專利名稱：一種基因芯片上的酶標信號檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因芯片信號檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因芯片上的酶標信號檢測方法。
背景技術(shù)：
基因芯片技術(shù)大致包括四個部分樣品的前期處理、芯片制作、制作后的生物學反應(yīng)、信號檢測。信號檢測是基因芯片技術(shù)中一個不可或缺的組成部分，目前已經(jīng)有多種芯片信號檢測方法，主要包括熒光檢測法、化學發(fā)光檢測法、質(zhì)譜檢測法、納米放大信號檢測技術(shù)等。熒光信號檢測方法是目前應(yīng)用最多的基因芯片信號檢測方法，普通的熒光掃描儀可以在半徑100微米的區(qū)域內(nèi)檢測到10-18mol熒光分子，符合高密度、高通量的基因芯片信號檢測的要求，但高靈敏度也帶來了高背景等問題，特別是采用該方法進行基因芯片信號檢測需要價格不菲等專門檢測儀器；20世紀90年代后期，有研究報道通過質(zhì)譜對基因芯片的信號進行檢測，通過該方法可以檢測到10-12-10-15mol核酸分子，所獲得的信號檢測結(jié)果精確度高，但采用該方法需要質(zhì)譜儀，操作復(fù)雜，目前僅限制在有關(guān)的科研院校中使用；采用化學發(fā)光信號檢測方法檢測核酸需要對核酸進行相關(guān)化學修飾，而且必需專門的信號檢測儀器，因而該方法在基因芯片信號檢測應(yīng)用上的報道較少；隨著納米技術(shù)的發(fā)展以及納米技術(shù)與生物技術(shù)的相互融合，近幾年出現(xiàn)了一種基因芯片上的納米放大信號檢測技術(shù)，有文獻報道用納米金進行信號檢測，結(jié)合銀染方法，核酸檢測靈敏度可高出熒光檢測方法兩個數(shù)量級，但該方法尚處于發(fā)展初期，離實用化還有一定距離。
綜上所述，研究者們一直在為尋找實用化的基因芯片信號檢測方法而努力，但以上幾種方法都難以實現(xiàn)實用化這一目標。
2002年，首次出現(xiàn)了酶標信號檢測技術(shù)在基因芯片上應(yīng)用的文獻報道。酶標信號檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的傳統(tǒng)的信號檢測技術(shù)之一，其基本技術(shù)流程為在待檢測的核酸中摻入半抗原生物素；通過化學交聯(lián)方法將親和素(或鏈霉親和素)與信號檢測用酶(堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶等)交聯(lián)在一起；用交聯(lián)產(chǎn)物親和素-堿性磷酸酶(或辣根過氧化物酶等)進行信號檢測，利用親和素(鏈霉親和素)與核酸中的生物素的特異性作用將信號檢測用酶引入核酸，酶催化底物(如5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氯化硝基四氮唑藍混合液)產(chǎn)生顏色反應(yīng)。與熒光等方法相比較而言，該方法信號檢測靈敏度相對較低，因此很難在高密度基因芯片上進行應(yīng)用；但其核酸檢測靈敏度可達1-5皮克，能夠滿足中低密度基因芯片(≤400點/cm2)信號檢測的要求，而且該方法操作簡便，可根據(jù)顏色的有無判斷生化反應(yīng)的結(jié)果，結(jié)合簡易型信號檢測儀即可進行定量或半定量分析，易于推廣應(yīng)用；2000年，本研究室邵文海等人報道了一種可定向交聯(lián)堿性磷酸酶與鏈霉親和素的方法(Wen-Hai Shao et al.，Anchor-Chain Molecular System forOrientation Control in Enzyme Immobilization.Bioconjugate Chem.2000，11，822-826)，通過該方法實現(xiàn)了堿性磷酸酶與鏈霉親和素(Straptactin)的定向交聯(lián)。采用堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽(II型)融合蛋白與鏈霉親和素的定向交聯(lián)復(fù)合物進行酶標信號檢測，核酸檢測靈敏度可達0.1皮克(圖2)，信號檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性也有很大提高。因此酶標信號檢測方法可望發(fā)展成為實用化的中低密度基因芯片信號檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基因芯片上的酶標信號檢測方法。首先制作好有關(guān)基因芯片，并進行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中引入生物素；芯片生化反應(yīng)結(jié)束后，采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或自行制備的堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物進行信號檢測；在信號檢測過程中，對酶標信號檢測方法的反應(yīng)條件進行優(yōu)化，簡化反應(yīng)步驟，提高了信號檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性；通過采用自行制備的堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素定向交聯(lián)復(fù)合物進行信號檢測，提高了信號檢測靈敏度。
