形式固定探針的材料或材料組合。本發(fā)明中的探針板的生產(chǎn)，可以利用任何可在固相載體上將探針以低密度分布的形式固定的方法，例如點(diǎn)樣、噴墨、印章等方法。
本發(fā)明所述的標(biāo)記系統(tǒng)中的標(biāo)記示蹤物為能與標(biāo)記份子牢固結(jié)合的金屬膠體、金屬鹽類，如膠體金、鉑等著色劑或/和銀鹽催化放大系統(tǒng)。
利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的基本步驟是(1)，將待測(cè)樣品加入芯片探針板的反應(yīng)器中，使探針與相應(yīng)的目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽結(jié)合，然后洗去樣品中的未結(jié)合組分；(2)，將膠體金屬標(biāo)記的親和分子加入芯片探針板的反應(yīng)器中，使標(biāo)記物與探針固定的目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽結(jié)合，然后洗去未結(jié)合物；(3)，如果目標(biāo)分子數(shù)量很少，膠體金標(biāo)記的親和分子顏色太淺，可以加入銀鹽。當(dāng)膠體金標(biāo)記分子與目標(biāo)分子結(jié)合，金微粒沉積于目標(biāo)分子上時(shí)，再加入銀鹽溶液，這時(shí)結(jié)合于目標(biāo)分子上的金微粒催化銀離子還原成銀晶粒沉積于金微粒周圍，將顯色結(jié)果放大，使其易于進(jìn)行檢測(cè)。可根據(jù)需要，控制銀鹽溶液濃度和反應(yīng)時(shí)間將銀離子沉積面積控制在所需大小。然后洗去未結(jié)合物；(4)，顯色反應(yīng)完成后，當(dāng)樣點(diǎn)面積足夠大時(shí)，可直接用肉眼或借助于光學(xué)放大系統(tǒng)觀察，判斷結(jié)果，進(jìn)行定性分析。也可用儀器閱讀數(shù)據(jù)，例如，將玻片放進(jìn)計(jì)算機(jī)相連的圖像掃描儀，圈定玻片掃描范圍后，用適當(dāng)?shù)木€數(shù)掃描，數(shù)據(jù)采集到計(jì)算機(jī)后，結(jié)果由專用軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；也可將玻片用數(shù)碼相機(jī)拍照，拍照得到的圖片數(shù)據(jù)送到計(jì)算機(jī)后，由專用軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)算機(jī)處理后的結(jié)果同芯片掃描儀數(shù)據(jù)處理后一樣，可以由打印機(jī)打印出定性和定量的結(jié)果。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為，具備比現(xiàn)有多肽芯片試劑盒檢測(cè)更快速、更簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本更低的特點(diǎn)。當(dāng)在一個(gè)檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)分子不多時(shí)，最適合使用本發(fā)明中的芯片試劑盒。事實(shí)上，對(duì)多肽芯片而言，其探針布陣并不僅是高密度一種形式。低密度多肽芯片(每平方厘米少于20個(gè)可區(qū)別的探針區(qū)域)仍是有廣泛用途的。舉一個(gè)極端的例子，僅固定HIV1+2抗原作為探針的芯片，即使在一平方厘米上只有6個(gè)可區(qū)別的探針區(qū)域(點(diǎn))，由于同現(xiàn)在的ELISA方法比較，一個(gè)檢測(cè)只消耗不到ELISA百分之一的HIV1+2抗原(特別在雙抗原夾心法時(shí))。同時(shí)，在低密度的情況下，結(jié)果還能用肉眼或光學(xué)放大系統(tǒng)進(jìn)行快速判斷。為生物芯片生產(chǎn)商省去了昂貴的高精度的點(diǎn)樣、印刷設(shè)備的高投資，和為檢測(cè)單位省去芯片掃描儀的高投資以及昂貴的檢測(cè)操作費(fèi)用。所以在低密度芯片生產(chǎn)和應(yīng)用中具有明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施例方式
例一HIV金銀染色芯片試劑盒的生產(chǎn)和應(yīng)用例在本例中，HIV金銀染色芯片試劑盒的探針板的制備如下使用已活化顯微鏡玻片作為載體、HIV1+2抗原為探針，手工點(diǎn)樣，6個(gè)探針點(diǎn)以2×3點(diǎn)陣排列，每個(gè)探針點(diǎn)直徑為1mm，探針點(diǎn)之間距為3mm。探針固定后，經(jīng)封閉液對(duì)未包被的部分封閉后，吹干備用。
HIV金銀染色芯片試劑盒的標(biāo)記系統(tǒng)為膠體金標(biāo)記的羊抗人IgA及硝酸銀溶液。