為達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施。首先根據(jù)以下步驟制作基因芯片并進行芯片PCR等生化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中引入生物素A)首先通過氫氟酸蝕刻，在普通載玻片上制作點陣；其次對載玻片進行巰基硅烷化修飾；B)合成相關(guān)引物，對引物的5’末端進行二硫鍵修飾；通過二硫鍵修與巰基的交換反應(yīng)將引物固定于載玻片，形成引物陣列；至此基因芯片制作完畢；C)在基因芯片上構(gòu)建生化反應(yīng)室，進行芯片PCR等生化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中引入生物素。芯片PCR等生化反應(yīng)結(jié)束后，采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物，按下述步驟進行芯片信號檢測a)用溶液I(10mM Tris-HCl，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween-20)37℃漂洗芯片5分鐘，洗去非特異性結(jié)合的核酸；b)以溶液II(100mM Tris-HCl，pH7.5；150mMNaCl，50mg/ml BSA)37℃封阻芯片10分鐘，防止信號檢測酶的非特異性吸附；c)堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物或堿性磷酸酶-連接肽-鏈霉結(jié)合肽-鏈霉親和素復(fù)合物在芯片上37℃作用10分鐘，使復(fù)合物中的親和素或鏈霉親和素與芯片上DNA中的生物素充分作用；d)以溶液I 37℃漂洗芯片兩次，每次10分鐘，除去非特異性吸附的堿性磷酸酶復(fù)合物；e)在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(NBT)混合液，其中BCIP與NBT的終濃度均為200微克/毫升，于37℃下反應(yīng)，30分鐘以內(nèi)出現(xiàn)藍紫色陽性反應(yīng)結(jié)果。由上可知，在研究過程中，我們對酶標信號檢測方法進行了以下優(yōu)化將酶標信號檢測方法中所有步驟的反應(yīng)溫度恒定于37℃；配置新的通用洗脫液(溶液I)，在每個洗脫步驟中應(yīng)用；省去了傳統(tǒng)酶標信號檢測過程中底物緩沖液洗滌這一步驟。通過上述手段，增加了信號檢測方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，使其更適合于中低密度基因芯片的信號檢測。
本發(fā)明與其他基因芯片信號檢測技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和效果本方法的核酸檢測靈敏度可達0.1皮克，穩(wěn)定性和重復(fù)性好，特別適合中低密度基因芯片的信號檢測；本方法操作簡便，檢測速度快，整個操作流程僅需70分鐘，可根據(jù)顏色的有無判斷生化反應(yīng)的結(jié)果，結(jié)合簡易型信號檢測儀即可進行定量或半定量分析，因此本發(fā)明易于推廣應(yīng)用，可進一步開發(fā)成基因芯片信號檢測試劑盒。


圖1.優(yōu)化后酶標信號檢測方法的靈敏度檢驗結(jié)果a為陽性對照，采用商品化堿性磷酸酶作為信號檢測用酶；B為采用定向交聯(lián)產(chǎn)物進行信號檢測所得結(jié)果；I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX，分別對應(yīng)不同DNA(摻入生物素)量25納克、5納克、1納克、100皮克、50皮克、10皮克、0.5皮克、0.1皮克；X為陰性對照。
圖2.芯片PCR電泳結(jié)果
M為DNA Marker DL-20001號泳道為芯片PCR液相產(chǎn)物；2號泳道和3號泳道均為玻片PCR擴增產(chǎn)物，2號摻入生物素，3號未摻入生物素。
圖3.芯片半巢式PCR酶標信號檢測結(jié)果采用優(yōu)化后酶標方法進行信號檢測； 為陽性對照，點加未經(jīng)二硫鍵修飾內(nèi)引物； 為陽性結(jié)果。
具體實施例方式
實施例酶標信號檢測方法檢測結(jié)核菌rpoB基因芯片PCR結(jié)果。其步驟是1、對普通載玻片進行巰基硅烷化修飾后，固定rpoB基因特異性引物W10685(5’-TTTTTTTTTTAGTTCTTCGGCACCAGCCAG-3’)，形成引物陣列(芯片)根據(jù)結(jié)核菌rpoB基因序列設(shè)計一對外引物(上游引物為5’-CAGACCACGATGACCGTTCC-3’，編號54684下游引物為5’-GAGCCGATCAGACCGATGTT-3’，編號54685)在PCR反應(yīng)液中加入一對外引物，使PCR反應(yīng)在引物陣列上進行，PCR過程中摻入生物素，液相擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖-2；2、采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物，按下述步驟進行酶標信號檢測①用溶液I在37℃下漂洗芯片5分鐘，除去非特異性結(jié)合于芯片上的核酸和生物素；②以溶液II在37℃下封阻芯片10分鐘，防止堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物在芯片上的非特異吸附；③用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物37℃下在芯片上作用10分鐘，使其充分與芯片上DNA中的生物素充分結(jié)合④以溶液I37℃漂洗兩次，10分鐘每次，洗脫非特異性結(jié)合于芯片上的堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物⑤在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)/氯化硝基四氮唑藍(NBT)混合液，其中BCIP與NBT的終濃度均為200微克/毫升，于37℃下反應(yīng)，30分鐘以內(nèi)出現(xiàn)藍紫色陽性反應(yīng)結(jié)果。
權(quán)利要求
1.一種基因芯片上的酶標信號檢測方法，該方法包括以下步驟1)制作基因芯片并進行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中引入生物素；具體包括以下步驟A.首先在普通載玻片上制作點陣；其次對載玻片進行巰基硅烷化修飾；B.合成相關(guān)引物，對引物的5’末端進行二硫鍵修飾；將修飾后引物固定于載玻片，形成引物陣列，基因芯片制作完畢；C.在基因芯片上構(gòu)建生化反應(yīng)室，進行芯片生化反應(yīng)，在反應(yīng)過程中引入生物素；2)采用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物，按下述步驟進行酶標信號檢測a)用溶液I 37℃漂洗芯片5分鐘，溶液I的組成成份為10mMTris-Cl，pH7.5；150mM NaCl，0.05％Tween-20；b)以溶液II 37℃封阻芯片10分鐘，溶液II的組成成份為100mMTris-Cl，pH7.5；150mM NaCl，50mg/ml BSA；c)用堿性磷酸酶-親和素復(fù)合物在芯片上37℃作用10分鐘，使其與芯片上DNA中的生物素充分結(jié)合；d)用溶液I 37℃漂洗芯片兩次，每次10分鐘；e)在芯片上滴加5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/氯化硝基四氮唑藍混合液，37℃下反應(yīng)，30分鐘內(nèi)出現(xiàn)藍紫色陽性結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因芯片上的酶標信號檢測方法。其步驟是制作基因芯片;構(gòu)建芯片生化反應(yīng)室,進行芯片生化反應(yīng),在反應(yīng)過程中引入生物素;生化反應(yīng)完成后采用堿性磷酸酶復(fù)合物進行芯片信號檢測。在信號檢測過程中,優(yōu)化了反應(yīng)條件,簡化了反應(yīng)步驟,提高了信號檢測的穩(wěn)定性和重復(fù)性。本發(fā)明核酸檢測靈敏度可達0.1皮克,檢測速度快,重復(fù)性和穩(wěn)定性好;操作簡便,成本低,易于推廣應(yīng)用;可進一步開發(fā)成基因芯片信號檢測試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK1384210SQ0211583
公開日2002年12月11日 申請日期2002年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月14日
發(fā)明者張先恩, 鄧教宇, 黃旭, 張治平, 邵文海, 文繼開, 陸紅兵, 劉強 申請人:中國科學院武漢病毒研究所