HIV金銀染色芯片試劑盒應(yīng)用于愛(ài)滋病毒快檢的例子首先加入待檢血清樣品，反應(yīng)完成后，洗去未結(jié)合的血清成分，加入膠體金標(biāo)記的二抗，當(dāng)二抗與檢測(cè)樣品中的HIV抗體反應(yīng)完成后，洗去未結(jié)合的二抗，再加入硝酸銀溶液，利用金微粒催化銀離子還原成銀并沉積在金粒子周圍，使顯色作用放大，顏色比膠體金顯色更清楚，用肉眼判斷陰陽(yáng)結(jié)果。
例二丙型肝炎金銀染色芯片試劑盒的生產(chǎn)及應(yīng)用例在本例中，金銀染色芯片試劑盒探針板的制備如下使用已活化顯微鏡玻片作為載體、丙型肝炎NS3、NS4、CORE抗原為探針，手工點(diǎn)樣，每種探針點(diǎn)6個(gè)探針點(diǎn)，以3×6點(diǎn)陣排列，每個(gè)探針點(diǎn)直徑為1mm，探針點(diǎn)之間距為3mm。探針固定后，經(jīng)封閉液對(duì)未包被的部分封閉后，吹干備用。
丙型肝炎金銀染色芯片試劑盒的標(biāo)記系統(tǒng)為膠體金標(biāo)記的羊抗人IgA及硝酸銀溶液。
丙型肝炎金銀染色芯片試劑盒應(yīng)用于丙型肝炎檢測(cè)的例子首先加入待檢血清樣品，反應(yīng)完成后，洗去未結(jié)合的血清成分，再加入著色劑標(biāo)記的二抗，當(dāng)二抗與檢測(cè)樣品中的丙型肝炎抗體反應(yīng)完成后，洗去未結(jié)合的二抗，再加入硝酸銀溶液，利用金微粒催化銀離子還原成銀并沉積在金粒子周圍，使顯色作用放大，顏色比膠體金顯色更明顯，用肉眼可判斷陰陽(yáng)結(jié)果。為了與其他檢測(cè)方法作比較，本試驗(yàn)也使用CCD器件采集數(shù)據(jù)，結(jié)果經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，表一是與RIBA結(jié)果的比較，數(shù)據(jù)為6個(gè)點(diǎn)的平均值。表1，膠體金銀染色芯片檢測(cè)結(jié)果血清樣品 RIBA結(jié)果金銀染色結(jié)果NS3NS4CORENS3NS4CORE1-- -- -- 11 26 172-- -- -- 28 20 93+ + -- 117139394++ -- ++ 17932 1985++++ -- -- 27137 226-- + - 13 114367- ++ - 16 31 1678++++ ++ ++ 23419917權(quán)利要求
1.對(duì)生物樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和/或定量檢出的多肽芯片試劑盒，由探針板和標(biāo)記系統(tǒng)為主要組成，其特征在于在其探針板上的一個(gè)反應(yīng)器中，可區(qū)分的多肽/蛋白質(zhì)探針的分布密度低于20個(gè)/平方厘米；其標(biāo)記系統(tǒng)以金屬膠體為標(biāo)記物質(zhì)，在必要時(shí)加以銀離子為著色放大劑。
2.按照權(quán)利要求1所述的低密度多肽芯片試劑盒，對(duì)生物樣品中的目標(biāo)化合物進(jìn)行定性和/或定量檢出的方法，其基本步驟是A、將待測(cè)樣品加入芯片探針板的反應(yīng)器中，使探針與相應(yīng)的目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽結(jié)合，然后洗去樣品中的未結(jié)合組分；B、將膠體金屬標(biāo)記的親和分子加入芯片探針板的反應(yīng)器中，使標(biāo)記物與探針固定的目標(biāo)蛋白或目標(biāo)多肽結(jié)合，然后洗去未結(jié)合物；C、如果目標(biāo)分子數(shù)量很少，膠體金標(biāo)記的親和分子顏色太淺，可以加入銀鹽為著色放大劑。反應(yīng)完全后，洗去未結(jié)合的物質(zhì)。D、顯色反應(yīng)完成后，可直接用肉眼或借助于光學(xué)放大系統(tǒng)觀察、分析，也可用掃描儀等裝置來(lái)進(jìn)行觀察、分析。
全文摘要
利用現(xiàn)有的多肽芯片試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，需要配備高精度、高價(jià)格的熒光掃描儀。本發(fā)明提供一種對(duì)印刷、掃描和處理掃描結(jié)果的軟、硬件的投資要求較低的多肽芯片試劑盒，其特征為探針板上選擇性反應(yīng)器中探針的分布密度低，即每平方厘米少于20個(gè)可區(qū)別的探針區(qū)域；標(biāo)記系統(tǒng)采用高靈敏度的膠體金屬及銀鹽等著色劑為標(biāo)記物質(zhì)。當(dāng)在一個(gè)檢測(cè)中同時(shí)檢測(cè)的目標(biāo)分子數(shù)目不多時(shí)，特別適合使用本發(fā)明中的芯片試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1464308SQ0211383
公開(kāi)日2003年12月31日 申請(qǐng)日期2002年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 胡勁梅, 王建霞 申請(qǐng)人:成都夸?？萍加邢薰?br>